Ultrazvuková fragmentace DNA pro sekvenování příští generace
Sekvenování nové generace (NGS) vyžaduje spolehlivé stříhání a fragmentaci genomické DNA, aby bylo možné sekvenci genomických pramenů DNA a vytvoření genomových knihoven. Řízená fragmentace DNA na fragmenty DNA je nezbytným krokem přípravy vzorku požadovaným před sekvencí DNA. Ultrazvuku je prokázána jako účinná a spolehlivá technika pro fragmentaci DNA určité délky. Ultrazvukové protokoly fragmentace DNA dosahují reprodukovatelná fragmentace výsledků. Hielscher ultrasonicators jsou schopni produkovat širokou škálu genomických distribucí velikosti fragmentů DNA, přesně kontrolovatelných pomocí provozních parametrů. Vzhledem k tomu, Hielscher ultrazvukové DNA stříhání systémy jsou k dispozici pro jednotlivé a více lahviček, stejně jako pro mikroplatby, příprava vzorku se stává vysoce efektivní.
Elektroforetická analýza genomové DNA E. coli EDL933 podrobené 0-15 min ultrazvuku. L označuje DNA Ladder. (Basselet et al., 2008)
- opakovatelné / reprodukovatelné výsledky
- přesně nastavitelné pro získání určité délky fragmentu
- rychlé zpracování
- konzistentní výsledky fragmentace DNA
- zařízení pro jakékoli objemy vzorků (např. více injekčních lahviček nebo mikroplatb)
- vysoká propustnost
- přesná regulace teploty
- jednoduchá, uživatelsky přívětivá obsluha
Sekvenování nové generace: Ultrazvuková fragmentace DNA pro přípravu knihovny
Pro provedení sekvenování nové generace musí být provedeny tři základní kroky (1) přípravy knihovny, (2) sekvenování a (3) analýzy dat. Během přípravy knihovny je DNA fragmentována, pak jsou konce fragmentů opraveny (leštěny) přidáním jedné adeninové základny a cílové fragmenty jsou převedeny na dvousoučtovou DNA. Nakonec jsou takzvané adaptéry připojeny ligací, PCR nebo tagmentací, takže konečný produkt DNA knihovny lze kvantifikovat pro sekvenování.
Fragmentace DNA pomocí ultrazvuku: Zvláště když technologie sekvenování krátkého čtení, jako je Illumina, která nemůže snadno číst delší fragmenty DNA, musí být stojany DNA fragmentovány na určitou velikost, které lze spolehlivě dosáhnout ultrazvukem.
Ultrazvuku lze spolehlivě použít pro fragmentaci DNA, RNA a chromatinu.
Jak funguje ultrazvuková fragmentace DNA?
Sonikace, známá také jako akustické zpracování vzorků, je široce používaná metoda fragmentace DNA. Pro ultrazvukové stříhání DNA jsou vzorky vystaveny ultrazvukovým vlnám pod kontrolovaným stavem. Pracovní princip ultrazvukové fragmentace DNA je založen na vibracích a kavitaci generované ultrazvukovými vlnami. Smykové síly, které jsou výsledkem ultrazvukové (akustické) kavitace, rozbijí molekuly DNA s vysokou molekulovou hmotností. Nastavení ultrazvuku, jako je intenzita (amplituda, doba trvání), režim pulzace a teplota, umožňuje přesnou fragmentaci DNA na určitou požadovanou délku fragmentů DNA. Zatímco DNA je často snížena na 100 až 600 bp pomocí ultrazvuku, delší fragmenty DNA až 1300 bp lze získat při použití mírnějších ultrazvukových podmínek.
Ultrazvukové stříhání DNA během ChIP – imunoprecipitace chromatinu
Upraveno z Jkwchui pod CC-BY-SA.03
Regulace teploty, aby se zabránilo degradaci DNA
Dvouslepý molekulární tvar DNA je vysoce citlivý na zvýšené teploty, takže přesná kontrola teploty během kroků přípravy vzorku je klíčovým faktorem pro spolehlivé výsledky analýzy.
