Lyze buněk BL21 sonikací

Buňky BL21 jsou kmen E. coli, který se široce používá ve výzkumných laboratořích, v biotechnologii a v průmyslové výrobě díky své schopnosti exprimovat proteiny vysoce efektivně. Ultrazvuková dezintegrace buněk, lyze a extrakce proteinů je běžnou metodou izolace a získávání cílových proteinů z nitra buněk BL21. Sonikace buňku zcela rozruší a uvolní všechny uzavřené proteiny, čímž zpřístupní 100% proteinu.

Buňky BL21 pro expresi proteinů

Buňka BL21 je chemicky kompetentní bakteriální kmen E. coli vhodný pro transformaci a vysokou úroveň exprese proteinů s využitím indukčního systému T7 RNA polymeráza-IPTG. Buňky BL21 umožňují vysoce účinnou expresi proteinů z jakéhokoli genu, který je pod kontrolou promotoru T7. Kmen E. coli BL21(DE3) je kmen pro produkci proteinů založený na T7 RNA polymeráze, kombinovaný s expresními vektory založenými na promotoru T7, a široce se používá v laboratořích i v průmyslu k produkci rekombinantních proteinů. V BL21(DE3) je exprese genu kódujícího rekombinantní protein transkribována chromozomálně kódovanou T7 RNA polymerázou (T7 RNAP), která transkribuje osmkrát rychleji než konvenční RNAP E. coli. Díky tomu je kmen BL21(DE3) vysoce účinný a činí z něj jeden z nejpreferovanějších buněčných systémů pro expresi proteinů.

Protokol pro ultrazvukovou lyzi a extrakci proteinů z buněk BL21

Lyze buněk BL21 se většinou provádí sonikací v kombinaci s lauroylsarkosinátem sodným (známým také jako sarkosyl) jako lyzačním pufrem. Výhody ultrazvukové dezintegrace buněk a extrakce proteinů spočívají ve spolehlivosti, reprodukovatelnosti a také v jednoduché, bezpečné a rychlé obsluze ultrazvukových přístrojů. Níže uvedený protokol poskytuje postup krok za krokem pro ultrazvukovou lyzi buněk BL21:

• Za účelem odstranění chaperonových proteinů byly bakteriální pelety BL21 resuspendovány v 50 ml ledově vychlazeného pufru sodium-Tris-EDTA (STE) (sestávajícího z 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, doplněného 100 mM PMSF).
• Poté se přidá 500 ul lysozymu (10 mg/ ml) a buňky se inkubují na ledu po dobu 15 min.
• Následně se přidá 500 ul DTT a 7 ml sarkosylu (10% (w/v), připraveného v pufru STE).
• Je nezbytné udržovat všechny purifikační pufry ledově vychlazené a vzorky po celou dobu uchovávat na ledu. Všechny purifikační kroky by se měly pokud možno provádět v chladové místnosti.



• Pro ultrazvukovou lyzi a extrakci proteinů se vzorky sonikují v ultrazvukovém přístroji pro více vzorků VialTweeter MultiSample po dobu 4 x 30 s při 100% amplitudě s 2min intervalem mezi jednotlivými sonikacemi. Alternativně lze použít sondový ultrazvukový homogenizátor s mikrohrotem, např. UP200Ht s mikrohrotem S26d2 (3 x 30 s, 2 min. pauza mezi ultrazvukovými cykly, 80% amplituda).
• Pro další purifikační kroky musí být vzorky udržovány na ledu, nebo alternativně uchovávány při -80°C až do dalšího zpracování.

Ultrazvuková lyze s přesnou regulací teploty

Přesná a spolehlivá regulace teploty je při práci s biologickými vzorky zásadní. Vysoké teploty ve vzorcích iniciují tepelně indukovanou degradaci proteinů.
Jako všechny mechanické techniky přípravy vzorků i sonikace vytváří teplo. Teplotu vzorků však lze při použití zařízení VialTweeter dobře regulovat. Představujeme Vám různé možnosti, jak monitorovat a regulovat teplotu Vašich vzorků při jejich přípravě k analýze pomocí zařízení VialTweeter a VialPress.

