Ultrazvukové Lýza E. coli
- coli bakterií E. jsou nejčastěji používané bakterie v mikrobiologii a biotechnologie.
- Ultrazvukové buněčné disruptory dodávat spolehlivé a reprodukovatelné výsledky pro lyži E. coli.
- Intenzivní dosud přesně kontrolovatelné kavitační a smykové síly vést k úplné přerušení a ve vysokých výtěžcích extrakce (např. Proteiny, DNA).
Proč je ultrazvukové narušení buněk E. coli preferovanou metodou?
Ultrazvukové homogenizéry nebo sondy typu ultrasonicators nabízejí několik výhod pro E. coli lýzu jako intenzivní ultrazvuk účinně narušuje buněčné stěny a membrány. Sonda typu ultrasonicators jsou široce používány pro E. coli lýzu z následujících důvodů:

Extrakce proteinů z buněk E. coli se účinně provádí pomocí ultrazvuková sonda UP200St
Sonda typu ultrasonicator nabízí mnoho výhod pro E. coli lýzy. Spolehlivá a přesná kontrola ultrazvukových procesních parametrů umožňuje optimalizovat provozní parametry, jako je výkon, doba trvání a manipulace se vzorky, aby bylo dosaženo požadovaných výsledků.
Narušení buněk pomocí ultrazvukové kavitace
Ultrazvukové homogenizátory typu sondy pracují s cca. 20 000 cyklů za sekundu (při 20 kHz) a způsobují kavitaci v kapalinách nebo suspenzích. Akustická kavitace mikroskopické oblasti vakuových tlaků a vysokých teplot, které trhají buňky od sebe. Ačkoli teploty mohou dosáhnout několika tisíc stupňů Celsia, objemy kavitace jsou tak malé, že proces výrazně nezahřívají. Ultrazvukem generovaná akustická kavitace a smykové síly perforují nebo rozbíjejí buněčnou membránu bakteriálních buněk, jako je E. coli. Hielscher ultrasonicators umožňují přesnou kontrolu nad parametry procesu, jako je ultrazvuková intenzita, amplituda, vstup energie a teplota. Tím může být proces ultrazvukové lýzy optimálně přizpůsoben typu buněk, buněčné kultuře a cíli procesu.
- přesné ovládání lyže (intenzita, amplituda, teplota)
- Spolehlivé a reprodukovatelné výsledky
- optimální přizpůsobení na konkrétní vzorky
- regulace teploty
- pro velmi malé až velmi velké vzorky (ul na litry)
- Čistě mechanické zpracování
- Uživatelsky přívětivý, bezpečný provoz
- lineární scale-up z laboratoře do výroby

VialTweeter pro ultrazvukové lyži
Ultrazvukový homogenizátor vs jiné techniky lýzy
Zatímco chemická a enzymatická lýza může být problematická – protože chemická lýza může měnit proteinové struktury a zavést problémy čištění a enzymatické lýzu vyžaduje dlouhé inkubační doby a není reprodukovatelný – Ultrazvukové narušení je sofistikovaná metoda narušení rychle buňka.
Ultrazvuková lýza je založena pouze na mechanických silách. Nepřidávají se žádné chemikálie, sonikace rozbíjí buněčnou stěnu smykovými silami. Chemická lýza může změnit strukturu bílkovin a způsobit problémy s čištěním. Enzymatické narušení vyžaduje dlouhou inkubační dobu a není reprodukovatelné. Ultrazvukové narušení buněk bakterií E. coli je rychlé, jednoduché, spolehlivé a reprodukovatelné. To je důvod, proč Hielscher ultrasonicators jsou používány v biologických a biochemických laboratořích po celém světě pro přípravu vzorků, pre-ananlytika, in-vitro diagonstika a rozmanité testy.
Obecná doporučení pro ultrazvukovou lýzu
Sonikace je nejoblíbenější technika pro lýzu velmi malé, střední a velké množství buněčných suspenzí – z Pico-l až 100L / h (za použití ultrazvukové průtokové buňky). Buňky se lyžují kapalným střihu a kavitace. DNA je také stříhá při použití ultrazvuku, takže není nutné přidávat DNázu k buněčné suspenzi.
Regulace teploty během ultrazvukové E. coli lýzy
Pre-chlazení vzorku a udržování vzorku při sonikaci na ledu, vzorek tepelné degradace vzorku lze snadno zabránit.
