Ultrazvuková fragmentace DNA pro sekvenování příští generace

Sekvenování nové generace (NGS) vyžaduje spolehlivé stříhání a fragmentaci genomické DNA, aby bylo možné sekvenci genomických pramenů DNA a vytvoření genomových knihoven. Řízená fragmentace DNA na fragmenty DNA je nezbytným krokem přípravy vzorku požadovaným před sekvencí DNA. Ultrazvuku je prokázána jako účinná a spolehlivá technika pro fragmentaci DNA určité délky. Ultrazvukové protokoly fragmentace DNA dosahují reprodukovatelná fragmentace výsledků. Hielscher ultrasonicators jsou schopni produkovat širokou škálu genomických distribucí velikosti fragmentů DNA, přesně kontrolovatelných pomocí provozních parametrů. Vzhledem k tomu, Hielscher ultrazvukové DNA stříhání systémy jsou k dispozici pro jednotlivé a více lahviček, stejně jako pro mikroplatby, příprava vzorku se stává vysoce efektivní.

Žádost o informace





UIP400MTP Plate Sonicator pro přípravu vzorků s vysokou propustností: UIP400MTP rovnoměrně sonikuje vzorky ve vícejamkových, mikrotitračních destičkách a 96jamkových destičkách, které narušují buňky, extrahují proteiny, fragmentují DNA, RNA a alfa-synukleinové fibrily.

UIP400MTP deskový sonikátor Pro přípravu vzorků s vysokou propustností rovnoměrně sonikuje vzorky ve vícejamkových, mikrotitračních destičkách a 96jamkových destičkách

Výhody ultrazvukové fragmentace DNA

  • opakovatelné / reprodukovatelné výsledky
  • přesně nastavitelné pro získání určité délky fragmentu
  • rychlé zpracování
  • konzistentní výsledky fragmentace DNA
  • zařízení pro jakékoli objemy vzorků (např. více injekčních lahviček nebo mikroplatb)
  • vysoká propustnost
  • přesná regulace teploty
  • jednoduchá, uživatelsky přívětivá obsluha

Sekvenování nové generace: Ultrazvuková fragmentace DNA pro přípravu knihovny

Pro provedení sekvenování nové generace musí být provedeny tři základní kroky (1) přípravy knihovny, (2) sekvenování a (3) analýzy dat. Během přípravy knihovny je DNA fragmentována, pak jsou konce fragmentů opraveny (leštěny) přidáním jedné adeninové základny a cílové fragmenty jsou převedeny na dvousoučtovou DNA. Nakonec jsou takzvané adaptéry připojeny ligací, PCR nebo tagmentací, takže konečný produkt DNA knihovny lze kvantifikovat pro sekvenování.
Fragmentace DNA pomocí ultrazvuku: Zvláště když technologie sekvenování krátkého čtení, jako je Illumina, která nemůže snadno číst delší fragmenty DNA, musí být stojany DNA fragmentovány na určitou velikost, které lze spolehlivě dosáhnout ultrazvukem.
Ultrazvuku lze spolehlivě použít pro fragmentaci DNA, RNA a chromatinu.

Sekvenování nové generace – Příprava knihovny

Ultrazvuková fragmentace DNA se běžně používá při přípravě knihoven sekvenování DNA pro platformy sekvenování nové generace (NGS). Tato technika se používá k rozbití molekul DNA na menší fragmenty požadovaného rozsahu velikostí, což usnadňuje následné kroky při přípravě knihovny. Ultrazvuková fragmentace DNA je obvykle vyžadována během kroku přípravy knihovny pracovních postupů NGS k fragmentaci genomové DNA na menší kousky vhodné pro následné zpracování a sekvenování. Hraje klíčovou roli při zajišťování úspěchu sekvenačního experimentu generováním fragmentů DNA vhodného rozsahu velikostí pro konkrétní používanou sekvenační platformu.

