Ultrazvuková Lyže pro westernovým přenosem

  • Western blot je analytický postup pro detekci specifických proteinů ve vzorku tkáňového homogenátu nebo extraktu z buněk.
  • Pro spuštění Western blotting nebo pro měření enzymové aktivity, mnoho testy vyžadují přístup k materiálu (například proteiny, DNA, subcelulární fragmenty) zachycených v buňce.
  • Sonikace je spolehlivý a snadno ovladatelná metoda pro řízené rozrušení buněk a rozkladu.

Ultrazvuková rozrušením buněk

Extrakce proteinu z tkání a kultivovaných buněk je prvním krokem k mnoha biologických a biochemických a analytické techniky (PAGE, Western blot, ELISA, hmotnostní spektrometrii, atd.) nebo čištění proteinů. Pro dosažení vysokého výtěžku proteinu se buněčný materiál a tkáň musí být účinně narušena / lyžovány. Zda rostlinné buňky nebo živočišné tkáně, použití ultrazvuku je způsob přípravy váš mobilní lyzát snadno a rychle.

Výhody použití ultrazvuku

  • Rychle & účinný
  • snadná obsluha
  • vysoký výnos proteinu
  • reprodukovatelný / opakovatelné
  • přesně řízené
  • škálovatelné

Žádost o informace





Hielscher's VialTweeter is ideal for the lysis of multiple samples

VialTweeter sonicator pro ultrazvukovou přípravu vzorků, jako je narušení buněk a izolace proteinů

Imunoprecipitace Protocol Pro západní imunoblotingem

A. Reakční

Pro přípravu roztoků, pomocí čištěné vody, jako je Milli-Q.

  • 1X fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS)
  • 1X Cell Lysis Buffer: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 pyrofosforečnan mM sodný, 1 mM β-glycerofosfát, 1 mM Na3VO4, 1 ug / ml leupeptinu
    Důležité: Přidá se 1 mM PMSF bezprostředně před použitím.
  • 15 ul proteinu protein + 15 ul G je dostatečná pro IP, ale může záviset na primární objemu protilátky a vzorku. Lze také použít předem smíchaný protein A / G agarózy (např. Protein A pro králičí IgG strhnout a protein G pro myší IgG strhnout)
  • 3X SDS vzorkový pufr: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 při 25 ° C), 6% hmotnost / objem SDS, 30% glycerol, 150 mM DTT, 0,03% hmotnost / objem bromfenolové modři

B. Příprava buněčných lyzátů

  • Sklizeň buněk. Pro sklizení buněk za nedenaturujícím podmínek, odstranit médium a buňky opláchnout jedenkrát ledově chladným PBS.
  • Odstraňte PBS a přidá se 0,5 ml ledově chladného lyzačního pufru 1X buněk na každé desce (10 cm) a inkubovat na ledu po dobu 5 minut.
  • Scrape buňky mimo desky a přenos do mikrocentrifugační zkumavky. Mějte na ledě.
  • Zpracování směsi ultrazvukem dvakrát po dobu 10 sekund v ledově chladném pufru imunoprecipitace (IP pufru: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 a směs inhibitor proteázy). Pro sonikaci VialTweeter nebo ultrasonicator sonda, jako je UP100H nebo Uf200 ः t jsou nejvhodnější.
  • Odstřeďujte lyzátů při 15000 g po dobu 10 minut při teplotě 4 ° C.
  • Přeneste supernatant do nové zkumavky. (Je-li to nutné, lyzát může být skladován při -80 ° C).
  • Přidejte primární protilátku k supernatantu. Supernatant s primární protilátkou se inkubuje po dobu 1 h při 4 ° C za lehkého míchání. Primární protilátka je typicky přidán v množství 10x koncentrovanější než je použit pro Western blot. (Můžete začít s 1 ug na 100 ul.)
  • Supernatant se pak dále inkubuje se směsí stejných množství Protein A-agarózy (Invitrogen) a protein G agarózy další 1 hodiny.
  • Promyjte agaróza pelet třikrát IP pufrem. Poté, extrahovat navázaných proteinů s SDS-PAGE nanášecího pufru zahříváním při teplotě 95 ° C po dobu 5 minut.

