Ultrazvuková extrakce proteinů z tkání a buněčných kultur
- Extrakce proteinů je nezbytným krokem přípravy vzorků v proteomice.
- Proteiny lze extrahovat z rostlinných a živočišných tkání, kvasinek a mikroorganismů.
- Sonikace je spolehlivá a účinná metoda extrakce proteinů, která poskytuje vysoké výtěžky proteinů během krátké doby extrakce.
Extrakce proteinů z tkání a buněk
Extrakce proteinů z tkání a kultivovaných buněk je nezbytným krokem přípravy vzorků, který se provádí v rámci mnoha biochemických a analytických technik, jako je ELISA, PAGE, Western blotting, hmotnostní spektrometrie nebo purifikace proteinů. Ultrazvuková dezintegrace buněk, lyze a extrakce je přesně řiditelná netermální technika, která zajišťuje vysoké výtěžky proteinů.
Extrakce proteinů z buněk pomocí ultrazvukové sondy UP200St
- Rychlé
- Vysoké výtěžky
- Vysoce účinné
- Přesná kontrola parametrů
- Reprodukovatelné výsledky
- Lineární škálovatelnost
Obecné pokyny pro ultrazvukovou lyzi a extrakci proteinů
- Řízení teploty: Aby byl zajištěn vysoký výtěžek proteinů bez tepelné denaturace, musí být teplota během extrakce kontrolována. Špičkové ultrazvukové homogenizátory Hielscher – nazývané také ultrazvukové dezintegrátory nebo ultrasonifikátory – jsou přesně řiditelné. Dodávají se se zásuvným teplotním čidlem. V nastavení ultrazvukového homogenizátoru lze nastavit maximální teplotu. Jakmile je této maximální teploty dosaženo, ultrazvukový přístroj se automaticky zastaví, dokud se vzorek neochladí.
- Pufr: Volba vhodného pufru a správného objemu pufru se liší tkáň od tkáně a musí být zjištěna testováním metodou pokusů a omylů.
- Izolace / purifikace: Proteinové lyzáty mohou obsahovat nadbytek biomolekul, jako je DNA nebo sacharidy, které mohou být odstraněny precipitací proteinů (deoxycholát-kyselina trichloroctová) nebo výměnou pufru.
Chittapalo a Noomhorm (2009) ve své studii uvedli, že se výtěžek proteinů při použití sonikace zvýšil a že proces ultrazvukové homogenizace a lyze tkání může významně zlepšit stávající extrakční procesy – a umožnit tak nové komerční možnosti extrakce.
Ultrazvukový CupHorn pro simultánní, vysoce účinnou přípravu více vzorků za stejných podmínek pro izolaci proteinů a fragmentaci DNA.
Extrakce proteinů ze živočišné tkáně
Při přípravě celých tkání (např. ledvin, srdce, plic, svalů atd.) by měla být tkáň rozřezána na velmi malé kousky čistými nástroji, nejlépe na ledu, a co nejrychleji, aby se zabránilo degradaci proteázami (např. lyzační pufr, jako je RIPA, nebo hypotonický lyzační pufr obsahující koktejl inhibitorů proteáz a fosfatáz). Po rozřezání se vzorek ponoří do kapalného dusíku k šokovému zmrazení. Vzorek lze uchovávat při -80°C pro pozdější použití nebo ponechat na ledu k okamžité homogenizaci. Bezprostředně před ultrazvukovou extrakcí se do zkumavky se vzorkem rychle přidá ledově vychlazený lyzační pufr (s inhibitory proteáz DTT, leupeptinem a aprotininem) (na ~10 mg tkáně se doporučuje cca ~600 μL pufru). Na jednu zkumavku se vzorkem se doporučuje cca 20–60mg tkáně.
Ultrazvuková homogenizace, lyze a extrakce se provádí ultrazvukovým homogenizátorem, jako je UP100H nebo UP200Ht, vybaveným sonotrodou s mikrohrotem. Doba sonikace je 60–90 s v cyklickém režimu 15 s sonikace a 10 s pauzy. Vzorek by měl být po celou dobu udržován v ledu.