V ideálním případě by vzorky měly být během lýzy udržovány ledově chladné, ale u většiny vzorků stačí, pokud teplota nepřekročí teplotu kultury nebo zdroje tkáně. Proto se doporučuje, aby suspenze byla na ledě a sonikovala několika krátkými ultrazvukovými pulzy 5-10 sec a pauzami 10-30 sec. Během pauz se teplo může rozptýlit, aby se obnovila nízká teplota. Pro větší vzorky buněk jsou k dispozici různé reaktory s průtokovými buňkami s chladicím pláštěm.
Protokoly pro ultrazvukovou přípravu lyzátů E. coli
Výzkumníci používají Hielscher ultrazvukové homogenizátory pro narušení buněk E. coli. Níže naleznete různé testované a osvědčené protokoly pro lýzu E. coli pomocí ultrazvukových homogenizérů Hielscher pro různé aplikace související s E. coli.
Růst buněk, zesíťování a příprava extraktů buněk E. coli pomocí ultrazvuku
Pro SeqA a RNA polymerasy ChIP-Chip E. coli MG1655 nebo MG1655 ΔseqA se kultivoval při teplotě 37 ° C na OD600 přibližně 0,15 v 50 ml LB (+ 0,2% glukózy) před přidáním 27 μl formaldehydu (37%) na ml média (konečná koncentrace 1%). Zesíťování se provádí za pomalého protřepávání (100 otáček za minutu) při teplotě místnosti po dobu 20 minut, načež následuje kalení 10 ml 2,5 M glycinu (konečná koncentrace 0,5 M). Pro pokusy s tepelným šokem byl E. coli MG1655 pěstován v 65 ml LB média při 30 ° C na OD600 asi 0,3. Následně se 30 ml kultury převede do předem ohřáté baňky na 43 °C a zbytek se udrží při teplotě 30 °C. Zesíťování a kalení probíhalo tak, jak je popsáno výše, s výjimkou toho, že buňky byly udržovány při teplotě 30 nebo 43 °C po dobu 5 minut před dalším pomalým protřepáním při pokojové teplotě. Buňky byly odebrány centrifugací a dvakrát promyty studeným TBS (pH 7,5). Po resuspenzi v 1 ml lyzačního pufru (10 mM Tris (pH 8,0), 20% sacharóza, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lysozymu) a inkubaci při 37 ° C po dobu 30 minut následovanou přidáním 4 ml IP pufru byly buňky sonikovány na ledu s 12 krát 30 sec a 30 sec přestávky pomocí ultrazvukového procesoru Hielscher UP400St při 100% nastavení výkonu. Po odstřeďování po dobu 10 minut při 9000 g bylo 800 μl alikvotů supernatantu skladováno při teplotě -20 °C. (Waldminghaus 2010)
Nadprodukce a čištění enzymů ultrazvukovou sondou
Pro nadprodukci proteinů značených dekahistidinem (His10) byla E. coli BL21(DE3) transformována konstrukty pET19b. Přes noc byla prekultura sklizena centrifugací a 1% bylo použito k naočkování expresní kultury. Buňky nesoucí pET19mgtB rostly při teplotě 22 °C až do optické hustoty při 600 nm (OD600) 0,7. Kultura byla přenesena na 17 °C a indukována 100 μM IPTG. Po 16 hodinách byla kultura sklizena odstřeďováním při 7 500 × g při 4 °C. Buňky byly resuspendovány v 50 mM fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) s 0,3 M NaCl při pH 7,4 a narušeny ultrazvukem s sonotrodou S2 micro-tip na Hielscher ultrasonicator UP200St v cyklu 0,5 a amplitudě 75%.
Nadprodukce decahistidine značený GtfC byl indukován při 37 ° C na OD600 0,6 s 100 uM IPTG. Buňky pak byly inkubovány po dobu 4 hodin, sklizeny a lyžovány, jak je uvedeno výše pro MgtB.
Extrakty ze surových buněk byly centrifugovány při 15 000 × g a 4 °C, aby se sedimentovaly buněčné zbytky. Vyčištěné extrakty byly vloženy do 1 ml surových kolon HisTrap FF pomocí systému ÄKTAprime Plus. Enzymy byly čištěny podle protokolu výrobce pro gradientní eluci proteinů označených His. Eluované proteinové roztoky byly dialyzovány dvakrát proti 1 000 objemům 50 mM PBS, pH 7,4, s 0,3 M NaCl při 4 °C. Čištění bylo analyzováno 12% SDS-PAGE. Koncentrace proteinu byla stanovena Bradfordovou metodou pomocí Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)
Ultrazvuková extrakce bílkovin z bakterií E. coli
Návnady protein (v tomto případě, MTV1 z Arabidopsis thaliana) je fúzován s GST tag a exprimován v BL21 Escherichia coli (E. coli) buněk.
