Ultrazvukové Extrakce proteinu z tkáňových a buněčných kultur
- Extrakce bílkovin je základním příprava vzorku krokem proteomiky.
- Proteiny mohou být extrahovány z rostlinné a živočišné tkáně, kvasinek a mikroorganismů.
- Sonikace je spolehlivý a účinný způsob extrakce proteinu dává vysoké výtěžky proteinu v krátké době extrakce.
Extrakce bílkovin z tkání a buněk
Extrakce proteinů z tkání a kultivovaných buněk je základním krokem přípravy vzorku, který se provádí během mnoha biochemických a analytických technik, jako jsou ELISA, PAGE, Western blotting, hmotnostní spektrometrie nebo purifikace proteinů. Ultrazvukové narušení buněk, lýza a extrakce je přesně kontrolovatelná, netepelná technika pro zajištění vysokých výnosů bílkovin.
Extrakce bílkovin z buněk s ultrazvuková sonda UP200St
- rychlý
- vysoké výnosy
- vysoce účinný
- Přesná kontrola nad parametry
- reprodukovatelné výsledky
- lineární škálovatelnost
Obecné pokyny pro ultrazvukovou lýzu a extrakci bílkovin
- Regulace teploty: Pro zajištění vysokého výtěžku proteinu bez tepelné denaturaci, Teplota během extrakce musí být kontrolovány. state-of-art ultrazvukové homogenizátory Hielscher je – také nazývaný ultrazvukový dezintegrátor nebo ultrasonifikátor – jsou přesně kontrolovatelné. Přicházejí s čidlem plugable teploty. V možnostech nastavení ultrazvukového homogenizátoru, maximální teplota může být nastavena. Po dosažení této teploty max se ultrasonicator automaticky zastaví, dokud se vzorek ochladí.
- Vyrovnávací paměti: Volba vhodného pufru a pravé objemu pufru se pohybuje od tkáně do tkáně a musí být přišel-out testováním metodou pokusu a omylu.
- Izolace / čištění: Proteinové lyzáty mohou obsahovat přebytek biomolekul, jako je DNA nebo sacharidů, které mohou být odstraněny tím, vysrážení proteinu (kyselina deoxycholátu-trichlor) nebo výměně pufru.
Chittapalo a Noomhorm (2009) ve své studii uvedli, že výtěžek bílkovin se zvýšil pomocí sonikace a že ultrazvuková homogenizace tkání a proces lýzy může významně zlepšit stávající extrakční procesy – umožnění nových obchodních příležitostí těžby.
ultrazvukové cuphorn pro současnou, vysoce účinnou přípravu více vzorků za stejných podmínek pro izolaci proteinů a fragmentaci DNA.
Extrakce proteinu z živočišné tkáně
Při přípravě celistvých tkání (např. Ledviny, srdce, plic, svalů apod.) By se tkáň měla rozřezat na velmi malé kousky čistými nástroji, přednostně na ledu a co nejrychleji, aby se zabránilo degradaci proteázami (např. lýzovací pufr, jako je RIPA nebo hypotonický lyzační pufr obsahující koktejl inhibitoru proteázy a fosfatázy). Po disekování se vzorek ponoří do kapalného dusíku pro zmrazení. Vzorek může být skladován při -80 ° C pro pozdější použití nebo může být uchováván na ledu pro okamžitou homogenizaci. Bezprostředně před extrakcí ultrazvukem se do zkumavky vzorku rychle přidá ledový lyzační pufr (s inhibitory proteázy DTT, leupeptinem a aprotininem) (na ~ 10 mg tkáně se doporučuje přibližně 600 μl pufru). Cca. Pro každou zkumavku se doporučuje 20-60 mg tkáně.
Ultrazvuková homogenizace, lýza a extrakce se provádí pomocí ultrazvukového homogenizátoru, jako je UP100H nebo UP200Ht, vybavený sonotrodou s mikrošpičkou. Doba sonikace je 60-90 sec. v režimu ultrazvukového cyklu 15 sec. sonikace a 10 sec. doba odpočinku. Vzorek by měl být po celou dobu uchováván v ledu.
