Ultrazvuková fragmentace DNA pro sekvenování nové generace
Sekvenování nové generace (NGS) vyžaduje spolehlivé smykové štěpení a fragmentaci genomové DNA, aby bylo možné sekvenovat vlákna genomové DNA a vytvářet genomové knihovny. Řízená fragmentace DNA na fragmenty DNA je nezbytným krokem přípravy vzorků, který musí předcházet sekvenování DNA. Sonikace je osvědčenou účinnou a spolehlivou technikou fragmentace DNA na fragmenty určité délky. Protokoly ultrazvukové fragmentace DNA dosahují reprodukovatelných výsledků fragmentace. Ultrazvukové přístroje Hielscher jsou schopny vytvářet široké spektrum distribucí velikostí fragmentů genomové DNA, které lze přesně řídit pomocí provozních parametrů. Jelikož jsou ultrazvukové systémy Hielscher pro smykové štěpení DNA k dispozici pro jednotlivé i vícenásobné vialky a také pro mikrodestičky, stává se příprava vzorků vysoce efektivní.
Destičkový sonikátor UIP400MTP pro vysokokapacitní přípravu vzorků rovnoměrně sonikuje vzorky ve vícejamkových, mikrotitračních a 96jamkových destičkách
- opakovatelné / reprodukovatelné výsledky
- přesně nastavitelné pro dosažení určité délky fragmentů
- rychlé zpracování
- konzistentní výsledky fragmentace DNA
- přístroje pro jakékoli objemy vzorků (např. více vialek nebo mikrodestičky)
- vysoká kapacita zpracování
- přesná regulace teploty
- jednoduché a uživatelsky přívětivé ovládání
Sekvenování nové generace: ultrazvuková fragmentace DNA pro přípravu knihoven
K provedení sekvenování nové generace je nutné provést tři základní kroky: (1) přípravu knihovny, (2) sekvenování a (3) analýzu dat. Během přípravy knihovny se DNA fragmentuje, poté se konce fragmentů opraví (zarovnají) přidáním jedné adeninové báze a cílové fragmenty se převedou na dvouvláknovou DNA. Nakonec se ligací, PCR nebo tagmentací připojí takzvané adaptéry, aby bylo možné výsledný DNA produkt knihovny kvantifikovat pro sekvenování.
Fragmentace DNA pomocí sonikace: Zejména v případě technologií sekvenování krátkých čtení, jako je Illumina, které nedokážou snadno číst delší fragmenty DNA, musí být vlákna DNA fragmentována na určitou velikost, čehož lze spolehlivě dosáhnout sonikací.
Sonikaci lze spolehlivě využít k fragmentaci DNA, RNA a chromatinu.
Sekvenování nové generace – příprava knihoven
Ultrazvuková fragmentace DNA se běžně používá při přípravě sekvenačních knihoven DNA pro platformy sekvenování nové generace (NGS). Tato technika slouží k rozložení molekul DNA na menší fragmenty v požadovaném rozsahu velikostí, což usnadňuje následné kroky přípravy knihovny. Ultrazvuková fragmentace DNA je obvykle vyžadována v kroku přípravy knihovny v pracovních postupech NGS, aby se genomová DNA fragmentovala na menší úseky vhodné pro následné zpracování a sekvenování. Hraje klíčovou roli při zajištění úspěchu sekvenačního experimentu tím, že vytváří fragmenty DNA ve vhodném rozsahu velikostí pro konkrétní používanou sekvenační platformu.
Elektroforetické analýzy genomové DNA E. coli EDL933 podrobené sonikaci po dobu 0 – 15 min. L označuje DNA žebříček. (Basselet et al. 2008)
Sekvenování nové generace – kroky procesu:
- Ultrazvuková fragmentace DNA: Před konstrukcí knihovny se genomová DNA fragmentuje na menší, lépe zpracovatelné úseky. Ultrazvuková fragmentace spočívá v použití vysokofrekvenčních zvukových vln ke smykovému štěpení molekul DNA na fragmenty v požadovaném rozsahu velikostí. Tento krok je zásadní, protože pomáhá zajistit, aby sekvenační čtení vytvořená později měla vhodnou délku pro používanou sekvenační platformu. Rozsah velikostí fragmentů lze upravit podle specifických požadavků sekvenačního experimentu.
- Klonální amplifikace pomocí PCR: Po ultrazvukové fragmentaci procházejí fragmenty DNA opravou konců, ligací adaptérů a amplifikací PCR, čímž vznikají výsledné sekvenační knihovny DNA. Tyto kroky připravují fragmentované molekuly DNA na proces sekvenování přidáním adaptérových sekvencí nezbytných pro vazbu na sekvenační platformu a poskytnutím primerových míst pro amplifikaci PCR.
