Ultrazvuková lyze E. coli

Bakterie E. coli jsou nejčastěji používanými bakteriemi v mikrobiologii a biotechnologii.
Ultrazvukové dezintegrátory buněk poskytují spolehlivé a reprodukovatelné výsledky při lyzi E. coli.
Intenzivní, a přesto přesně regulovatelná kavitace a smykové síly vedou k úplné dezintegraci a vysokým výtěžkům extrakce (např. proteinů, DNA).

Proč je ultrazvuková dezintegrace buněk E. coli preferovanou metodou?

Ultrazvukové homogenizátory nebo sondové ultrazvukové přístroje nabízejí pro lyzi E. coli řadu výhod, protože intenzivní ultrazvuk účinně narušuje buněčné stěny a membrány. Sondové ultrazvukové přístroje se k lyzi E. coli široce používají z následujících důvodů:

Účinné narušení buněčných stěn: E. coli má polotuhou buněčnou stěnu tvořenou peptidoglykanem, kterou může být obtížné rozrušit tradičními metodami lyze. Sondový ultrazvukový přístroj generuje intenzivní ultrazvukové vlny, které v kapalině obklopující buňky vytvářejí kavitační bubliny. Když tyto bubliny kolabují, vznikají vysokorychlostní proudy kapaliny a rázové vlny, které vedou k mechanickému narušení buněčných stěn a účinně uvolňují buněčný obsah, jako jsou biomolekuly.

Lepší pronikání: Ultrazvukové vlny generované sondou / sonotrodou mohou proniknout hluboko do vzorku, zasáhnout větší počet buněk E. coli a ošetřit je rovnoměrně. To pomáhá zajistit rovnoměrnější lyzi v celém vzorku, což vede k vyšší účinnosti dezintegrace buněk.

Kratší doba zpracování: Energie dodávaná sondovým ultrazvukovým přístrojem je vysoce koncentrovaná a lokalizovaná, což vede k rychlé a účinné lyzi buněk. Ve srovnání s jinými metodami, jako je rozbíjení kuličkami (bead beating) nebo enzymatická lyze, dokáže sonikace dosáhnout lyze E. coli během několika minut či dokonce sekund. Zatímco mnoho alternativních technik, jako je zmrazování a rozmrazování, vyžaduje několik cyklů ošetření, ultrazvuková lyze otevírá buňky v jediném procesním kroku.

Regulace teploty: Nejmodernější ultrazvukové přístroje jsou vybaveny teplotními senzory a inteligentním softwarem, který umožňuje nastavit maximální procesní teplotu. Ultrazvukový přístroj se po dosažení teplotního limitu automaticky pozastaví a spustí proces sonikace, jakmile je dosaženo nastaveného teplotního bodu. Chlazení vzorků v ledové lázni je jednoduchá metoda, jak udržet nízkou teplotu vzorku a zabránit jeho degradaci vlivem tepla.

Škálovatelnost: Sondové ultrazvukové přístroje jsou k dispozici v různých velikostech, od ručních zařízení až po velké průmyslové modely. Díky tomu jsou vhodné pro zpracování malých objemů v laboratoři i pro převod do většího měřítka v rozsáhlejších bioprocesních aplikacích, např. při výrobě vakcín nebo biosyntéze molekul.

Všestrannost: Ultrazvukové přístroje lze kromě lyze buněk využít v různých dalších aplikacích, jako je stříhání DNA, extrakce proteinů, homogenizace tkání, disperze nanočástic a emulgace. Investice do sondového ultrazvukového přístroje proto přináší všestrannost ve výzkumném i průmyslovém prostředí.

Sondové ultrazvukové přístroje, jako je UP200St, jsou spolehlivé tkáňové homogenizátory a dezintegrátory buněk, a proto se široce používají k přípravě vzorků v genetice, např. k lyzi E.coli

Extrakce proteinů z buněk E.coli se účinně provádí pomocí ultrazvukové sondy UP200St

Sondový ultrazvukový přístroj nabízí pro lyzi E. coli mnoho výhod. Spolehlivá a přesná regulace parametrů ultrazvukového procesu umožňuje optimalizovat provozní parametry, jako je výkon, doba trvání a manipulace se vzorkem, a dosáhnout tak požadovaných výsledků.