C. Imunoprecipitace

  • Se 200 ul buněčného lyzátu a přidat primární protilátku. Inkubujte s mírným třepáním přes noc při 4 ° C.
  • Přidá se buď protein A nebo G agarosové kuličky (20 ul 50% suspenze perliček). Inkubujte s mírným třepáním po dobu 1-3 hodin při teplotě 4 ° C.
  • Mikrocentrifuze po dobu 30 sekund při teplotě 4 ° C. Wash pelety pětkrát s 500 ul 1X buněčného lyzačního pufru. Mějte na ledě během praní.
  • Peleta se resuspenduje pomocí 20 ul pufru pro vzorky 3x SDS. Vortex, pak mikrocentrifuze po dobu 30 sekund.
  • Teplo vzorku na 95-100 ° C po dobu 2-5 minut a mikroodstředivce po dobu 1 minuty při 14000 x g.
  • Vložte vzorek (15-30 ul) na SDS-PAGE gelu (12-15%).
  • Analyzovat vzorek westernovým přenosem.

Analýza Western Blot s Sonicator UP50H

Následující protokol pomocí sondy typu sonicator UP50H byl použit ve studii Kriebisch et al. (2011):
Ultrazvuková sonda typu homogenizátor UP50H se běžně používá pro narušení buněk a izolaci proteinů jako krok přípravy vzorku před Western BlottingCelkový protein se izoluje z MC3T3-E1 buněk ošetřených s 1,25 (OH)2D3 (10-8 M), nebo vehikulum. Buňky byly lyžovány pufrem obsahujícím 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% dodecylsulfát sodný (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) a 0,5% deoxycholátu sodného (Merck). Buněčný lyzát se podrobí působení ultrazvuku po dobu 2 x 10 sekund při cyklu 1 a amplituda 80 s UP50H Ultrazvukový procesor (Hielscher, Ultrazvuk Technology, Teltow, Německo). Poté byl materiál centrifugován 10 minut při 14 000 ot / min a supernatant byl použit pro Western blot. Dvakrát pět μg proteinu se vaří ve vzorkovém pufru a redukčním činidle (Invitrogen) a následně se oddělí pomocí SDS-PAGE za použití 4-12% polyakrylamidových gelů (Invitrogen) a přenese se na nitrocelulózovou membránu (zdravotní péče GE). Membrána byla blokována 1 hodinu pomocí TBS (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl) obsahujícího 1% kaseinu (Sigma-Aldrich) a 1% Tris (1M). Po blokování byla membrána inkubována s mírným mícháním přes noc při teplotě 4 ° C s primární protilátkou (králičí anti-humánní CBS 1/500, vyvinutá v laboratoři prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). Inkubace s sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou (HPR) (Dako) byla provedena po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Všechny bloty byly vyvinuty zvýšenou chemiluminiscencí (Perkin Elmer).
 

Tento tutoriál vysvětluje, jaký typ sonikátoru je nejlepší pro vaše úkoly přípravy vzorků, jako je lýza, narušení buněk, izolace proteinů, fragmentace DNA a RNA v laboratořích, analýza a výzkum. Vyberte ideální typ sonikátoru pro vaši aplikaci, objem vzorku, počet vzorků a propustnost. Hielscher Ultrasonics má ideální ultrazvukový homogenizátor pro vás!

Jak najít perfektní sonikátor pro narušení buněk a extrakci bílkovin ve vědě a analýze

Miniatura videa

 

Klikněte zde a přečtěte si více o osvědčených postupech pro ultrazvukovou lýzu a extrakci buněk, přípravu lyzátu a doporučení pro zlepšení procesu!
 
