Ultrazvuková lýza E. coli
- Bakterie E. coli jsou nejčastěji používanými bakteriemi v mikrobiologii a biotechnologiích.
- Ultrazvukové buněčné disruptory poskytují spolehlivé a reprodukovatelné výsledky pro lýzu E. coli.
- Intenzivní, ale přesně kontrolovatelné kavitační a smykové síly mají za následek úplné narušení a vysoké výtěžky extrakce (např. proteinů, DNA).
Proč je ultrazvukové narušení buněk E. coli preferovanou metodou?
Ultrazvukové homogenizátory nebo ultrazvukové sondy nabízejí několik výhod pro lýzu E. coli, protože intenzivní ultrazvuk účinně narušuje buněčné stěny a membrány. Ultrazvuky typu sondy jsou široce používány pro lýzu E. coli z následujících důvodů:
Extrakce proteinů z buněk E.coli se účinně provádí pomocí ultrazvuková sonda UP200St
Ultrazvukový přístroj typu sondy nabízí mnoho výhod pro lýzu E. coli. Spolehlivá a přesná kontrola parametrů ultrazvukového procesu umožňuje optimalizovat provozní parametry, jako je výkon, doba trvání a manipulace se vzorkem, aby bylo dosaženo požadovaných výsledků.
Elektroforetické analýzy genomové DNA E. coli EDL933 podrobeny ultrazvuku 0 – 15 minut. L označuje žebřík DNA.
(studie a obrázek: ©Basselet et al. 2008)
Narušení buněk pomocí ultrazvukové kavitace
Ultrazvukové homogenizátory typu sondy pracují s cca. 20 000 cyklů za sekundu (při 20 kHz) a způsobují kavitaci v kapalinách nebo suspenzích. Akustická kavitace: mikroskopické oblasti s tlaky podobnými vakuu a vysokými teplotami, které trhají články na kusy. Přestože teploty mohou dosáhnout několika tisíc stupňů Celsia, objemy kavitace jsou tak malé, že proces významně nezahřívají. Ultrazvukem generovaná akustická kavitace a smykové síly perforují nebo narušují buněčnou membránu bakteriálních buněk, jako je E.coli. Hielscher ultrasonicators umožňují přesnou kontrolu nad parametry procesu, jako je ultrazvuková intenzita, amplituda, příkon energie a teplota. Tímto způsobem lze proces ultrazvukové lýzy optimálně přizpůsobit buněčnému typu, buněčné kultuře a cíli procesu.
- přesná kontrola lýzy (intenzita, amplituda, teplota)
- Spolehlivé, reprodukovatelné výsledky
- optimální přizpůsobení konkrétním vzorkům
- Regulace teploty
- pro velmi malé až velmi velké vzorky (μl až litry)
- Čistě mechanické zpracování
- Uživatelsky přívětivý, bezpečný provoz
- Lineární škálování z laboratoře do výroby
VialTweeter pro ultrazvukovou lýzu
Ultrazvukový homogenizátor vs jiné techniky lýzy
Zatímco chemická a enzymatická lýza může být problematická – Vzhledem k tomu, že chemická lýza může změnit proteinové struktury a způsobit problémy s purifikací a enzymatická lýza vyžaduje dlouhé inkubační doby a není reprodukovatelná – Ultrazvuková disrupce je sofistikovaná, rychlá metoda narušení buněk.
Ultrazvuková lýza je založena pouze na mechanických silách. Nepřidávají se žádné chemikálie, sonikace rozbíjí buněčnou stěnu smykovými silami. Chemická lýza může změnit strukturu proteinů a způsobit problémy s čištěním. Enzymatická disrupce vyžaduje dlouhou inkubační dobu a není reprodukovatelná. Ultrazvukové narušení buněk bakterií E.coli je rychlé, jednoduché, spolehlivé a reprodukovatelné. To je důvod, proč se Hielscher ultrasonicators používají v biologických a biochemických laboratořích po celém světě pro přípravu vzorků, pre-ananlytika, in-vitro diagnostika a rozmanité testy.