Tento návod vysvětluje, jaký typ sonikátoru je nejvhodnější pro přípravu vzorků, například pro lýzu, rozrušování buněk, izolaci proteinů a fragmentaci DNA a RNA v laboratořích, analytice a výzkumu. Vyberte si ideální typ sonikátoru podle své aplikace, objemu a počtu vzorků a požadované průchodnosti. Hielscher Ultrasonics pro vás má ideální ultrazvukový homogenizátor!

Ultrazvuková fragmentace DNA se často používá jako krok přípravy vzorků při sekvenování nové generace (NGS)

Elektroforetické analýzy genomové DNA E. coli EDL933 vystavené ultrazvukovému ošetření po dobu 0 – 15 min. L označuje DNA žebříček (DNA Ladder).
(studie a obrázek: ©Basselet et al. 2008)

Dezintegrace buněk pomocí ultrazvukové kavitace

Sondové ultrazvukové homogenizátory pracují s přibližně 20 000 cykly za sekundu (při 20kHz) a vyvolávají kavitaci v kapalinách nebo suspenzích. Akustická kavitace vytváří mikroskopické oblasti s tlaky blízkými vakuu a vysokými teplotami, které trhají buňky. Přestože teploty mohou dosáhnout několika tisíc stupňů Celsia, kavitační objemy jsou tak malé, že proces významně nezahřívají. Akustická kavitace a smykové síly generované ultrazvukem perforují nebo rozrušují buněčnou membránu bakteriálních buněk, jako je E.coli. Ultrazvukové přístroje Hielscher umožňují přesnou regulaci procesních parametrů, jako je intenzita ultrazvuku, amplituda, přívod energie a teplota. Proces ultrazvukové lyze tak lze optimálně přizpůsobit typu buněk, buněčné kultuře a cíli procesu.

Výhody ultrazvukové lyze

přesná regulace lyze (intenzita, amplituda, teplota)
spolehlivé, reprodukovatelné výsledky
optimální přizpůsobení konkrétním vzorkům
regulace teploty
pro velmi malé až velmi velké vzorky (µL až litry)
čistě mechanické ošetření
uživatelsky přívětivý, bezpečný provoz
lineární převod z laboratoře do výroby

Ultrazvukové zařízení VialTweeter umožňuje současnou přípravu vzorků až v 10 vialkách za stejných procesních podmínek. (Klikněte pro zvětšení!)

VialTweeter pro ultrazvukovou lyzi

Ultrazvukový homogenizátor vs. jiné techniky lyze

Zatímco chemická a enzymatická lyze mohou být problematické – protože chemická lyze může měnit strukturu proteinů a způsobovat problémy při purifikaci a enzymatická lyze vyžaduje dlouhé inkubační doby a není reprodukovatelná –, ultrazvuková dezintegrace je sofistikovaná a rychlá metoda dezintegrace buněk.
Ultrazvuková lyze je založena výhradně na mechanických silách. Nepřidávají se žádné chemikálie, sonikace rozrušuje buněčnou stěnu smykovými silami. Chemická lyze může měnit strukturu proteinů a způsobovat problémy při purifikaci. Enzymatická dezintegrace vyžaduje dlouhé inkubační doby a není reprodukovatelná. Ultrazvuková dezintegrace bakteriálních buněk E.coli je rychlá, jednoduchá, spolehlivá a reprodukovatelná. Proto se ultrazvukové přístroje Hielscher používají v biologických a biochemických laboratořích po celém světě pro přípravu vzorků, preanalytiku, diagnostiku in vitro a nejrůznější testy.