- Sekvenování DNA syntézou: Jakmile jsou sekvenační knihovny připraveny, začíná proces sekvenování DNA syntézou (SBS). Během SBS se sekvence DNA určuje postupným přidáváním nukleotidů ke komplementárnímu vláknu. Tento krok zahrnuje cyklické reakce inkorporace nukleotidů, zobrazování a štěpení, což umožňuje určit sekvenci DNA na základě fluorescenčních signálů emitovaných inkorporovanými nukleotidy.
- Masivně paralelní sekvenování: V posledním kroku se prostorově oddělené, amplifikované templáty DNA sekvenují současně masivně paralelním způsobem. Tento vysokokapacitní přístup k sekvenování umožňuje vytvořit miliony až miliardy sekvenačních čtení v jediném sekvenačním běhu, což umožňuje efektivní a rychlé určení sekvencí DNA.
Jak funguje ultrazvuková fragmentace DNA?
Sonikace, známá také jako akustické zpracování vzorků, je široce používanou metodou fragmentace DNA. Při ultrazvukovém smykovém štěpení DNA jsou vzorky vystaveny ultrazvukovým vlnám za řízených podmínek. Princip ultrazvukové fragmentace DNA je založen na vibracích a kavitaci generovaných ultrazvukovými vlnami. Smykové síly vznikající v důsledku ultrazvukové (akustické) kavitace štěpí vysokomolekulární molekuly DNA. Nastavení sonikace, jako je intenzita (amplituda, doba trvání), pulzní režim a teplota, umožňuje přesnou fragmentaci DNA na určitou požadovanou délku fragmentů DNA. Zatímco DNA se pomocí sonikace často zkracuje na 100 až 600 bp, při použití mírnějších ultrazvukových podmínek lze získat delší fragmenty DNA o délce až 1300 bp.
Ultrazvukové smykové štěpení DNA během ChIP – imunoprecipitace chromatinu
Upraveno podle Jkwchui pod licencí CC-BY-SA.03
Regulace teploty k zabránění degradaci DNA
Dvouvláknová molekulární struktura DNA je vysoce citlivá na zvýšené teploty, takže přesná regulace teploty během kroků přípravy vzorků je klíčovým faktorem pro spolehlivé výsledky analýz.
Ať už používáte sondové ultrazvukové přístroje Hielscher, VialTweeter nebo UIP400MTP – nepřetržité monitorování a regulace teploty jsou zajištěny díky připojitelnému teplotnímu čidlu a chytrému softwaru přístroje. Abyste udrželi teplotu v určitém rozmezí, můžete nastavit horní a dolní teplotní limit. Ultrazvukový přístroj se tak pozastaví, jakmile je tento teplotní limit překročen, a automaticky bude pokračovat v sonikaci, jakmile teplota klesne o nastavenou hodnotu ∆T.
Propracovaný software ultrazvukových přístrojů Hielscher zajišťuje spolehlivé udržování ideálních podmínek zpracování vzorků.
Hromadná fragmentace DNA ve vzorcích s ultrazvukovým přístrojem pro vícejamkové destičky UIP400MTP
Počty vzorků v biologických vědách se v posledním desetiletí výrazně zvýšily. To znamená, že velmi vysoké počty vzorků (např. 384, 1536 nebo 3456 jamek na mikrodestičku) musí být během přípravy vzorků a analýzy zpracovány za trvale stejných podmínek, aby bylo možné získat srovnatelné a validní výsledky. S přístrojem UIP400MTP sleduje Hielscher Ultrasonics trend hromadného zpracování vzorků. UIP400MTP je ultrazvukový přístroj pro přípravu vzorků v mikrodestičkách. UIP400MTP dokáže zpracovat destičky s 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 nebo 3456 jamkami. V závislosti na typu mikrodestičky může každá jamka obvykle pojmout objemy vzorků od desítek nanolitrů až po několik mililitrů. UIP400MTP, široce využívaný ve výzkumu v biologických vědách, se velmi často používá k přípravě vzorků před testy, jako je ELISA (enzymově vázaný imunosorbentní test) nebo PCR, před analýzou proteinů, a také k přípravě chromatinu před CHiP a CHiP-seq, identifikací modifikací histonů a dalšími analytickými postupy (např. gelová elektroforéza, hmotnostní spektrometrie).
Přečtěte si více o vysokokapacitním zpracování PCR destiček!
