Hielscher ultrazvuková technologie

Ultrazvukové Extrakce proteinu z tkáňových a buněčných kultur

  • Extrakce bílkovin je základním příprava vzorku krokem proteomiky.
  • Proteiny mohou být extrahovány z rostlinné a živočišné tkáně, kvasinek a mikroorganismů.
  • Sonikace je spolehlivý a účinný způsob extrakce proteinu dává vysoké výtěžky proteinu v krátké době extrakce.

 

Extrakce bílkovin z tkání a buněk

Extrakce proteinu z tkání a kultivovaných buněk je zásadním Příprava vzorku krok, který se provádí v průběhu mnoha biochemických a analytických technik, jako je například ELISA, PAGE, Západní rozkvět, Hmotnostní spektrometrie, nebo čištění proteinů. ultrazvukové rozrušení buněk, lyži a extrakce je přesně řiditelný technika pro zajištění vysokých výtěžků proteinů.

Extrakce proteinu z živočišné tkáně

Při přípravě celistvých tkání (např. Ledviny, srdce, plic, svalů apod.) By se tkáň měla rozřezat na velmi malé kousky čistými nástroji, přednostně na ledu a co nejrychleji, aby se zabránilo degradaci proteázami (např. lýzovací pufr, jako je RIPA nebo hypotonický lyzační pufr obsahující koktejl inhibitoru proteázy a fosfatázy). Po disekování se vzorek ponoří do kapalného dusíku pro zmrazení. Vzorek může být skladován při -80 ° C pro pozdější použití nebo může být uchováván na ledu pro okamžitou homogenizaci. Bezprostředně před extrakcí ultrazvukem se do zkumavky vzorku rychle přidá ledový lyzační pufr (s inhibitory proteázy DTT, leupeptinem a aprotininem) (na ~ 10 mg tkáně se doporučuje přibližně 600 μl pufru). Cca. Pro každou zkumavku se doporučuje 20-60 mg tkáně.
Ultrazvuková homogenizace, lýzy a extrakce se provádí za použití ultrazvukového homogenizéru, jako je Uf200 ः t nebo UP200St, Vybaven mikro-tip sonotrody. Doba zpracování ultrazvukem je 60 až 90 sekund. při způsobu ultrazvukové cyklu 15 vteřin. sonikace a 10 sec. odpočívá čas. Vzorek by měl být uchovávány v ledu po celou dobu.
Po ultrazvukové homogenizace / extrakce, lyzát odstřeďován při 27,000g po dobu cca. 20 min. Potom se supernatant se oddělí tak, že koncentrace proteinu se může stanovit testem proteinu, jako Pierce analýzu proteinů BCA.

Bílkovinná sonikace je důležitou metodou přípravy vzorku

Extrakce ultrazvukových bílkovin z buněk s UP200St

Žádost o informace





Extrakce proteinu z krevního séra

Pro homogenní směs séra a fosfátového pufru se nejprve před lýzou ultrazvukových buněk promíchá. Pro ultrazvukovou lýzu je vzorek sonikován ultrazvukovým laboratorním homogenizátorem, jako je UP100H pro 8 cyklů při 20% amplitudy, pro cykly po 5 sekund a 15 sekund vypnuto. Sonocation se provádí sonicationg v cyklech, a tím, že se vzorek na ledu, aby se zabránilo přehřátí a tepelná degradace vzorku. Vzhledem k tomu, sérum obsahuje velké množství proteinů s vysokou molekulovou hmotností (jako je albumin, a1-antitrypsinu, transferin, haptoglobulin, imunoglobulinu G a imunoglobulinu A), které interferují s separaci proteinů s nízkou molekulovou hmotností při IEF, doporučuje se jejich vyčerpat ze séra za použití kolony vyčerpání.