- Vezměte jednu peletu GST-MTV1 a GST (odpovídající 50 ml bakteriální kultury) a každá se resuspenduje v 2,5 ml ledově studeného extrakčního pufru.
- Použijte ultrasonicator UP100H (vybavené MS3 microtip-sonotroda pro malé objemy cca. 2-5ml) narušit bakteriální buňky, dokud nejsou lyzovány, což je indikováno sníženou opacitou a zvýšenou viskozitou. To musí být provedeno na ledu a doporučuje se sonikovat v intervalech (např. 10 sec sonikace následovaný 10 sec pauza na ledu a tak dále). Je třeba dbát na to, aby nedošlo k sonikaci s příliš vysokou intenzitou. Pokud je zjištěna pěna nebo tvorba bílé sraženiny, je třeba intenzitu snížit.
- Roztok lyzovaných bakterií se přenese do mikrocentrifugačních zkumavek o objemu 1,5 ml a odstřeďuje se 20 minut při teplotě 4 °C, 16 000 x g.

Sonda-typ ultrasonicators, jako je UP400St využívat pracovní princip akustické kavitace pro účinnou lýzu E. coli.
Expresní analýza a purifikace rekombinantního proteinu pomocí sonikace
Peleta E. coli byla sonikována Hielscherovým ultrasonicator UP100H. Za tímto účelem byly buněčné pelety resuspendovány v chlazeném lyzačním pufru (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) a ochlazeny na ledu po dobu 10 minut. Poté byla buněčná suspenze sonikována 10 krátkými výbuchy 10 s následovanými intervalem 30 s pro chlazení. Nakonec byly úlomky buněk odstraněny ultracentrifugací při 4 °C po dobu 15 minut při 14000 ot / min. Pro potvrzení exprese rPR byl supernatant spuštěn na 12% polyakrylamidovém gelu a analyzován pomocí SDS-PAGE a Western blotting. Čištění rPR bylo provedeno pomocí pryskyřice Ni2+-NTA (Invitrogen, USA) podle návodu výrobce. V této fázi byla použita nativní metoda čištění. Čistota čištěného proteinu byla hodnocena pomocí elektroforézy na 12% polyakrylamidovém gelu a následném barvení Coomassie blue. Koncentrace čištěných proteinů byla měřena soupravou Micro BCA protein assay kit (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)
Ultrazvukové homogenizátory pro E. coli Lysis
Hielscher Ultrasonics navrhuje, vyrábí a dodává vysoce výkonné ultrazvukové homogenizéry pro spolehlivou a účinnou lýzu bakterií E. coli a dalších typů buněk, tkání a buněčných kultur.
Široké portfolio ultrazvukových sond, stejně jako nepřímé sonikační systémy nám umožňuje nabídnout vám ideální ultrazvukový homogenizátor tkání pro vaše narušení buněk a extrakci aplikace.
Návrh, výroba a poradenství – Kvalita Vyrobeno v Německu
Hielscher ultrasonicators jsou dobře známé pro jejich nejvyšší kvalitu a designové standardy. Inteligentní software, intuitivní menu, programovatelné nastavení a automatické protokolování dat jsou jen některé funkce Hielscher ultrasonicators. Robustnost a snadná obsluha umožňují hladkou integraci našich ultrasonicators do výzkumných a biotechnologických zařízení. Dokonce i drsné podmínky a náročné prostředí jsou snadno zvládnutelné Hielscher ultrasonicators.
Hielscher Ultrasonics je společnost certifikovaná ISO a klade zvláštní důraz na vysoce výkonné ultrasonicators představovat state-of-the-art technologie a uživatelská přívětivost. Samozřejmě, Hielscher ultrasonicators jsou CE kompatibilní a splňují požadavky UL, CSA a RoHs.
