Hielscher Ultrasonics
Rádi s vámi probereme váš postup.
Zavolejte nám: +49 3328 437-420
Napište nám: info@hielscher.com

Buněčná lýza buněk BL21 ultrazvukem

Buňky BL21 jsou kmenem E. coli, který je široce používán ve výzkumných laboratořích, biotechnologiích a průmyslové výrobě díky své schopnosti vysoce efektivně exprimovat proteiny. Ultrazvukové narušení buněk, lýza a extrakce proteinů je běžnou metodou izolace a sběru cílových proteinů z buněčného vnitřku buněk BL21. Ultrazvuku zcela naruší buňku a uvolní všechny zachycené proteiny, čímž se zpřístupní 100% proteinu.

BL21 buňky pro expresi proteinů

Bakterie E. coli, jako jsou buňky BL21, jsou běžně lyzovány ultrazvukem, aby se uvolnily exprimované proteiny, jako jsou rekombinantní proteinyBuňka BL21 je chemicky kompetentní bakteriální kmen E. coli vhodný pro transformaci a vysokoúrovňovou expresi proteinů pomocí indukčního systému T7 RNA polymerázy-IPTG. Buňky BL21 umožňují vysoce účinnou proteinovou expresi jakéhokoli genu, který je pod kontrolou promotoru T7. Kmen E. coli BL21(DE3) je kmen produkce proteinů na bázi T7 RNA polymerázy kombinovaný s expresními vektory založenými na promotoru T7 a je široce používán v laboratořích a průmyslu k produkci rekombinantních proteinů. V BL21(DE3) je exprese genu kódujícího rekombinantní protein transkribována chromozomálně kódovanou T7 RNA polymerázou (T7 RNAP), která se přepisuje osmkrát rychleji než konvenční E. coli RNAP. Díky tomu je kmen BL21(DE3) vysoce účinný a mění se v jeden z nejpreferovanějších buněčných systémů pro expresi proteinů.

Protokol pro ultrazvukovou lýzu a extrakci proteinů z buněk BL21

Buněčná lýza buněk BL21 se většinou provádí pomocí ultrazvuku v kombinaci s lauroylsarkosinátem sodným (také známým jako sarkosyl) jako lyzačním pufrem. Výhody ultrazvukového narušení buněk a extrakce proteinů spočívají ve spolehlivosti, reprodukovatelnosti a jednoduchém, bezpečném a rychlém provozu ultrasonicators. Níže uvedený protokol poskytuje krok za krokem směr pro ultrazvukovou lýzu buněk BL21:

  • Aby se odstranily chaperonové proteiny, byly bakteriální pelety BL21 resuspendovány v 50 ml ledově studeného pufru Tris-EDTA (STE) sodného (skládajícího se z 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl doplněného 100 mM PMSF).
  • Přidá se 500 ul lysozymu (10 mg/ml) a buňky se inkubují na ledu po dobu 15 minut.
  • Poté se přidá 500 ul DTT a 7 ml sarkosylu (10 % (w/v) tvořených tlumivkou STE).
  • Je nezbytné udržovat všechny čisticí pufry ledově chladné a vzorky neustále udržovat na ledu. Všechny kroky čištění by měly být prováděny v chladírně, pokud je to možné.
  • VialTweeter na ultrazvukovém procesoru UP200ST

  • Pro ultrazvukovou lýzu a extrakci proteinů jsou vzorky sonikovány v VialTweeter MultiSample Ultrasonicator pro 4 x 30 sekund při 100% amplitudě s intervalem 2 minuty mezi každou ultrazvukem. Alternativně ultrazvukový homogenizátor typu sondy s mikrohrotem, např. UP200Ht s S26d2 (3 x 30 s, 2 min. pauza mezi ultrazvukovými cykly, 80% amplituda).
  • Pro další kroky čištění musí být vzorky uchovávány na ledu nebo alternativně skladovány při teplotě -80 °C až do dalšího zpracování.
Sondový inzonátor UP200St pro lýzu

Ultrazvukový buněčný disruptor UP200St s mikrohrotem S26d2 pro lýzu a extrakci proteinů

Žádost o informace




Všimněte si našich Zásady ochrany osobních údajů.