Obecná doporučení pro ultrazvukovou lyzi

Sonikace je nejoblíbenější technikou lyze velmi malých, středních i velkých množství buněčných suspenzí – od pikolitrů až po 100L/hr (s použitím ultrazvukové průtokové cely). Buňky jsou lyzovány smykem kapaliny a kavitací. Během sonikace se stříhá také DNA, takže není nutné přidávat do buněčné suspenze DNázu.

Regulace teploty během ultrazvukové lyze E.coli
Předchlazením vzorku a jeho udržováním na ledu během sonikace lze snadno zabránit tepelné degradaci vzorku.
V ideálním případě by vzorky měly být během lyze udržovány ledově studené, u většiny vzorků však postačí, pokud teplota nevystoupí nad teplotu kultury nebo zdrojové tkáně. Proto se doporučuje udržovat suspenzi na ledu a sonikovat několika krátkými ultrazvukovými pulzy po 5–10 s s pauzami 10–30 s. Během pauz se teplo může rozptýlit, aby se znovu obnovila nízká teplota. Pro větší vzorky buněk jsou k dispozici různé reaktory s průtokovými celami s chladicími plášti.
Přečtěte si zde podrobné tipy a doporučení pro úspěšnou ultrazvukovou lyzi!

Protokoly pro ultrazvukovou přípravu lyzátů E. coli

Výzkumníci používají ultrazvukové homogenizátory Hielscher k dezintegraci buněk E.coli. Níže naleznete různé vyzkoušené a osvědčené protokoly lyze E.coli s použitím ultrazvukových homogenizátorů Hielscher pro různé aplikace související s E. coli.

Růst buněk, síťování a příprava buněčných extraktů E. coli pomocí ultrazvuku

Pro ChIP-Chip SeqA a RNA polymerázy byly E. coli MG1655 nebo MG1655 ΔseqA kultivovány při 37°C do OD₆₀₀ přibližně 0,15 v 50 ml LB (+ 0,2% glukózy), poté bylo přidáno 27 μl formaldehydu (37%) na ml média (výsledná koncentrace 1%). Síťování probíhalo za pomalého třepání (100 rpm) při pokojové teplotě po dobu 20 min a následně bylo zastaveno (quenching) 10 ml 2,5 M glycinu (výsledná koncentrace 0,5 M). Pro experimenty s tepelným šokem byla E. coli MG1655 kultivována v 65 ml média LB při 30°C do OD₆₀₀ přibližně 0,3. Následně bylo 30 ml kultury přeneseno do předehřáté baňky při 43°C a zbytek byl ponechán při 30°C. Síťování a zastavení reakce probíhaly, jak je popsáno výše, s tím rozdílem, že buňky byly před dalším pomalým třepáním při pokojové teplotě udržovány 5 min při 30 nebo 43°C. Buňky byly odebrány centrifugací a dvakrát promyty studeným TBS (pH7.5). Po resuspendování v 1 ml lyzačního pufru (10 mM Tris (pH 8,0), 20% sacharóza, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lysozym) a inkubaci při 37°C po dobu 30 min s následným přidáním 4 ml IP pufru byly buňky sonikovány na ledu 12krát po 30 s s přestávkami 30 s pomocí ultrazvukového procesoru Hielscher UP400St při nastavení výkonu 100%. Po centrifugaci po dobu 10 min při 9000 g byly alikvoty supernatantu po 800 μl uloženy při -20°C. (Waldminghaus 2010)

