Ultrazvuková fragmentace DNA pro sekvenování nové generace
Sekvenování nové generace (NGS) vyžaduje spolehlivé stříhání a fragmentaci genomové DNA, aby bylo možné sekvenovat řetězce genomové DNA a vytvářet genomové knihovny. Řízená fragmentace DNA na fragmenty DNA je základním krokem přípravy vzorku, který je nutný před sekvenováním DNA. Ultrazvuku se osvědčila jako účinná a spolehlivá technika pro fragmentaci DNA určité délky. Ultrazvukové protokoly fragmentace DNA dosahují reprodukovatelných výsledků fragmentace. Hielscher ultrasonicators jsou schopni produkovat širokou škálu distribucí velikosti fragmentů genomu, přesně ovladatelné prostřednictvím provozních parametrů. Vzhledem k tomu, že ultrazvukové systémy stříhání DNA Hielscher jsou k dispozici pro jednu a více lahviček, stejně jako pro mikrodestičky, příprava vzorků se stává vysoce efektivní.
Sonikátor UIP400MTP desky pro přípravu vzorků s vysokou propustností rovnoměrně sonikuje vzorky ve vícejamkových destičkách, mikrotitračních destičkách a 96jamkových destičkách
- Opakovatelné? reprodukovatelné výsledky
- Přesně nastavitelné pro získání určité délky fragmentu
- Rychlé zpracování
- konzistentní výsledky fragmentace DNA
- zařízení pro libovolné objemy vzorků (např. více lahviček nebo mikrodestiček)
- Vysoká propustnost
- Přesná regulace teploty
- Jednoduchá, uživatelsky přívětivá obsluha
Next-Gen sekvenování: Ultrazvuková fragmentace DNA pro přípravu knihoven
Aby bylo možné provést sekvenování nové generace, musí být provedeny tři základní kroky: (1) příprava knihovny, (2) sekvenování a (3) analýza dat. Během přípravy knihovny je DNA fragmentována, poté jsou konce fragmentů opraveny (vyleštěny) přidáním jedné adeninové báze a cílové fragmenty jsou převedeny na dvouřetězcovou DNA. Nakonec se pomocí ligace, PCR nebo tagmentace připojí takzvané adaptéry, aby bylo možné kvantifikovat konečný produkt DNA knihovny pro sekvenování.
Fragmentace DNA pomocí sonikace: Zvláště při sekvenování s krátkým čtením, jako je Illumina, které nemohou snadno číst delší fragmenty DNA, musí být stojany DNA fragmentovány na určitou velikost, které lze spolehlivě dosáhnout ultrazvukem.
Ultrazvuku lze spolehlivě použít pro fragmentaci DNA, RNA a chromatinu.
Sekvenování nové generace – Příprava knihovny
Ultrazvuková fragmentace DNA se běžně používá při přípravě knihoven pro sekvenování DNA pro platformy sekvenování nové generace (NGS). Tato technika se používá k rozbití molekul DNA na menší fragmenty požadovaného rozsahu velikostí, což usnadňuje následné kroky při přípravě knihovny. Ultrazvuková fragmentace DNA je obvykle vyžadována během kroku přípravy knihovny pracovních postupů NGS k fragmentaci genomové DNA na menší kousky vhodné pro následné zpracování a sekvenování. Hraje klíčovou roli při zajišťování úspěchu sekvenačního experimentu tím, že generuje fragmenty DNA v rozsahu velikostí vhodných pro konkrétní používanou sekvenační platformu.
Elektroforetické analýzy genomové DNA E. coli EDL933 podrobeny ultrazvuku 0 – 15 minut. L označuje žebřík DNA. (Basselet et al. 2008)
Sekvenování nové generace – Kroky procesu:
- Ultrazvuková fragmentace DNA: Před vytvořením knihovny je genomová DNA roztříštěna na menší, lépe zvládnutelné kousky. Ultrazvuková fragmentace zahrnuje použití vysokofrekvenčních zvukových vln ke střihu molekul DNA na fragmenty požadovaného rozsahu velikostí. Tento krok je zásadní, protože pomáhá zajistit, že sekvenční čtení vygenerovaná později budou mít vhodnou délku pro používanou sekvenační platformu. Rozsah velikostí fragmentů může být upraven na základě specifických požadavků sekvenačního experimentu.
