• coli bakterií E. jsou nejčastěji používané bakterie v mikrobiologii a biotechnologie.
• Ultrazvukové buněčné disruptory dodávat spolehlivé a reprodukovatelné výsledky pro lyži E. coli.
• Intenzivní dosud přesně kontrolovatelné kavitační a smykové síly vést k úplné přerušení a ve vysokých výtěžcích extrakce (např. Proteiny, DNA).

Proč je ultrazvukové narušení buněk E. coli preferovanou metodou?

Ultrazvukové homogenizéry nebo sondy typu ultrasonicators nabízejí několik výhod pro E. coli lýzu jako intenzivní ultrazvuk účinně narušuje buněčné stěny a membrány. Sonda typu ultrasonicators jsou široce používány pro E. coli lýzu z následujících důvodů:

Sonda typu ultrasonicator nabízí mnoho výhod pro E. coli lýzy. Spolehlivá a přesná kontrola ultrazvukových procesních parametrů umožňuje optimalizovat provozní parametry, jako je výkon, doba trvání a manipulace se vzorky, aby bylo dosaženo požadovaných výsledků.
 

Narušení buněk pomocí ultrazvukové kavitace

Ultrazvukové homogenizátory typu sondy pracují s cca. 20 000 cyklů za sekundu (při 20 kHz) a způsobují kavitaci v kapalinách nebo suspenzích. Akustická kavitace mikroskopické oblasti vakuových tlaků a vysokých teplot, které trhají buňky od sebe. Ačkoli teploty mohou dosáhnout několika tisíc stupňů Celsia, objemy kavitace jsou tak malé, že proces výrazně nezahřívají. Ultrazvukem generovaná akustická kavitace a smykové síly perforují nebo rozbíjejí buněčnou membránu bakteriálních buněk, jako je E. coli. Hielscher ultrasonicators umožňují přesnou kontrolu nad parametry procesu, jako je ultrazvuková intenzita, amplituda, vstup energie a teplota. Tím může být proces ultrazvukové lýzy optimálně přizpůsoben typu buněk, buněčné kultuře a cíli procesu.
 

Ultrazvukový homogenizátor vs jiné techniky lýzy

Zatímco chemická a enzymatická lýza může být problematická – protože chemická lýza může měnit proteinové struktury a zavést problémy čištění a enzymatické lýzu vyžaduje dlouhé inkubační doby a není reprodukovatelný – Ultrazvukové narušení je sofistikovaná metoda narušení rychle buňka.
Ultrazvuková lýza je založena pouze na mechanických silách. Nepřidávají se žádné chemikálie, sonikace rozbíjí buněčnou stěnu smykovými silami. Chemická lýza může změnit strukturu bílkovin a způsobit problémy s čištěním. Enzymatické narušení vyžaduje dlouhou inkubační dobu a není reprodukovatelné. Ultrazvukové narušení buněk bakterií E. coli je rychlé, jednoduché, spolehlivé a reprodukovatelné. To je důvod, proč Hielscher ultrasonicators jsou používány v biologických a biochemických laboratořích po celém světě pro přípravu vzorků, pre-ananlytika, in-vitro diagonstika a rozmanité testy.

Obecná doporučení pro ultrazvukovou lýzu

Sonikace je nejoblíbenější technika pro lýzu velmi malé, střední a velké množství buněčných suspenzí – z Pico-l až 100L / h (za použití ultrazvukové průtokové buňky). Buňky se lyžují kapalným střihu a kavitace. DNA je také stříhá při použití ultrazvuku, takže není nutné přidávat DNázu k buněčné suspenzi.
 

Regulace teploty během ultrazvukové E. coli lýzy
Pre-chlazení vzorku a udržování vzorku při sonikaci na ledu, vzorek tepelné degradace vzorku lze snadno zabránit.
V ideálním případě by vzorky měly být během lýzy udržovány ledově chladné, ale u většiny vzorků stačí, pokud teplota nepřekročí teplotu kultury nebo zdroje tkáně. Proto se doporučuje, aby suspenze byla na ledě a sonikovala několika krátkými ultrazvukovými pulzy 5-10 sec a pauzami 10-30 sec. Během pauz se teplo může rozptýlit, aby se obnovila nízká teplota. Pro větší vzorky buněk jsou k dispozici různé reaktory s průtokovými buňkami s chladicím pláštěm.

Protokoly pro ultrazvukovou přípravu lyzátů E. coli

Výzkumníci používají Hielscher ultrazvukové homogenizátory pro narušení buněk E. coli. Níže naleznete různé testované a osvědčené protokoly pro lýzu E. coli pomocí ultrazvukových homogenizérů Hielscher pro různé aplikace související s E. coli.
 