Nadprodukce a purifikace enzymů pomocí ultrazvukové sondy

Pro nadprodukci proteinů značených dekahistidinem (His10) byla E. coli BL21(DE3) transformována konstrukty pET19b. Předkultura kultivovaná přes noc byla sklizena centrifugací a 1% bylo použito k inokulaci expresní kultury. Buňky nesoucí pET19mgtB byly kultivovány při 22°C do optické hustoty při 600 nm (OD600) 0,7. Kultura byla přenesena na 17°C a indukována 100 μM IPTG. Po 16 h byla kultura sklizena centrifugací při 7 500 × g a 4°C. Buňky byly resuspendovány v 50 mM fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) s 0,3 M NaCl při pH 7,4 a rozrušeny ultrazvukem pomocí sonotrody s mikrohrotem S2 na ultrazvukovém přístroji Hielscher UP200St při cyklu 0,5 a amplitudě 75%.
Nadprodukce GtfC značeného dekahistidinem byla indukována při 37°C při OD₆₀₀ 0,6 pomocí 100 μM IPTG. Buňky byly poté inkubovány 4 h, sklizeny a lyzovány, jak je uvedeno výše pro MgtB.
Surové buněčné extrakty byly centrifugovány při 15 000 × g a 4°C, aby se sedimentovaly buněčné zbytky. Vyčištěné extrakty byly naneseny na kolony HisTrap FF Crude o objemu 1 ml pomocí systému ÄKTAprime Plus. Enzymy byly purifikovány podle protokolu výrobce pro gradientovou eluci proteinů se značkou His. Eluované proteinové roztoky byly dvakrát dialyzovány proti 1 000 objemům 50 mM PBS, pH 7,4, s 0,3 M NaCl při 4°C. Purifikace byla analyzována pomocí 12% SDS-PAGE. Koncentrace proteinu byla stanovena Bradfordovou metodou s použitím Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)

Ultrazvuková extrakce proteinu z bakterií E. coli
Sledovaný návnadový protein (v tomto případě MTV1 z Arabidopsis thaliana) je fúzován se značkou GST a exprimován v buňkách Escherichia coli (E. coli) BL21.

Vezměte jednu peletu GST-MTV1 a GST (odpovídající 50 ml bakteriální kultury) a každou resuspendujte ve 2,5 mL ledově vychlazeného extrakčního pufru.
Pomocí ultrazvukového přístroje UP100H (vybaveného sonotrodou s mikrohrotem MS3 pro malé objemy přibl. 2–5mL) rozrušujte bakteriální buňky, dokud nejsou lyzovány, což se projeví sníženou opacitou a zvýšenou viskozitou. Tento krok je nutné provádět na ledu a doporučuje se sonikovat v intervalech (např. 10 s sonikace následovaných 10 s pauzy na ledu atd.). Je třeba dbát na to, aby sonikace neprobíhala s příliš vysokou intenzitou. Pokud zjistíte pěnění nebo tvorbu bílé sraženiny, je nutné intenzitu snížit.
Lyzovaný bakteriální roztok přeneste do 1,5 mL mikrocentrifugačních zkumavek a centrifugujte při 4°C, 16 000 x g po dobu 20 min.

Ultrazvukové sondy využívají síly akustické kavitace k rozrušení buněk a extrakci molekul a DNA z E.coli.

Sondové ultrazvukové přístroje, jako je UP400St, využívají pracovní princip akustické kavitace k účinné lyzi E.coli.

Expresní analýza a purifikace rekombinantního proteinu pomocí sonikace

Peleta E. coli byla sonikována ultrazvukovým přístrojem Hielscher UP100H. Za tímto účelem byla buněčná peleta resuspendována ve vychlazeném lyzačním pufru (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) a chlazena na ledu po dobu 10 min. Poté byla buněčná suspenze sonikována 10 krátkými pulzy po 10 s s následným intervalem 30 s pro chlazení. Nakonec byly buněčné zbytky odstraněny ultracentrifugací při 4°C po dobu 15 min při 14 000 rpm. Pro potvrzení exprese rPR byl supernatant nanesen na 12% polyakrylamidový gel a analyzován pomocí SDS-PAGE a westernového přenosu. Purifikace rPR byla provedena pomocí pryskyřice Ni2+-NTA (Invitrogen, USA) podle návodu výrobce. V této fázi byla použita nativní purifikační metoda. Čistota purifikovaného proteinu byla posouzena elektroforézou na 12% polyakrylamidovém gelu a následným barvením Coomassie blue. Koncentrace purifikovaného proteinu byla měřena soupravou Micro BCA protein assay kit (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)

Toto video ukazuje ultrazvukový cuphorn o výkonu 200 wattů pro dispergaci, homogenizaci, extrakci nebo odplyňování laboratorních vzorků.