- Klonální amplifikace pomocí PCR: Po ultrazvukové fragmentaci procházejí fragmenty DNA konečnou opravou, ligací adaptéru a amplifikací PCR, aby se vytvořily konečné knihovny sekvenování DNA. Tyto kroky připravují fragmentované molekuly DNA pro proces sekvenování přidáním sekvenčních adaptérů nezbytných pro vazbu na sekvenační platformu a poskytnutím primingových míst pro amplifikaci PCR.
- Sekvenování DNA syntézou: Jakmile jsou sekvenační knihovny připraveny, začíná proces sekvenování DNA syntézou (SBS). Během SBS je sekvence DNA určena postupným přidáváním nukleotidů do komplementárního řetězce. Tento krok zahrnuje cyklické reakce začleňování, zobrazování a štěpení nukleotidů, což umožňuje stanovení sekvence DNA na základě fluorescenčních signálů emitovaných inkorporovanými nukleotidy.
- Masivně paralelní sekvenování: V závěrečném kroku jsou prostorově oddělené, amplifikované templáty DNA sekvenovány současně masivně paralelním způsobem. Tento přístup k vysoce výkonnému sekvenování umožňuje generování milionů až miliard sekvenačních čtení v jediném sekvenování, což umožňuje efektivní a rychlé stanovení sekvencí DNA.
Jak funguje ultrazvuková fragmentace DNA?
Sonikace, známá také jako akustické zpracování vzorků, je široce používanou metodou fragmentace DNA. Při ultrazvukovém stříhání DNA jsou vzorky vystaveny ultrazvukovým vlnám za kontrolovaných podmínek. Princip fungování ultrazvukové fragmentace DNA je založen na vibracích a kavitaci generovaných ultrazvukovými vlnami. Smykové síly, které jsou výsledkem ultrazvukové (akustické) kavitace, rozbíjejí molekuly DNA s vysokou molekulovou hmotností. Nastavení sonikace, jako je intenzita (amplituda, trvání), režim pulzace a teplota, umožňuje přesnou fragmentaci DNA na určitou požadovanou délku fragmentů DNA. Zatímco DNA je často redukována na 100 až 600 bp pomocí ultrazvuku, delší fragmenty DNA až do 1300 bp mohou být získány, když jsou aplikovány mírnější ultrazvukové podmínky.
Ultrazvukové stříhání DNA během ChIP – imunoprecipitace chromatinu
Regulace teploty, aby se zabránilo degradaci DNA
Dvouřetězcový molekulární tvar DNA je vysoce citlivý na zvýšené teploty, takže přesná kontrola teploty během přípravných kroků vzorku je rozhodujícím faktorem pro spolehlivé výsledky analýzy.
Ať už používáte Hielscherovy sondy ultrasonicators, VialTweeter nebo UIP400MTP – Nepřetržité monitorování a řízení teploty je zajištěno díky zásuvnému teplotnímu čidlu a softwaru chytrého zařízení. Abyste udrželi teplotu v určitém rozmezí, můžete nastavit horní a dolní teplotní limit. V důsledku toho se ultrasonicator pozastaví, jakmile je tento teplotní limit překročen, a automaticky bude pokračovat v sonikaci, když se teplota sníží o nastavenou ∆T.
Sofistikovaný software Hielscher ultrasonicators zajišťuje spolehlivou údržbu ideálních podmínek zpracování vzorku.
Fragmentace hromadného vzorku DNA pomocí UIP400MTP Multi-Well Plate Ultrasonikator
Počet vzorků v biologických vědách se v posledním desetiletí výrazně zvýšil. To znamená, že velmi vysoký počet vzorků (např. 384, 1536 nebo 3456 jamek na mikrodestičku) musí být zpracován během přípravy a analýzy vzorků za konzistentně stejných podmínek, aby bylo možné získat srovnatelné a platné výsledky. S UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics sleduje trend hromadného zpracování vzorků. UIP400MTP je ultrazvukový přístroj pro přípravu vzorků pomocí mikrodestiček. UIP400MTP může zpracovávat desky se 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 nebo 3456 jamkami. V závislosti na typu mikrodestiček může každá jamka obvykle pojmout objem vzorku mezi desítkami nanolitrů až několika mililitry. Široce se používá ve výzkumu biologických věd a velmi běžně se používá pro přípravu vzorků před testy UIP400MTP, jako je ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) nebo PCR, před analýzou proteinů, stejně jako pro přípravu chromatinu před CHiP a CHiP-seq, identifikaci modifikace histonů a další analytické úpravy (např. gelová elektroforéza, hmotnostní spektrometrie).