Ultrazvuková fragmentace DNA se často používá jako krok přípravy vzorku v sekvenování nové generace (NGS)

Elektroforetická analýza genomové DNA E. coli EDL933 podrobené 0-15 min ultrazvuku. L označuje DNA Ladder. (Basselet et al., 2008)

Sekvenování nové generace – Kroky procesu:

  • Ultrazvuková fragmentace DNA: Před vytvořením knihovny je genomová DNA fragmentována na menší, lépe zvládnutelné kousky. Ultrazvuková fragmentace zahrnuje použití vysokofrekvenčních zvukových vln ke střihu molekul DNA na fragmenty požadovaného rozsahu velikostí. Tento krok je zásadní, protože pomáhá zajistit, aby sekvenční čtení vygenerovaná později měla vhodnou délku pro používanou sekvenační platformu. Rozsah velikosti fragmentů může být upraven na základě specifických požadavků sekvenačního experimentu.
  • Klonální amplifikace pomocí PCR: Po ultrazvukové fragmentaci fragmenty DNA procházejí opravou konce, ligací adaptéru a amplifikací PCR, aby se vytvořily konečné knihovny sekvenování DNA. Tyto kroky připravují fragmentované molekuly DNA pro proces sekvenování přidáním sekvencí adaptéru nezbytných pro vazbu na sekvenační platformu a poskytnutím primingových míst pro PCR amplifikaci.
  • Sekvenování DNA syntézou: Jakmile jsou sekvenační knihovny připraveny, začíná proces sekvenování DNA syntézou (SBS). Během SBS je sekvence DNA určena postupným přidáváním nukleotidů do komplementárního řetězce. Tento krok zahrnuje cyklické reakce začlenění nukleotidů, zobrazování a štěpení, což umožňuje určit sekvenci DNA na základě fluorescenčních signálů emitovaných inkorporovanými nukleotidy.
  • Masivně paralelní sekvenování: V závěrečném kroku jsou prostorově oddělené, amplifikované templáty DNA sekvenovány současně masivně paralelním způsobem. Tento přístup k vysoce výkonnému sekvenování umožňuje generovat miliony až miliardy sekvenačních čtení v jediném sekvenování, což umožňuje efektivní a rychlé stanovení sekvencí DNA.

Jak funguje ultrazvuková fragmentace DNA?

Sonikace, známá také jako akustické zpracování vzorků, je široce používaná metoda fragmentace DNA. Pro ultrazvukové stříhání DNA jsou vzorky vystaveny ultrazvukovým vlnám pod kontrolovaným stavem. Pracovní princip ultrazvukové fragmentace DNA je založen na vibracích a kavitaci generované ultrazvukovými vlnami. Smykové síly, které jsou výsledkem ultrazvukové (akustické) kavitace, rozbijí molekuly DNA s vysokou molekulovou hmotností. Nastavení ultrazvuku, jako je intenzita (amplituda, doba trvání), režim pulzace a teplota, umožňuje přesnou fragmentaci DNA na určitou požadovanou délku fragmentů DNA. Zatímco DNA je často snížena na 100 až 600 bp pomocí ultrazvuku, delší fragmenty DNA až 1300 bp lze získat při použití mírnějších ultrazvukových podmínek.

Ultrazvukové homogenizátory jsou spolehlivé pro stříhání DNA

Ultrazvukové stříhání DNA během ChIP – imunoprecipitace chromatinu
Upraveno z Jkwchui pod CC-BY-SA.03

 

Tento tutoriál vysvětluje, jaký typ sonikátoru je nejlepší pro vaše úkoly přípravy vzorků, jako je lýza, narušení buněk, izolace proteinů, fragmentace DNA a RNA v laboratořích, analýza a výzkum. Vyberte ideální typ sonikátoru pro vaši aplikaci, objem vzorku, počet vzorků a propustnost. Hielscher Ultrasonics má ideální ultrazvukový homogenizátor pro vás!