Ultrazvukové homogenizátory pro lyzi E. coli

Hielscher Ultrasonics navrhuje, vyrábí a dodává vysoce výkonné ultrazvukové homogenizátory pro spolehlivou a účinnou lyzi bakterií E. coli a dalších typů buněk, tkání a buněčných kultur.
Široké portfolio ultrazvukových sond i systémů pro nepřímou sonikaci nám umožňuje nabídnout vám ideální ultrazvukový tkáňový homogenizátor pro vaši aplikaci dezintegrace buněk a extrakce.

Konstrukce, výroba a poradenství – kvalita Made in Germany

Ultrazvukové přístroje Hielscher jsou známé svou nejvyšší kvalitou a konstrukčními standardy. Inteligentní software, intuitivní menu, programovatelná nastavení a automatické protokolování dat jsou jen některé z funkcí ultrazvukových přístrojů Hielscher. Robustnost a snadná obsluha umožňují hladkou integraci našich ultrazvukových přístrojů do výzkumných a biotechnologických zařízení. Ultrazvukové přístroje Hielscher snadno zvládají i drsné podmínky a náročná prostředí.

Hielscher Ultrasonics je společnost s certifikací ISO a klade zvláštní důraz na vysoce výkonné ultrazvukové přístroje s nejmodernější technologií a uživatelskou přívětivostí. Ultrazvukové přístroje Hielscher jsou samozřejmě v souladu s CE a splňují požadavky UL, CSA a RoHs.

Tabulka níže vám poskytuje přehled o přibližné zpracovatelské kapacitě našich ultrazvukových přístrojů:

Objem dávky	Průtok	Doporučená zařízení
multijamkové / mikrotitrační destičky	n.a.	UIP400MTP
CupHorn pro vialky nebo kádinku	n.a.	Ultrazvukový CupHorn
ultrazvukový mikroprůtokový reaktor	n.a.	GDmini2
až 10 vialek s 0,5 až 1,5mL	n.a.	VialTweeter
0,5 až 1,5mL	n.a.	VialTweeter
1 až 500mL	10 až 200mL/min	UP100H
10 až 2000mL	20 až 400mL/min	UP200Ht, UP400St
0,1 až 20L	0,2 až 4L/min	UIP2000hdT
10 až 100L	2 až 10L/min	UIP4000
n.a.	10 až 100L/min	UIP16000
n.a.	větší	klastr UIP16000

Kontaktujte nás! / Zeptejte se nás!

Video představuje ultrazvukový systém pro přípravu vzorků UIP400MTP, který umožňuje spolehlivou přípravu vzorků v libovolných standardních vícejamkových destičkách pomocí vysoce intenzivního ultrazvuku. Mezi typické aplikace systému UIP400MTP patří lýza buněk, fragmentace DNA, RNA a chromatinu a extrakce proteinů.

Další protokoly pro ultrazvukovou lyzi E. coli

Proteiny modifikované allicinem v E. coli s použitím ultrazvukového zařízení VialTweeter