VialTweeter pro přípravu vzorků až v 10 vialkách
VialTweeter je široce používaný laboratorní ultrazvukový přístroj VialTweeter, který umožňuje účinnou a pohodlnou sonikaci až 10 vialek současně. Jelikož jsou vialky a zkumavky (např. vialky Eppendorf, kryovialky, centrifugační zkumavky) sonikovány nepřímo, je vyloučena jakákoli křížová kontaminace. Protože je do každého vzorku přenášena stejná intenzita ultrazvuku, jsou všechny výsledky sonikace homogenní a reprodukovatelné. VialTweeter nabízí všechny chytré funkce jako naše ostatní digitální přístroje (např. chytré menu, programovatelná nastavení, regulace teploty, dálkové ovládání atd.), takže je zajištěn nejvyšší uživatelský komfort.
Víceprsté sonotrody pro mikrojamkové destičky
Víceprsté sonotrody se 4 nebo 8 prsty, dostupné pro ultrazvukové sondové homogenizátory UP200Ht a UP200St, představují pohodlnou možnost, jak sonikovat více vzorků současně za stejných podmínek. Například sonotroda MTP-24-8-96 je osmiprstá sonotroda, která je ideální pro integraci do automatizovaných systémů nebo pro efektivní ruční přípravu vzorků v jamkách vícejamkových destiček. Víceprstá sonotroda je ideální pro automatizaci v laboratořích, kde se většinou zpracovávají kádinky a zkumavky pomocí standardní ultrazvukové sonotrody. Víceprsté a standardní sonotrody lze rychle vyměnit během několika minut, čímž se z jednosondového ultrazvukového přístroje stane vícesondový ultrazvukový dezintegrátor.
Ultrazvukové přístroje Hielscher pro fragmentaci DNA
Hielscher Ultrasonics nabízí různé platformy založené na ultrazvuku pro fragmentaci DNA, RNA a chromatinu. Mezi tyto platformy patří ultrazvukové sondy (sonotrody), řešení nepřímé sonikace pro současnou přípravu vzorků ve více zkumavkách nebo vícejamkových destičkách (např. 96jamkových destičkách, mikrotitračních destičkách), sonoreaktory a ultrazvukové cuphorny. Všechny platformy pro smykové štěpení DNA jsou poháněny frekvenčně laděnými, vysoce výkonnými ultrazvukovými procesory, které jsou přesně řiditelné a poskytují reprodukovatelné výsledky.
Ultrazvukové procesory pro jakýkoli počet a velikost vzorků
S ultrazvukovými přístroji Hielscher pro více vzorků VialTweeter (až pro 10 zkumavek) a UIP400MTP (pro mikrodestičky/ vícejamkové destičky) lze snadno zkrátit dobu zpracování vzorků díky intenzivní a přesně řiditelné sonikaci a současně dosáhnout požadované distribuce velikostí fragmentů DNA a výtěžku. Ultrazvuková fragmentace DNA činí přípravu vzorků efektivní, spolehlivou a škálovatelnou. Protokoly lze lineárně škálovat od jednoho vzorku až po velké množství vzorků použitím trvale řízeného ultrazvuku.
Sondové ultrazvukové přístroje s jedním až pěti prsty jsou ideální pro přípravu menších počtů vzorků. Laboratorní ultrazvukové přístroje Hielscher jsou k dispozici v různých velikostech, takže Vám můžeme doporučit ideální přístroj pro Vaši aplikaci a požadavky.
Přesné řízení procesu
Přesně řiditelná nastavení sonikace jsou klíčová, protože nadměrná sonikace může zničit DNA, RNA i chromatin, zatímco nedostatečné ultrazvukové smykové štěpení vede k příliš dlouhým fragmentům DNA a chromatinu. Digitální ultrazvukové přístroje Hielscher lze snadno nastavit na přesné parametry sonikace. Specifická nastavení sonikace lze také uložit jako naprogramované nastavení pro rychlé opakování stejného postupu.
Všechny sonikace jsou automaticky protokolovány a ukládány jako soubor CSV na vestavěnou SD kartu. To umožňuje přesnou dokumentaci provedených pokusů a snadnou revizi sonikačních běhů.
Pomocí dálkového ovládání přes prohlížeč lze všechny digitální ultrazvukové přístroje obsluhovat a monitorovat přes jakýkoli standardní prohlížeč. Instalace dalšího softwaru není nutná, protože připojení LAN umožňuje velmi jednoduché nastavení typu plug-n-play.