Obecná doporučení pro ultrazvukovou lýzu
Sonikace je nejoblíbenější technikou pro lýzování velmi malých, středních a velkých množství buněčných suspenzí – od pikolitrů až do 100 l/h (pomocí ultrazvukové průtokové cely). Buňky jsou lyzovány smykem kapaliny a kavitací. DNA je také stříhána během sonikace, takže není nutné přidávat DNázu do buněčné suspenze.
Regulace teploty během ultrazvukové lýzy E.coli
Předchlazením vzorku a udržováním vzorku během sonikace na ledu lze snadno zabránit tepelné degradaci vzorku vzorku.
V ideálním případě by vzorky měly být během lýzy udržovány v ledovém chladu, ale pro většinu vzorků je dostačující, pokud teplota nestoupne nad teplotu kultury nebo tkáňového zdroje. Proto se doporučuje, aby suspenze zůstala na ledu a sonikovat několika krátkými ultrazvukovými pulzy 5-10 sekund a pauzami 10-30 sekund. Během přestávek se teplo může rozptýlit, aby se znovu vytvořila nízká teplota. Pro vzorky větších cel jsou k dispozici různé reaktory s průtočnou buňkou s chladicími plášti.
Přečtěte si zde podrobné tipy a doporučení pro úspěšnou ultrazvukovou lýzu!
Protokoly pro ultrazvukovou přípravu lyzátů E. coli
Výzkumníci používají Hielscher ultrazvukové homogenizátory pro narušení buněk E.coli. Níže naleznete různé testované a osvědčené protokoly pro lýzu E.coli pomocí ultrazvukových homogenizátorů Hielscher pro různé aplikace související s E. coli.
Buněčný růst, zesíťování a příprava buněčných extraktů E. coli pomocí ultrazvuku
Pro SeqA a RNA polymerázu ChIP-Chip E. coli byl MG1655 nebo MG1655 ΔseqA pěstován při teplotě 37 °C na OD600 asi 0,15 v 50 ml LB (+ 0,2 % glukózy), než bylo přidáno 27 μl formaldehydu (37 %) na ml média (konečná koncentrace 1 %). Zesíťování bylo prováděno za pomalého protřepávání (100 ot./min) při pokojové teplotě po dobu 20 minut s následným zhášením 10 ml 2,5 M glycinu (konečná koncentrace 0,5 M). Pro experimenty s tepelným šokem byla E. coli MG1655 pěstována v 65 ml LB média při 30 °C na OD600 asi 0,3. Následně se 30 ml kultury přelije do předehřáté baňky na 43 °C a zbytek se uchová při teplotě 30 °C. Zesíťování a zhášení probíhalo tak, jak bylo popsáno výše, s tím rozdílem, že články byly udržovány při teplotě 30 nebo 43 °C po dobu 5 minut, než se dále pomalu protřepaly při pokojové teplotě. Buňky byly odebrány centrifugací a dvakrát promyty studeným TBS (pH7,5). Po resuspenzi v 1 ml lyzačního pufru (10 mM Tris (pH 8,0), 20% sacharóza, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lysozymu) a inkubaci při 37 °C po dobu 30 minut s následným přidáním 4 ml IP pufru, buňky byly sonikovány na ledu s 12 krát 30 sec a 30 sec přestávkami pomocí ultrazvukového procesoru Hielscher UP400St při 100% nastavení výkonu. Po centrifugaci po dobu 10 minut při 9000 g bylo 800 μl alikvotů supernatantu skladováno při teplotě -20 °C. (Waldminghaus 2010)
Nadprodukce a čištění enzymů ultrazvukovou sondou
Pro nadprodukci proteinů značených dekahistidinem (His10) byla E. coli BL21(DE3) transformována pomocí konstruktů pET19b. Prekultura přes noc byla sklizena centrifugací a 1 % bylo použito k naočkování expresní kultury. Buňky nesoucí pET19mgtB byly pěstovány při 22 °C až do optické hustoty na 600 nm (OD600) 0,7. Kultura byla přenesena na 17 °C a indukována 100 μM IPTG. Po 16 hodinách byla kultura sklizena centrifugací při teplotě 7 500 × g při teplotě 4 °C. Buňky byly resuspendovány v 50 mM fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS) s 0,3 M NaCl při pH 7,4 a narušeny ultrazvukem s mikro-hrotem sonotrody S2 na Hielscher ultrasonicator UP200St v cyklu 0,5 a amplituda 75%.
