Ultrazvuková extrakce proteinů z tkáňových a buněčných kultur
- Extrakce proteinů je základním krokem přípravy vzorku v proteomice.
- Proteiny lze extrahovat z rostlinných a živočišných tkání, kvasinek a mikroorganismů.
- Sonikace je spolehlivá a účinná metoda extrakce proteinů, která poskytuje vysoké výnosy bílkovin během krátké doby extrakce.
Extrakce proteinů z tkání a buněk
Extrakce proteinů z tkání a kultivovaných buněk je základním krokem přípravy vzorku, který se provádí během mnoha biochemických a analytických technik, jako je ELISA, PAGE, Western blotting, hmotnostní spektrometrie nebo purifikace proteinů. Ultrazvukové narušení, lýza a extrakce buněk je přesně kontrolovatelná, netepelná technika pro zajištění vysokých výnosů proteinů.
Extrakce proteinů z buněk pomocí ultrazvuková sonda UP200St
- Rychlý
- Vysoké výnosy
- Vysoká efektivita
- Přesná kontrola nad parametry
- Reprodukovatelné výsledky
- Lineární škálovatelnost
Obecné pokyny pro ultrazvukovou lýzu a extrakci proteinů
- Regulace teploty: Aby byl zajištěn vysoký výtěžek bílkovin bez tepelné denaturace, musí být teplota během extrakce kontrolována. Hielscherovy nejmodernější ultrazvukové homogenizátory – Nazývá se také ultrazvukový dezintegrátor nebo ultrasonifikátor – jsou přesně ovladatelné. Dodávají se se zásuvným teplotním čidlem. V možnostech nastavení ultrazvukového homogenizátoru lze nastavit maximální teplotu. Když je dosaženo této maximální teploty, ultrasonikátor se automaticky zastaví, dokud vzorek nevychladne.
- Vyrovnávací paměť: Volba vhodného pufru a správného objemu pufru se liší tkáň od tkáně a musí být stanovena testováním pokusů a omylů.
- Izolace / čištění: Proteinové lyzáty mohou obsahovat nadbytek biomolekul, jako je DNA nebo sacharidy, které mohou být odstraněny srážením bílkovin (kyselina deoxycholát-trichloroctová) nebo výměnou pufrů.
Chittapalo a Noomhorm (2009) uvedli ve své studii, že výtěžek bílkovin se zvýšil pomocí sonikace a že ultrazvukový proces homogenizace a lýzy tkání může výrazně zlepšit stávající extrakční procesy – umožňující nové příležitosti pro komerční těžbu.
Ultrazvukový CupHorn pro simultánní, vysoce účinnou přípravu více vzorků za stejných podmínek pro izolaci proteinů a fragmentaci DNA.
Extrakce proteinů z živočišné tkáně
Pro přípravu tkáně celé velikosti (např. ledviny, srdce, plíce, svaly atd.) by měla být tkáň rozpitvána na velmi malé kousky čistými nástroji, nejlépe na ledu a co nejrychleji, aby se zabránilo degradaci proteázami (např. lyzačním pufrem, jako je RIPA, nebo hypotonickým lyzačním pufrem obsahujícím koktejl inhibitorů proteázy a fosfatázy). Po vypreparování se vzorek ponoří do tekutého dusíku, aby se zmrazil. Vzorek může být skladován při teplotě -80 °C pro pozdější použití nebo může být uchováván na ledu pro okamžitou homogenizaci. Bezprostředně před ultrazvukovou extrakcí se do zkumavky se vzorkem rychle přidá ledově studený lýzní pufr (s inhibitory proteázy DTT, leupeptinem a aprotininem) (na ~ 10 mg tkáně se doporučuje přibližně ~ 600 μl pufru). Na jednu zkumavku se doporučuje přibližně 20-60 mg tkáně.
Ultrazvuková homogenizace, lýza a extrakce se provádí ultrazvukovým homogenizátorem, jako je UP100H nebo UP200Ht, vybaveným sonotrodou s mikrohrotem. Doba trvání ultrazvuku je 60-90 sec. v režimu ultrazvukového cyklu 15 sec. sonikace a 10 sec. doba odpočinku. Vzorek by měl být neustále uchováván v ledu.