Po ultrazvukové homogenizaci / extrakci se lyzát centrifuguje při 27 000g po dobu cca 20 min. Poté se odebere supernatant, aby bylo možné stanovit koncentraci proteinů pomocí proteinového testu, jako je Pierce protein assay BCA.
Extrakce proteinů z krevního séra
Pro homogenní promíchání séra a fosfátového pufru se vzorek před ultrazvukovou lyzí buněk nejprve vortexuje. Při ultrazvukové lyzi se vzorek sonikuje laboratorním ultrazvukovým homogenizátorem, jako je UP100H, v 8 cyklech při 20% amplitudě, přičemž každý cyklus zahrnuje 5 sekund chodu a 15 sekund pauzy. Extrakce proteinů se provádí sonikací v cyklech (pulzní režim) a umístěním vzorku na led, aby se zabránilo přehřátí a tepelné degradaci vzorku. Protože sérum obsahuje velké množství vysokomolekulárních proteinů (jako je albumin, α1-antitrypsin, transferin, haptoglobulin, imunoglobulin G a imunoglobulin A), které interferují se separací nízkomolekulárních proteinů během IEF, doporučuje se je ze séra odstranit pomocí depleční kolony.
Extrakce proteinů z rostlinné tkáně
Čerstvou, měkkou rostlinnou tkáň, např. mech apod., lze snadno rozrušit pouhým vložením nasekaného vzorku do lyzačního pufru k sonikaci. Tuhé, zdřevnatělé rostlinné tkáně, jako jsou semena, jedlové jehlice atd., by měly být rozemlety nasucho. Některé tvrdé, dřevité rostlinné materiály musí být před extrakcí sonikací zmrazeny a rozemlety v kapalném dusíku. U suspenzí rostlinných buněčných kultur většinou postačuje ultrazvukové ošetření v lyzačním pufru po dobu 30 až 150 sekund. Tužší materiál, jako jsou dýňová semena, vyžaduje intenzivnější sonikaci, jak je popsáno níže.
Protokol ultrazvukové extrakce albuminu z dýňových semen
Pro ultrazvukovou extrakci albuminu z jemně mletého prášku z dýňových semen se do 250mL skleněné kádinky přidá 10 g odtučněného prášku z dýňových semen a 100 mL deionizované vody jako rozpouštědla. Extrakce proteinů se skládá ze dvou kroků: Nejprve se vzorek sonikuje sondovým ultrazvukovým přístrojem UP400St (400W, 24kHz) vybaveným sonotrodou S24d7. Během ultrazvukové homogenizace je skleněná kádinka umístěna v lázni se studenou vodou. Zásuvné teplotní čidlo a nastavení regulace teploty ultrazvukového přístroje UP400St zajišťují, že teplota vzorku je vždy udržována pod 30°C. Díky přesné regulaci teploty během sonikace se zabrání denaturaci albuminu. Za druhé byla extrakce provedena pomocí míchadla při rychlosti 200 rpm a při 30°C. Poté se kádinka přenese do termostatované třepačky. Globulin se odstraní dialýzou s destilovanou vodou. Po odstranění globulinu lze z proteinového extraktu odebrat vzorek ke stanovení profilu albuminu a extrakt se následně upraví na pI=3,0 pomocí 0,1 M HCl ke koagulaci albuminu. Pevná fáze se oddělí centrifugací při 5000g a 20°C a znovu se rozpustí v deionizované vodě. Koagulace albuminu se provádí dvakrát, aby se zvýšil podíl proteinů v albuminovém koncentrátu.
Ultrazvuková alkalická extrakce proteinů pro přípravu proteinového koncentrátu z rýžových otrub ukazuje, že ultrazvukové ošetření vede k vyššímu výtěžku proteinů za výrazně kratší dobu extrakce – ve srovnání s konvenčními extrakčními metodami.