Extrakce proteinu z rostlinné tkáně

Čerstvé, měkké rostlinná tkáň, např. mech atd., může být snadno narušeny jednoduše umístěním nakrájenou vzorek materiálu v lyzačním pufru za použití ultrazvuku. Tuhé, ligenous rostlinných tkání, jako jsou semena, jedle jehly apod, by se měly provádět za sucha. Některé pevné, dřevina materiály musí být zmraženy a mele v tekutém dusíku před extrahována pomocí ultrazvuku. Pro rostlinné buněčné kultury suspenzí, ultrazvukový ošetření mezi 30 a 150 sekund v pufru pro lýzu je většinou dostačující. Tužší materiál, jako jsou dýňová semínka potřebují intenzivnější ultrazvuku, jak je popsáno níže.

Protokol pro ultrazvukové extrakce albuminu z dýňových semínek

Ultrazvukový tkáňového homogenizátoru UP400St s S24d40 - pro extrakci proteinů z rostlin a živočišných tkání (Klikněte pro zvětšení!)Pro extrakci ultrazvukového proteinu albuminu z jemně mletého prášku dýně semen, 10 g odtučněného sušeného dýňových semen a 100 ml deionizované vody jako rozpouštědla, se přidá do 250 ml skleněné kádince. Extrakce proteinu spočívá ve dvou krocích: Nejprve se vzorek ultrazvukem se sondou typu ultrasonicator UP400St (400W, 24kHz) namontovány sonotrody S24d7. Skleněná kádinka se umístí do studené vodní lázni během ultrazvukového homogenizace. The nastavení ultrasonicator UP400St s připojitelným teplotním čidlem zajišťuje, aby teplota vzorku byla vždy udržována pod 30 ° C. Přesným řízením teploty během sonikace se zabraňuje denaturaci albuminů. Za druhé, extrakce byla prováděna se směšovačem rychlostí 200 ot / min a při 30 ° C. Potom se kádinka přenese do termostatické třepačky. Globulin se odstraní dialyzací destilovanou vodou. Po odstranění globulinu lze z bílkovinového extraktu odebrat vzorek pro stanovení profilu albuminů a následně se upraví na hodnotu pH = 3,0 pomocí 0,1 M kyseliny chlorovodíkové pro koagulaci albuminů. Pevná fáze se oddělí centrifugací při 5000 g, 20 ° C a znovu se rozpustí v deionizované vodě. Koagulace albuminů se provádí dvakrát, aby se zvýšil poměr bílkovin v koncentraci albuminů.

Ultrazvukové alkalické extrakce proteinu pro přípravu proteinového koncentrátu z rýžových otrub, ukazuje, že ultrazvukové léčba vede k vyššímu výtěžku proteinu v podstatně kratší době extrakce – ve srovnání s běžnými extrakčními metodami.

Ultrazvukový přístroj VialTweeter pro extrakci proteinů ze vzorků tkáně (Klikněte pro zvětšení!)

VialTweeter pro nepřímé použití ultrazvuku.

Výhody

  • rychlý
  • vysoké výnosy
  • vysoce účinný
  • Přesná kontrola nad parametry
  • reprodukovatelné výsledky
  • lineární škálovatelnost

Příprava vzorků protokol pro funkční iNOS enzym

Pro získání plně funkční iNOS enzym (např. Pro screening léčiv), doporučuje se následující protokol: Suspenze buněk by měly být umístěny na led a ultrazvukem s UP100H na 10 um amplitudy v režimu cyklu 5 sec. sonikace a 25 sec. spočívat na ledě. Tento postup by měl být opakován cca. 3 krát. Doba odpočinku mezi sonikací cykly snižuje nárůst teploty, a proto snižují riziko denaturace.

Ultrazvukové Protein Rozpouštění

Sonikace může urychlit proces rozpouštění bílkovin, což obvykle trvá několik hodin. Aby nedošlo k přehřátí vzorku a zabránění degradace proteinů a změny v roztocích, obsahujících močovinu, měly by ultrazvukové impulsy neměla být delší než několik sekund.