Ultrazvuková lýza pod Prescise Temperature Control

Přesná a spolehlivá regulace teploty je při manipulaci s biologickými vzorky klíčová. Vysoké teploty iniciují tepelně indukovanou degradaci proteinů ve vzorcích.
Stejně jako všechny techniky mechanické přípravy vzorků, sonikace vytváří teplo. Teplota vzorků však může být dobře kontrolována při použití VialTweeter. Představujeme vám různé možnosti sledování a řízení teploty vašich vzorků při jejich přípravě pomocí VialTweeter a VialPress pro analýzu.

  1. Monitorování teploty vzorku: Ultrazvukový procesor UP200St, který pohání VialTweeter, je vybaven inteligentním softwarem a zásuvným teplotním senzorem. Zapojte teplotní senzor do UP200St a vložte špičku teplotního senzoru do jedné ze vzorkových trubic. Prostřednictvím digitálního barevného dotykového displeje můžete v nabídce UP200St nastavit konkrétní teplotní rozsah pro sonikaci vzorku. Ultrasouckator se automaticky zastaví, když je dosaženo maximální teploty, a pozastaví se, dokud teplota vzorku neklesne na nižší hodnotu nastavené teploty ∆. Poté se sonikace spustí automaticky znovu. Tato chytrá funkce zabraňuje degradaci vyvolané teplem.
  2. Blok VialTweeter lze předchladit. Vložte blok VialTweeter (pouze sonotroda bez převodníku!) do lednice nebo mrazničky, aby se titanový blok předchladil, což pomáhá odložit nárůst teploty ve vzorku. Pokud je to možné, lze předchladit i samotný vzorek.
  3. Během sonikace použijte k chlazení suchý led. Použijte mělký podnos naplněný suchým ledem a umístěte VialTweeter na led, aby se teplo mohlo rychle rozptýlit.

Zákazníci po celém světě používají VialTweeter a VialPress pro každodenní přípravu vzorků v biologických, biochemických, lékařských a klinických laboratořích. Díky inteligentnímu softwaru a řízení teploty procesoru UP200St je teplota spolehlivě řízena a je zabráněno degradaci vzorku způsobené teplem. Ultrazvuková příprava vzorků pomocí VialTweeter a VialPress poskytuje vysoce spolehlivé a reprodukovatelné výsledky!
 

Tento tutoriál vysvětluje, jaký typ sonikátoru je nejlepší pro vaše úkoly přípravy vzorků, jako je lýza, narušení buněk, izolace proteinů, fragmentace DNA a RNA v laboratořích, analýza a výzkum. Vyberte si ideální typ sonikátoru pro vaši aplikaci, objem vzorku, počet vzorků a propustnost. Hielscher Ultrasonics má pro vás ideální ultrazvukový homogenizátor!

Jak najít perfektní sonikátor pro narušení buněk a extrakci proteinů ve vědě a analýze

Miniatura videa

 

