Hielscher ultrazvuková technologie

Ultrazvukové Lýza E. coli

  • coli bakterií E. jsou nejčastěji používané bakterie v mikrobiologii a biotechnologie.
  • Ultrazvukové buněčné disruptory dodávat spolehlivé a reprodukovatelné výsledky pro lyži E. coli.
  • Intenzivní dosud přesně kontrolovatelné kavitační a smykové síly vést k úplné přerušení a ve vysokých výtěžcích extrakce (např. Proteiny, DNA).

Rozrušením buněk kavitací

Bakterie Escherichia coli jsou spolehlivě lyžovány za použití ultrazvukových homogenizátory tkáně.Ultrazvukové sondy typu homogenizátory pracují s cca. 20.000 cyklů za sekundu (při 20 kHz) a způsobují kavitaci v kapalinách nebo supsensions. Akustické kavitace mikroskopické oblasti vakuových podobných tlaků a vysokých teplot, které trhají buňky od sebe. I když teploty mohou dosáhnout několik tisíc stupňů Celsia, objemy kavitace jsou tak malé, že neohřívají proces významně. Ultrazvuk generované akustické kavitace a smykové síly perforovat nebo porušit buněčné membrány E. coli – V závislosti na nastavení tohoto zařízení ultrazvukového homogenizátoru.

Výhodou ultrazvukové Lysis

  • přesné ovládání lyže (intenzita, amplituda, teplota)
  • optimální přizpůsobení na konkrétní vzorky
  • regulace teploty
  • pro velmi malé až velmi velké vzorky (ul na litry)
  • čistý mechanické čištění
  • lineární scale-up z laboratoře do výroby
Ultrazvukový přístroj VialTweeter umožňuje současné přípravu vzorků do 10 lahviček za stejných podmínek. (Klikni pro zvětšení!)

VialTweeter pro ultrazvukové lyži

Žádost o informace





Zatímco chemický a enzymtic lýza může být problematické – protože chemická lýza může měnit proteinové struktury a zavést problémy čištění a enzymatické lýzu vyžaduje dlouhé inkubační doby a není reprodukovatelný – Ultrazvukové narušení je sofistikovaná metoda narušení rychle buňka.
Ultrazvuková lysis pufru je založena pouze na mechanických silách. Žádné chemikálie se nepřidávají, sonikace přeruší stěnu buňky smykacím silami. Chemická Lýza může měnit proteinovou strukturu a způsobit problémy s čištěním. enzymatické rušení vyžaduje dlouhé inkubační časy a není reprodukovatelné.

Obecná doporučení

UP400St ultrasonicator s průtokového reaktoruSonikace je nejoblíbenější technika pro lýzu velmi malé, střední a velké množství buněčných suspenzí – z Pico-l až 100L / h (za použití ultrazvukové průtokové buňky). Buňky se lyžují kapalným střihu a kavitace. DNA je také stříhá při použití ultrazvuku, takže není nutné přidávat DNázu k buněčné suspenzi.
Regulace teploty:
Pre-chlazení vzorku a udržování vzorku při sonikaci na ledu, vzorek tepelné degradace vzorku lze snadno zabránit.
V ideálním případě by měly být vzorky během lýzy udržovány v chladu, ale u většiny vzorků dostačují, pokud se teplota nezvýší nad teplotu kultury nebo zdroje tkáně. Proto se doporučuje udržovat suspenzi na ledu a sonitovat s několika krátkými ultrazvukové impulzy o 5-10 sec a pauze 10-30 sec. Během přestávka se teplo může rozptýlit, aby se znovu vytvořila nízká teplota. U větších vzorků buněk jsou k dispozici různé reaktory pro průtokové buňky s chladicími kabáty.

Protokoly pro přípravu lyzátů E. coli

Analýza exprese a purifikace rekombinantního proteinu

Coli pelety E. se vystaví působení ultrazvuku s ultrazvukovým systémem UP100H (Hielscher). Pro tento účel byla buněčná peleta resuspendována v chlazeném lyzačním pufru (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) a ochlazena na ledu po dobu 10 minut. Poté byla buněčná suspenze podrobena ultrazvuku s 10 krátkými výboji po 10 s, po nichž následovalo 30 sekund pro chlazení. Nakonec byly buněčné úlomky odstraněny ultracentrifugací při 4 ° C po dobu 15 minut při 14000 ot / min. Pro potvrzení exprese rPR se supernatant zpracoval na 12% polyakrylamidovém gelu a analyzoval SDS-PAGE a Western blotting. Purifikace rPR se provádí za použití Ni2 +-NTA pryskyřice (Invitrogen, USA) podle návodu výrobce. V této fázi byla použita nativní způsob čištění. Čistota purifikovaného proteinu byla hodnocena za použití elektroforézy na 12% polyakrylamidovém gelu a následným barvením Coomassie modří. Koncentrace čištěný protein se měří Micro BCA proteinové testovací sady (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al., 2016)

Ultrazvukové buněk disruptor UP100H (100 W) pro lýzu, narušení buněk a DNA stříhání.