Protokol přípravy vzorku pro funkční enzym iNOS
Pro získání plně funkčního enzymu iNOS (např. pro screening léčiv) se doporučuje následující protokol: Buněčná suspenze by měla být umístěna na led a sonikuje se přístrojem UP100H při amplitudě 10µm v cyklickém režimu 5 s sonikace a 25 s pauzy na ledu. Postup by se měl opakovat cca 3krát. Pauza mezi cykly sonikace omezuje nárůst teploty, a tím snižuje riziko denaturace.
Ultrazvuková solubilizace proteinů
Sonikace může urychlit proces solubilizace proteinů, který obvykle trvá několik hodin. Aby nedošlo k přehřátí vzorku a aby se zabránilo degradaci a modifikacím proteinů v roztocích obsahujících močovinu, neměly by ultrazvukové pulzy trvat déle než několik sekund.
Ultrazvukový přístroj UP200Ht s 2mm mikrohrotem S26d2 pro sonikaci malých vzorků.
Ultrazvuková zařízení pro extrakci proteinů
Hielscher Ultrasonics nabízí širokou škálu ultrazvukových homogenizátorů pro dezintegraci buněk, tkání, bakterií, mikroorganismů, kvasinek a spor.
Laboratorní ultrazvukové přístroje Hielscher jsou výkonné a snadno se obsluhují. Jsou konstruovány pro provoz 24/7 a navrženy jako robustní a účinná laboratorní a stolní zařízení. U všech zařízení lze přesně řídit energetický výkon i amplitudu. Široká nabídka příslušenství otevírá další možnosti sestavení. Digitální ultrazvukové přístroje, jako jsou VialTweeter, UP200Ht, UP200St a UP400St, mají integrovanou regulaci teploty a vestavěnou SD kartu pro automatický záznam dat.
Pro nepřímou, simultánní sonikaci více vzorků bez křížové kontaminace nabízíme VialTweeter nebo ultrazvukový CupHorn.
Níže uvedená tabulka Vám poskytuje přehled našich ultrazvukových přístrojů pro přípravu vzorků, dezintegraci buněk a extrakci. Kliknutím na typ zařízení získáte další informace o jednotlivých ultrazvukových homogenizátorech. Náš dobře vyškolený technický personál s dlouholetými zkušenostmi Vám rád pomůže s výběrem nejvhodnějšího ultrazvukového přístroje pro přípravu Vašich vzorků!
| Objem dávky | Průtok | Doporučená zařízení |
|---|---|---|
| až 10 lahviček nebo zkumavek | n.a. | VialTweeter |
| multijamkové / mikrotitrační destičky | n.a. | UIP400MTP |
| více zkumavek / nádob | n.a. | CupHorn |
| 1 až 500mL | 10 až 200mL/min | UP100H |
| 10 až 1000mL | 20 až 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 až 2000mL | 20 až 400mL/min | UP400St |
V závislosti na Vaší aplikaci, materiálu a objemu vzorku Vám doporučíme nejvhodnější sestavu pro přípravu Vašich vzorků. Kontaktujte nás ještě dnes!
Kontaktujte nás! / Zeptejte se nás!
Digitální ultrazvukové přístroje Hielscher jsou vybaveny dálkovým ovládáním přes prohlížeč a automatickým protokolováním dat na integrovanou SD kartu.
VialTweeter pro nepřímou sonikaci.
Fakta, která stojí za to znát
Proteomika
Proteomika je výzkumný obor, který zkoumá proteiny a proteom. Proteiny plní v organismech obrovské množství životně důležitých funkcí. Proteom je celý soubor proteinů exprimovaných genomem, buňkou, tkání nebo organismem v určitém čase. Proteom se mění s časem a s odlišnými požadavky či stresy, kterým buňka nebo organismus podléhá. Přesněji řečeno, jde o soubor exprimovaných proteinů v daném typu buňky nebo organismu, v daném čase a za definovaných podmínek. Termín vznikl spojením slov proteiny a genom. Proteomika je studium proteomu.