Stanovení obsahu sulfhydrylových skupin testem s 5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoovou kyselinou) (DTNB)
Noční kultura E. coli MG1655 byla použita k inokulaci minimálního média MOPS (1:100). Kultura byla kultivována aerobně do dosažení A600 0,4. Kultura byla rozdělena na tři 15ml kultury pro stresové ošetření. Neošetřená kultura sloužila jako negativní kontrola. Do každé ze zbývajících dvou kultur bylo přidáno buď 0,79 mM allicinu (128 μg ml-1), nebo 1 mM diamidu. Kultury byly inkubovány 15 min. Z každé kultury bylo 5 ml sklizeno centrifugací (8 525 × g, 4°C, 10 min). Buňky byly dvakrát promyty 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, před použitím uchovávaný anaerobně) a centrifugovány (13 000 × g, 4°C, 10 min). Buňky byly resuspendovány v lyzačním pufru (PBS s 6 mM guanidinium HCl, pH 7,4) před rozrušením při 4°C ultrazvukem (VialTweeter – ultrazvukový přístroj, Hielscher GmbH, Německo) (3 × 1 min). Buněčné zbytky byly peletovány centrifugací (13 000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatant byl přenesen do makrokyvety QS o objemu 3,5 ml (10 mm) s magnetickým míchadlem a smíchán s 1 ml lyzačního pufru. Extinkce vzorků byla sledována při 412 nm spektrofotometrem Jasco V-650 vybaveným termostatovaným držákem kyvet PSC-718 při pokojové teplotě. Bylo přidáno 100μl 3 mM roztoku dithiobis(2-nitrobenzoové kyseliny). Extinkce byla sledována, dokud nedosáhla saturace. Výpočet koncentrace thiolů byl proveden s použitím extinkčního koeficientu ϵ₄₁₂ = 13 700 M^-1 cm^-1 pro thio-2-nitrobenzoovou kyselinu (TNB). Buněčné koncentrace thiolů byly vypočteny na základě objemu buněk E. coli 6,7 × 10^-15 litru a buněčné hustoty A600 = 0,5 (což odpovídá 1 × 10⁸ buněk ml^-1 kultury). (Müller et al. 2016)

Stanovení glutathionu in vivo pomocí ultrazvukového dezintegrátoru buněk

E.coli MG1655 byla kultivována v minimálním médiu MOPS v celkovém objemu 200ml do dosažení A600 0,5. Kultura byla rozdělena na 50ml kultury pro stresové ošetření. Po 15 min inkubace s 0,79 mM allicinu, 1 mM diamidu nebo dimethylsulfoxidem (kontrola) byly buňky sklizeny při 4 000g a 4°C po dobu 10 min. Buňky byly dvakrát promyty pufrem KPE před resuspendováním pelet v 700µl pufru KPE. Pro deproteinaci bylo přidáno 300l 10% (w/v) kyseliny sulfosalicylové před rozrušením buněk ultrazvukem (3 x 1 min; VialTweeter – ultrazvukový přístroj). Supernatanty byly odebrány po centrifugaci (30 min, 13 000g, 4°C). Koncentrace kyseliny sulfosalicylové byly sníženy na 1% přidáním 3 objemů pufru KPE. Měření celkového glutathionu a GSSG byla provedena, jak je popsáno výše. Buněčné koncentrace glutathionu byly vypočteny na základě objemu buněk E. coli 6,7×10^-15 litru a buněčné hustoty A600 0,5 (což odpovídá 1×10⁸ buněk ml^-1 kultury). Koncentrace GSH byly vypočteny odečtením 2[GSSG] od celkového glutathionu. (Müller et al. 2016)

Exprese lidské mAspAT v E. coli pomocí ultrazvukového homogenizátoru

Jedna kolonie E. coli BL21 (DE3) nesoucí expresní vektor byla naočkována do 30 mL média Luria-Bertani (LB) obsahujícího 100μg/mL ampicilinu a poté kultivována při 37ºC, dokud optická hustota (OD₆₀₀) nedosáhla 0,6. Buňky byly sklizeny centrifugací při 4 000 × g po dobu 10 min a resuspendovány ve 3L čerstvého média LB obsahujícího 100μg/mL ampicilinu.
Následně byla exprese proteinu indukována 1 mM isopropyl-β-ᴅ-1-thiogalaktopyranosidem (IPTG) po dobu 20 h při 16ºC. Buňky byly sklizeny centrifugací při 8 000 × g po dobu 15 min a promyty pufrem A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Z 3 L kultury bylo získáno přibližně 45g buněk (mokrá hmotnost). Po centrifugaci byly buněčné pelety resuspendovány ve 40 mL (na 1 L kultury) ledově vychlazeného extrakčního pufru A a lyzovány ultrazvukem při teplotě ledu pomocí ultrazvukového dezintegrátoru buněk Hielscher UP400St. Buněčný lyzát byl centrifugován při 12 000 rpm po dobu 15 min, aby se oddělily rozpustné (supernatant) a precipitované (peleta) frakce. (Jiang et al. 2015)