Nadprodukce dekahistidinu značeného GtfC byla vyvolána při 37 °C při vnějším průměru600 0,6 s 100 μM IPTG. Buňky byly poté inkubovány po dobu 4 hodin, odebrány a lyzovány, jak je uvedeno výše pro MgtB.
Surové buněčné extrakty byly odstředěny při 15 000 × g a 4 °C, aby se buněčné zbytky sedimentovaly. Vyčištěné extrakty byly naloženy do kolon HisTrap FF Crude o objemu 1 ml pomocí systému ÄKTAprime Plus. Enzymy byly purifikovány v souladu s protokolem výrobce pro gradientovou eluci proteinů značených Hi. Eluované proteinové roztoky byly dialyzovány dvakrát proti 1 000 objemům 50 mM PBS, pH 7,4, s 0,3 M NaCl při 4 °C. Čištění bylo analyzováno pomocí 12% SDS-PAGE. Koncentrace proteinu byla stanovena Bradfordovou metodou pomocí Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)
Ultrazvuková extrakce proteinu z bakterií E. coli
Zajímavý návnadový protein (v tomto případě MTV1 z Arabidopsis thaliana) je spojen s GST značkou a exprimován v buňkách BL21 Escherichia coli (E. coli).
- Vezměte jednu peletu GST-MTV1 a GST (odpovídající 50 ml bakteriální kultury) a každou resuspendujte ve 2.5 ml pufru pro extrakci ledovým ledem.
- Použijte ultrasonikator UP100H (vybavený MS3 microtip-sonotrode pro malé objemy cca. 2-5 ml) k narušení bakteriálních buněk, dokud nejsou lyzovány, což je indikováno sníženým neprůhledností a zvýšenou viskozitou. To musí být provedeno na ledu a doporučuje se sonikovat v intervalech (např. 10 sekund sonikace následovaná 10 sekundovou pauzou na ledu atd.). Je třeba dbát na to, aby nedošlo k sonikaci s příliš vysokou intenzitou. Pokud je detekováno pěnění nebo tvorba bílé sraženiny, je třeba snížit intenzitu.
- Roztok lyzovaných bakterií se přenese do mikrocentrifugačních zkumavek o objemu 1,5 ml a centrifuguje se při teplotě 4 °C, 16 000 x g po dobu 20 minut.
Ultrazvukové sondy, jako je UP400St využít pracovní princip akustické kavitace pro účinnou lýzu E.coli.