Ať už používáte Hielscherovy sondové ultrasonicators, VialTweeter nebo UIP400MTP – nepřetržité monitorování a regulace teploty je zajištěno díky připojitelnému teplotnímu senzoru a softwaru inteligentního zařízení. Chcete-li udržet teplotu v určitém rozsahu, můžete nastavit horní a dolní teplotní limit. V důsledku toho se ultrasonicator zastaví, jakmile je tento teplotní limit překročen a automaticky bude pokračovat v sonikátu, když teplota klesla o ∆T.
Sofistikovaný software ultrasonicators Hielscher zajišťuje spolehlivou údržbu ideálních podmínek zpracování vzorků.
Fragmentace DNA hmotnostní vzorek s víceúčelovým ultrazvukem UIP400MTP
Počet vzorků v oblasti vědy o životě se za posledních deset let výrazně zvýšil. To znamená, že velmi vysoký počet vzorků (např. 384, 1536 nebo 3456 jamek na mikroplatu) musí být zpracován během přípravy a analýzy vzorku za trvale stejných podmínek, aby se dosáhlo srovnatelných a platných výsledků. S UIP400MTP, Hielscher Ultrazvuk sleduje trend hromadného zpracování vzorků. UIP400MTP je ultrasonicator pro přípravu vzorků pomocí mikroplatiček. UIP400MTP může zpracovávat desky s 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 nebo 3456 jamek. V závislosti na typu mikroplaty může každá studna obvykle pojmout objemy vzorku mezi desítkami nanolitrů až po několik mililitrů. UIP400MTP, široce používaný ve výzkumu přírodních věd, se velmi běžně používá pro přípravu vzorků před testy, jako je ELISA (enzym-vázáný imunosorbentní test) nebo PCR, před analýzou proteinů, stejně jako pro přípravu chromatinu před CHiP a CHiP-seq, identifikace modifikace hábitu a další analytické léčby (např. gelová elektroforéza, hmotnostní spektrometrie).
VialTweeter pro praparaci vzorků až 10 injekčních lahviček
VialTweeter je široce používaný laboratorní ultrasonicator VialTweeter, který umožňuje efektivní a pohodlné použití ultrazvuku až 10 lahviček současně. Vzhledem k tomu, že injekční lahvičky a zkumavky (např. Eppendorfovy lahvičky, kryo lahvičky, odstředivkové zkumavky) jsou sonikovány nepřímo, je zabráněno jakékoli křížové kontaminaci. Vzhledem k tomu, že do každého vzorku je dodávána stejná ultrazvuková intenzita, jsou všechny výsledky ultrazvuku homogenní a reprodukovatelné. VialTweeter nabízí všechny chytré funkce, jako jsou naše další digitální zařízení (např. chytré menu, programovatelné nastavení, regulace teploty, dálkové ovládání atd.), aby byl zajištěn nejvyšší uživatelský komfort.
Sondy s více prsty pro mikrowellové desky
K dispozici pro ultrazvukové sondy homogenizátory UP200Ht a UP200St, vícepísmenné sondy se 4 nebo 8 prsty jsou pohodlnou volbou pro sonikaci více vzorků současně za stejných podmínek. Například sonotroda MTP-24-8-96 je osmikožcová sonda, která je ideální pro integraci do automatizovaných systémů nebo efektivní ruční přípravu vzorků jamek z víceúčelových desek. Sonotroda s více prsty je ideální pro automatizované pro laboratoře, kde se většinou zpracovávají kádinky a zkumavky pomocí standardní ultrazvukové sonotrody. Více prstů a standardní sondy mohou být rychle inter-změněny během několika minut přeměnit ultrazvukový systém jedné sondy na ultrazvukový disruptor s více sondami.