Související témata

Zajímavá fakta

E.coli

Escherichia coli (E. coli) je gramnegativní, fakultativně anaerobní, tyčinkovitá koliformní bakterie rodu Escherichia, která se běžně vyskytuje v dolní části střeva teplokrevných organismů (endotermů). Existuje velké množství kmenů (neboli subtypů) E. coli s rozmanitými vlastnostmi. Většina kmenů E. coli je pro člověka neškodná, např. kmeny B a K-12, které se běžně používají pro výzkumné aplikace v laboratořích. Některé kmeny jsou však škodlivé a mohou způsobit vážná onemocnění.
E. coli hraje důležitou roli v moderním biologickém inženýrství a průmyslové mikrobiologii, protože s touto bakterií lze snadno manipulovat. Mezi běžné laboratorní aplikace, které často zahrnují použití E. coli, patří např. tvorba rekombinantní deoxyribonukleové kyseliny (DNA) nebo využití E. coli jako modelového organismu.
E. coli je velmi všestranným hostitelem pro produkci heterologních proteinů a k produkci rekombinantních proteinů v E. coli je k dispozici řada expresních systémů. Pomocí plazmidů, které umožňují vysokou úroveň exprese proteinu, lze do bakterií vnést geny, což umožňuje produkovat takové proteiny ve velkých množstvích v průmyslových fermentačních procesech.
E.coli se používají jako buněčné továrny k produkci inzulinu. Mezi další aplikace patří využití modifikovaných buněk E. coli k vývoji a výrobě vakcín a imobilizovaných enzymů, k výrobě biopaliv a také k bioremediaci.
Kmen K-12 je mutantní forma E. coli, která nadměrně exprimuje enzym alkalickou fosfatázu (ALP). Tato mutace vzniká v důsledku defektu genu, který enzym neustále kóduje. Pokud gen vytváří produkt bez jakékoli inhibice, označuje se to jako konstitutivní aktivita. Tato specifická mutantní forma se používá k izolaci a purifikaci enzymu ALP.
Bakterie E. coli se také široce používají jako buněčné továrny. Upravené mikroorganismy (např. bakterie) a rostlinné buňky lze využít jako tzv. buněčné továrny. Tyto geneticky modifikované buňky produkují molekuly, chemikálie, polymery, proteiny a další látky, které se používají například ve farmaceutickém, potravinářském a chemickém průmyslu. K uvolnění molekul produkovaných uvnitř takto bioinženýrsky upravených buněk je ultrazvuková lyze běžnou metodou, jak rozrušit buněčné stěny a převést cílové látky do okolní kapaliny. Přečtěte si více o lyzi bioinženýrsky upravených buněk!

Ultrazvukové stříhání DNA

Ultrazvukové smykové síly jsou běžně používanou metodou k uvolňování molekul, organel a proteinů z nitra buněk a také k rozlámání řetězců DNA na fragmenty. Akustická kavitace rozrušuje buněčné stěny a membrány, čímž umožňuje extrahovat DNA z buněk, a generuje fragmenty o délce přibližně 600 – 800 bp, což je ideální pro analýzu.
Klikněte zde a zjistěte více o ultrazvukových homogenizátorech pro fragmentaci DNA!

Literatura / Reference

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

Vysoce výkonný ultrazvuk! Produktová řada Hielscher pokrývá celé spektrum od kompaktního laboratorního ultrazvukového přístroje přes stolní jednotky až po plně průmyslové ultrazvukové systémy.

Hielscher Ultrasonics vyrábí vysoce výkonné ultrazvukové homogenizátory od laboratorní až po průmyslovou velikost.