Analýza exprese a purifikace rekombinantního proteinu pomocí ultrazvuku
Peleta E. coli byla sonikována pomocí Hielscher ultrasonikator UP100H. Za tímto účelem byly buněčné pelety resuspendovány v chlazeném lyzačním pufru (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) a chlazeny na ledu po dobu 10 minut. Poté byla buněčná suspenze sonikována 10 krátkými dávkami po 10 s, po nichž následoval interval 30 s pro chlazení. Nakonec byly zbytky článků odstraněny ultracentrifugací při 4 °C po dobu 15 minut při 14000 ot./min. Pro potvrzení exprese rPR byl supernatant aplikován na 12% polyakrylamidový gel a analyzován pomocí SDS-PAGE a Western blotting. Purifikace rPR byla provedena pomocí pryskyřice Ni2+-NTA (Invitrogen, USA) podle návodu výrobce. V této fázi byla použita nativní čistící metoda. Čistota purifikovaného proteinu byla stanovena pomocí elektroforézy na 12% polyakrylamidovém gelu a následného barvení Coomassieho modří. Purifikovaná koncentrace proteinu byla měřena pomocí Micro BCA protein assay kit (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)
Ultrazvukové homogenizátory pro lýzu E. coli
Hielscher Ultrasonics navrhuje, vyrábí a dodává vysoce výkonné ultrazvukové homogenizátory pro spolehlivou a efektivní lýzu bakterií E. coli a dalších buněčných typů, tkání a buněčných kultur.
Široké portfolio ultrazvukových sond i systémů nepřímé sonikace nám umožňuje nabídnout vám ideální ultrazvukový tkáňový homogenizátor pro vaši aplikaci narušení buněk a extrakce.
Projekce, výroba a poradenství – Kvalita Made in Germany
Hielscher ultrasonicators jsou dobře známí pro své nejvyšší standardy kvality a designu. Inteligentní software, intuitivní menu, programovatelná nastavení a automatické protokolování dat jsou jen některé funkce Hielscher ultrasonicators. Robustnost a snadná obsluha umožňují hladkou integraci našich ultrasonicators do výzkumných a biotechnologických zařízení. Dokonce i drsné podmínky a náročná prostředí jsou snadno zvládnutelné Hielscher ultrasonicators.
Hielscher Ultrasonics je společnost certifikovaná ISO a klade zvláštní důraz na vysoce výkonné ultrasonicators s nejmodernější technologií a uživatelskou přívětivostí. Samozřejmě, Hielscher ultrasonicators jsou v souladu s CE a splňují požadavky UL, CSA a RoHs.
Níže uvedená tabulka vám poskytuje přibližný přehled o zpracovatelské kapacitě našich ultrasonicators:
| Objem dávky | Průtok | Doporučená zařízení |
|---|---|---|
| vícejamkové / mikrotitrační destičky | Není k dispozici | UIP400MTP |
| CupHorn pro lahvičky nebo kádinku | Není k dispozici | Ultrazvukový CupHorn |
| Ultrazvukový mikroprůtokový reaktor | Není k dispozici | GDmini2 řekl: |
| až 10 lahviček s 0,5 až 1,5 ml | Není k dispozici | VialTweeter |
| 0Přibližně 5 až 1,5 ml | Není k dispozici | VialTweeter |
| 1 až 500 ml | 10 až 200 ml / min | UP100H |
| 10 až 2000 ml | 20 až 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 až 20L | 0.2 až 4 l/min | UIP2000hdT |
| 10 až 100 l | 2 až 10 l/min | UIP4000 |
| Není k dispozici | 10 až 100 l / min | UIP16000 |
| Není k dispozici | větší | shluk UIP16000 |
Kontaktujte nás! / Zeptejte se nás!