Hielscher ultrasonicators pro fragmentaci DNA
Hielscher Ultrasonics nabízí různé ultrazvukové platformy pro FRAGMENTACI DNA, RNA a chromatinu. Tyto různé platformy zahrnují ultrazvukové sondy (sonotrody), nepřímé sonikační roztoky pro současnou přípravu vzorku více trubek nebo víceúčelových desek (např. desky 96-well, mikrotitrační desky), sonoreaktory a ultrazvukové cuphorny. Všechny platformy pro stříhání DNA jsou poháněny frekvenčními, vysoce výkonnými ultrazvukovými procesory, které jsou přesně kontrolovatelné a poskytují reprodukovatelné výsledky.
Ultrazvukové procesory pro jakékoli číslo vzorku a velikost
S Hielscherovými ultrasonicators VialTweeter (až pro 10 zkumav) a UIP400MTP (pro mikroplaty / vícevětší desky) je snadné zkrátit dobu zpracování vzorku díky intenzivní a přesně kontrolovatelné ultrazvuku a zároveň získat požadovanou distribuci a výtěžnost fragmentu DNA. Díky ultrazvukové fragmentaci DNA je příprava vzorku účinná, spolehlivá a škálovatelná. Protokoly mohou být lineárně škálovány z jednoho na mnoho vzorků pomocí neustále kontrolovaného ultrazvuku.
Sondové ultrasonicators s jedním až pěti prsty jsou ideální pro přípravu menších čísel vzorků. Hielscherovy laboratorní ultrasonicators jsou k dispozici v různých velikostech, takže vám můžeme doporučit ideální zařízení pro vaši aplikaci a požadavky.
přesné řízení procesu
Přesné kontrolovatelné nastavení ultrazvuku je rozhodující, protože vyčerpávající sonifikace může zničit DNA, RNA a chromatin, ale nedostatečné ultrazvukové stříhání vede k příliš dlouhým fragmentům DNA a chromatinu. Hielscherovy digitální ultrasonicators lze snadno nastavit na přesný parametr ultrazvuku. Specifická nastavení ultrazvuku lze také uložit jako naprogramované nastavení pro rychlé opakování stejného postupu.
Veškerá použití ultrazvuku jsou automaticky protokolována a uložena jako soubor CSV na vestavěné SD kartě. To umožňuje přesnou dokumentaci provedených zkoušek a umožňuje snadno revidovat zvukové běhy.
Prostřednictvím dálkového ovládání prohlížeče lze všechny digitální ultrasonicators ovládat a monitorovat prostřednictvím jakéhokoli standardního prohlížeče. Instalace dalšího softwaru není nutná, protože připojení LAN umožňuje velmi jednoduché nastavení plug-n-play.
Nejvyšší uživatelská přívětivost v ultrazvukové přípravě vzorků
Všechny Hielscher ultrasonicators jsou navrženy tak, aby poskytovaly vysoce výkonný ultrazvuk, a zároveň jsou vždy velmi uživatelsky přívětivé a snadno ovlyžovat. Všechna nastavení jsou dobře strukturovaná v jasné nabídce, ke které lze snadno přistupovat pomocí barevného dotykového displeje nebo dálkového ovládání prohlížeče. Chytrý software s programovatelným nastavením a automatickým záznamem dat zajišťuje optimální nastavení ultrazvuku pro spolehlivé a reprodukovatelné výsledky. Čisté a snadno ovladatelné rozhraní nabídky mění ultrasonicators Hielscher na uživatelsky přívětivá a účinná zařízení.
Níže uvedená tabulka vám dává indikaci přibližné zpracovatelské kapacity našich laboratorních ultrasonicators, které jsou ideální pro úkoly přípravy vzorků, jako je fragmentace DNA a RNA, buněčná lýza a extrakce bílkovin:
| přístroj | Výkon [W] | Typ | Objem [ml] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP | 400 | pro mikroplatby | 6 – 3456 jamek | VialTweeter | 200 | pro až 10 injekčních lahviček plus možnost upnutí | 00,5 – 1,5 |
| UP50H | 50 | Sondy typu | 0.01 – 250 |
| UP100H | 100 | Sondy typu | 0.01 – 500 |
| Uf200 ः t | 200 | Sondy typu | 00,1 – 1000 |
| UP200St | 200 | Sondy typu | 00,1 – 1000 |
| UP400St | 400 | Sondy typu | 5,0 – 2000 |
| CupHorn | 200 | CupHorn, sonoreherec | 10 – 200 |
| GDmini2 | 200 | bez kontaminace toku buněk |
Kontaktujte nás! / Zeptej se nás!