1. Monitorování teploty vzorku: Ultrazvukový procesor UP200St, který pohání VialTweeter, je vybaven inteligentním softwarem a zásuvným teplotním čidlem. Zapojte teplotní čidlo do UP200St a vložte hrot teplotního čidla do jedné ze zkumavek se vzorky. Prostřednictvím digitálního barevného dotykového displeje můžete v menu UP200St nastavit konkrétní teplotní rozsah pro sonikaci Vašeho vzorku. Ultrazvukový přístroj se automaticky zastaví po dosažení max. teploty a pozastaví se, dokud teplota vzorku neklesne na dolní hodnotu nastaveného teplotního ∆. Poté se sonikace automaticky znovu spustí. Tato chytrá funkce zabraňuje degradaci vyvolané teplem.
2. Blok VialTweeter lze předchladit. Vložení bloku VialTweeter (pouze sonotrody bez měniče!) do chladničky nebo mrazničky za účelem předchlazení titanového bloku pomáhá oddálit nárůst teploty ve vzorku. Je-li to možné, lze předchladit i samotný vzorek.
3. Ke chlazení během sonikace použijte suchý led. Použijte mělkou misku naplněnou suchým ledem a umístěte VialTweeter na led, aby se teplo mohlo rychle odvádět.

Zákazníci po celém světě používají VialTweeter a VialPress pro každodenní přípravu vzorků v biologických, biochemických, lékařských a klinických laboratořích. Díky inteligentnímu softwaru a regulaci teploty procesoru UP200St je teplota spolehlivě regulována a degradaci vzorků vyvolané teplem je zabráněno. Ultrazvuková příprava vzorků pomocí zařízení VialTweeter a VialPress přináší vysoce spolehlivé a reprodukovatelné výsledky!

Najděte optimální ultrazvukový dezintegrátor pro Vaši aplikaci lyze

Hielscher Ultrasonics je dlouholetý zkušený výrobce vysoce výkonných ultrazvukových dezintegrátorů buněk a homogenizátorů pro laboratoře, stolních a průmyslových systémů. Velikost Vaší bakteriální buněčné kultury, Váš výzkumný nebo výrobní cíl a objem buněk, který je třeba zpracovat za hodinu nebo za den, jsou zásadními faktory pro nalezení správného ultrazvukového dezintegrátoru buněk pro Vaši aplikaci.
Hielscher Ultrasonics nabízí různá řešení pro simultánní sonikaci více vzorků (až 10 lahviček se zařízením VialTweeter) a hromadných vzorků (tj. mikrotitračních destiček / destiček ELISA se zařízením UIP400MTP), stejně jako klasické sondové laboratorní ultrazvukové přístroje s různými úrovněmi výkonu od 50 do 400 wattů až po plně průmyslové ultrazvukové procesory s výkonem až 16 000 wattů na jednotku pro komerční dezintegraci buněk a extrakci proteinů ve velkovýrobě. Všechny ultrazvukové přístroje Hielscher jsou konstruovány pro provoz 24/7/365 při plném zatížení. Robustnost a spolehlivost jsou klíčovými vlastnostmi našich ultrazvukových zařízení.
Všechny digitální ultrazvukové homogenizátory jsou vybaveny chytrým softwarem, barevným dotykovým displejem a automatickým protokolováním dat, díky čemuž je ultrazvukové zařízení pohodlným pracovním nástrojem v laboratořích i výrobních provozech.
Dejte nám vědět, jaký druh buněk, jaký objem, s jakou frekvencí a s jakým cílem potřebujete zpracovávat své biologické vzorky. Doporučíme Vám nejvhodnější ultrazvukový dezintegrátor buněk pro Vaše procesní požadavky.

Níže uvedená tabulka Vám poskytuje orientační přehled přibližné zpracovatelské kapacity našich ultrazvukových systémů od kompaktních ručních homogenizátorů a ultrazvukových přístrojů MultiSample až po průmyslové ultrazvukové procesory pro komerční aplikace:

Literatura / Reference

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.