Jak najít perfektní sonikátor pro narušení buněk a extrakci bílkovin ve vědě a analýze

Miniatura videa

 

Regulace teploty, aby se zabránilo degradaci DNA

Dvouslepý molekulární tvar DNA je vysoce citlivý na zvýšené teploty, takže přesná kontrola teploty během kroků přípravy vzorku je klíčovým faktorem pro spolehlivé výsledky analýzy.
Ať už používáte Hielscherovy sondové ultrasonicators, VialTweeter nebo UIP400MTP – nepřetržité monitorování a regulace teploty je zajištěno díky připojitelnému teplotnímu senzoru a softwaru inteligentního zařízení. Chcete-li udržet teplotu v určitém rozsahu, můžete nastavit horní a dolní teplotní limit. V důsledku toho se ultrasonicator zastaví, jakmile je tento teplotní limit překročen a automaticky bude pokračovat v sonikátu, když teplota klesla o ∆T.
Sofistikovaný software ultrasonicators Hielscher zajišťuje spolehlivou údržbu ideálních podmínek zpracování vzorků.

Fragmentace DNA hmotnostní vzorek s víceúčelovým ultrazvukem UIP400MTP

Ultrazvuková jednotka pro přípravu více vzorků UIP400MTP pro použití ultrazvuku s více jamkamiPočet vzorků v oblasti vědy o životě se za posledních deset let výrazně zvýšil. To znamená, že velmi vysoký počet vzorků (např. 384, 1536 nebo 3456 jamek na mikroplatu) musí být zpracován během přípravy a analýzy vzorku za trvale stejných podmínek, aby se dosáhlo srovnatelných a platných výsledků. S UIP400MTP, Hielscher Ultrazvuk sleduje trend hromadného zpracování vzorků. UIP400MTP je ultrasonicator pro přípravu vzorků pomocí mikroplatiček. UIP400MTP může zpracovávat desky s 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 nebo 3456 jamek. V závislosti na typu mikroplaty může každá studna obvykle pojmout objemy vzorku mezi desítkami nanolitrů až po několik mililitrů. UIP400MTP, široce používaný ve výzkumu přírodních věd, se velmi běžně používá pro přípravu vzorků před testy, jako je ELISA (enzym-vázáný imunosorbentní test) nebo PCR, před analýzou proteinů, stejně jako pro přípravu chromatinu před CHiP a CHiP-seq, identifikace modifikace hábitu a další analytické léčby (např. gelová elektroforéza, hmotnostní spektrometrie).

Ultrazvukový homogenizátor UIP400MTP může sonikovat s více jamkovými deskami a mikrotitračními deskami pro lýzu buněk, fragmentaci DNA, dispergaci nebo homogenizaci.

UIP400MTP pro multi-well-plate sonikace

Miniatura videa

VialTweeter pro praparaci vzorků až 10 injekčních lahviček

Kompletní instalace VialTweeter: VialTweeter sonotroda při ultrazvukové procesor UP200StVialTweeter je široce používaný laboratorní ultrasonicator VialTweeter, který umožňuje efektivní a pohodlné použití ultrazvuku až 10 lahviček současně. Vzhledem k tomu, že injekční lahvičky a zkumavky (např. Eppendorfovy lahvičky, kryo lahvičky, odstředivkové zkumavky) jsou sonikovány nepřímo, je zabráněno jakékoli křížové kontaminaci. Vzhledem k tomu, že do každého vzorku je dodávána stejná ultrazvuková intenzita, jsou všechny výsledky ultrazvuku homogenní a reprodukovatelné. VialTweeter nabízí všechny chytré funkce, jako jsou naše další digitální zařízení (např. chytré menu, programovatelné nastavení, regulace teploty, dálkové ovládání atd.), aby byl zajištěn nejvyšší uživatelský komfort.

Sondy s více prsty pro mikrowellové desky

4 snímací hlavy nebo 4 sonotrody pro současnou sonikaci 4 vzorků při stejné intenzitě s Hielscher 200 watts ultrasonicator modely UP200ST a UP200HTK dispozici pro ultrazvukové sondy homogenizátory UP200Ht a UP200St, vícepísmenné sondy se 4 nebo 8 prsty jsou pohodlnou volbou pro sonikaci více vzorků současně za stejných podmínek. Například sonotroda MTP-24-8-96 je osmikožcová sonda, která je ideální pro integraci do automatizovaných systémů nebo efektivní ruční přípravu vzorků jamek z víceúčelových desek. Sonotroda s více prsty je ideální pro automatizované pro laboratoře, kde se většinou zpracovávají kádinky a zkumavky pomocí standardní ultrazvukové sonotrody. Více prstů a standardní sondy mohou být rychle inter-změněny během několika minut přeměnit ultrazvukový systém jedné sondy na ultrazvukový disruptor s více sondami.