Ultrazvuková jednotka pro přípravu více vzorků VialTweeter umožňuje současnou použití ultrazvuku až 10 lahviček. S upnutým zařízením VialPress lze pro intenzivní použití ultrazvuku přitlačit až 4 další trubky dopředu.
Sonotroda MTP-24-8-96 má osm ultrazvukových sond pro použití ultrazvuku jamek mikrotitračních desek.
Literatura / Reference
- Poptsova, M., Il’icheva, I., Nechipurenko, D. et al. (2014): Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing. Scientific Reports 4, 4532; 2014.
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample processing for DNA chip array-based analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts the Resistance to Doxorubicin in Human Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Characterization of the growth behavior of Leishmania tarentolae – a new expression system for recombinant proteins. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-wide tracking of unmethylated DNA Alu repeats in normal and cancer cells. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Protein Hint1 Triggers Apoptosis Independent of Its Enzymatic Activity. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.
Fakta Worth Knowing
Co je sekvenování nové generace?
Sekvenování nové generace, také Next Gen Sequencing (NGS), sekvenování s vysokou propustností nebo sekvenování druhé generace, odkazuje na přístup masivního paralelního sekvenování, kde je současně paralelně sekvenováno velmi velké (masivní) množství DNA milionů fragmentů.
Pro provedení sekvenování nové generace musí být provedeny tři základní kroky (1) přípravy knihovny, (2) sekvenování a (3) analýzy dat. Během přípravy knihovny musí být vlákna DNA fragmentována na fragmenty DNA určité délky. Sonikace je jednou z preferovaných technik pro fragmentaci DNA.
Během procesu sekvenování DNA se pořadí nukleotidů v DNA – jako sekvence nukleové kyseliny – je stanovena. Sekvence nukleové kyseliny se skládá ze čtyř nukleotidových bází – adeninu, cytosinu, guaninu,thyminu – který kód pro informaci.
Sekvenování nové generace je hnací silou výzkumu v oblasti vědy o životě a personalizované medicíny, protože sekvenování DNA a RNA se silně používá v genomickém výzkumu, výzkumu rakoviny, výzkumu vzácných a komplexních onemocnění, mikrobiálním výzkumu, agrigenomice a mnoha dalších výzkumných oblastech.
Sekvenování nové generace vs. sekvenování Sanger
Zatímco s sekvenováním nové generace (NGS) je možné sekvenovat masivní počet genomických vzorků, Sanger Sequencing (také známý jako metoda ukončení řetězce nebo sekvenování první generace) má pouze schopnost sekvenční malá čísla vzorků. Sanger sekvenování pouze sekvence jeden fragment DNA najednou a může být provedeno v jednom dni. Vzhledem ke své akruaci je sekvenování Sanger také považováno za technologii zlatého standardu, která se používá k ověření výsledků získaných sekvenováním nové generace.
Sanger sekvenování dosahuje délky čtení přibližně 800bp (obvykle 500-600bp s neobohacenou DNA). Delší délky čtení v sangerském sekvenování mají významné výhody oproti jiným metodám sekvenování, zejména pokud jde o sekvenování opakujících se oblastí genomu. Výzva dat sekvence krátkého čtení je obzvláště problémem při sekvenování nových genomů (de novo) a při sekvenování vysoce přeskupených genomových segmentů, obvykle těch, které jsou vidět u genomů rakoviny nebo v oblastech chromozomů, které vykazují strukturální odchylky. [cp. Morozova a Marra, 2008]
Hielscher Ultrasonics vyrábí vysoce výkonné ultrazvukové homogenizátory od Laboratoř na průmyslové velikosti.