Po ultrazvukové homogenizace / extrakce, lyzát odstřeďován při 27,000g po dobu cca. 20 min. Potom se supernatant se oddělí tak, že koncentrace proteinu se může stanovit testem proteinu, jako Pierce analýzu proteinů BCA.
Extrakce proteinu z krevního séra
Pro homogenní směs séra a fosfátového pufru se vzorek nejprve víruje před ultrazvukovou lýzou buněk. Pro ultrazvukovou lýzu je vzorek sonikován ultrazvukovým laboratorním homogenizátorem, jako je UP100H pro 8 cyklů při 20% amplitudě, pro cykly každých 5 sekund zapnuto a 15 sekund vypnuto. Extrakce proteinů se provádí sonikací v cyklech (pulzační režim) a umístěním vzorku na led tak, aby se zabránilo přehřátí a tepelné degradaci vzorku. Vzhledem k tomu, že sérum obsahuje velké množství proteinů s vysokou molekulovou hmotností (jako je albumin, α1-antitrypsin, transferrin, haptoglobulin, imunoglobulin G a imunoglobulin A), které interferují s separací proteinů s nízkou molekulovou hmotností během IEF, doporučuje se je vyčerpat ze séra pomocí depleční kolony.
Extrakce proteinu z rostlinné tkáně
Čerstvé, měkké rostlinná tkáň, např. mech atd., může být snadno narušeny jednoduše umístěním nakrájenou vzorek materiálu v lyzačním pufru za použití ultrazvuku. Tuhé, ligenous rostlinných tkání, jako jsou semena, jedle jehly apod, by se měly provádět za sucha. Některé pevné, dřevina materiály musí být zmraženy a mele v tekutém dusíku před extrahována pomocí ultrazvuku. Pro rostlinné buněčné kultury suspenzí, ultrazvukový ošetření mezi 30 a 150 sekund v pufru pro lýzu je většinou dostačující. Tužší materiál, jako jsou dýňová semínka potřebují intenzivnější ultrazvuku, jak je popsáno níže.
Protokol pro ultrazvukové extrakce albuminu z dýňových semínek
Pro ultrazvukovou extrakci bílkovin albuminu z jemně mletého dýňového prášku se do skleněné kádinky o objemu 250 ml přidá 10 g odtučněného prášku z dýňových semen a 100 ml deionizované vody jako rozpouštědla. Extrakce proteinů se skládá ze dvou kroků: Nejprve je vzorek sonikován sonda typu ultrasonicator UP400St (400W, 24kHz) vybavený sonotrodou S24d7. Skleněná kádinka se během ultrazvukové homogenizace umístí do studené vodní lázně. Připojitelný teplotní čidlo a nastavení regulace teploty ultrasonicator UP400St zajistit, že teplota vzorku je vždy udržována pod 30 ° C. Přesnou regulací teploty během sonikace se zabrání denaturaci albuminu. Za druhé, extrakce byla prováděna míchačkou při otáčkách 200 ot/min a při 30 °C. Poté se kádinka převede do termostatické třepačky. Globulin se odstraňuje dialýzou destilovanou vodou. Po odstranění globulinu může být proteinový extrakt odebrán pro stanovení albuminového profilu a následně upraven na pI = 3,0 za použití 0,1 M HCl pro koagulaci albuminu. Pevná fáze se oddělí odstřeďováním při teplotě 5000 g, 20 °C a znovu se rozpustí v deionizované vodě. Koagulace albuminu se provádí dvakrát, aby se zvýšil poměr bílkovin v koncentrátu albuminu.
Ultrazvukové alkalické extrakce proteinu pro přípravu proteinového koncentrátu z rýžových otrub, ukazuje, že ultrazvukové léčba vede k vyššímu výtěžku proteinu v podstatně kratší době extrakce – ve srovnání s běžnými extrakčními metodami.