Po ultrazvukové homogenizaci / extrakci se lyzát odstředí při hmotnosti 27 000 g po dobu cca. 20 min. Poté se supernatent shromáždí, takže koncentrace proteinu může být stanovena proteinovým testem, jako je Pierce protein assay BCA.
Extrakce bílkovin z krevního séra
U homogenní směsi séra a fosfátového pufru se vzorek nejprve víří před ultrazvukovou lýzou buněk. Pro ultrazvukovou lýzu je vzorek sonikován ultrazvukovým laboratorním homogenizátorem, jako je UP100H po dobu 8 cyklů při 20% amplitudě, pro cykly každých 5 sekund zapnuto a 15 sekund vypnuto. Extrakce proteinů se provádí sonikací v cyklech (pulzační režim) a umístěním vzorku na led, aby se zabránilo přehřátí a tepelné degradaci vzorku. Vzhledem k tomu, že sérum obsahuje velké množství proteinů s vysokou molekulovou hmotností (jako je albumin, α1-antitrypsin, transferin, haptoglobulin, imunoglobulin G a imunoglobulin A), které interferují se separací proteinů s nízkou molekulovou hmotností během IEF, doporučuje se je ze séra vyčerpat pomocí depleční kolony.
Extrakce bílkovin z rostlinných tkání
Čerstvá, měkká rostlinná tkáň, např. mech atd., může být snadno narušena jednoduchým umístěním nasekaného materiálu vzorku do lýzového pufru pro sonikaci. Tvrdé, ligenové rostlinné tkáně, jako jsou semena, jehličí jedle atd., by měly být rozemlety v suchu. Některé tvrdé, dřevité rostlinné materiály musí být zmrazeny a rozemlety v tekutém dusíku před extrakcí sonikací. U suspenzí rostlinných buněčných kultur je většinou dostačující ultrazvukové ošetření mezi 30 a 150 sekundami v lyzačním pufru. Tvrdší materiál, jako jsou dýňová semínka, vyžaduje intenzivnější sonikaci, jak je popsáno níže.
Protokol pro ultrazvukovou extrakci albuminu z dýňových semen
Pro ultrazvukovou extrakci bílkovin albuminu z jemně mletého prášku z dýňových semen se do 250 ml skleněné kádinky přidá 10 g odtučněného prášku z dýňových semínek a 100 ml deionizované vody jako rozpouštědla. Extrakce proteinu se skládá ze dvou kroků: Nejprve se vzorek sonikuje ultrazvukový přístroj typu sondy UP400St (400W, 24kHz) vybavený sonotrodou S24d7. Skleněná kádinka se během ultrazvukové homogenizace umístí do studené vodní lázně. Zásuvný teplotní senzor a nastavení regulace teploty ultrasonicator UP400St zajišťují, že teplota vzorku je vždy udržována pod 30 °C. Přesnou regulací teploty během sonikace je zabráněno denaturaci albuminu. Za druhé, extrakce byla provedena míchadlem při rychlosti 200 ot./min a při 30 °C. Poté se kádinka převede do termostatické třepačky. Globulin se odstraňuje dialýzou s destilovanou vodou. Po odstranění globulinu může být proteinový extrakt odebrán pro stanovení albuminového profilu a následně je upraven na pI=3,0 s použitím 0,1 M HCl pro koagulaci albuminu. Pevná fáze se oddělí centrifugací při 5000 g, 20 °C a znovu se rozpustí v deionizované vodě. Koagulace albuminu se provádí dvakrát, aby se zvýšil poměr bílkovin v albuminovém koncentrátu.
Ultrazvuková alkalická extrakce proteinů pro přípravu proteinového koncentrátu z rýžových otrub ukazuje, že ultrazvuková léčba vede k vyššímu výtěžku bílkovin za výrazně kratší dobu extrakce – ve srovnání s konvenčními metodami extrakce.