Nejvyšší uživatelská přívětivost při ultrazvukové přípravě vzorků
Všechny ultrazvukové přístroje Hielscher jsou navrženy tak, aby poskytovaly vysoce výkonný ultrazvuk a zároveň byly vždy velmi uživatelsky přívětivé a snadno ovladatelné. Všechna nastavení jsou přehledně uspořádána v jasném menu, které je snadno přístupné přes barevný dotykový displej nebo dálkové ovládání přes prohlížeč. Chytrý software s programovatelnými nastaveními a automatickým záznamem dat zajišťuje optimální nastavení sonikace pro spolehlivé a reprodukovatelné výsledky. Čisté a snadno použitelné rozhraní menu činí z ultrazvukových přístrojů Hielscher uživatelsky přívětivá a efektivní zařízení.
Níže uvedená tabulka Vám poskytne představu o přibližné kapacitě zpracování našich laboratorních ultrazvukových přístrojů, které jsou ideální pro úlohy přípravy vzorků, jako je fragmentace DNA a RNA, lyze buněk a extrakce proteinů:
| Přístroj | Výkon [W] | Typ | Objem [mL] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP | 400 | pro mikrodestičky | 6 – 3456 jamek | VialTweeter | 200 | pro až 10 vialek plus možnost připojení upínacího přípravku | 0,5 – 1,5 |
| UP50H | 50 | sondový typ | 0,01 – 250 |
| UP100H | 100 | sondový typ | 0,01 – 500 |
| UP200Ht | 200 | sondový typ | 0,1 – 1000 |
| UP200St | 200 | sondový typ | 0,1 – 1000 |
| UP400St | 400 | sondový typ | 5,0 – 2000 |
| CupHorn | 200 | CupHorn, sonoreaktor | 10 – 200 |
| GDmini2 | 200 | bezkontaminační průtoková cela |
Kontaktujte nás! / Zeptejte se nás!
Ultrazvuková jednotka pro přípravu více vzorků VialTweeter umožňuje současnou sonikaci až 10 vialek. Pomocí upínacího přípravku VialPress lze až 4 další zkumavky přitlačit k přední straně pro intenzivní sonikaci.
Sonotroda MTP-24-8-96 má osm ultrazvukových sond pro sonikaci jamek mikrotitračních destiček.
Literatura / Reference
- Qiyun Liang, Christoph Ratzke (2025): Lysing diverse bacteria with the Hielscher UIP400MTP for DNA sequencing. Protocol Uni Tübingen 2025.
- Poptsova, M., Il’icheva, I., Nechipurenko, D. et al. (2014): Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing. Scientific Reports 4, 4532; 2014.
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample processing for DNA chip array-based analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Wang Y., Joshu C.E., Curtis S.D., Douville C., Burk V.A., Ru M., Popoli M., Ptak J., Dobbyn L., Silliman N., Coresh J., Boerwinkle E., Prizment A., Bettegowda C., Kinzler K.W., Papadopoulos N., Platz E.A., Vogelstein B. (2025): Detection of cancers three years prior to diagnosis using plasma cell-free DNA. Cancer Discovery 2025 May.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts the Resistance to Doxorubicin in Human Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Characterization of the growth behavior of Leishmania tarentolae – a new expression system for recombinant proteins. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-wide tracking of unmethylated DNA Alu repeats in normal and cancer cells. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Protein Hint1 Triggers Apoptosis Independent of Its Enzymatic Activity. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.
Fakta, která stojí za to znát
Co je sekvenování nové generace?
Sekvenování nové generace, také Next Gen Sequencing (NGS), vysokokapacitní sekvenování nebo sekvenování druhé generace, označuje přístup masivně paralelního sekvenování, při kterém se velmi velká (masivní) množství DNA z milionů fragmentů sekvenují současně a paralelně v jednom běhu.
K provedení sekvenování nové generace jsou zapotřebí tři základní kroky:
- příprava knihovny,
- sekvenování a
- analýza dat
Všechny jsou nezbytné.
Během přípravy knihovny musí být vlákna DNA fragmentována na fragmenty DNA určité délky. Sonikace je jednou z preferovaných technik fragmentace DNA.
Během procesu sekvenování DNA se určuje pořadí nukleotidů v DNA – známé jako sekvence nukleové kyseliny. Sekvence nukleové kyseliny je složena ze čtyř nukleotidových bází – adeninu, cytosinu, guaninu a thyminu –, které kódují informaci.