Příprava vzorků protokol pro funkční iNOS enzym
Pro získání plně funkčního enzymu iNOS (např. pro screening léků) se doporučuje následující protokol: Buněčná suspenze by měla být umístěna na led a je sonikována pomocí UP100H při amplitudě 10μm v režimu cyklu 5 sec. sonikace a 25 sec. odpočinek na ledu. Postup by měl být opakován přibližně 3 krát. Doba odpočinku mezi cykly sonikace snižuje nárůst teploty, a proto sníží riziko denaturace.
Ultrazvukové Protein Rozpouštění
Sonikace může urychlit proces rozpouštění bílkovin, což obvykle trvá několik hodin. Aby nedošlo k přehřátí vzorku a zabránění degradace proteinů a změny v roztocích, obsahujících močovinu, měly by ultrazvukové impulsy neměla být delší než několik sekund.
Ultrasonicator UP200Ht s 2mm microtip S26d2 pro sonikaci malých vzorků.
Ultrazvukové zařízení pro Protein Extraction
Hielscher Ultrasonics nabízejí širokou škálu ultrazvukové homogenizátory pro dezintegraci buněk, tkání, bakterie, mikroorganismy, kvasinky a spóry.
Hielscher laboratorní ultrasonicators jsou výkonné a snadno ovladatelné. Jsou konstruovány pro provoz 24 hodin denně, 7 dní v týdnu a jsou navrženy jako robustní a efektivní laboratorní a stolní zařízení. U všech zařízení lze přesně řídit energetický výkon a amplitudu. Široká škála příslušenství otevírá další možnosti nastavení. Digitální ultrasonicators jako VialTweeter, UP200Ht, UP200St, a UP400St mají integrovanou regulaci teploty a vestavěnou SD kartu pro automatické nahrávání dat.
Pro nepřímé, bez křížové kontaminace a současné sonikace více vzorků nabízíme VialTweeter nebo ultrazvukový CupHorn.
Níže uvedená tabulka vám poskytuje přehled o našich ultrasonicators pro přípravu vzorků, narušení buněk a extrakci. Kliknutím na typ zařízení získáte další informace o každém ultrazvukovém homogenizátoru. Náš dobře vyškolený a dlouholetý zkušený technický personál vám rád pomůže vybrat nejvhodnější ultrasonicator pro přípravu vzorků!
| Hromadná dávka | průtok | Doporučené Devices |
|---|---|---|
| až 10 injekčních lahviček nebo zkumavek | na | VialTweeter |
| multiwell / mikrotitrační desky | na | UIP400MTP |
| více trubek / nádob | na | CupHorn |
| 1 až 500 ml | 10 až 200 ml / min | UP100H |
| 10 až 1000 ml | 20 až 200 ml/min | Uf200 ः t, UP200St |
| 10 až 2000ml | 20 až 400 ml / min | UP400St |
V závislosti na aplikaci, materiálu a objemu vzorku, doporučíme vám nejvhodnější nastavení pro váš vzorek prep. Kontaktujte nás ještě dnes!
Kontaktujte nás! / Zeptej se nás!
Hielscher digitální ultrasonicators jsou vybaveny dálkovým ovládáním prohlížeče a automatickým protokolováním dat na integrované SD kartě.
VialTweeter pro nepřímé použití ultrazvuku.
Fakta Worth Knowing
proteomika
Proteomika je výzkum pole, které šetří proteiny a proteomu. Proteiny fullfil obrovské množství životně důležitých funkcí v organismu. Proteomu je celý soubor proteinů exprimovaných v genomu buňky, tkáně nebo organismu v určitém čase. Proteomu se mění s časem a různých požadavků, nebo napětí, že se buňka nebo organismus prochází. Přesněji řečeno, je množina exprimovaných proteinů v daném typu buňky nebo organismu, v daném okamžiku, za definovaných podmínek. Termín je směs bílkovin a genomu. Proteomika je studium proteomu.
