Ultrazvuková lyze pro western blotting

• Western blot je analytický postup pro detekci specifických proteinů ve vzorku tkáňového homogenátu nebo buněčného extraktu.
• Pro provedení western blotu nebo měření enzymové aktivity vyžaduje mnoho testů přístup k materiálům (např. proteinům, DNA, subcelulárním fragmentům) uzavřeným v buňce.
• Sonikace je spolehlivá a snadno ovladatelná metoda pro řízenou dezintegraci buněk a lyzi.

Ultrazvuková dezintegrace buněk

Extrakce proteinů z tkání a kultivovaných buněk je prvním krokem mnoha biologických, biochemických a analytických technik (PAGE, western blotting, ELISA, hmotnostní spektrometrie atd.) nebo purifikace proteinů. Pro dosažení vysokého výtěžku proteinů musí být buněčný materiál a tkáň účinně dezintegrovány/ lyzovány. Ať jde o rostlinné buňky, nebo živočišnou tkáň, sonikace je metodou, jak snadno a rychle připravit váš buněčný lyzát.

Výhody sonikace

• rychlá a účinná
• snadná obsluha
• vysoký výtěžek proteinů
• reprodukovatelná/ opakovatelná
• přesně řízená
• škálovatelná

Protokol imunoprecipitace pro western imunoblotting

A. Reagencie

K přípravě roztoků použijte purifikovanou vodu, např. Milli-Q.

• 1X fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS)
• 1X lyzační pufr pro buňky: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM pyrofosforečnan sodný, 1 mM β-glycerofosfát, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptin
  Důležité: Bezprostředně před použitím přidejte 1 mM PMSF.
• 15 μl proteinu A+15 μl proteinu G je pro IP dostačující, ale může to záviset na vaší primární protilátce a objemu vzorku. Můžete také použít předem smíchanou agarózu s proteinem A/ G (např. protein A pro pull-down králičího IgG a protein G pro pull-down myšího IgG)
• 3X SDS vzorkový pufr: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 při 25°C), 6% w/v SDS, 30% glycerol, 150 mM DTT, 0,03% w/v bromfenolová modř

B. Příprava buněčných lyzátů

• Proveďte sklizeň buněk. Pro sklizeň buněk za nedenaturujících podmínek odstraňte médium a buňky jednou opláchněte ledově studeným PBS.
• Odstraňte PBS, na každou misku (10 cm) přidejte 0,5 ml ledově studeného 1X lyzačního pufru pro buňky a misky inkubujte 5 minut na ledu.
• Seškrábněte buňky z misek a přeneste je do mikrocentrifugačních zkumavek. Uchovávejte na ledu.
• Sonikujte dvakrát po 10 sekundách v ledově studeném imunoprecipitačním pufru (IP pufr: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 a směs inhibitorů proteáz). Pro sonikaci jsou VialTweeter nebo sondový ultrasonikátor, jako je UP100H nebo UP200Ht, nejvhodnější.
• Lyzáty centrifugujte při 15 000 g po dobu 10 minut při 4°C.
• Supernatant přeneste do nové zkumavky. (V případě potřeby lze lyzát uchovávat při –80°C.)
• Do supernatantu přidejte primární protilátku. Supernatant s primární protilátkou se inkubuje 1 h při 4°C za mírného míchání. Primární protilátka se obvykle přidává v množství 10x koncentrovanějším, než jaké se používá pro western blotting. (Můžete začít s 1μg na 100μL.)
• Supernatant se poté dále inkubuje se směsí stejných množství agarózy s proteinem A (Invitrogen) a agarózy s proteinem G po dobu další 1 h.
• Agarózové pelety třikrát promyjte IP pufrem. Poté vázané proteiny extrahujte nanášecím pufrem pro SDS-PAGE zahřátím na 95°C po dobu 5 minut.

C. Imunoprecipitace

• Odeberte 200 μl buněčného lyzátu a přidejte primární protilátku. Inkubujte za mírného kývání přes noc při 4°C.
• Přidejte agarózové kuličky s proteinem A nebo G (20 μl 50% suspenze kuliček). Inkubujte za mírného kývání 1–3 hodiny při 4°C.
• Mikrocentrifugujte 30 sekund při 4°C. Peletu pětkrát promyjte 500 µl 1X lyzačního pufru pro buňky. Během promývání uchovávejte na ledu.
• Peletu resuspendujte ve 20 μl 3X SDS vzorkového pufru. Promíchejte na vortexu a poté 30 sekund mikrocentrifugujte.
• Vzorek zahřejte na 95–100°C po dobu 2–5 minut a 1 minutu mikrocentrifugujte při 14 000 X g.
• Naneste vzorek (15–30 μl) na gel pro SDS-PAGE (12–15%).
• Vzorek analyzujte western blottingem.

Analýza western blot se sonikátorem UP50H

Následující protokol se sondovým sonikátorem UP50H byl použit ve studii Kriebisch et al. (2011):
Celkový protein byl izolován z buněk MC3T3-E1 ošetřených 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) nebo vehikulem. Buňky byly lyzovány pufrem obsahujícím 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% dodecylsulfát sodný (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) a 0,5% deoxycholát sodný (Merck). Buněčný lyzát byl sonikován 2 × 10 s při cyklu 1 a amplitudě 80 pomocí ultrazvukového procesoru UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Německo). Poté byl materiál centrifugován 10 min při 14 000 rpm a supernatant byl použit pro western blotting. Dvacet pět μg proteinu bylo povařeno ve vzorkovém pufru a redukčním činidle (Invitrogen), následně rozděleno pomocí SDS-PAGE na 4–12% polyakrylamidových gelech (Invitrogen) a přeneseno na nitrocelulózovou membránu (GE health care). Membrána byla blokována 1 h v TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) obsahujícím 1% kasein (Sigma-Aldrich) a 1% Tris (1 M). Po blokování byla membrána inkubována za mírného míchání přes noc při 4°C s primární protilátkou (králičí anti-lidská CBS 1/500, vyvinutá v laboratoři Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). Inkubace se sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou (HPR) (Dako) probíhala 1 h při pokojové teplotě. Všechny bloty byly vyvolány pomocí zesílené chemiluminiscence (Perkin Elmer).

Klikněte zde a přečtěte si více o osvědčených postupech pro ultrazvukovou lyzi buněk a extrakci, přípravu lyzátu a o doporučeních pro zlepšení procesu!

Následující tabulka vám poskytne orientační představu o přibližné zpracovatelské kapacitě našich laboratorních ultrasonikátorů:

Literatura / Reference

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.