Žádost o informace





Hielscher ultrasonicators pro fragmentaci DNA

Hielscher Ultrasonics nabízí různé ultrazvukové platformy pro FRAGMENTACI DNA, RNA a chromatinu. Tyto různé platformy zahrnují ultrazvukové sondy (sonotrody), nepřímé sonikační roztoky pro současnou přípravu vzorku více trubek nebo víceúčelových desek (např. desky 96-well, mikrotitrační desky), sonoreaktory a ultrazvukové cuphorny. Všechny platformy pro stříhání DNA jsou poháněny frekvenčními, vysoce výkonnými ultrazvukovými procesory, které jsou přesně kontrolovatelné a poskytují reprodukovatelné výsledky.

Ultrazvukové procesory pro jakékoli číslo vzorku a velikost

S Hielscherovými ultrasonicators VialTweeter (až pro 10 zkumav) a UIP400MTP (pro mikroplaty / vícevětší desky) je snadné zkrátit dobu zpracování vzorku díky intenzivní a přesně kontrolovatelné ultrazvuku a zároveň získat požadovanou distribuci a výtěžnost fragmentu DNA. Díky ultrazvukové fragmentaci DNA je příprava vzorku účinná, spolehlivá a škálovatelná. Protokoly mohou být lineárně škálovány z jednoho na mnoho vzorků pomocí neustále kontrolovaného ultrazvuku.
Sondové ultrasonicators s jedním až pěti prsty jsou ideální pro přípravu menších čísel vzorků. Hielscherovy laboratorní ultrasonicators jsou k dispozici v různých velikostech, takže vám můžeme doporučit ideální zařízení pro vaši aplikaci a požadavky.

přesné řízení procesu

Hielscher ultrasonicators mohou být dálkově ovládány pomocí ovládání prohlížeče. Parametry sonikace lze sledovat a přesně přizpůsobit požadavkům procesu.Přesné kontrolovatelné nastavení ultrazvuku je rozhodující, protože vyčerpávající sonifikace může zničit DNA, RNA a chromatin, ale nedostatečné ultrazvukové stříhání vede k příliš dlouhým fragmentům DNA a chromatinu. Hielscherovy digitální ultrasonicators lze snadno nastavit na přesný parametr ultrazvuku. Specifická nastavení ultrazvuku lze také uložit jako naprogramované nastavení pro rychlé opakování stejného postupu.
Veškerá použití ultrazvuku jsou automaticky protokolována a uložena jako soubor CSV na vestavěné SD kartě. To umožňuje přesnou dokumentaci provedených zkoušek a umožňuje snadno revidovat zvukové běhy.
Prostřednictvím dálkového ovládání prohlížeče lze všechny digitální ultrasonicators ovládat a monitorovat prostřednictvím jakéhokoli standardního prohlížeče. Instalace dalšího softwaru není nutná, protože připojení LAN umožňuje velmi jednoduché nastavení plug-n-play.

Nejvyšší uživatelská přívětivost v ultrazvukové přípravě vzorků

Všechny Hielscher ultrasonicators jsou navrženy tak, aby poskytovaly vysoce výkonný ultrazvuk, a zároveň jsou vždy velmi uživatelsky přívětivé a snadno ovlyžovat. Všechna nastavení jsou dobře strukturovaná v jasné nabídce, ke které lze snadno přistupovat pomocí barevného dotykového displeje nebo dálkového ovládání prohlížeče. Chytrý software s programovatelným nastavením a automatickým záznamem dat zajišťuje optimální nastavení ultrazvuku pro spolehlivé a reprodukovatelné výsledky. Čisté a snadno ovladatelné rozhraní nabídky mění ultrasonicators Hielscher na uživatelsky přívětivá a účinná zařízení.
Níže uvedená tabulka vám dává indikaci přibližné zpracovatelské kapacity našich laboratorních ultrasonicators, které jsou ideální pro úkoly přípravy vzorků, jako je fragmentace DNA a RNA, buněčná lýza a extrakce bílkovin:

přístrojVýkon [W]TypObjem [ml]
UIP400MTP400pro mikroplatby6 – 3456 jamek
VialTweeter200pro až 10 injekčních lahviček plus možnost upnutí00,5 – 1,5
UP50H50Sondy typu0.01 – 250
UP100H100Sondy typu0.01 – 500
Uf200 ः t200Sondy typu00,1 – 1000
UP200St200Sondy typu00,1 – 1000
UP400St400Sondy typu5,0 – 2000
CupHorn200CupHorn, sonoreherec10 – 200
GDmini2 200bez kontaminace toku buněk

Kontaktujte nás! / Zeptej se nás!

Požádejte o další informace

Použijte prosím níže uvedený formulář a vyžádejte si další informace o ultrazvukových procesorech, aplikacích a ceně. Rádi s vámi probereme váš proces a nabídneme vám ultrazvukový systém splňující vaše požadavky!









Uvědomte si prosím naši Zásady ochrany osobních údajů,


VialTweeter je MultiSample Ultraonicator, který umožňuje spolehlivou přípravu vzorků za přesně řízených teplotních podmínek.

Ultrazvuková jednotka pro přípravu více vzorků VialTweeter umožňuje současnou použití ultrazvuku až 10 lahviček. S upnutým zařízením VialPress lze pro intenzivní použití ultrazvuku přitlačit až 4 další trubky dopředu.


Sonotroda MTP-24-8-96 má osm ultrazvukových sond pro použití ultrazvuku jamek mikrotitračních desek.

Sonotroda MTP-24-8-96 má osm ultrazvukových sond pro použití ultrazvuku jamek mikrotitračních desek.



Literatura / Reference

Fakta Worth Knowing

Co je sekvenování nové generace?

Sekvenování nové generace, také Next Gen Sequencing (NGS), sekvenování s vysokou propustností nebo sekvenování druhé generace, odkazuje na přístup masivního paralelního sekvenování, kde je současně paralelně sekvenováno velmi velké (masivní) množství DNA milionů fragmentů.
Aby bylo možné provést sekvenování nové generace, je třeba provést tři základní kroky

  1. příprava knihovny,
  2. sekvenování a
  3. Analýza dat

jsou vyžadovány.
Během přípravy knihovny musí být řetězce DNA fragmentovány na fragmenty DNA určité délky. Sonikace je jednou z preferovaných technik fragmentace DNA.
Během procesu sekvenování DNA se pořadí nukleotidů v DNA – jako sekvence nukleové kyseliny – je stanovena. Sekvence nukleové kyseliny se skládá ze čtyř nukleotidových bází – adeninu, cytosinu, guaninu,thyminu – který kód pro informaci.
Sekvenování nové generace je hnací silou výzkumu v oblasti vědy o životě a personalizované medicíny, protože sekvenování DNA a RNA se silně používá v genomickém výzkumu, výzkumu rakoviny, výzkumu vzácných a komplexních onemocnění, mikrobiálním výzkumu, agrigenomice a mnoha dalších výzkumných oblastech.

Sekvenování nové generace vs. sekvenování Sanger

Zatímco s sekvenováním nové generace (NGS) je možné sekvenovat masivní počet genomických vzorků, Sanger Sequencing (také známý jako metoda ukončení řetězce nebo sekvenování první generace) má pouze schopnost sekvenční malá čísla vzorků. Sanger sekvenování pouze sekvence jeden fragment DNA najednou a může být provedeno v jednom dni. Vzhledem ke své akruaci je sekvenování Sanger také považováno za technologii zlatého standardu, která se používá k ověření výsledků získaných sekvenováním nové generace.
Sanger sekvenování dosahuje délky čtení přibližně 800bp (obvykle 500-600bp s neobohacenou DNA). Delší délky čtení v sangerském sekvenování mají významné výhody oproti jiným metodám sekvenování, zejména pokud jde o sekvenování opakujících se oblastí genomu. Výzva dat sekvence krátkého čtení je obzvláště problémem při sekvenování nových genomů (de novo) a při sekvenování vysoce přeskupených genomových segmentů, obvykle těch, které jsou vidět u genomů rakoviny nebo v oblastech chromozomů, které vykazují strukturální odchylky. [cp. Morozova a Marra, 2008]