Ultrazvuková homogenizátor UP100H 100W

Cell Growth, Síťování a příprava E. coli buněčných extraktů

Pro SeqA a RNA polymerasy ChIP-Chip E. coli MG1655 nebo MG1655 ΔseqA se kultivoval při teplotě 37 ° C na OD600 přibližně 0,15 v 50 ml LB (+ 0,2% glukózy) před přidáním 27 μl formaldehydu (37%) na ml média (konečná koncentrace 1%). Zesíťování se provádí za pomalého protřepávání (100 otáček za minutu) při teplotě místnosti po dobu 20 minut, načež následuje kalení 10 ml 2,5 M glycinu (konečná koncentrace 0,5 M). Pro pokusy s tepelným šokem byl E. coli MG1655 pěstován v 65 ml LB média při 30 ° C na OD600 přibližně 0,3. Následně se 30 ml kultury přenese do předem zahřáté baňky při 43 ° C a zbytek se udržuje na teplotě 30 ° C. Zesíťování a kalení bylo popsáno výše s tím rozdílem, že buňky byly udržovány při 30 nebo 43 ° C po dobu 5 minut před dalším pomalým protřepáváním při pokojové teplotě. Buňky byly odebrány centrifugací a promyty dvakrát studeným TBS (pH 7,5). Po resuspendování v 1 ml lyzačního pufru (10 mM Tris (pH 8,0), 20% sacharózy, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lysozymu) a inkubace při 37 ° C po dobu 30 minut a následné přidání 4 ml IP pufru byly buňky sonikovány na ledu s 12 krát třicet 30 s a 30 s při jednom UP400St Ultrazvukový procesor (Hielscher Ultrasonics GmbH) se 100% výkonu. Po odstředění po dobu 10 minut při 9000 g, 800 ul aliquotes supernatantu byly skladovány při -20 ° C. (Waldminghaus 2010)

Nadprodukce a čištění enzymů.

Pro nadprodukci decahistidine (His10) -tagged proteinů E. coli BL21 (DE3) byla transformována pET19b konstrukty. Přes noc prekultura se shromáždí centrifugací, a 1% se použije k naočkování expresní kultury. Buňky nesoucí pET19mgtB byly pěstovány při teplotě 22 ° C až do dosažení optické hustoty při 600 nm (OD600) 0,7. Kultura byla přenesena do 17 ° C a indukovány 100 uM IPTG. Po 16 hodinách se kultura sklidí odstředěním při 7500 x g při 4 ° C. Buňky byly resuspendovány v 50 mM fyziologickém roztoku pufrovaném fosfáty (PBS) s 0,3 M NaCl při pH 7,4 a rozrušeny ultrazvukem s S2 mikro-tip sonotrody Na UP200St ultrasonicator (Hielscher, Teltow, Německo) při cyklu 0,5 a amplitudou 75%.
Nadprodukce decahistidine značený GtfC byl indukován při 37 ° C na OD600 0,6 s 100 uM IPTG. Buňky pak byly inkubovány po dobu 4 hodin, sklizeny a lyžovány, jak je uvedeno výše pro MgtB.
Surové buněčné extrakty byly centrifugovány při 15000 x g a 4 ° C, aby došlo k sedimentaci buněčných zbytků. Vyčeřený extrakty byly naneseny na 1-ml HisTrap FF Surové sloupci za použití systému ÄKTAprime Plus (GE Healthcare). Enzymy byly čištěny podle protokolu výrobce pro gradientovou elucí His-značených proteinů. Eluované proteinové roztoky byly dvakrát dialyzuje proti 1,000 objemech 50 mM PBS, pH 7,4, s 0,3 M NaCl při teplotě 4 ° C. Purifikace byla analyzována pomocí 12% SDS-PAGE. Koncentrace proteinu byla stanovena Bradfordovou metodou za použití Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Německo). (Rabausch et al., 2013)

Extrakce proteinu z bakterií E. coli
Návnady protein (v tomto případě, MTV1 z Arabidopsis thaliana) je fúzován s GST tag a exprimován v BL21 Escherichia coli (E. coli) buněk.
1. Vezměte jeden peleta GST-MTV1 a GST (což odpovídá 50 ml bakteriální kultury) a resuspendace každé v 2,5 ml ledově studené pufru extrakce.
2. Použijte ultrasonicator UP100H (Vybavený MS3 mikrohrotem-sonotrody pro malé objemy (2-5mL)) k rozrušení bakteriální buňky, dokud nejsou lyžovány, což je indikováno sníženou opacitou a zvýšenou viskozitou. To musí být provedeno na ledu, a doporučuje se vystaví působení ultrazvuku v časových intervalech (např. 10 s sonifikační následuje 10 sekund na ledu, a tak dále). Péče musí být přijata, aby Zpracuje se ultrazvukem za příliš vysokou intenzitou. V případě pěny nebo je detekována tvorba bílé sraženiny, musí být snížena intenzita.
3. Přenos lyžovaných bakterií řešení do 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky a odstředí se při teplotě 4 ° C, 16000 x g po dobu 20 minut.