Obecné pokyny

Regulace teploty: Pro zajištění vysokého výtěžku proteinu bez tepelné denaturaci, Teplota během extrakce musí být kontrolovány. state-of-art ultrazvukové homogenizátory Hielscher je – také volal Ultrazvukový dezintegrátor nebo sonificator – jsou přesně kontrolovatelné. Přicházejí s čidlem plugable teploty. V možnostech nastavení ultrazvukového homogenizátoru, maximální teplota může být nastavena. Po dosažení této teploty max se ultrasonicator automaticky zastaví, dokud se vzorek ochladí.
Vyrovnávací paměti: Volba vhodného pufru a pravé objemu pufru se pohybuje od tkáně do tkáně a musí být přišel-out testováním metodou pokusu a omylu.
Izolace / čištění: Proteinové lyzáty mohou obsahovat přebytek biomolekul, jako je DNA nebo sacharidů, které mohou být odstraněny tím, vysrážení proteinu (kyselina deoxycholátu-trichlor) nebo výměně pufru.

Chittapalo a Noomhorm (2009) uvádí, že výtěžek proteinu zvýšená pomocí sonikace a že je ultrazvukový tkáň homogenizace a lýza proces může zlepšit stávající extrakčních procesů výrazně – umožnění nových obchodních příležitostí těžby.

Protihlukové s Hielscher je protihlukovým krytem SPB-L a ultrazvukovým přístrojem UP200St. (Klikni pro zvětšení!)

Ultrazvukové tkáňového homogenizátoru UP200St pro účinnou extrakci proteinů

Přesné ovládání působení ultrazvuku (Klikněte pro zvětšení!)

ovládání prohlížeče pro přesné ovládání a monitorování procesu sonifikačního

Ultrazvukové zařízení pro Protein Extraction

Hielscher Ultrasonics nabízejí širokou škálu ultrazvukové homogenizátory pro dezintegraci buněk, tkání, bakterie, mikroorganismy, kvasinky a spóry.
Hielscher laboratorní ultrasonicators jsou výkonné a snadno ovladatelné. Postavený pro provoz 24/7, které jsou navrženy jako robustní a efektivní laboratorní a bench-top zařízeními. Pro všechna zařízení, energetický výdej a amplituda může být přesně kontrolována. Široká škála Příslušenství otevírá další možnosti nastavení. Digitální zařízení, jako jsou VialTweeter, Uf200 ः t, UP200St, a UP400St mají integrovaný regulaci teploty a vestavěným SD kartu pro automatické zaznamenávání dat.
Pro nepřímé, křížové kontaminace-zdarma a současným ultrazvuku více vzorků, nabízíme VialTweeter nebo ultrazvukové cuphorn,
V závislosti na aplikaci, materiálu a objemu vzorku, doporučíme vám nejvhodnější nastavení pro váš vzorek prep. Kontaktujte nás ještě dnes!

Kontaktujte nás! / Zeptej se nás!

Použijte formulář níže, pokud chcete požádat o další informace o ultrazvukové homogenizace. Budeme rádi Vám nabídnout ultrazvukový systém plnění vašich požadavků.









Uvědomte si prosím naši Zásady ochrany osobních údajů,


Literatura / Reference

  • Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrazvukové pomoci alkalického extrakce proteinu z odtučněné rýžové otruby a vlastností proteinových koncentrátů. Int J Food Sci Technol 44: 1843-1849.
  • Simoes, André E.S:; Pereira, Diana M. Amaral, Joan. Nunes, Ana M. Gomes, Sofia E. Roberts, Peter M. Lo, Adrian C. D'Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen C. Borralho, Peter M. Rodrigues, Cecilia M. P. (2013): Efektivní regenerace proteinů z různých vzorků zdroje po extrakci RNA Trizol nebo Trizol LS a dlouhodobé skladování. BMC Genomics, 2013, 14: 181.


Fakta Worth Knowing

proteomika

Proteomika je výzkum pole, které šetří proteiny a proteomu. Proteiny fullfil obrovské množství životně důležitých funkcí v organismu. Proteomu je celý soubor proteinů exprimovaných v genomu buňky, tkáně nebo organismu v určitém čase. Proteomu se mění s časem a různých požadavků, nebo napětí, že se buňka nebo organismus prochází. Přesněji řečeno, je množina exprimovaných proteinů v daném typu buňky nebo organismu, v daném okamžiku, za definovaných podmínek. Termín je směs bílkovin a genomu. Proteomika je studium proteomu.

