Lýza buněk BL21 buněk ultrazvuku
BL21 buňky jsou kmen E. coli, který je široce používán ve výzkumných laboratořích, biotechnologie a průmyslové výroby díky své schopnosti vyjádřit proteiny vysoce efektivní. Ultrazvukové narušení buněk, lýza a extrakce bílkovin je běžnou metodou izolovat a sbírat cílené proteiny z buněčného vnitřku buněk BL21. Ultrazvuku zcela narušuje buňku a uvolňuje všechny zachycené proteiny, takže 100% bílkovin je k dispozici.
BL21 Buňky pro expresi proteinu
BL21 buňka je chemicky kompetentní E. coli bakteriální kmen vhodný pro transformaci a expresi bílkovin na vysoké úrovni pomocí indukčního systému T7 RNA polymerázy-IPTG. Buňky BL21 umožňují vysoce účinnou expresi proteinů jakéhokoli genu, který je pod kontrolou promotoru T7. Kmen E. coli BL21(DE3) je kmen pro výrobu polymerázy na bázi T7 RNA v kombinaci s vektory exprese založenými na T7 a je široce používán v laboratořích a průmyslu k výrobě rekombinantních proteinů. V BL21(DE3) je exprese genu kódujícího rekombinantní protein přepsána chromozomálně kódovanou T7 RNA polymerázou (T7 RNAP), která přepisuje osmkrát rychleji než konvenční E. coli RNAP. Díky tomu je kmen BL21(DE3) vysoce účinný a mění se na jeden z nejoblíbenějších buněčných systémů pro expresi bílkovin.
Protokol pro ultrazvukovou lýzu a extrakci bílkovin z buněk BL21
Buněčná lýza buněk BL21 se většinou provádí pomocí ultrazvuku v kombinaci s lauroyl sarkosinátem sodným (také známý jako sarkosyl) jako lyzační pufr. Výhody narušení ultrazvukových buněk a extrakce bílkovin spočívají ve spolehlivosti, reprodukovatelnosti, stejně jako v jednoduchém, bezpečném a rychlém provozu ultrasonicators. Níže uvedený protokol poskytuje krok za krokem směr pro ultrazvukové BL21 buněčné lýzy:
- Za účelem odstranění proteinů garde byly bakteriální pelety BL21 resuspendovány v 50 ml ledového pufru Ed-EDTA (STE) (sestávající z 10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl doplněný o 100 mM PMSF).
- Přidá se 500 ul lysozymu (10 mg/ ml) a buňky se inkubují na led po dobu 15 minut.
- Poté se přidá 500 ul DTT a 7 ml sarkosylu (10% (w/v) zhoděného v STE pufru).
- Je nezbytné, aby všechny čisticí pufry byly ledově studené a aby vzorky byly neustále udržovány na ledu. Všechny očistné kroky by měly být prováděny v chladné místnosti, pokud je to možné.
- Pro ultrazvukovou lýzu a extrakci bílkovin jsou vzorky sonicated v VialTweeter MultiSample Ultrasonicator pro 4 x 30 sec při 100% amplitudě s intervalem 2 min mezi jednotlivými sonikacemi. Alternativně se může například ultrazvukový homogenizátor sondy s mikrokapou Uf200 ः t s S26d2 (3 x 30 sec, 2 min. pauza mezi ultrazvukovými cykly, 80% amplituda) může být použit.
- Pro další čištění musí být vzorky uchovávány na ledu nebo alternativně skladovány při teplotě -80 °C až do dalšího zpracování.
Ultrazvukový buněčný disruptor UP200St s mikro-tipem S26d2 pro lýzu a extrakci bílkovin
Ultrazvuková lýza pod prescise regulace teploty
Při manipulaci s biologickými vzorky je rozhodující přesná a spolehlivá regulace teploty. Vysoké teploty iniciují tepelně indukovanou degradaci proteinů ve vzorcích.
Jako všechny techniky mechanické přípravy vzorků, použití ultrazvuku vytváří teplo. Nicméně, teplota vzorků může být dobře kontrolována při použití VialTweeter. Představujeme vám různé možnosti sledování a řízení teploty vašich vzorků při jejich přípravě pomocí VialTweeter a VialPress pro analýzu.