Protokol přípravy vzorku pro funkční enzym iNOS
Pro získání plně funkčního enzymu iNOS (např. Pro screening drog) se doporučuje následující protokol: Buněčná suspenze by měla být umístěna na led a je sonikována UP100H při amplitudě 10 μm v režimu cyklu 5 sec. sonikace a 25 sec. odpočinek na ledu. Postup by se měl opakovat cca. 3x. Doba odpočinku mezi cykly ultrazvuku snižuje nárůst teploty, a proto sníží riziko denaturace.
ultrazvuková solubilizace proteinů
Sonikace může urychlit proces solubilizace proteinů, který obvykle vyžaduje několik hodin. Aby nedošlo k přehřátí vzorku a zabránilo se degradaci proteinů a modifikacím v roztocích obsahujících močovinu, neměly by ultrazvukové výbuchy trvat déle než několik sekund.
Ultrasonicator UP200Ht s 2mm mikrohrotem S26d2 pro sonikaci malých vzorků.
Ultrazvukové zařízení pro extrakci proteinů
Hielscher Ultrasonics nabízí širokou škálu ultrazvukových homogenizátorů pro rozpad buněk, tkání, bakterií, mikroorganismů, kvasinek a spor.
Hielscher laboratorní ultrasonicators jsou výkonné a snadno ovladatelné. Jsou konstruovány pro provoz 24 hodin denně, 7 dní v týdnu a jsou navrženy jako robustní a efektivní laboratorní a stolní zařízení. U všech zařízení lze přesně regulovat výkon energie a amplitudu. Široká škála příslušenství otevírá další možnosti nastavení. Digitální ultrasonicators, jako je VialTweeter, UP200Ht, UP200St a UP400St mají integrovanou regulaci teploty a vestavěnou SD kartu pro automatické nahrávání dat.
Pro nepřímé, bez křížové kontaminace a simultánní sonikaci více vzorků nabízíme VialTweeter nebo ultrazvukový CupHorn.
Níže uvedená tabulka vám poskytuje přehled o našich ultrazvukových zařízeních pro přípravu vzorků, narušení buněk a extrakci. Kliknutím na typ zařízení získáte další informace o každém ultrazvukovém homogenizátoru. Náš dobře vyškolený technický personál s dlouholetými zkušenostmi vám rád pomůže vybrat nejvhodnější ultrasonikátor pro přípravu vzorku!
| Objem dávky | Průtok | Doporučená zařízení |
|---|---|---|
| až 10 lahviček nebo zkumavek | Není k dispozici | VialTweeter |
| vícejamkové / mikrotitrační destičky | Není k dispozici | UIP400MTP |
| více trubic / nádob | Není k dispozici | Roh Poháru |
| 1 až 500 ml | 10 až 200 ml / min | UP100H |
| 10 až 1000 ml | 20 až 200 ml/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 až 2000 ml | 20 až 400 ml/min | UP400St |
V závislosti na vaší aplikaci, materiálu a objemu vzorku vám doporučíme nejvhodnější nastavení pro vaši přípravu vzorku. Kontaktujte nás ještě dnes!
Kontaktujte nás! / Zeptejte se nás!
Hielscher digitální ultrasonicators jsou vybaveny dálkovým ovládáním prohlížeče a automatickým protokolováním dat na integrované SD kartě.
VialTweeter pro nepřímou sonikaci.
Fakta, která stojí za to vědět
PROTEOMIKA
Proteomika je výzkumná oblast, která zkoumá proteiny a proteom. Proteiny plní širokou škálu životně důležitých funkcí v organismech. Proteom je celá sada proteinů exprimovaných genomem, buňkou, tkání nebo organismem v určitém čase. Proteom se mění s časem a odlišnými požadavky nebo stresy, kterým buňka nebo organismus podstupuje. Přesněji řečeno, jedná se o soubor exprimovaných proteinů v daném typu buňky nebo organismu, v daném čase a za definovaných podmínek. Termín je směsí proteinů a genomu. Proteomika je studium proteomu.