Růst buněk, zesíťování a příprava extraktů buněk E. coli pomocí ultrazvuku

Pro SeqA a RNA polymerasy ChIP-Chip E. coli MG1655 nebo MG1655 ΔseqA se kultivoval při teplotě 37 ° C na OD₆₀₀ přibližně 0,15 v 50 ml LB (+ 0,2% glukózy) před přidáním 27 μl formaldehydu (37%) na ml média (konečná koncentrace 1%). Zesíťování se provádí za pomalého protřepávání (100 otáček za minutu) při teplotě místnosti po dobu 20 minut, načež následuje kalení 10 ml 2,5 M glycinu (konečná koncentrace 0,5 M). Pro pokusy s tepelným šokem byl E. coli MG1655 pěstován v 65 ml LB média při 30 ° C na OD₆₀₀ asi 0,3. Následně se 30 ml kultury převede do předem ohřáté baňky na 43 °C a zbytek se udrží při teplotě 30 °C. Zesíťování a kalení probíhalo tak, jak je popsáno výše, s výjimkou toho, že buňky byly udržovány při teplotě 30 nebo 43 °C po dobu 5 minut před dalším pomalým protřepáním při pokojové teplotě. Buňky byly odebrány centrifugací a dvakrát promyty studeným TBS (pH 7,5). Po resuspenzi v 1 ml lyzačního pufru (10 mM Tris (pH 8,0), 20% sacharóza, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lysozymu) a inkubaci při 37 ° C po dobu 30 minut následovanou přidáním 4 ml IP pufru byly buňky sonikovány na ledu s 12 krát 30 sec a 30 sec přestávky pomocí ultrazvukového procesoru Hielscher UP400St při 100% nastavení výkonu. Po odstřeďování po dobu 10 minut při 9000 g bylo 800 μl alikvotů supernatantu skladováno při teplotě -20 °C. (Waldminghaus 2010)
 

Nadprodukce a čištění enzymů ultrazvukovou sondou

Pro nadprodukci proteinů značených dekahistidinem (His10) byla E. coli BL21(DE3) transformována konstrukty pET19b. Přes noc byla prekultura sklizena centrifugací a 1% bylo použito k naočkování expresní kultury. Buňky nesoucí pET19mgtB rostly při teplotě 22 °C až do optické hustoty při 600 nm (OD600) 0,7. Kultura byla přenesena na 17 °C a indukována 100 μM IPTG. Po 16 hodinách byla kultura sklizena odstřeďováním při 7 500 × g při 4 °C. Buňky byly resuspendovány v 50 mM fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) s 0,3 M NaCl při pH 7,4 a narušeny ultrazvukem s sonotrodou S2 micro-tip na Hielscher ultrasonicator UP200St v cyklu 0,5 a amplitudě 75%.
Nadprodukce decahistidine značený GtfC byl indukován při 37 ° C na OD₆₀₀ 0,6 s 100 uM IPTG. Buňky pak byly inkubovány po dobu 4 hodin, sklizeny a lyžovány, jak je uvedeno výše pro MgtB.
Extrakty ze surových buněk byly centrifugovány při 15 000 × g a 4 °C, aby se sedimentovaly buněčné zbytky. Vyčištěné extrakty byly vloženy do 1 ml surových kolon HisTrap FF pomocí systému ÄKTAprime Plus. Enzymy byly čištěny podle protokolu výrobce pro gradientní eluci proteinů označených His. Eluované proteinové roztoky byly dialyzovány dvakrát proti 1 000 objemům 50 mM PBS, pH 7,4, s 0,3 M NaCl při 4 °C. Čištění bylo analyzováno 12% SDS-PAGE. Koncentrace proteinu byla stanovena Bradfordovou metodou pomocí Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)
 

Ultrazvuková extrakce bílkovin z bakterií E. coli
Návnady protein (v tomto případě, MTV1 z Arabidopsis thaliana) je fúzován s GST tag a exprimován v BL21 Escherichia coli (E. coli) buněk.

1. Vezměte jednu peletu GST-MTV1 a GST (odpovídající 50 ml bakteriální kultury) a každá se resuspenduje v 2,5 ml ledově studeného extrakčního pufru.
2. Použijte ultrasonicator UP100H (vybavené MS3 microtip-sonotroda pro malé objemy cca. 2-5ml) narušit bakteriální buňky, dokud nejsou lyzovány, což je indikováno sníženou opacitou a zvýšenou viskozitou. To musí být provedeno na ledu a doporučuje se sonikovat v intervalech (např. 10 sec sonikace následovaný 10 sec pauza na ledu a tak dále). Je třeba dbát na to, aby nedošlo k sonikaci s příliš vysokou intenzitou. Pokud je zjištěna pěna nebo tvorba bílé sraženiny, je třeba intenzitu snížit.
3. Roztok lyzovaných bakterií se přenese do mikrocentrifugačních zkumavek o objemu 1,5 ml a odstřeďuje se 20 minut při teplotě 4 °C, 16 000 x g.

Expresní analýza a purifikace rekombinantního proteinu pomocí sonikace

Peleta E. coli byla sonikována Hielscherovým ultrasonicator UP100H. Za tímto účelem byly buněčné pelety resuspendovány v chlazeném lyzačním pufru (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) a ochlazeny na ledu po dobu 10 minut. Poté byla buněčná suspenze sonikována 10 krátkými výbuchy 10 s následovanými intervalem 30 s pro chlazení. Nakonec byly úlomky buněk odstraněny ultracentrifugací při 4 °C po dobu 15 minut při 14000 ot / min. Pro potvrzení exprese rPR byl supernatant spuštěn na 12% polyakrylamidovém gelu a analyzován pomocí SDS-PAGE a Western blotting. Čištění rPR bylo provedeno pomocí pryskyřice Ni2+-NTA (Invitrogen, USA) podle návodu výrobce. V této fázi byla použita nativní metoda čištění. Čistota čištěného proteinu byla hodnocena pomocí elektroforézy na 12% polyakrylamidovém gelu a následném barvení Coomassie blue. Koncentrace čištěných proteinů byla měřena soupravou Micro BCA protein assay kit (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)