- Sledování teploty vzorku: Ultrazvukový procesor UP200St, který pohání VialTweeter, je vybaven inteligentním softwarem a připojitelným teplotním čidlem. Zapojte teplotní čidlo do up200St a vložte špičku teplotního čidla do jedné z zkumavek. Pomocí digitálního barevného dotykového displeje můžete nastavit v nabídce UP200St specifický teplotní rozsah pro použití vzorku. Ultrazvukový systém se automaticky zastaví, když je dosaženo maximální teploty, a pozastaví se, dokud teplota vzorku nesníží na nižší hodnotu nastavené teploty ∆. Pak se sonikace znovu spustí automaticky. Tato inteligentní funkce zabraňuje degradaci vyvolané teplem.
- Blok VialTweeter lze předchladit. Vložte blok VialTweeter (pouze sonotrodu bez snímače!) do chladničky nebo mrazničky, aby se titanový blok předchladl, pomáhá odložit zvýšení teploty ve vzorku. Pokud je to možné, může být vzorek sám předchlazen.
- Při použití ultrazvuku používejte suchý led k ochlazení. Použijte mělkou misku naplněnou suchým ledem a umístěte VialTweeter na led, aby se teplo rychle rozptýlilo.
Zákazníci po celém světě používají VialTweeter a VialPress pro každodenní přípravu vzorků v biologických, biochemických, lékařských a klinických laboratořích. Inteligentní software a regulace teploty procesoru UP200St, teplota je spolehlivě řízena a zabraňuje se degradaci vzorku vyvolané teplem. Ultrazvuková příprava vzorků s VialTweeter a VialPress přináší vysoce spolehlivé a reprodukovatelné výsledky!
Najděte optimální ultrazvukový disruptor pro vaši aplikaci Lysis
Hielscher Ultrazvuk je dlouholetý zkušený výrobce vysoce výkonných ultrazvukových buněčných disruptorů a homogenizátorů pro laboratoře, stolní a průmyslové systémy. Vaše velikost bakteriální buněčné kultury, váš výzkum nebo výrobní cíl a objem buňky zpracovat za hodinu nebo den jsou základní faktory najít správné ultrazvukové buňky disruptor pro vaši aplikaci.
Hielscher Ultrasonics nabízí různá řešení pro současnou použití ultrazvuku více vzorků (až 10 lahviček s VialTweeter) a masové vzorky (tj. mikrotitrační desky / desky ELISA s UIP400MTP), stejně jako klasický laboratorní ultrazvukový přístroj typu sondy s různými úrovněmi výkonu od 50 do 400 wattů až po plně průmyslové ultrazvukové procesory s až 16 000wattů na jednotku pro komerční narušení buněk a extrakci bílkovin ve velké výrobě. Všechny Hielscher ultrasonicators jsou postaveny pro 24/7/365 provoz při plném zatížení. Robustnost a spolehlivost jsou základními funkcemi našich ultrazvukových zařízení.
Všechny digitální ultrazvukové homogenizátory jsou vybaveny inteligentním softwarem, barevným dotykovým displejem a automatickým protokolem dat, které činí ultrazvukové zařízení do pohodlného pracovního nástroje v laboratoři a výrobních zařízeních.
Dejte nám vědět, jaký druh buněk, jaký objem, s jakou frekvencí a s jakým cílem musíte zpracovat své biologické vzorky. Doporučíme vám nejvhodnější ultrazvukový buněčný disruptor pro vaše procesní požadavky.
Níže uvedená tabulka vám dává údaj o přibližné kapacitě zpracování našich ultrazvukových systémů od kompaktních ručních homogenizátorů a víceodvětvových ultrazvukových procesorů až po průmyslové ultrazvukové procesory pro komerční aplikace:
| Hromadná dávka | průtok | Doporučené Devices |
|---|---|---|
| 96-well / mikrotitrační desky | na | UIP400MTP |
| 10 lahviček à 0,5 až 1,5 ml | na | VialTweeter na UP200St |
| 0.01 až 250 ml | 5 až 100 ml/min | UP50H |
| 0.01 až 500 ml | 10 až 200 ml / min | UP100H |
| 10 až 2000ml | 20 až 400 ml / min | Uf200 ः t, UP400St |
| 00,1 až 20L | 00,2 až 4 litry / min | UIP2000hdT |
| 10 až 100L | 2 až 10 l / min | UIP4000hdT |
| na | 10 až 100L / min | UIP16000 |
| na | větší | hrozen UIP16000 |
Kontaktujte nás! / Zeptej se nás!