Protein
Proteiny jsou velké biomolekuly, tzv. makromolekuly – složené z jednoho nebo více dlouhých řetězců aminokyselinových zbytků. Proteiny jsou přítomny ve všech organismech rostlinného i živočišného původu a jsou klíčové pro většinu biologických funkcí. Protože proteiny obsahují mnoho biologických informací, extrahují se pro analytické účely, např. pro proteomický výzkum. Mezi nejdůležitější funkce, které proteiny plní, patří katalýza metabolických reakcí, replikace DNA, reakce na podněty a transport molekul z jednoho místa na druhé. Proteiny se od sebe liší především sekvencí aminokyselin, která je určena nukleotidovou sekvencí jejich genů a která obvykle vede ke sbalení proteinu do specifické trojrozměrné struktury určující jeho aktivitu. Proteiny jsou – vedle peptidů – jednou z klíčových složek potravin. Proto je proteomika v potravinářské vědě účinným nástrojem pro optimalizaci procesů, bezpečnost potravin a nutriční hodnocení.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction je předanalytický postup k separaci a prekoncentraci analytů. V kombinaci s ultrazvukovým ošetřením lze extrakci v bodě zákalu intenzifikovat, čímž se proces stane účinnějším, rychlejším a šetrnějším k životnímu prostředí. S ultrazvukovým ošetřením je extrakce v bodě zákalu výrazně účinnější metodou přípravy analytů. Přečtěte si více o ultrazvukem asistované extrakci v bodě zákalu!
Gelová elektroforéza
Gelová elektroforéza je hlavní metodou separace a analýzy makromolekul, jako je DNA, RNA a proteiny, a také jejich fragmentů na základě jejich velikosti a náboje. Používá se v klinické chemii k separaci proteinů podle náboje a/nebo velikosti (IEF v agaróze, v podstatě nezávisle na velikosti) a v biochemii, molekulární biologii a proteomice k separaci směsné populace fragmentů DNA a RNA podle délky, k odhadu velikosti fragmentů DNA a RNA nebo k separaci proteinů podle náboje.
Buněčné kultury
Buněčná kultura je řízený proces růstu, při kterém jsou buňky kultivovány za kontrolovaných podmínek. Podmínky kultivace se u jednotlivých typů buněk liší. Obecně prostředí buněčné kultury tvoří vhodná nádoba (např. Petriho miska) se substrátem nebo médiem, které dodává esenciální živiny (aminokyseliny, sacharidy, vitaminy, minerální látky), růstové faktory, hormony a plyny (CO2, O2) a reguluje fyzikálně-chemické prostředí (pH pufr, osmotický tlak, teplota). Většina buněk potřebuje povrch nebo umělý substrát, zatímco jiné buněčné kultury lze kultivovat volně plovoucí v kultivačním médiu (suspenzní kultura, buněčná suspenze).
Hromadné kultury živočišných buněčných linií se používají v průmyslové výrobě virových vakcín a dalších biotechnologicky získaných produktů. Lidské kmenové buňky se kultivují za účelem zvýšení počtu buněk a jejich diferenciace na různé typy somatických buněk pro transplantační účely.
Vzorky tkání
Pojem tkáň označuje buněčný mezistupeň, kdy je buněčný materiál na organizační úrovni mezi buňkami a celým orgánem. V tkáni jsou seskupeny podobné buňky stejného původu, které společně vykonávají specifickou funkci. Funkčním seskupením více tkání vznikají složité struktury orgánů.
Tkáň se odebírá pro výzkum v biologii, histologii/histopatologii, parazitologii, biochemii, imunohistochemii, jakož i ke kultivaci a extrakci DNA. Rozlišuje se živočišná (podskupina: savčí tkáň) a rostlinná tkáň. Živočišné tkáně se dělí do čtyř základních typů: pojivová, svalová, nervová a epitelová tkáň. Rostlinná tkáň se dělí do následujících tří soustav pletiv: pokožka, základní pletivo a vodivé pletivo.
Vzorky tkání lze připravit z živočišných nebo rostlinných částí, např. kostí, svalů, listů atd.