Bílkovin

Bílkoviny jsou velké biomolekul, takzvané makromolekuly – které jsou složeny z jednoho nebo více dlouhých řetězců aminokyselinových zbytků. Proteiny jsou přítomny ve všech organismech rostlinného i živočišného původu a jsou rozhodující pro většinu biologických funkcí. Protože proteiny obsahují mnoho biologických informací, jsou extrahovány pro analytické účely, např. Pro proteomický výzkum. Nejdůležitější funkcí, kterou proteiny provádějí, jsou katalýza metabolických reakcí, replikace DNA, odezva na stimuly a transport molekul z jednoho místa do druhého. Proteiny se navzájem liší primárně ve své sekvenci aminokyselin, která je diktována nukleotidovou sekvencí jejich genů a která obvykle vede k tomu, že se protein skládá do specifické trojrozměrné struktury, která určuje její aktivitu. Proteiny jsou – kromě peptidů – Jedním z klíčových složek potravy. Z tohoto důvodu, proteomika je mocným nástrojem v potravinářské vědy pro optimalizaci procesů, bezpečnosti potravin a nutriční hodnocení.

Gelová elektroforéza

Gelová elektroforéza je hlavní metoda pro separaci a analýzu makromolekul, jako je DNA, RNA a proteinů, stejně jako jejich fragmenty, v závislosti na jejich velikosti a náboje. Používá se v klinické chemii pro separaci proteinů podle náboje a / nebo velikosti (IEF agaróza, v podstatě velikost nezávislý) a biochemie, molekulární biologie a proteomika oddělit smíšenou populaci DNA a RNA fragmenty podle délky, odhadnout velikost DNA a RNA fragmenty nebo pro separaci proteinů podle náboje.

buněčné kultury

Buněčná kultura je řízen rostoucí proces, při kterém jsou buňky kultivovány za řízených podmínek. Podmínky kultivace buněk se liší pro každý typ buňky. Obecně platí, že prostředí buněčné kultury se skládá z vhodné nádoby (např. Petriho misky) se substrátem, nebo médiu, které dodává základní živiny (aminokyseliny, sacharidy, vitamíny, minerální látky), růstové faktory, hormony, a plyny (CO2The2), A reguluje fyzikálně-chemické prostředí (pH pufr, osmotický tlak, teplota). Většina buněk potřebují povrch nebo umělém substrátu, zatímco jiné buněčné kultury mohou být pěstovány bez plovoucí v kultivačním médiu (suspenzní kultuře, buněčné suspenze).
Hromadné kultury buněčných linií na zvířatech se používají při průmyslové výrobě virových vakcín a dalších biotechnologicky získaných produktů. Lidské kmenové buňky jsou kultivovány, aby rozšířit počet buněk a diferenciaci buněk do různých somatických buněčných typů pro účely transplantace.

tkáňové vzorky

Termín tkáň popisuje buněčná meziprodukt, kde buňka je materiál na organizační úrovni mezi buňkami a úplný orgán. V tkáni, podobné buňky, ze stejného původu, které společně vykonávají specifickou funkci, jsou sestaveny. Funkčním seskupení mnoha tkáních, jsou vytvořeny komplexní struktury orgánů.
Tkáň se vzorky pro výzkum v biologii, histologie / histopatologie, parazitologie, biochemie, imunohistochemie i kultivovat a extrakci DNA. To může být rozlišováno mezi zvířat (dělení: savec tkáně) a rostlinné tkáně. Živočišné tkáně jsou seskupeny do čtyř základních typů pojivových, svalů, nervové a epitelové tkáně. Rostlinná tkáň je rozdělena do následujících tří tkáňových systémů: epidermis, v přízemí tkáně a cévní tkáně.
Vzorky tkáně se mohou připravit z živočišných nebo rostlinných částí, např kostí, svalů, listí, atd.