UIP400MTP Deska Sonicator pro narušení buněk s vysokou propustností v 96jamkových destičkách
ultrazvukovač Uf200 ः t s 2mm mikrotipem S26d2 pro použití ultrazvuku malých vzorků
Přečtěte si více o tom, jak můžete použít ultrazvukový homogenizátor tkání pro účinnou a spolehlivou přípravu pufrových roztoků!
Fakta Worth Knowing
Bakterie Escherichia Coli
Escherichia coli je typ bakterií, který je neformující spóry, gramnegativní a vyznačuje se formou rovné tyče. Bakterie E.coli jsou přítomny v prostředí, potraviny, a střeva lidí a zvířat. E. coli je obvykle motile pomocí peritrichous flagella, ale tam jsou nonmotile typy, taky. E.coli jsou takzvané fakultativně anaerobní chemoorganotrofní organismy, což znamená, že jsou schopné jak respiračního, tak fermentačního metabolismu. Většina typů E.coli je benigní a plní užitečné funkce v těle, např.
Escherichia coli buňka bakterií takzvaného typu B je zvláštní kategorie kmenů E.coli, které jsou široce používány ve výzkumu k vyšetření mechanismů, jako je bakteriofágová citlivost nebo systémy změny omezení. Kromě toho jsou bakterie E.coli oceňovány jako spolehlivý dříč pro expresi bílkovin v biotechnologických a biologických laboratořích. Například, E.coli se používají k syntéze sloučenin, jako jsou bílkoviny a oligosacharidy v průmyslovém měřítku. Vzhledem ke specifickým vlastnostem, jako je nedostatek proteázy, nízká produkce acetátu na vysoké úrovni glukózy a zvýšená propustnost, E. coli B buňky jsou nejčastěji používány hostitelské buňky pro výrobu geneticky modifikovaných proteinů.
Rekombinantní protein
Rekombinantní proteiny (rProt) získávají značný význam v rozmanitých odvětvích, včetně chemické výroby, farmaceutické, kosmetické, humánní a živočišné medicíny, zemědělství, potravin a průmyslu zpracování odpadů.
Produkce rekombinantního proteinu vyžaduje použití expresního systému. Jako vyjádření buněčných systémů pro výrobu rekombinantní DNA lze použít jak prokaryotické, tak eukaryotické buňky. Zatímco bakteriální buňky jsou nejvíce široce používány pro expresi bílkovin v důsledku faktorů, jako jsou nízké náklady, snadná škálovatelnost a jednoduché mediální podmínky, savčí, kvasinky, řasy, hmyz a bezbuněčné systémy jsou zavedeny alternativy. Typ proteinu, funkční aktivita, stejně jako požadovaný výtěžek exprimovaného proteinu ovlivňují výběr buněčného systému používaného pro expresi bílkovin.
Aby bylo možné exprimovat rekombinantní protein, musí být určitá buňka transfekována vektorem DNA obsahujícím šablonu rekombinantní DNA. Buňky transfected s šablonou jsou pak kultivované. V důsledku buněčného mechanismu buňky přepisují a překládají bílkovinu, která je zajímavá, čímž produkují cílový protein.
Vzhledem k tomu, že exprimované proteiny jsou zachyceny v buněčné matrici, musí být buňka lyzována (narušena a rozbita), aby se uvolnily bílkoviny. V následném kroku čištění je protein oddělen a čištěn.
První rekombinantní protein používaný při léčbě byl rekombinantní lidský inzulín v roce 1982. Dnes, více než 170 typů rekombinantních bílkovin jsou vyráběny po celém světě pro lékařské ošetření. Běžně používané rekombinantní proteiny používané v medicíně jsou například rekombinantní hormony, interferony, interleukiny, růstové faktory, faktory nekrózy nádoru, faktory srážení krve, trombolytické léky a enzymy pro léčbu závažných onemocnění, jako je cukrovka, zakrslost, infarkt myokardu, městnavé srdeční selhání, mozková apoplexie, roztroušená skleróza, neutropenie, trombocytopenie, anémie, hepatitida, revmatoidní artritida, astma, Crohnova choroba a léčba rakoviny. (srov. Phuc V. Pham, v Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Literatura / Reference
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
VialTweeter sonicator pro současnou sonikaci 10 vzorků, např. k narušení buněk BL21
Vysoce výkonný ultrazvuk! Hielscher je produktová řada pokrývá celé spektrum od kompaktní laboratoře ultrasonicator přes bench-top jednotky na full-průmyslové ultrazvukové systémy.