bílkovina
Proteiny jsou velké biomolekuly, tzv. makromolekuly – které jsou složeny z jednoho nebo více dlouhých řetězců aminokyselinových zbytků. Proteiny jsou přítomny ve všech organismech rostlinného i živočišného původu a jsou klíčové pro většinu biologických funkcí. Vzhledem k tomu, že proteiny obsahují mnoho biologických informací, jsou extrahovány pro analytické účely, např. pro proteomický výzkum. Mezi nejdůležitější funkce, které proteiny vykonávají, patří katalýza metabolických reakcí, replikace DNA, reakce na podněty a transport molekul z jednoho místa na druhé. Proteiny se od sebe liší především sekvencí aminokyselin, která je diktována nukleotidovou sekvencí jejich genů a která obvykle vede k tomu, že se protein skládá do specifické trojrozměrné struktury, která určuje jeho aktivitu. Proteiny jsou – Kromě peptidů – jednou z klíčových složek potravin. Proto je proteomika v potravinářské vědě mocným nástrojem pro optimalizaci procesů, bezpečnosti potravin a hodnocení výživy.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction je preanalytický postup k separaci a předkoncentraci analytů. V kombinaci s ultrazvukem lze zintenzivnit extrakci bodu zákalu, díky čemuž je proces efektivnější, rychlejší a šetrnější k životnímu prostředí. Při ultrazvuku je extrakce bodu zákalu výrazně účinnější metodou přípravy analytu. Přečtěte si více o ultrazvukem asistované extrakci zákalových bodů!Elektroforéza
Gelová elektroforéza je hlavní metodou pro separaci a analýzu makromolekul, jako je DNA, RNA a proteiny, a také jejich fragmentů na základě jejich velikosti a náboje. Používá se v klinické chemii k oddělení proteinů podle náboje a/nebo velikosti (IEF agaróza, v podstatě nezávislá na velikosti) a v biochemii, molekulární biologii a proteomice k oddělení smíšené populace fragmentů DNA a RNA podle délky, k odhadu velikosti fragmentů DNA a RNA nebo k oddělení proteinů podle náboje.
Buněčné kultury
Buněčná kultura je řízený proces pěstování, při kterém jsou buňky kultivovány za kontrolovaných podmínek. Podmínky buněčné kultury se liší pro každý typ buněk. Obecně platí, že prostředí buněčné kultury se skládá z vhodné nádoby (např. Petriho misky) se substrátem nebo médiem, které dodává základní živiny (aminokyseliny, sacharidy, vitamíny, minerály), růstové faktory, hormony a plyny (CO2, O2) a reguluje fyzikálně-chemické prostředí (pH pufr, osmotický tlak, teplota). Většina buněk potřebuje povrchový nebo umělý substrát, zatímco jiné buněčné kultury lze kultivovat volně plovoucí v kultivačním médiu (suspenzní kultura, buněčná suspenze).
Masové kultury živočišných buněčných linií se používají při průmyslové výrobě virových vakcín a dalších biotechnologicky získaných produktů. Lidské kmenové buňky se kultivují, aby se rozšířil počet buněk a buňky se diferencovaly na různé typy somatických buněk pro účely transplantace.
Vzorky tkání
Pojem tkáň popisuje buněčný meziprodukt, kde se buněčný materiál nachází na organizační úrovni mezi buňkami a kompletním orgánem. V tkáni jsou sestaveny podobné buňky stejného původu, které společně plní specifickou funkci. Funkčním seskupením více tkání se vytvářejí složité struktury orgánů.
Vzorky tkáně jsou odebírány pro výzkum v biologii, histologii/histopatologii, parazitologii, biochemii, imunohistochemii a také pro kultivaci a extrakci DNA. Lze rozlišovat mezi živočišnou (dělení: savčí tkáň) a rostlinnou tkání. Živočišné tkáně se dělí na čtyři základní typy pojivové, svalové, nervové a epiteliální tkáně. Rostlinná tkáň se dělí na následující tři tkáňové systémy: epidermis, pozemní tkáň a cévní tkáň.