Sekvenování nové generace je hnací silou výzkumu v biologických vědách a personalizované medicíně, protože sekvenování DNA a RNA se intenzivně využívá v genomickém výzkumu, výzkumu rakoviny, výzkumu vzácných a komplexních onemocnění, mikrobiologickém výzkumu, agrigenomice a mnoha dalších oblastech výzkumu.
Sekvenování nové generace vs. Sangerovo sekvenování
Zatímco pomocí sekvenování nové generace (NGS) lze sekvenovat obrovské počty genomových vzorků, Sangerovo sekvenování (známé také jako metoda terminace řetězce nebo sekvenování první generace) je schopno sekvenovat pouze malé počty vzorků. Sangerovo sekvenování sekvenuje vždy pouze jediný fragment DNA a lze je provést během jediného dne. Díky své přesnosti je Sangerovo sekvenování rovněž považováno za technologii zlatého standardu, která se používá k ověřování výsledků získaných sekvenováním nové generace.
Sangerovo sekvenování dosahuje délky čtení přibližně 800bp (typicky 500–600bp u neobohacené DNA). Delší čtení u Sangerova sekvenování vykazují významné výhody oproti jiným sekvenačním metodám, zejména pokud jde o sekvenování repetitivních oblastí genomu. Problém dat krátkých čtení se projevuje zejména při sekvenování nových genomů (de novo) a při sekvenování silně přestavěných úseků genomu, typicky těch, které se vyskytují v nádorových genomech, nebo v oblastech chromozomů vykazujících strukturní variabilitu. [srov. Morozova a Marra, 2008]
DNA – deoxyribonukleová kyselina – její formy a funkce
Každá forma DNA má jedinečné vlastnosti a využití a přispívá k širokému spektru oblastí výzkumu, včetně onkologie, genetiky, forenzní vědy a evoluční biologie. Sonikátory Hielscher představují vysoce účinné a spolehlivé řešení pro izolaci a fragmentaci DNA a RNA pro účely Vašich analýz. V níže uvedeném seznamu Vám vysvětlíme jednotlivé formy DNA a rozdělíme je podle jejich biologického kontextu a funkcí:
- Genomová DNA (gDNA)
Genomová DNA (gDNA): Úplný soubor DNA v organismu, zahrnující kódující (geny) i nekódující oblasti. - Extracelulární DNA
Cirkulující nádorová DNA (ctDNA): Fragmenty DNA uvolňované do krevního oběhu nádorovými buňkami.
Volná (bezbuněčná) DNA (cfDNA): Fragmenty DNA volně cirkulující v krevním oběhu, pocházející z různých tkání. - Extrachromozomální cirkulární DNA (eccDNA): Cirkulární molekuly DNA nacházející se mimo chromozomy v eukaryotických buňkách.
Virová DNA: DNA pocházející z virů, buď integrovaná do genomu hostitele, nebo jako epizomální DNA. - Mitochondriální DNA
Mitochondriální DNA (mtDNA): DNA nacházející se v mitochondriích, děděná po matce a podílející se na produkci energie. - Plazmidová DNA
Plazmidová DNA: Malé cirkulární molekuly DNA, které se replikují nezávisle na chromozomální DNA, běžně se vyskytují v bakteriích a používají se v genetickém inženýrství. - Jaderná DNA
Jaderná DNA (nDNA): DNA obsažená v jádře eukaryotických buněk, tvořící většinu genetického materiálu organismu. - DNA jednotlivých buněk
DNA jednotlivých buněk (scDNA): DNA extrahovaná z jediné buňky, používaná pro podrobnou genomovou analýzu na úrovni jednotlivých buněk. - Rekombinantní DNA
Rekombinantní DNA (rDNA): Molekuly DNA vytvořené laboratorními metodami genetické rekombinace, které spojují genetický materiál z více zdrojů. - Specializované formy
Environmentální DNA (eDNA): DNA odebraná ze vzorků životního prostředí (půda, voda) bez izolace zdrojových organismů
Starobylá DNA (aDNA): DNA extrahovaná ze starobylých vzorků, poskytující poznatky o evoluční biologii a dávných populacích. - Chromozomální DNA
Chromozomální DNA: DNA tvořící chromozomy v buněčném jádře, zahrnující kódující i nekódující oblasti. - Virové a syntetické formy
Virová DNA: DNA pocházející z virů, která může být buď integrována do genomů hostitele, nebo existovat jako samostatné entity.
Syntetická DNA: Uměle syntetizované sekvence DNA vytvořené chemickými procesy, často používané ve výzkumu a biotechnologiích.
Hielscher Ultrasonics vyrábí vysoce výkonné ultrazvukové homogenizátory od laboratorní po průmyslovou velikost.