Níže uvedená tabulka vám dává informaci o přibližné zpracovatelské kapacity našich ultrasonicators:
Hromadná dávka | průtok | Doporučené Devices |
---|---|---|
multi-well / mikrotitrační desky | na | UIP400MTP |
CupHorn pro injekční lahvičky nebo kádinku | na | ultrazvukové cuphorn |
ultrazvukový mikroprůtokový reaktor | na | GDmini2 |
až 10 injekčních lahviček s 0,5 až 1,5 ml | na | VialTweeter |
00,5 až 1,5 ml | na | VialTweeter |
1 až 500 ml | 10 až 200 ml / min | UP100H |
10 až 2000ml | 20 až 400 ml / min | Uf200 ः t, UP400St |
00,1 až 20L | 00,2 až 4 litry / min | UIP2000hdT |
10 až 100L | 2 až 10 l / min | UIP4000 |
na | 10 až 100L / min | UIP16000 |
na | větší | hrozen UIP16000 |
Kontaktujte nás! / Zeptej se nás!
Další protokoly pro ultrazvukovou E. coli lýzy
Allicin-modifikované proteiny v E. coli pomocí ultrazvukové lahvičkyTweeter
Stanovení sulfhydrylových Obsah od 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoové kyseliny) (DTNB) Obsah
Kultivace E. coli MG1655 přes noc byla použita k naočkování minimálního média MOPS (1:100). Kultura byla pěstována aerobně, dokud nebylo dosaženo A600 0,4. Kultura byla rozdělena do tří 15 ml kultur pro léčbu stresu. Neošetřená kultura sloužila jako negativní kontrola. 0,79 mM allicin (128 μg ml-1) nebo 1 mM diamid byl přidán do jedné ze zbývajících dvou kultur. Kultury byly inkubovány po dobu 15 min. 5 ml každé kultury bylo sklizeno odstředěním (8,525 × g, 4°C, 10 min). Buňky byly dvakrát promyty 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, před použitím anaerobně skladovány) a odstředěny (13 000 × g, 4 °C, 10 min). Buňky byly resuspendovány v lyzačním pufru (PBS s 6 mM guanidinium HCl, pH 7,4) před narušením při 4 °C ultrazvuku (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Německo) (3 × 1 min). Úlomky buněk byly peletovány centrifugací (13 000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatant byl přenesen do 3,5 ml QS-makro kyvety (10 mm) s magnetickou míchací tyčinkou a smíchán s 1 ml lyzačního pufru. Exinkce vzorků byla sledována při vlnové délce 412 nm spektrofotometrem Jasco V-650 vybaveným držákem buněk PSC-718 s řízenou teplotou při pokojové teplotě. Bylo přidáno 100 μl 3 mM roztoku dithiobis (kyselina 2-nitrobenzoová). Vymírání bylo sledováno, dokud nedosáhlo nasycení. Výpočet koncentrace thiolu byl proveden pomocí extinkčního koeficientu ε412 = 13700 M-1 Cm-1 na thio-2-nitrobenzoové kyseliny (TNB). Buněčné thiolové koncentrace byly vypočteny na základě objemu buněk E. coli na 6,7 x 10-15 litr a hustota buněk A600 = 0,5 (odpovídá 1 × 108 buňky ml-1 kultura). (Muller a kol. 2016)
In vivo stanovení glutathionu pomocí ultrazvukového drtiče buněk
E. coli MG1655 byla pěstována v minimálním médiu MOPS v celkovém objemu 200 ml, dokud nebylo dosaženo A600 0,5. Kultura byla rozdělena na 50 ml kultury pro léčbu stresu. Po 15 minutách inkubace s 0,79 mM alicinem, 1 mM diamidem nebo dimethylsulfoxidem (kontrola) byly buňky odebrány při 4 000 g při 4 °C po dobu 10 minut. Buňky byly dvakrát promyty KPE pufrem před resuspendací pelet v 700 μl KPE pufru. Pro deproteinaci bylo přidáno 300 l 10% (w / V) kyseliny sulfosalicylové před narušením buněk ultrazvuku (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Supernatanty byly sbírány po odstředění (30 min, 13.000 g, 4 ° C). Koncentrace kyseliny sulfosalicylové byly sníženy na 1% přídavkem 3 objemů KPE pufru. Měření celkového glutathionu a GSSG byly provedeny, jak je popsáno výše. Buněčné koncentrace glutathionu byly vypočteny na základě objemu E. coli buňky 6.7×10-15 litr a hustota buněk A600 0,5 (odpovídá 1×108 buňky ml-1 kultura). Koncentrace GSH se vypočítá odečtením 2 [GSSG] z celkového glutathionu. (Muller a kol. 2016)
Exprese lidského mAspAT v E. coli pomocí ultrazvukového homogenizátoru
Jediná kolonie E. coli BL21 (DE3) nesoucí expresní vektor, ve 30 ml Luria-Bertani (LB) média obsahujícího 100 ug / ml ampicilinu, a kultivován při teplotě 37 ° C až do optické hustoty (OD600) Dosáhl 0,6. Buňky byly sklizeny centrifugací při 4000 x g po dobu 10 minut a resuspendovány v čerstvém 3L LB média obsahujícího 100 ug / ml ampicilinu.