Allicin-modifikované proteiny v E. coli

VialTweeter je komfortní ultrasonicator na malém vzorku homogenizaciStanovení sulfhydrylových Obsah od 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoové kyseliny) (DTNB) Obsah
Přes noc pěstované kultury E. coli MG1655 se použije k naočkování MOPS minimální médium (1: 100). Kultura byla pěstována za aerobních podmínek až do dosažení A600 0,4. Kultura byla rozdělena do tří 15 ml kultur na stres léčbu. Neošetřená kultura sloužila jako negativní kontrola. 0,79 mM allicin (128 ug ml-1) Nebo 1 mM diamid se přidá k jedné ze zbývajících dvou kultur každý. Kultury byly inkubovány po dobu 15 minut. 5 ml každé kultury byly sklizeny centrifugací (8525 x g, 4 ° C, 10 min). Buňky byly dvakrát promyty 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, anaerobně skladované před použitím) a centrifugovány (13 000 x g, 4 ° C, 10 min). Buňky byly resuspendovány v lyzačním pufru (PBS 6 mM guanidinium-HCl, pH 7,4) před rozbitím při 4 ° C pomocí ultrazvuku (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Německo) (3 x 1 min). Zbytky buněk byly peletovány centrifugací (13000 x g, 4 ° C, 15 min). Supernatant byl přenesen do 3,5 ml QS-makro kyvety (10 mm) s magnetickou míchací tyčinkou a smísí s 1 ml lyzačního pufru. Zánik vzorků byl monitorován při 412 nm se na spektrofotometru Jasco V-650 vybaveným regulovanou teplotou držáku buněk PSC-718 (Jasco) při teplotě místnosti. Přidá se 100 ul roztoku 3 mM dithiobis (2-nitrobenzoové kyseliny). Extinkce byla sledována až do dosažení nasycení. Výpočet koncentrace thiolu bylo provedeno za použití extinkčního koeficientu e412 = 13700 M-1 Cm-1 na thio-2-nitrobenzoové kyseliny (TNB). Buněčné thiolové koncentrace byly vypočteny na základě objemu buněk E. coli na 6,7 ​​x 10-15 litr a hustoty buněk A600 = 0,5 (odpovídá 1 x 108 buňky ml-1 kultura). (Muller a kol. 2016)

V Vivo Glutathion stanovení

E. coli MG1655 byly pěstovány v minimálním médiu MOPS v celkovém objemu 200 ml, dokud A600 bylo dosaženo hodnoty 0,5. Kultivace byla rozdělena na 50 ml kultivaci pro ošetření stresem. Po 15 minutách inkubace s 0,79 mM allicinu, 1 mM diamidu nebo dimethylsulfoxidu (kontrola) byly buňky sklizeny při 4 000 g při 4 ° C po dobu 10 minut. Buňky byly dvakrát promyty pufrem KPE před resuspendováním pelet v 700 μl KPE pufru. Pro deproteinaci bylo přidáno 300 ul 10% (hmotn./obj.) Kyseliny sulfosalicylové před přerušením buněk pomocí ultrazvuku (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Supernatanty byly sbírány po odstředění (30 min, 13.000 g, 4 ° C). Koncentrace kyseliny sulfosalicylové byly sníženy na 1% přídavkem 3 objemů KPE pufru. Měření celkového glutathionu a GSSG byly provedeny, jak je popsáno výše. Buněčné koncentrace glutathionu byly vypočteny na základě objemu E. coli buňky 6.7×10-15 litr a hustoty buněk A600 00,5 (ekvivalent 1×108 buňky ml-1 kultura). Koncentrace GSH se vypočítá odečtením 2 [GSSG] z celkového glutathionu. (Muller a kol. 2016)

Ultrazvuková disruptor pro lyži buněk a extrakce biologického materiálu (Klikněte pro zvětšení!)