Najděte optimální ultrazvukový disruptor pro vaši aplikaci lýzy

Hielscher ultrasonicators lze dálkově ovládat pomocí ovládacího prvku prohlížeče. Parametry sonikace lze sledovat a přesně upravovat podle požadavků procesu.Hielscher Ultrasonics je dlouholetým zkušeným výrobcem vysoce výkonných ultrazvukových buněčných disruptorů a homogenizátorů pro laboratoře, stolní a průmyslové měřítkové systémy. Velikost vaší bakteriální buněčné kultury, váš výzkumný nebo výrobní cíl a objem buňky, která se má zpracovat za hodinu nebo den, jsou základními faktory pro nalezení správného ultrazvukového buněčného disruptoru pro vaši aplikaci.
Hielscher Ultrasonics nabízí různá řešení pro simultánní sonikaci více vzorků (až 10 lahviček s VialTweeter) a hromadných vzorků (tj. mikrotitrační desky / desky ELISA s UIP400MTP), stejně jako klasický laboratorní ultrasonicator typu sondy s různými úrovněmi výkonu od 50 do 400 wattů na plně průmyslové ultrazvukové procesory s až 16 000 watty na jednotku pro komerční narušení buněk a extrakci proteinů ve velké výrobě. Všechny Hielscher ultrasonicators jsou vyrobeny pro provoz 24/7/365 při plném zatížení. Robustnost a spolehlivost jsou základními vlastnostmi našich ultrazvukových přístrojů.
Všechny digitální ultrazvukové homogenizátory jsou vybaveny chytrým softwarem, barevným dotykovým displejem a automatickým protokolováním dat, díky čemuž se ultrazvukové zařízení stává pohodlným pracovním nástrojem v laboratorních a výrobních zařízeních.
Dejte nám vědět, jaké buňky, jaký objem, s jakou frekvencí a s jakým cílem musíte zpracovávat své biologické vzorky. Doporučíme vám nejvhodnější ultrazvukový disruptor článků pro vaše procesní požadavky.

Níže uvedená tabulka vám poskytuje přibližnou kapacitu zpracování našich ultrazvukových systémů od kompaktních ručních homogenizátorů a MultiSample Ultrasonicators až po průmyslové ultrazvukové procesory pro komerční aplikace:

Objem dávky Průtok Doporučená zařízení
96-jamkové / mikrotitrační destičky Není k dispozici UIP400MTP
10 lahviček à 0,5 až 1,5 ml Není k dispozici VialTweeter na UP200St
0.01 až 250 ml 5 až 100 ml/min UP50H
001 až 500 ml 10 až 200 ml / min UP100H
10 až 2000 ml 20 až 400 ml/min UP200Ht, UP400St
0.1 až 20L 0.2 až 4 l/min UIP2000hdT
10 až 100 l 2 až 10 l/min UIP4000hdT
Není k dispozici 10 až 100 l / min UIP16000
Není k dispozici větší shluk UIP16000

Kontaktujte nás! / Zeptejte se nás!

Vyžádejte si více informací

Použijte prosím níže uvedený formulář a vyžádejte si další informace o ultrazvukových procesorech, aplikacích a ceně. Rádi s vámi prodiskutujeme váš proces a nabídneme vám ultrazvukový systém, který bude vyhovovat vašim požadavkům!









Vezměte prosím na vědomí naše Zásady ochrany osobních údajů.




Ultrazvuková fragmentace DNA je spolehlivá a účinná technika běžně používaná pro protein narušení buněk, izolaci a fragmentaci DNA v sekvenování nové generace (NGS)

UIP400MTP deska sonikátor pro disrupci cel s vysokou propustností v 96jamkových destičkách

 
 

Ultrasonicator UP200Ht s mikrohrotem S26d2 pro ultrazvukovou lýzu biologických vzorků

Ultrazvukový přístroj UP200Ht s 2mm mikrohrotem S26d2 pro sonikaci malých vzorků

 
Přečtěte si více o tom, jak můžete použít ultrazvukový tkáňový homogenizátor pro efektivní a spolehlivou přípravu pufrovacích roztoků!
 