Níže uvedená tabulka vám dává údaj o přibližné kapacitě zpracování našich laboratorních ultrasonicators:

Doporučené Devices Hromadná dávka průtok
UIP400MTP 96jamkový deskový sonikátor multi-well / mikrotitrační desky na
ultrazvukové cuphorn CupHorn pro injekční lahvičky nebo kádinku na
GDmini2 ultrazvukový mikroprůtokový reaktor na
VialTweeter 00,5 až 1,5 ml na
UP100H 1 až 500 ml 10 až 200 ml / min
Uf200 ः t, UP200St 10 až 1000 ml 20 až 200 ml/min
UP400St 10 až 2000ml 20 až 400 ml / min
ultrazvuková sítová třepačka na na

Kontaktujte nás! / Zeptej se nás!

Požádejte o další informace

Použijte níže uvedený formulář a vyžádejte si další informace o našich sonicators pro přípravu vzorků před Western Blots, podrobné aplikační protokoly a cenu. Rádi s vámi probereme váš proces přípravy vzorků a nabídneme vám ultrazvukový systém splňující vaše požadavky!









Uvědomte si prosím naši Zásady ochrany osobních údajů,


Mikrodestičky, vícejamkové destičky, PCR destičky a 96jamkové destičky lze pohodlně a rovnoměrně sonikovat pomocí UIP400MTP destičky sonicator

UIP400MTP Deska Sonicator pro vysoce výkonnou sonikaci 96jamkových destiček



O westernovým přenosem

Bloty jsou analytické postupy, kde DNA, RNA a proteinů jsou přenášeny na nosič tak, že mohou oddělit.
Southern blot se používá pro detekci DNA, Northern blot pro RNA a Western blot pro proteiny.
Western blot se také nazývá protein imunoblot, protože protilátka je použita pro specifickou detekci svůj antigen. Western Blotting je jedním z nejdůležitějších analytických metod pro detekci specifických proteinů ve vzorku. Ve Western blot se proteiny se imobilizují na membránách je odhalit použití monoklonálních nebo polyklonálních protilátek.
Natálními proteiny SDS-polyakrylamidovou gelovou elektroforézou (SDS-PAGE) se oddělí 3-D struktura nebo denaturované proteiny délkou polypeptidu. Proteiny jsou pak přeneseny na membránu (typicky nitrocelulózu nebo PVDF), kde jsou barveny protilátkami specifickými pro cílový protein. Krok gelové elektroforézy je zahrnut v Western blot analýze k vyřešení problému zkřížené reaktivity protilátek.
Poté se oddělené proteiny promítají na matrici (většinou na nitrocelulózové nebo PVDF membráně), kde jsou barveny protilátkami. Protilátky fungují jako sonda a jsou specificky vybrány pro cílový protein. Analýza umístění a intenzity specifické reakce odhaluje detaily exprese cílových proteinů v daném vzorku. Western blot může detekovat cílový protein, který je tak nízký jako 1 ng kvůli vysokému rozlišení gelové elektroforézy a silné specificitě a vysoké citlivosti imunotestu. Metoda Western blot se používá v molekulární biologii, biochemii, imunogenetice a dalších oblastech molekulárního výzkumu.
Další související techniky zahrnují dot blot analýza, imunohistochemie a imunocytochemie, kde jsou použity protilátky k detekci proteinů v tkáních a buňkách imunobarvením a enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).


Literatura / Reference

Kompletní instalace VialTweeter: VialTweeter sonotroda při ultrazvukové procesor UP200St

VialTweeter sonicator pro současnou přípravu vzorků více injekčních lahviček

Kontaktujte nás! / Zeptej se nás!





Uvědomte si prosím naši Zásady ochrany osobních údajů,


Sonikace je důležitým krokem při přípravě vzorků

UP200St s mikro-tip na vzorek ultrazvuku

Rádi probereme váš proces.

Pojďme se spojit.