Hielscher ultrazvuková technologie

Ultrazvuková Lyže pro westernovým přenosem

  • Western blot je analytický postup pro detekci specifických proteinů ve vzorku tkáňového homogenátu nebo extraktu z buněk.
  • Pro spuštění Western blotting nebo pro měření enzymové aktivity, mnoho testy vyžadují přístup k materiálu (například proteiny, DNA, subcelulární fragmenty) zachycených v buňce.
  • Sonikace je spolehlivý a snadno ovladatelná metoda pro řízené rozrušení buněk a rozkladu.

Ultrazvuková rozrušením buněk

Extrakce proteinu z tkání a kultivovaných buněk je prvním krokem k mnoha biologických a biochemických a analytické techniky (PAGE, Western blot, ELISA, hmotnostní spektrometrii, atd.) nebo čištění proteinů. Pro dosažení vysokého výtěžku proteinu se buněčný materiál a tkáň musí být účinně narušena / lyžovány. Zda rostlinné buňky nebo živočišné tkáně, použití ultrazvuku je způsob přípravy váš mobilní lyzát snadno a rychle.

Výhody použití ultrazvuku

  • Rychle & účinný
  • snadná obsluha
  • vysoký výnos proteinu
  • reprodukovatelný / opakovatelné
  • přesně řízené
  • škálovatelné

Imunoprecipitace Protocol Pro západní imunoblotingem

A. Reakční

Pro přípravu roztoků, pomocí čištěné vody, jako je Milli-Q.

  • 1X fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS)
  • 1X Cell Lysis Buffer: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 pyrofosforečnan mM sodný, 1 mM β-glycerofosfát, 1 mM Na3VO4, 1 ug / ml leupeptinu
    Důležité: Přidá se 1 mM PMSF bezprostředně před použitím.
  • 15 ul proteinu protein + 15 ul G je dostatečná pro IP, ale může záviset na primární objemu protilátky a vzorku. Lze také použít předem smíchaný protein A / G agarózy (např. Protein A pro králičí IgG strhnout a protein G pro myší IgG strhnout)
  • 3X SDS vzorkový pufr: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 při 25 ° C), 6% hmotnost / objem SDS, 30% glycerol, 150 mM DTT, 0,03% hmotnost / objem bromfenolové modři
Hielscher's VialTweeter is is´deal for the lysis of multiple samples

VialTweeter pro ultrazvukové vzorku prep

Kontaktujte nás! / Zeptej se nás!





Uvědomte si prosím naši Zásady ochrany osobních údajů,


Sonikace je důležitým krokem při přípravě vzorků

UP200St s mikro-tip na vzorek ultrazvuku

B. Příprava buněčných lyzátů

  • Sklizeň buněk. Pro sklizení buněk za nedenaturujícím podmínek, odstranit médium a buňky opláchnout jedenkrát ledově chladným PBS.
  • Odstraňte PBS a přidá se 0,5 ml ledově chladného lyzačního pufru 1X buněk na každé desce (10 cm) a inkubovat na ledu po dobu 5 minut.
  • Scrape buňky mimo desky a přenos do mikrocentrifugační zkumavky. Mějte na ledě.
  • Zpracování směsi ultrazvukem dvakrát po dobu 10 sekund v ledově chladném pufru imunoprecipitace (IP pufru: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 a směs inhibitor proteázy). Pro sonikaci VialTweeter nebo ultrasonicator sonda, jako je UP100H nebo Uf200 ः t jsou nejvhodnější.
  • Odstřeďujte lyzátů při 15000 g po dobu 10 minut při teplotě 4 ° C.
  • Přeneste supernatant do nové zkumavky. (Je-li to nutné, lyzát může být skladován při -80 ° C).
  • Přidejte primární protilátku k supernatantu. Supernatant s primární protilátkou se inkubuje po dobu 1 h při 4 ° C za lehkého míchání. Primární protilátka je typicky přidán v množství 10x koncentrovanější než je použit pro Western blot. (Můžete začít s 1 ug na 100 ul.)
  • Supernatant se pak dále inkubuje se směsí stejných množství Protein A-agarózy (Invitrogen) a protein G agarózy další 1 hodiny.
  • Promyjte agaróza pelet třikrát IP pufrem. Poté, extrahovat navázaných proteinů s SDS-PAGE nanášecího pufru zahříváním při teplotě 95 ° C po dobu 5 minut.