Dna – Deoxyribonukleová kyselina – Jeho formy a funkce

Každá forma DNA má jedinečné vlastnosti a aplikace, které přispívají k širokému spektru oblastí výzkumu, včetně onkologie, genetiky, forenzních věd a evoluční biologie. Hielscher sonikátory jsou vysoce účinným a spolehlivým řešením pro izolaci a fragmentaci DNA a RNA pro účely analýzy. V níže uvedeném seznamu vám vysvětlíme konkrétní formy DNA a kategorizujeme je na základě jejich biologického kontextu a funkcí:

  • Genomová DNA (gDNA)
    Genomová DNA (gDNA): Kompletní sada DNA v organismu, včetně kódujících (geny) i nekódujících oblastí.
  • Extracelulární DNA
    Cirkulující nádorová DNA (ctDNA): Fragmenty DNA uvolňované dělat krevního řečiště nádorovými buňkami.
    Bezbuněčná DNA (cfDNA): Fragmenty DNA, které volně cirkulují v krevním řečišti a pocházejí z různých tkání.
  • Extrachromozomální kruhová DNA (eccDNA): Kruhové molekuly DNA nacházející se mimo chromozomy v eukaryotických buňkách.
    Virová DNA: DNA pocházející z virů, buď integrovaná do hostitelského genomu, nebo jako episomální DNA.
  • Mitochondriální DNA
    Mitochondriální DNA (mtDNA): DNA se nachází v mitochondriích, dědí se po matce a podílí se na výrobě energie.
  • plazmidová DNA
    Plazmidová DNA: Malé kruhové molekuly DNA, které se replikují nezávisle na chromozomální DNA, běžně se vyskytují v bakteriích a používají se v genetickém inženýrství.
  • Jaderná DNA
    Jaderná DNA (nDNA): DNA obsažená v jádře eukaryotických buněk, která tvoří většinu genetického materiálu v organismu.
  • Jednobuněčná DNA
    Jednobuněčná DNA (scDNA): DNA extrahovaná z jediné buňky, používaná pro podrobnou genomickou analýzu na úrovni jednotlivých buněk.
  • Rekombinantní DNA
    Rekombinantní DNA (rDNA): Molekuly DNA vytvořené laboratorními metodami genetické rekombinace, které spojují genetický materiál z více zdrojů.
  • Specializované formuláře
    Environmentální DNA (eDNA): DNA odebraná ze vzorků životního prostředí (půda, voda) bez izolace zdrojových organismů
    Starověká DNA (aDNA): DNA extrahovaná ze starověkých vzorků, která poskytuje vhled do evoluční biologie a starověkých populací.
  • Chromozomální DNA
    Chromozomální DNA: DNA, která tvoří chromozomy v buněčném jádře a zahrnuje kódující i nekódující oblasti.
  • Virové a syntetické formy
    Virová DNA: DNA odvozená z virů, které mohou být buď integrovány do hostitelských genomů, nebo mohou existovat jako nezávislé entity.
    Syntetická DNA: Uměle syntetizované sekvence DNA vytvořené chemickými procesy, často používané ve výzkumu a biotechnologiích.

Vysoce výkonný ultrazvuk! Hielscherův sortiment pokrývá celé spektrum od kompaktního laboratorního ultrasonicatoru přes bench-top jednotky až po plně průmyslové ultrazvukové systémy.

Hielscher Ultrasonics vyrábí vysoce výkonné ultrazvukové homogenizátory od Laboratoř na průmyslové velikosti.


Rádi probereme váš proces.

Pojďme se spojit.