Tělní tekutiny

Krev, sérum, plazma, mozkomíšní mok, sliny a synoviální tekutině jsou tělesné tekutiny, které nabízejí velký zdroj diagnosticky relevantních informací. Proto sofistikovaný příprava vzorků tělních tekutin pro analýzu je důležité. První potíž je spojen s širokým dynamickým rozsahem složek přítomných v tělních tekutinách.

Stanovení koncentrace proteinů

Bradford test, Lowry test a test kyselina bicinchoninová (BCA) jsou běžné testy pro stanovení koncentrace proteinů. Hovězí sérový albumin (BSA), je jedním z nejčastěji používaných proteinového standardu.

Lýzový pufr

Lyzační pufr musí být vybrán v souladu s buněčného materiálu nebo tkáně (tkáňové kultuře, rostlin, bakterií, plísní, atd.), A to, zda buňky jsou ve struktuře a typu konstrukce. Široká škála lýze vyrovnávacích pamětí pro extrakci proteinů, membrán a organel jsou formulovány s jedním nebo více detergentů. Detergent se obvykle volí prostřednictvím pokusu a omylu zkoušek nebo – Pokud je k dispozici – podle existujícího proteinu a extrakci protokolu. Prací prostředek musí být kompatibilní se zdrojem tkáně a proteinů. Obecně platí, že nejmírnější prací prostředek, který pracuje pro konkrétní tkáně / proteinu, je zvolen tak, aby se udržela maximální funkčnost extraktu. Kromě toho, v případě extrakce membrán a organel, jemný prací prostředek udržuje membrána neporušený. Běžně používané detergenty v lyzačním pufrů jsou převážně neiontová nebo obojetná, např. CHAPS, deoxycholát, Triton ™ X-100, NP40, a Tween 20.
Například, tkáně, jako je mozek, játra, střeva, ledviny, slezina atd. Mohou být jednoduše pufrován RIPA – by však měly být zahrnuty inhibitory proteáz a DTT (např. pro gelové elektroforézy).
Lyzační pufr pro tkáně kosterního svalstva (led studené): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 1 mM MgCl 2, 1% Triton X-100, 10% (hmotnost / objem) glycerol, 1 mM EDTA , 1 mM dithiothreitolu, doplněném proteázy a inhibitor fosfatasy koktejl
Tabulka běžných pufrů a jejich rozmezí pH. Obecně jsou tyto pufry se obvykle používají v koncentracích 20-50 mM.

nárazník rozmezí pH
Kyselina citronová – Naoh 2,2 – 6,5
Citrát sodný – Kyselina citronová 3,0 – 6,2
Octan sodný – octová kyselina 3,6 – 5,6
sodná sůl kyseliny Cacodylic – Hcl 5,0 – 7,4
MY – Naoh 5,6 – 6,8
Dihydrogenfosforečnanu sodného – hydrogenfosforečnan sodný 5,8 – 8,0
imidazol – Hcl 6,2 – 7,8
Mopy – Koh 6,6 – 7,8
triethanolamin hydrochlorid – Naoh 6,8 – 8,8
Tris – Hcl 7,0 – 9,0
HEPES – Naoh 7,2 – 8,2
tricin – Naoh 7,6 – 8,6
tetraboritan sodný – kyselina boritá 7,6 – 9,2
Bicinu – Naoh 7,7 – 8,9
glycin – Naoh 8,6 – 10,6

Většina pufry vykazují pH závislost s teplotou. To platí zejména pro Tris pufry. Hodnota pKa se mění od 8,06 při teplotě 25 ° C až 8,85 při teplotě 0 ° C.
(PH a pKa pufru: pH měří koncentrace vodíkových iontů ve vodném roztoku pKa (= disociační konstanta kyseliny) je příbuzný, ale konkrétnější opatření v tom, že pomáhá předvídat, jak molekula, bude působit na specifický. hodnota PH.)

TRIzol

Trizol je chemický roztok pro extrakci RNA / DNA / proteinu během extrakce guanidin thiokyanát-fenol-chloroform. Použití ultrazvukem asistované výsledků TRIzol odsávání ve vysokém DNA, RNA a proteinové výtěžky ze stejného vzorku a vyniká tím Jiné metody extrakce.