Přečtěte si více o vysoce výkonném zpracování PCR destiček!
VialTweeter pro přípravu vzorku až z 10 lahviček
VialTweeter je široce používaný laboratorní ultrasonikator VialTweeter, který umožňuje efektivní a pohodlné sonikaci až 10 lahviček současně. Vzhledem k tomu, že lahvičky a zkumavky (např. lahvičky Eppendorf, kryo lahvičky, centrifugační zkumavky) jsou sonikovány nepřímo, je zabráněno jakékoli křížové kontaminaci. Vzhledem k tomu, že do každého vzorku je dodávána stejná intenzita ultrazvuku, jsou všechny výsledky sonikace homogenní a reprodukovatelné. VialTweeter nabízí všechny chytré funkce jako naše ostatní digitální zařízení (např. chytré menu, programovatelná nastavení, ovládání teploty, dálkové ovládání atd.), takže je zajištěn nejvyšší uživatelský komfort.
Víceprsté sondy pro mikrotitrační destičky
K dispozici pro homogenizátory ultrazvukové sondy UP200Ht a UP200St, sondy s více prsty se 4 nebo 8 prsty jsou pohodlnou možností sonikace více vzorků současně za stejných podmínek. Například sonotroda MTP-24-8-96 je sonda s osmi prsty, která je ideální pro integraci do automatizovaných systémů nebo pro efektivní ruční přípravu vzorků jamek s více jamkami. Víceprstá sonotroda je ideální pro automatizaci pro laboratoře, kde se zpracovávají převážně kádinky a zkumavky pomocí standardní ultrazvukové sonotrody. Víceprsté a standardní sondy lze rychle vyměnit během několika minut, čímž se ultrasonikátor s jednou sondou promění v ultrazvukový disruptor s více sondami.
Hielscher Ultrasonicators pro fragmentaci DNA
Hielscher Ultrasonics nabízí různé platformy založené na ultrazvuku pro fragmentaci DNA, RNA a chromatinu. Tyto různé platformy zahrnují ultrazvukové sondy (sonotrody), nepřímá sonikační řešení pro současnou přípravu vzorků více zkumavek nebo vícejamkových destiček (např. 96jamkové destičky, mikrotitrační desky), sonoreaktory a ultrazvukové cuphorny. Všechny platformy pro stříhání DNA jsou poháněny frekvenčně laděnými, vysoce výkonnými ultrazvukovými procesory, které jsou přesně ovladatelné a poskytují reprodukovatelné výsledky.
Ultrazvukové procesory pro libovolný počet a velikost vzorku
S Hielscherovými vícevzorkovými ultrasonicators VialTweeter (až pro 10 zkumavek) a UIP400MTP (pro mikrodestičky / vícejamkové destičky) je snadno možné zkrátit dobu zpracování vzorku díky intenzivní a přesně kontrolovatelné ultrazvuku při získávání požadované distribuce velikosti fragmentu DNA a výtěžku. Díky ultrazvukové fragmentaci DNA je příprava vzorku účinná, spolehlivá a škálovatelná. Protokoly lze lineárně škálovat od jednoho až po mnoho vzorků použitím neustále řízeného ultrazvuku.
Sondy ultrasonicators s jedním až pěti prsty jsou ideální pro přípravu menších čísel vzorků. Hielscherovy laboratorní ultrasonicators jsou k dispozici v různých velikostech, takže vám můžeme doporučit ideální zařízení pro vaši aplikaci a požadavky.
Přesné řízení procesu
Přesně kontrolovatelné nastavení sonikace je zásadní, protože vyčerpávající sonifikace může zničit DNA, RNA a chromatin, ale nedostatečné ultrazvukové stříhání má za následek příliš dlouhé fragmenty DNA a chromatinu. Hielscherovy digitální ultrasonicators lze snadno nastavit na přesný parametr sonikace. Specifická nastavení sonikace lze také uložit jako naprogramované nastavení pro rychlé opakování stejného postupu.
Všechny sonikace jsou automaticky protokolovány a ukládány jako soubor CSV na vestavěnou SD kartu. To umožňuje přesnou dokumentaci provedených studií a umožňuje snadno revidovat běhy ultrazvuku.
Prostřednictvím dálkového ovládání prohlížeče lze všechny digitální ultrasonicators ovládat a monitorovat prostřednictvím libovolného standardního prohlížeče. Instalace dalšího softwaru není nutná, protože připojení k síti LAN umožňuje velmi jednoduché nastavení plug-n-play.