Další protokoly pro ultrazvukovou lýzu E. coli
Proteiny modifikované alicinem v E. coli pomocí ultrazvukové lahvičky Tweeter
Stanovení obsahu sulfhydrylu stanovením 5,5′-dithiobis (kyselina 2-nitrobenzoová) (DTNB)
K inokulaci minimálního média MOPS byla použita jednodenní kultura E. coli MG1655 (1:100). Kultura byla pěstována aerobně, dokud nebylo dosaženo A600 0,4. Kultura byla rozdělena do tří 15ml kultur pro léčbu stresu. Neošetřená kultura sloužila jako negativní kontrola. 0,79 mM allicinu (128 μg ml-1) nebo 1 mM diamidu bylo přidáno do jedné ze zbývajících dvou kultur. Kultury byly inkubovány po dobu 15 min. 5 ml každé kultury bylo odebráno centrifugací (8 525 × g, 4 °C, 10 min). Články byly dvakrát promyty 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, před použitím skladovány anaerobně) a odstředěny (13 000 × g, 4 °C, 10 min). Buňky byly resuspendovány v lyzačním pufru (PBS s 6 mM guanidinium HCl, pH 7,4) před narušením při 4 ° C ultrazvukem (VialTweeter ultrasonikator, Hielscher GmbH, Německo) (3 × 1 min). Buněčný odpad byl peletován centrifugací (13 000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatant byl přenesen do 3,5 ml QS-makro kyvety (10 mm) s magnetickým míchadlem a smíchán s 1 ml lyzačního pufru. Vyhasínání vzorků bylo sledováno při vlnové délce 412 nm spektrofotometrem Jasco V-650 vybaveným teplotně řízeným držákem cely PSC-718 při pokojové teplotě. Bylo přidáno 100 μl 3 mM roztoku dithiobisu (kyseliny 2-nitrobenzoové). Vymírání bylo sledováno, dokud nedosáhlo nasycení. Výpočet koncentrace thiolu byl proveden pomocí extinkčního koeficientu ε412 = 13,700 M-1 cm-1 pro kyselinu thio-2-nitrobenzoovou (TNB). Buněčné koncentrace thiolu byly vypočteny na základě objemu buněk E. coli 6,7 × 10-15 litr a hustota buněk A600 = 0,5 (ekvivalent 1 × 108 Buňky ml-1 kultura). (Müller et al. 2016)
Stanovení glutathionu in vivo pomocí ultrazvukového drtiče článků
E.coli MG1655 byla pěstována v minimálním médiu MOPS v celkovém objemu 200 ml, dokud nebylo dosaženo A600 0,5. Kultura byla rozdělena na 50ml kultury pro léčbu stresu. Po 15 minutách inkubace s 0,79 mM alicinem, 1 mM diamidem nebo dimethylsulfoxidem (kontrola) byly buňky odebrány při 4 000 g při 4 °C po dobu 10 minut. Články byly dvakrát promyty KPE pufrem před resuspenzí pelet v 700 μl KPE pufru. Pro deproteinaci bylo před narušením buněk ultrazvukem (3 x 1 min) přidáno 300 l 10% (w/v) kyseliny sulfosalicylové (3 x 1 min; VialTweeter ultrazvuku). Supernatanty byly odebrány po centrifugaci (30 min, 13 000 g, 4 °C). Koncentrace kyseliny sulfosalicylové byly sníženy na 1 % přidáním 3 objemů pufru KPE. Měření celkového glutathionu a GSSG byla provedena tak, jak je popsáno výše. Koncentrace buněčného glutathionu byly vypočteny na základě objemu buněk E. coli 6,7×10-15 litru a hustota buněk A600 0,5 (ekvivalent 1×108 Buňky ml-1 kultura). Koncentrace GSH byly vypočteny odečtením 2[GSSG] od celkového glutathionu. (Müller et al. 2016)
Exprese lidského mAspAT v E. coli pomocí ultrazvukového homogenizátoru
Jediná kolonie E. coli BL21 (DE3) obsahující expresní vektor v 30 ml média Luria-Bertani (LB) obsahujícího ampicilin 100 μg/ml a poté kultivovaná při 37 °C až do optické hustoty (OD600) dosáhla hodnoty 0,6. Články byly odebrány centrifugací při 4 000 × g po dobu 10 minut a resuspendovány v 3 l čerstvém LB médiu obsahujícím 100 μg/ml ampicilinu.