Sondy typu ultrasonicator UP400St

Exprese lidského mAspAT v E. coli

Ultrazvukové buněk disruptor UP400St (400W) pro extrakci intracelulární hmoty (například proteiny, organely, DNA, RNA atd.)Jediná kolonie E. coli BL21 (DE3) nesoucí expresní vektor, ve 30 ml Luria-Bertani (LB) média obsahujícího 100 ug / ml ampicilinu, a kultivován při teplotě 37 ° C až do optické hustoty (OD600) Dosáhl 0,6. Buňky byly sklizeny centrifugací při 4000 x g po dobu 10 minut a resuspendovány v čerstvém 3L LB média obsahujícího 100 ug / ml ampicilinu.
Následně, exprese proteinu byla indukována pomocí 1 mM isopropyl-beta ᴅ-1-thiogalaktopyranosidu (IPTG) po dobu 20 hodin při teplotě 16 ° C. Buňky byly sklizeny centrifugací při 8000 x g po dobu 15 minut a promyje se pufrem A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Aproximovat 45 g (mokrá hmotnost) buňky byly získány od 3 L kultury. Po odstředění, buněčné pelety se resuspendovaly v 40 ml (1 L kultura) ledem chlazeného extrakčního pufru a lyžovány ultrazvukem při teplotě ledově chladného za použití UP400St Přístroj (Dr. Hielscher GmbH, Německo). Buněčná lýze byl centrifugován při 12000 otáčkách za minutu po dobu 15 minut, aby se oddělí rozpustné (supernatant) a vysrážené (pelety) frakce. (Jiang et al., 2015)

Níže uvedená tabulka vám dává informaci o přibližné zpracovatelské kapacity našich ultrasonicators:

Hromadná dávka průtok Doporučené Devices
00,5 až 1,5 ml na VialTweeter
1 až 500 ml 10 až 200 ml / min UP100H
10 až 2000ml 20 až 400 ml / min Uf200 ः t, UP400St
00,1 až 20L 00,2 až 4 litry / min UIP2000hdT
10 až 100L 2 až 10 l / min UIP4000
na 10 až 100L / min UIP16000
na větší hrozen UIP16000

Kontaktujte nás! / Zeptej se nás!

Použijte formulář níže, pokud chcete požádat o další informace o ultrazvukové homogenizace. Budeme rádi Vám nabídnout ultrazvukový systém plnění vašich požadavků.









Uvědomte si prosím naši Zásady ochrany osobních údajů,


Literatura / Reference



Fakta Worth Knowing

E-coli

Escherichia coli (E. coli) je gramnegativní, fakultativně anaerobní, koliformní bakterie rodu Escherichia, která se běžně vyskytuje v dolním střevě teplokrevných organismů (endotermů). Existuje velké množství kmenů E. coli (nebo podtypů) s různými charakteristikami. Většina kmenů E. coli je pro člověka neškodná, např. Kmeny B a K-12, které se běžně používají pro výzkumné aplikace v laboratořích. Nicméně některé kmeny jsou škodlivé a mohou způsobit vážná onemocnění.
E. coli hraje důležitou roli v moderní biologické inženýrství a průmyslové mikrobiologii, protože bakterie jsou snadno manipulovat. Běžné laboratorní aplikace, které zahrnují často použití E. coli, například vytvořit rekombinantní deoxyribonukleové kyseliny (DNA), nebo působí jako modelový organismus.
E. coli je velmi univerzální hostitele pro produkci heterologních proteinů, a rozdělovače proteinové expresní systémy jsou k dispozici pro výrobu rekombinantních proteinů v E. coli. Pomocí plasmidů, které umožňují vysokou hladinu exprese proteinu, geny mohou být zavedeny do bakterií, které umožňuje, aby se na produkci těchto proteinů ve velkém množství v průmyslových fermentačních procesů.
E. coli jsou používány jako buněčné továrny k produkci inzulinu. Další aplikace zahrnují použití modifikovaných buněk E. coli, na vývoj a výrobu vakcíny a imobilizované enzymy, pro výrobu biopaliv, stejně jako pro bioremediaci.
Kmen K-12 je mutantní forma E. coli, která nadměrně exprimuje enzym alkalické fosfatázy (ALP). Tato mutace se vyskytuje v důsledku defektu v genu, který neustále kóduje enzym. Pokud gen vytváří produkt bez inhibice toto je známé jako konstitutivní aktivity. Tento specifický mutantní forma se používá k izolaci a čištění ALP enzymu.

Ultrazvukové DNA Stříhání

Ultrazvukové smykové síly jsou běžně používaná metoda k oddělení z buňky a rozbít řetězců DNA na kusy. Akustické kavitace přestávky buněčné stěny a membrány pro extrakci DNA z buněk a generovat fragmenty o 600 – 800 párů bází, který je ideální pro analýzu.
Zde se dozvíte více o ultrazvukové homogenizátory pro fragmentaci DNA!