Nejvyšší uživatelská přívětivost při přípravě vzorků ultrazvukem
Všechny Hielscher ultrasonicators jsou navrženy tak, aby poskytovaly vysoce výkonný ultrazvuk, přičemž jsou zároveň vždy velmi uživatelsky přívětivé a snadno ovladatelné. Všechna nastavení jsou přehledně uspořádána v přehledném menu, ke kterému lze snadno přistupovat pomocí barevného dotykového displeje nebo dálkového ovladače prohlížeče. Inteligentní software s programovatelným nastavením a automatickým záznamem dat zajišťuje optimální nastavení ultrazvuku pro spolehlivé a reprodukovatelné výsledky. Čisté a snadno použitelné rozhraní nabídky promění Hielscher ultrasonicators v uživatelsky přívětivá a efektivní zařízení.
Níže uvedená tabulka vám poskytuje přibližný přehled o zpracovatelské kapacitě našich laboratorních ultrasonicators, které jsou ideální pro úkoly přípravy vzorků, jako je fragmentace DNA a RNA, lýza buněk a extrakce proteinů:
| Zařízení | Výkon [W] | Typ | Objem [ml] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP | 400 | pro mikrodestičky | 6 – 3456 studní | VialTweeter | 200 | až pro 10 lahviček s možností upnutí | 0.5 – 1.5 |
| UP50H | 50 | typ sondy | 0.01 – 250 |
| UP100H | 100 | typ sondy | 0.01 – 500 |
| UP200Ht | 200 | typ sondy | 0.1 – 1000 |
| UP200St | 200 | typ sondy | 0.1 – 1000 |
| UP400St | 400 | typ sondy | 5.0 – 2000 |
| Roh Poháru | 200 | CupHorn, sonoreaktor | 10 – 200 |
| GDmini2 řekl: | 200 | Průtočná cela bez kontaminace |
Kontaktujte nás!? Zeptejte se nás!
Ultrazvuková jednotka pro přípravu více vzorků VialTweeter Umožňuje současnou sonikaci až 10 lahviček. S upínacím zařízením VialPress lze dopředu přitlačit až 4 další zkumavky pro intenzivní sonikaci.
Sonotroda MTP-24-8-96 má osm ultrazvukových sond pro sonikaci jamek mikrotitračních destiček.
Literatura? Reference
- Qiyun Liang, Christoph Ratzke (2025): Lysing diverse bacteria with the Hielscher UIP400MTP for DNA sequencing. Protocol Uni Tübingen 2025.
- Poptsova, M., Il’icheva, I., Nechipurenko, D. et al. (2014): Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing. Scientific Reports 4, 4532; 2014.
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample processing for DNA chip array-based analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts the Resistance to Doxorubicin in Human Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Characterization of the growth behavior of Leishmania tarentolae – a new expression system for recombinant proteins. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-wide tracking of unmethylated DNA Alu repeats in normal and cancer cells. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Protein Hint1 Triggers Apoptosis Independent of Its Enzymatic Activity. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.
Fakta, která stojí za to vědět
Co je sekvenování nové generace?
Sekvenování nové generace, také sekvenování nové generace (NGS), sekvenování s vysokou propustností nebo sekvenování druhé generace, označuje přístup masivního paralelního sekvenování, kdy je paralelně sekvenováno velmi velké (masivní) množství DNA o milionech fragmentů současně v jednom cyklu.
Aby bylo možné provést sekvenování nové generace, je třeba provést tři základní kroky
- příprava knihovny,
- sekvenování a
- Analýza dat
jsou vyžadovány.
Během přípravy knihovny musí být řetězce DNA fragmentovány na fragmenty DNA určité délky. Sonikace je jednou z preferovaných technik fragmentace DNA.
Během procesu sekvenování DNA se pořadí nukleotidů v DNA – známá jako sekvence nukleové kyseliny – je stanovena. Sekvence nukleové kyseliny se skládá ze čtyř nukleotidových bází – adeninu, cytosinu, guaninu, thyminu – který kód pro informace.
Sekvenování nové generace je hnací silou výzkumu v oblasti biologických věd a personalizované medicíny, protože sekvenování DNA a RNA se intenzivně používá v genomickém výzkumu, výzkumu rakoviny, výzkumu vzácných a komplexních onemocnění, mikrobiálním výzkumu, agrogenomice a mnoha dalších oblastech výzkumu.