C. Imunoprecipitace

  • Se 200 ul buněčného lyzátu a přidat primární protilátku. Inkubujte s mírným třepáním přes noc při 4 ° C.
  • Přidá se buď protein A nebo G agarosové kuličky (20 ul 50% suspenze perliček). Inkubujte s mírným třepáním po dobu 1-3 hodin při teplotě 4 ° C.
  • Mikrocentrifuze po dobu 30 sekund při teplotě 4 ° C. Wash pelety pětkrát s 500 ul 1X buněčného lyzačního pufru. Mějte na ledě během praní.
  • Peleta se resuspenduje pomocí 20 ul pufru pro vzorky 3x SDS. Vortex, pak mikrocentrifuze po dobu 30 sekund.
  • Teplo vzorku na 95-100 ° C po dobu 2-5 minut a mikroodstředivce po dobu 1 minuty při 14000 x g.
  • Vložte vzorek (15-30 ul) na SDS-PAGE gelu (12-15%).
  • Analyzovat vzorek westernovým přenosem.

Kontakt / požádat o další informace

Promluvte si s námi o vaše požadavky na zpracování. Doporučíme nejvhodnější nastavení a zpracování parametrů pro váš projekt.





Uvědomte si prosím naši Zásady ochrany osobních údajů,


Další použití ultrazvuku protokoly

Western blot s ultrasonicator UP50H

Následující protokol byl použit ke studiu Kriebisch et al. (2011):
Celkový protein se izoluje z MC3T3-E1 buněk ošetřených s 1,25 (OH)2D3 (10-8 M), nebo vehikulum. Buňky byly lyžovány pufrem obsahujícím 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% dodecylsulfát sodný (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) a 0,5% deoxycholátu sodného (Merck). Buněčný lyzát se podrobí působení ultrazvuku po dobu 2 x 10 sekund při cyklu 1 a amplituda 80 s UP50H Ultrazvukový procesor (Hielscher, Ultrazvuk Technology, Teltow, Německo). Poté byl materiál centrifugován 10 minut při 14 000 ot / min a supernatant byl použit pro Western blot. Dvakrát pět μg proteinu se vaří ve vzorkovém pufru a redukčním činidle (Invitrogen) a následně se oddělí pomocí SDS-PAGE za použití 4-12% polyakrylamidových gelů (Invitrogen) a přenese se na nitrocelulózovou membránu (zdravotní péče GE). Membrána byla blokována 1 hodinu pomocí TBS (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl) obsahujícího 1% kaseinu (Sigma-Aldrich) a 1% Tris (1M). Po blokování byla membrána inkubována s mírným mícháním přes noc při teplotě 4 ° C s primární protilátkou (králičí anti-humánní CBS 1/500, vyvinutá v laboratoři prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). Inkubace s sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou (HPR) (Dako) byla provedena po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Všechny bloty byly vyvinuty zvýšenou chemiluminiscencí (Perkin Elmer).

Literatura / Reference



O westernovým přenosem

Bloty jsou analytické postupy, kde DNA, RNA a proteinů jsou přenášeny na nosič tak, že mohou oddělit.
Southern blot se používá pro detekci DNA, Northern blot pro RNA a Western blot pro proteiny.
Western blot se také nazývá protein imunoblot, protože protilátka je použita pro specifickou detekci svůj antigen. Western Blotting je jedním z nejdůležitějších analytických metod pro detekci specifických proteinů ve vzorku. Ve Western blot se proteiny se imobilizují na membránách je odhalit použití monoklonálních nebo polyklonálních protilátek.
Natálními proteiny SDS-polyakrylamidovou gelovou elektroforézou (SDS-PAGE) se oddělí 3-D struktura nebo denaturované proteiny délkou polypeptidu. Proteiny jsou pak přeneseny na membránu (typicky nitrocelulózu nebo PVDF), kde jsou barveny protilátkami specifickými pro cílový protein. Krok gelové elektroforézy je zahrnut v Western blot analýze k vyřešení problému zkřížené reaktivity protilátek.
Poté se oddělené proteiny promítají na matrici (většinou na nitrocelulózové nebo PVDF membráně), kde jsou barveny protilátkami. Protilátky fungují jako sonda a jsou specificky vybrány pro cílový protein. Analýza umístění a intenzity specifické reakce odhaluje detaily exprese cílových proteinů v daném vzorku. Western blot může detekovat cílový protein, který je tak nízký jako 1 ng kvůli vysokému rozlišení gelové elektroforézy a silné specificitě a vysoké citlivosti imunotestu. Metoda Western blot se používá v molekulární biologii, biochemii, imunogenetice a dalších oblastech molekulárního výzkumu.
Další související techniky zahrnují dot blot analýza, imunohistochemie a imunocytochemie, kde jsou použity protilátky k detekci proteinů v tkáních a buňkách imunobarvením a enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).