Vzorky tkání lze připravit z částí živočichů nebo rostlin, např. kostí, svalů, listů atd.
Tělní tekutiny
Krev, sérum, plazma, mozkomíšní mok, sliny a synoviální tekutina jsou tělní tekutiny, které nabízejí skvělý zdroj diagnosticky relevantních informací. Proto je důležitá sofistikovaná příprava vzorků tělních tekutin pro analýzu. První obtíž je spojena s širokým dynamickým rozsahem složek přítomných v tělních tekutinách.
Stanovení koncentrace bílkovin
Bradfordův test, Lowryho test a test kyseliny bicinchonové (BCA) jsou běžné testy pro stanovení koncentrace proteinů. Bovinní sérový albumin (BSA) je jedním z nejčastěji používaných proteinových standardů.
Lytický pufr
Lýzní pufr musí být zvolen v souladu s buněčným materiálem nebo tkání (tkáňová kultura, rostlina, bakterie, houby atd.) a s tím, zda jsou buňky ve struktuře a typu struktury. Široká škála lyzačních pufrů pro extrakci proteinů, membrán a organel je formulována s jedním nebo více detergenty. Prací prostředek se obvykle vybírá pomocí testů pokus-omyl nebo – pokud je k dispozici – v souladu s existujícím protokolem extrakce proteinů. Prací prostředek musí být kompatibilní se zdrojem tkáně a proteiny. Obecně platí, že nejjemnější detergent, který funguje pro konkrétní tkáň / protein, je vybrán tak, aby byla zachována maximální funkčnost extraktu. Navíc v případě extrakce membrán a organel udržuje jemný detergent membránu neporušenou. Běžně používané detergenty v lyzačních pufrech jsou většinou neiontové nebo zwitteriontové, např. CHAPS, deoxycholát, Triton™ X-100, NP40 a Tween 20.
Například tkáně, jako je mozek, játra, střevo, ledviny, slezina atd., mohou být jednoduše pufrovány pomocí RIPA – měly by však být zahrnuty inhibitory proteázy a DTT (např. pro gelovou elektroforézu).
Lysis pufr pro tkáň kosterního svalstva (ledově studený): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol doplněný koktejlem inhibitorů proteázy a fosfatázy
Tabulka běžných pufrů a jejich rozsah pH. Obecně se tyto pufry běžně používají při koncentracích 20-50 mM.
| vyrovnávací paměť | Rozsah pH |
|---|---|
| Kyselina citrónová – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Citrát sodný – Kyselina citrónová | 3.0 – 6.2 |
| Octan sodný – kyselina octová | 3.6 – 5.6 |
| Sodná sůl kyseliny kakodylové – Hcl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Dihydrogenfosforečnan sodný – hydrogenfosforečnan sodný | 5.8 – 8.0 |
| imidazol – Hcl | 6.2 – 7.8 |
| MOPY – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Triethanolamin hydrochlorid – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – Hcl | 7.0 – 9.0 |
| HEVOLA – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricine – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Tetraboritan sodný – borová voda | 7.6 – 9.2 |
| Cyklistika – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| glycin – NaOH | 8.6 – 10.6 |
Většina pufrů vykazuje závislost pH na teplotě. To platí zejména pro vyrovnávací paměti Tris. pKa se mění z 8,06 při 25 °C na 8,85 při 0 °C.
(pH a pKa pufru: pH měří koncentraci vodíkových iontů ve vodném roztoku. pKa (= disociační konstanta kyseliny) je příbuzné, ale specifičtější měřítko, protože pomáhá předpovědět, jak se molekula bude chovat při specifické hodnotě pH.)
TRIzol
TRIzol je chemický roztok používaný k extrakci RNA/DNA/proteinu během extrakce guanidinium-thiokyanát-fenol-chloroformu. Použití ultrazvukem asistované extrakce TRIzol má za následek vysoké výtěžky DNA, RNA a proteinů ze stejného vzorku a vyniká tím i v jiných extrakčních metodách.
Literatura/Odkazy
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.