Sekvenování nové generace vs Sangerovo sekvenování
Zatímco u sekvenování nové generace (NGS) je možné sekvenovat obrovské množství genomických vzorků, Sangerovo sekvenování (známé také jako metoda ukončení řetězce nebo sekvenování první generace) má schopnost sekvenovat pouze malý počet vzorků. Sangerovo sekvenování sekvenuje pouze jeden fragment DNA najednou a lze jej provést za jediný den. Díky své přesnosti je Sangerovo sekvenování také považováno za zlatý standard technologie, která se používá k ověřování výsledků získaných sekvenováním nové generace.
Sangerovo sekvenování dosahuje délky čtení přibližně 800 bp (typicky 500-600 bp s neobohacenou DNA). Delší délka čtení v Sangerově sekvenování vykazuje významné výhody oproti jiným metodám sekvenování, zejména pokud jde o sekvenování opakujících se oblastí genomu. Problém s krátkými sekvenčními daty je problém zejména při sekvenování nových genomů (de novo) a při sekvenování vysoce přeskupených segmentů genomu, typicky těch, které se vyskytují u genomů rakoviny nebo v oblastech chromozomů, které vykazují strukturální variabilitu. [srov. Morozová a Marra, 2008]
DNA – Deoxyribonukleová kyselina – Jeho formy a funkce
Každá forma DNA má jedinečné vlastnosti a aplikace, které přispívají k širokému spektru oblastí výzkumu, včetně onkologie, genetiky, forenzních věd a evoluční biologie. Hielscher sonikátory jsou vysoce účinné a spolehlivé řešení pro izolaci a fragmentaci DNA a RNA pro účely analýzy. V níže uvedeném seznamu vám vysvětlíme konkrétní formy DNA a kategorizujeme je na základě jejich biologického kontextu a funkcí:
- Genomová DNA (gDNA)
Genomová DNA (gDNA): Kompletní sada DNA v organismu, včetně kódujících (genů) i nekódujících oblastí. - Extracelulární DNA
Cirkulující nádorová DNA (ctDNA): Fragmenty DNA uvolňované dělat krevního oběhu nádorovými buňkami.
Volná buněčná DNA (cfDNA): Fragmenty DNA, které volně cirkulují v krevním řečišti a pocházejí z různých tkání. - Extrachromozomální cirkulární DNA (eccDNA): Kruhové molekuly DNA nacházející se mimo chromozomy v eukaryotických buňkách.
Virová DNA: DNA pocházející z virů, buď integrovaná do hostitelského genomu, nebo jako episomální DNA. - mitochondriální DNA
Mitochondriální DNA (mtDNA): DNA se nachází v mitochondriích, dědí se po matce a podílí se na výrobě energie. - plazmidová DNA
Plazmidová DNA: Malé, kruhové molekuly DNA, které se replikují nezávisle na chromozomální DNA, běžně se vyskytují v bakteriích a používají se v genetickém inženýrství. - jaderná DNA
Jaderná DNA (nDNA): DNA obsažená v jádře eukaryotických buněk, která tvoří většinu genetického materiálu v organismu. - Jednobuněčná DNA
Jednobuněčná DNA (scDNA): DNA extrahovaná z jediné buňky, používaná pro podrobnou genomickou analýzu na úrovni jednotlivých buněk. - Rekombinantní DNA
Rekombinantní DNA (rDNA): Molekuly DNA vytvořené laboratorními metodami genetické rekombinace, které spojují genetický materiál z více zdrojů. - Specializované formuláře
Environmentální DNA (eDNA): DNA odebraná ze vzorků životního prostředí (půda, voda) bez izolace zdrojových organismů
Starověká DNA (aDNA): DNA extrahovaná ze starověkých vzorků, která poskytuje vhled do evoluční biologie a starověkých populací. - Chromozomální DNA
Chromozomální DNA: DNA, která tvoří chromozomy v buněčném jádře a zahrnuje kódující i nekódující oblasti. - Virové a syntetické formy
Virová DNA: DNA odvozená z virů, které mohou být buď integrovány do hostitelských genomů, nebo mohou existovat jako nezávislé entity.
Syntetická DNA: Uměle syntetizované sekvence DNA vytvořené chemickými procesy, často používané ve výzkumu a biotechnologiích.
Hielscher Ultrasonics vyrábí vysoce výkonné ultrazvukové homogenizátory od laboratoř k průmyslová velikost.