Bílkovin
Bílkoviny jsou velké biomolekul, takzvané makromolekuly – které jsou složeny z jednoho nebo více dlouhých řetězců aminokyselinových zbytků. Proteiny jsou přítomny ve všech organismech rostlinného i živočišného původu a jsou rozhodující pro většinu biologických funkcí. Protože proteiny obsahují mnoho biologických informací, jsou extrahovány pro analytické účely, např. Pro proteomický výzkum. Nejdůležitější funkcí, kterou proteiny provádějí, jsou katalýza metabolických reakcí, replikace DNA, odezva na stimuly a transport molekul z jednoho místa do druhého. Proteiny se navzájem liší primárně ve své sekvenci aminokyselin, která je diktována nukleotidovou sekvencí jejich genů a která obvykle vede k tomu, že se protein skládá do specifické trojrozměrné struktury, která určuje její aktivitu. Proteiny jsou – kromě peptidů – Jedním z klíčových složek potravy. Z tohoto důvodu, proteomika je mocným nástrojem v potravinářské vědy pro optimalizaci procesů, bezpečnosti potravin a nutriční hodnocení.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction je preanalytický postup pro separaci a prekoncepci analytů. V kombinaci s ultrazvuku může být zesílena extrakce oblačných bodů, což činí proces efektivnějším, rychlejším a šetrnějším k životnímu prostředí. Při ultrazvuku je extrakce zákalového bodu výrazně účinnější metodou přípravy analytu. Přečtěte si více o ultrazvukem asistované extrakci oblačných bodů!Gelová elektroforéza
Gelová elektroforéza je hlavní metoda pro separaci a analýzu makromolekul, jako je DNA, RNA a proteinů, stejně jako jejich fragmenty, v závislosti na jejich velikosti a náboje. Používá se v klinické chemii pro separaci proteinů podle náboje a / nebo velikosti (IEF agaróza, v podstatě velikost nezávislý) a biochemie, molekulární biologie a proteomika oddělit smíšenou populaci DNA a RNA fragmenty podle délky, odhadnout velikost DNA a RNA fragmenty nebo pro separaci proteinů podle náboje.
buněčné kultury
Buněčná kultura je řízen rostoucí proces, při kterém jsou buňky kultivovány za řízených podmínek. Podmínky kultivace buněk se liší pro každý typ buňky. Obecně platí, že prostředí buněčné kultury se skládá z vhodné nádoby (např. Petriho misky) se substrátem, nebo médiu, které dodává základní živiny (aminokyseliny, sacharidy, vitamíny, minerální látky), růstové faktory, hormony, a plyny (CO2The2), A reguluje fyzikálně-chemické prostředí (pH pufr, osmotický tlak, teplota). Většina buněk potřebují povrch nebo umělém substrátu, zatímco jiné buněčné kultury mohou být pěstovány bez plovoucí v kultivačním médiu (suspenzní kultuře, buněčné suspenze).
Hromadné kultury buněčných linií na zvířatech se používají při průmyslové výrobě virových vakcín a dalších biotechnologicky získaných produktů. Lidské kmenové buňky jsou kultivovány, aby rozšířit počet buněk a diferenciaci buněk do různých somatických buněčných typů pro účely transplantace.
tkáňové vzorky
Termín tkáň popisuje buněčná meziprodukt, kde buňka je materiál na organizační úrovni mezi buňkami a úplný orgán. V tkáni, podobné buňky, ze stejného původu, které společně vykonávají specifickou funkci, jsou sestaveny. Funkčním seskupení mnoha tkáních, jsou vytvořeny komplexní struktury orgánů.
Tkáň se vzorky pro výzkum v biologii, histologie / histopatologie, parazitologie, biochemie, imunohistochemie i kultivovat a extrakci DNA. To může být rozlišováno mezi zvířat (dělení: savec tkáně) a rostlinné tkáně. Živočišné tkáně jsou seskupeny do čtyř základních typů pojivových, svalů, nervové a epitelové tkáně. Rostlinná tkáň je rozdělena do následujících tří tkáňových systémů: epidermis, v přízemí tkáně a cévní tkáně.
Vzorky tkáně se mohou připravit z živočišných nebo rostlinných částí, např kostí, svalů, listí, atd.
Tělní tekutiny
Krev, sérum, plazma, mozkomíšní mok, sliny a synoviální tekutině jsou tělesné tekutiny, které nabízejí velký zdroj diagnosticky relevantních informací. Proto sofistikovaný příprava vzorků tělních tekutin pro analýzu je důležité. První potíž je spojen s širokým dynamickým rozsahem složek přítomných v tělních tekutinách.