Fakta, která stojí za to vědět

Bakterie Escherichia coli

Escherichia coli je typ bakterie, který netvoří spory, je gramnegativní a vyznačuje se tvarem rovné tyčinky. Bakterie E.coli jsou přítomny v životním prostředí, potravinách a střevech lidí a zvířat. E. coli se obvykle přenáší pomocí peritrichózních bičíků, ale existují i nepohyblivé typy. E.coli jsou tzv. fakultativně anaerobní chemoorganotrofní organismy, což znamená, že jsou schopné jak respiračního, tak fermentačního metabolismu. Většina typů E.coli je benigní a plní v těle užitečné funkce, např. potlačuje růst škodlivých bakteriálních druhů, syntetizuje vitamíny atd.
Bakteriální buňky Escherichia coli tzv. typu B jsou speciální kategorií kmenů E.coli, které jsou široce používány ve výzkumu k vyšetření mechanismů, jako je citlivost bakteriofágů nebo restrikčně-modifikační systémy. Kromě toho jsou bakterie E.coli ceněny jako spolehlivý tahoun pro expresi bílkovin v biotechnologických a biologických laboratořích. Například E.coli se používá k syntéze sloučenin, jako jsou proteiny a oligosacharidy v průmyslovém měřítku. Vzhledem ke specifickým vlastnostem, jako je nedostatek proteázy, nízká produkce acetátu při vysoké hladině glukózy a zvýšená propustnost, jsou E. coli B buňky nejčastěji využívanými hostitelskými buňkami pro produkci geneticky upravených proteinů.

Rekombinantní protein

Rekombinantní proteiny (rProt) získávají významný význam v mnoha odvětvích, včetně chemické výroby, farmaceutického, kosmetického, humánního a zvířecího lékařství, zemědělství, potravinářství a také v průmyslu zpracování odpadů.
Produkce rekombinantního proteinu vyžaduje použití expresního systému. Jako exprimující buněčné systémy pro produkci rekombinantní DNA lze použít jak prokaryotické, tak eukaryotické buňky. Zatímco bakteriální buňky jsou nejrozšířenější pro expresi proteinů kvůli faktorům, jako je nízká cena, snadná škálovatelnost a jednoduché podmínky médií, savčí, kvasinky, řasy, hmyz a bezbuněčné systémy jsou zavedenými alternativami. Typ proteinu, funkční aktivita, stejně jako požadovaný výtěžek exprimovaného proteinu ovlivňují výběr buněčného systému použitého pro expresi proteinu.
Aby bylo možné exprimovat rekombinantní protein, musí být konkrétní buňka transfekována vektorem DNA, který obsahuje templát rekombinantní DNA. Buňky transfekované templátem jsou poté kultivovány. V důsledku buněčného mechanismu buňky přepisují a překládají požadovaný protein, čímž produkují cílový protein.
Vzhledem k tomu, že exprimované proteiny jsou zachyceny v buněčné matrici, buňka musí být lyzována (narušena a rozbita), aby se proteiny uvolnily. V následujícím kroku čištění se protein oddělí a purifikuje.
Prvním rekombinantním proteinem použitým v léčbě byl rekombinantní lidský inzulín v roce 1982. V současné době se na celém světě vyrábí více než 170 typů rekombinantních proteinů pro léčebné postupy. Běžně používané rekombinantní proteiny používané v medicíně jsou například rekombinantní hormony, interferony, interleukiny, růstové faktory, faktory nádorové nekrotizy, faktory srážení krve, trombolytika a enzymy pro léčbu závažných onemocnění, jako je cukrovka, nanismus, infarkt myokardu, městnavé srdeční selhání, mozková mrtvice, roztroušená skleróza, neutropenie, trombocytopenie, anémie, hepatitida, revmatoidní artritida, astma, Crohnova choroba a léčba rakoviny. (srov. Phuc V. Pham, v Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)


Literatura / Reference

VialTweeter na ultrazvukovém procesoru UP200ST

VialTweeter sonikátor pro simultánní sonikaci 10 vzorků, např. k narušení buněk BL21


Hielscher Ultrasonics dodává vysoce výkonné ultrazvukové homogenizátory od laboratorní až po průmyslovou velikost.

Vysoce výkonný ultrazvuk! Sortiment produktů Hielscher pokrývá celé spektrum od kompaktního laboratorního ultrasonicator přes stolní jednotky až po plně průmyslové ultrazvukové systémy.

Rádi s vámi probereme váš postup.

Let's get in contact.