Následně byla exprese proteinu indukována 1 mM isopropyl β-ᴅ-1-thiogalaktoparynosidem (IPTG) po dobu 20 hodin při 16 °C. Články byly odebrány centrifugací při 8 000 × g po dobu 15 minut a promyty pufrem A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Přibližných 45 g (hmotnost v syrovém stavu) buněk bylo získáno z 3 l kultury. Po centrifugaci byly buněčné pelety resuspendovány ve 40 ml (pro 1 l kultury) ledově chladným extrakčním pufrem A a lyzovány ultrazvukem při ledově chladné teplotě pomocí ultrazvukového drtiče článků Hielscher UP400St. Lýza článku byla centrifugována při 12 000 otáčkách za minutu po dobu 15 minut, aby se oddělily rozpustné (supernatant) a vysrážené (pelety) frakce. (Jiang et al. 2015)
Fakta, která stojí za to vědět
E.coli
Escherichia coli (E. coli) je gramnegativní, fakultativně anaerobní, tyčinkovitá, koliformní bakterie rodu Escherichia, která se běžně vyskytuje v dolním střevě teplokrevných organismů (endotermy). Existuje velké množství kmenů E. coli (nebo podtypů) s různými vlastnostmi. Většina kmenů E. coli je pro člověka neškodná, např. kmeny B a K-12, které se běžně používají pro výzkumné aplikace v laboratořích. Některé kmeny jsou však škodlivé a mohou způsobit vážné onemocnění.
E. coli hraje důležitou roli v moderním biologickém inženýrství a průmyslové mikrobiologii, protože s bakteriemi lze snadno manipulovat. Běžné laboratorní aplikace, které často zahrnují použití E. coli, např. k vytvoření rekombinantní deoxyribonukleové kyseliny (DNA) nebo k fungování jako modelový organismus.
E. coli je velmi všestranným hostitelem pro produkci heterologních proteinů a pro produkci rekombinantních proteinů v E. coli jsou k dispozici rozmanité systémy exprese proteinů. Pomocí plazmidů, které umožňují vysokou úroveň exprese proteinu, mohou být do bakterií zavedeny geny, což umožňuje produkovat takové proteiny ve velkém množství v průmyslových fermentačních procesech.
E.coli se používají jako buněčné továrny na výrobu inzulínu. Mezi další aplikace patří použití modifikovaných buněk E. coli k vývoji a výrobě vakcín a imobilizovaných enzymů, k výrobě biopaliv, jakož i k bioremediaci.
Kmen K-12 je mutantní forma E. coli, která nadměrně exprimuje enzym alkalickou fosfatázu (ALP). K této mutaci dochází v důsledku defektu v genu, který neustále kóduje enzym. Pokud gen produkuje produkt bez jakékoli inhibice, nazývá se to konstitutivní aktivita. Tato specifická mutantní forma se používá k izolaci a purifikaci enzymu ALP.
Bakterie E. coli jsou také široce používány jako buněčné továrny. Upravené mikroby (např. bakterie) a rostlinné buňky lze použít jako takzvané buněčné továrny. Tyto geneticky modifikované buňky produkují molekuly, chemikálie, polymery, proteiny a další látky, které se používají například ve farmaceutickém, potravinářském a chemickém průmyslu. Aby se uvolnily molekuly produkované uvnitř takových bioinženýrských buněk, je ultrazvuková lýza běžnou metodou k narušení buněčných stěn a přenosu cílových látek do okolní kapaliny. Přečtěte si více o lýze bioinženýrských buněk!
Ultrazvukové stříhání DNA
Ultrazvukové smykové síly jsou běžně používanou metodou k uvolnění molekul, organel a proteinů z vnitřku buňky a také k rozbití řetězců DNA na kousky. Akustická kavitace rozbíjí buněčné stěny a membrány, aby extrahovala DNA z buněk a vytvořila fragmenty asi 600 – Délka 800 bp, což je ideální pro analýzu.
Klikněte zde a dozvíte se více o ultrazvukových homogenizátorech pro fragmentaci DNA!
Literatura / Reference
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
Hielscher Ultrasonics vyrábí vysoce výkonné ultrazvukové homogenizátory od laboratoř k průmyslová velikost.