Stanovení koncentrace proteinů
Bradford test, Lowry test a test kyselina bicinchoninová (BCA) jsou běžné testy pro stanovení koncentrace proteinů. Hovězí sérový albumin (BSA), je jedním z nejčastěji používaných proteinového standardu.
Lýzový pufr
Lyzační pufr musí být vybrán v souladu s buněčného materiálu nebo tkáně (tkáňové kultuře, rostlin, bakterií, plísní, atd.), A to, zda buňky jsou ve struktuře a typu konstrukce. Široká škála lýze vyrovnávacích pamětí pro extrakci proteinů, membrán a organel jsou formulovány s jedním nebo více detergentů. Detergent se obvykle volí prostřednictvím pokusu a omylu zkoušek nebo – Pokud je k dispozici – podle existujícího proteinu a extrakci protokolu. Prací prostředek musí být kompatibilní se zdrojem tkáně a proteinů. Obecně platí, že nejmírnější prací prostředek, který pracuje pro konkrétní tkáně / proteinu, je zvolen tak, aby se udržela maximální funkčnost extraktu. Kromě toho, v případě extrakce membrán a organel, jemný prací prostředek udržuje membrána neporušený. Běžně používané detergenty v lyzačním pufrů jsou převážně neiontová nebo obojetná, např. CHAPS, deoxycholát, Triton ™ X-100, NP40, a Tween 20.
Například, tkáně, jako je mozek, játra, střeva, ledviny, slezina atd. Mohou být jednoduše pufrován RIPA – by však měly být zahrnuty inhibitory proteáz a DTT (např. pro gelové elektroforézy).
Lyzační pufr pro tkáně kosterního svalstva (led studené): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 1 mM MgCl 2, 1% Triton X-100, 10% (hmotnost / objem) glycerol, 1 mM EDTA , 1 mM dithiothreitolu, doplněném proteázy a inhibitor fosfatasy koktejl
Tabulka běžných pufrů a jejich rozmezí pH. Obecně jsou tyto pufry se obvykle používají v koncentracích 20-50 mM.
| nárazník | rozmezí pH |
|---|---|
| Kyselina citronová – Naoh | 2,2 – 6,5 |
| Citrát sodný – Kyselina citronová | 3,0 – 6,2 |
| Octan sodný – octová kyselina | 3,6 – 5,6 |
| sodná sůl kyseliny Cacodylic – Hcl | 5,0 – 7,4 |
| MY – Naoh | 5,6 – 6,8 |
| Dihydrogenfosforečnanu sodného – hydrogenfosforečnan sodný | 5,8 – 8,0 |
| imidazol – Hcl | 6,2 – 7,8 |
| Mopy – Koh | 6,6 – 7,8 |
| triethanolamin hydrochlorid – Naoh | 6,8 – 8,8 |
| Tris – Hcl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – Naoh | 7,2 – 8,2 |
| tricin – Naoh | 7,6 – 8,6 |
| tetraboritan sodný – kyselina boritá | 7,6 – 9,2 |
| Bicinu – Naoh | 7,7 – 8,9 |
| glycin – Naoh | 8,6 – 10,6 |
Většina pufry vykazují pH závislost s teplotou. To platí zejména pro Tris pufry. Hodnota pKa se mění od 8,06 při teplotě 25 ° C až 8,85 při teplotě 0 ° C.
(PH a pKa pufru: pH měří koncentrace vodíkových iontů ve vodném roztoku pKa (= disociační konstanta kyseliny) je příbuzný, ale konkrétnější opatření v tom, že pomáhá předvídat, jak molekula, bude působit na specifický. hodnota PH.)
TRIzol
Trizol je chemický roztok pro extrakci RNA / DNA / proteinu během extrakce guanidin thiokyanát-fenol-chloroform. Použití ultrazvukem asistované výsledků TRIzol odsávání ve vysokém DNA, RNA a proteinové výtěžky ze stejného vzorku a vyniká tím Jiné metody extrakce.
Literatura / Reference
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.