Následně byla exprese proteinu indukována 1 mM isopropyl β-ᴅ-1-thiogalaktopyranosidem (IPTG) po dobu 20 hodin při 16 °C. Buňky byly odebrány centrifugací při 8 000 × g po dobu 15 minut a promyty pufrem A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Přibližně 45 g (vlhká hmotnost) buněk bylo získáno z 3 l kultury. Po odstřeďování byly buněčné pelety resuspendovány ve 40 ml (pro 1 L kulturu) ledově studený extrakční pufr A a lyzovány ultrazvukem při ledově studené teplotě pomocí ultrazvukového drtiče buněk Hielscher UP400St. Lýza buněk byla centrifugována při 12 000 otáčkách za minutu po dobu 15 minut, aby se oddělily rozpustné (supernatant) a vysrážené (peletové) frakce. (Jiang et al. 2015)
Fakta Worth Knowing
E-coli
Escherichia coli (E. coli) je gramnegativní, fakultativně anaerobní, koliformní bakterie rodu Escherichia, která se běžně vyskytuje v dolním střevě teplokrevných organismů (endotermů). Existuje velké množství kmenů E. coli (nebo podtypů) s různými charakteristikami. Většina kmenů E. coli je pro člověka neškodná, např. Kmeny B a K-12, které se běžně používají pro výzkumné aplikace v laboratořích. Nicméně některé kmeny jsou škodlivé a mohou způsobit vážná onemocnění.
E. coli hraje důležitou roli v moderní biologické inženýrství a průmyslové mikrobiologii, protože bakterie jsou snadno manipulovat. Běžné laboratorní aplikace, které zahrnují často použití E. coli, například vytvořit rekombinantní deoxyribonukleové kyseliny (DNA), nebo působí jako modelový organismus.
E. coli je velmi univerzální hostitele pro produkci heterologních proteinů, a rozdělovače proteinové expresní systémy jsou k dispozici pro výrobu rekombinantních proteinů v E. coli. Pomocí plasmidů, které umožňují vysokou hladinu exprese proteinu, geny mohou být zavedeny do bakterií, které umožňuje, aby se na produkci těchto proteinů ve velkém množství v průmyslových fermentačních procesů.
E. coli se používají jako buněčné továrny k výrobě inzulínu. Další aplikace zahrnují použití modifikovaných buněk E. coli k vývoji a výrobě vakcín a imobilizovaných enzymů, k výrobě biopaliv, jakož i k bioremediaci.
Kmen K-12 je mutantní forma E. coli, která nadměrně exprimuje enzym alkalické fosfatázy (ALP). Tato mutace se vyskytuje v důsledku defektu v genu, který neustále kóduje enzym. Pokud gen vytváří produkt bez inhibice toto je známé jako konstitutivní aktivity. Tento specifický mutantní forma se používá k izolaci a čištění ALP enzymu.
Bakterie E. coli jsou také široce používány jako buněčné továrny. Umělé mikroby (např. bakterie) a rostlinné buňky mohou být použity jako takzvané buněčné továrny. Tyto geneticky modifikované buňky produkují molekuly, chemikálie, polymery, proteiny a další látky, které se používají například ve farmaceutickém, potravinářském a chemickém průmyslu. Aby se uvolnily molekuly produkované uvnitř takových bioinženýrských buněk, ultrazvuková lýza je běžnou metodou narušení buněčných stěn a přenosu cílových látek do okolní kapaliny. Přečtěte si více o lýze bioinženýrských buněk!
Ultrazvukové DNA Stříhání
Ultrazvukové smykové síly jsou běžně používanou metodou k uvolňování molekul, organel a proteinů z buněčného interiéru, stejně jako k rozbití řetězců DNA na kousky. Akustická kavitace rozbíjí buněčné stěny a membrány, aby extrahovala DNA z buněk a generovala fragmenty asi 600 – 800 párů bází, který je ideální pro analýzu.
Zde se dozvíte více o ultrazvukové homogenizátory pro fragmentaci DNA!
Literatura / Reference
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

Hielscher Ultrasonics vyrábí vysoce výkonné ultrazvukové homogenizátory od Laboratoř na průmyslové velikosti.