Tělní tekutiny
Krev, sérum, plazma, mozkomíšní mok, sliny a synoviální tekutina jsou tělní tekutiny, které představují velký zdroj diagnosticky relevantních informací. Proto je důležitá sofistikovaná příprava vzorků tělních tekutin pro analýzu. První obtíž souvisí s širokým dynamickým rozsahem složek přítomných v tělních tekutinách.
Stanovení koncentrace proteinů
Bradfordův test, Lowryho test a test s kyselinou bicinchoninovou (BCA) jsou běžné testy ke stanovení koncentrace proteinů. Hovězí sérový albumin (BSA) je jedním z nejčastěji používaných proteinových standardů.
Lyzační pufr
Lyzační pufr je nutné zvolit podle buněčného materiálu nebo tkáně (tkáňová kultura, rostlina, bakterie, houby atd.) a podle toho, zda jsou buňky součástí struktury, a podle typu této struktury. Široká škála lyzačních pufrů pro extrakci proteinů, membrán a organel je formulována s jedním nebo více detergenty. Detergent se obvykle volí na základě zkoušek metodou pokusů a omylů nebo – je-li k dispozici – podle existujícího protokolu extrakce proteinů. Detergent musí být kompatibilní se zdrojovou tkání i s proteiny. Obecně se volí nejšetrnější detergent, který pro danou tkáň / protein funguje, aby byla zachována maximální funkčnost extraktu. Při extrakci membrán a organel navíc šetrný detergent zachovává membránu neporušenou. Běžně používané detergenty v lyzačních pufrech jsou většinou neionogenní nebo zwitteriontové, např. CHAPS, deoxycholát, Triton™ X-100, NP40 a Tween 20.
Například tkáně jako mozek, játra, střevo, ledviny, slezina atd. lze jednoduše pufrovat pomocí RIPA – měly by však být přidány inhibitory proteáz a DTT (např. pro gelovou elektroforézu).
Lyzační pufr pro tkáň kosterního svalu (ledově vychlazený): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, doplněný koktejlem inhibitorů proteáz a fosfatáz
Tabulka běžných pufrů a jejich rozsahu pH. Obecně se tyto pufry běžně používají v koncentracích 20–50 mM.
| Pufr | Rozsah pH |
|---|---|
| Kyselina citronová – NaOH | 2,2 – 6,5 |
| Citrát sodný – kyselina citronová | 3,0 – 6,2 |
| Octan sodný – kyselina octová | 3,6 – 5,6 |
| Sodná sůl kyseliny kakodylové – HCl | 5,0 – 7,4 |
| MES – NaOH | 5,6 – 6,8 |
| Dihydrogenfosforečnan sodný – hydrogenfosforečnan disodný | 5,8 – 8,0 |
| Imidazol – HCl | 6,2 – 7,8 |
| MOPS – KOH | 6,6 – 7,8 |
| Triethanolamin-hydrochlorid – NaOH | 6,8 – 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7,2 – 8,2 |
| Tricin – NaOH | 7,6 – 8,6 |
| Tetraboritan sodný – kyselina boritá | 7,6 – 9,2 |
| Bicin – NaOH | 7,7 – 8,9 |
| Glycin – NaOH | 8,6 – 10,6 |
Většina pufrů vykazuje teplotní závislost pH. To platí zejména pro pufry Tris. Hodnota pKa se mění z 8,06 při 25°C na 8,85 při 0°C.
(pH a pKa pufru: pH měří koncentraci vodíkových iontů ve vodném roztoku. pKa (= disociační konstanta kyseliny) je příbuzná, ale specifičtější veličina v tom smyslu, že pomáhá předpovědět, jak se bude molekula chovat při konkrétní hodnotě pH.)
TRIzol
TRIzol je chemický roztok používaný k extrakci RNA/DNA/proteinů při guanidinium-thiokyanát-fenol-chloroformové extrakci. Použití ultrazvukem asistované extrakce TRIzolem vede k vysokým výtěžkům DNA, RNA a proteinů ze stejného vzorku, a tím předčí jiné extrakční metody.
Literatura/Reference
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.