Ultrazvuková lýza pro Western Blotting

• Western blot je analytický postup pro detekci specifických proteinů ve vzorku tkáňového homogenátu nebo buněčného extraktu.
• Aby bylo možné provést Western blot nebo změřit aktivitu enzymů, vyžaduje mnoho testů přístup k materiálům (např. proteinům, DNA, subcelulárním fragmentům) zachyceným v buňce.
• Sonikace je spolehlivá a snadno ovladatelná metoda pro řízené narušení a lýzu buněk.

Ultrazvukové narušení buněk

Extrakce proteinů z tkání a kultivovaných buněk je prvním krokem pro mnoho biologických, biochemických a analytických technik (PAGE, Western blotting, ELISA, hmotnostní spektrometrie atd.) nebo purifikace proteinů. Aby se dosáhlo vysokého výtěžku bílkovin, musí být buněčný materiál a tkáň účinně narušeny/lyzovány. Ať už se jedná o rostlinnou buňku nebo živočišnou tkáň, sonikace je způsob, jak snadno a rychle připravit buněčný lyzát.

Výhody ultrazvuku

• Rychlý & Efektivní
• Snadná obsluha
• vysoký výnos bílkovin
• reprodukovatelné / opakovatelné
• Přesné ovládání
• škálovatelný

Protokol imunoprecipitace pro západní imunoblotting

A. Činidla

Pro přípravu roztoků použijte čištěnou vodu, jako je Milli-Q.

• 1X fyziologický roztok pufrovaný fosfátem (PBS)
• 1X buněčný lytický pufr: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM pyrofosforečnan sodný, 1 mM β-glycerofosfát, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptinu
  Důležité: Bezprostředně před použitím přidejte 1 mM PMSF.
• 15 μl Protein A+15 μl Protein G je dostačující pro IP, ale může to záviset na vaší primární protilátce a objemu vzorku. Můžete také použít předem namíchaný protein A/ G agarózu (např. Protein A pro králičí IgG pulldown a Protein G pro myší IgG pulldown)
• 3X SDS vzorkovací pufr: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 při 25 °C), 6 % w/v SDS, 30 % glycerol, 150 mM DTT, 0,03 % w/v bromfenol modř

B. Příprava buněčných lyzátů

• Sklízejte buňky. Chcete-li sklízet buňky za nedenaturačních podmínek, vyjměte médium a buňky jednou opláchněte ledově vychlazeným PBS.
• Vyjměte PBS a na každý talíř (10 cm) přidejte 0,5 ml ledově vychlazeného pufru pro lýzu buněk 1X a destičky inkubujte na ledu po dobu 5 minut.
• Seškrábněte buňky z destiček a přeneste je do mikrocentrifugačních zkumavek. Zůstaňte na ledu.
• Sonikovat dvakrát po dobu 10 sekund v ledově studeném imunoprecipitačním pufru (IP pufr: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 a směs inhibitorů proteázy). Pro sonikaci VialTweeter nebo sonda ultrasonicator, jako je UP100H nebo UP200Ht jsou nejvhodnější.
• Lyzáty se odstřeďují při 15 000 g po dobu 10 minut při teplotě 4 °C.
• Přeneste supernatant do nové zkumavky. (V případě potřeby lze lyzát skladovat při teplotě –80 °C.)
• Přidejte primární protilátku k supernatantu. Supernatant s primární protilátkou se inkubuje po dobu 1 hodiny při teplotě 4 °C za světelné agitovanosti. Primární protilátka se obvykle přidává v množství 10x koncentrovanějším, než se používá pro western blotting. (Můžete začít s 1 μg na 100 μl.)
• Supernatant se poté dále inkubuje se směsí stejného množství proteinu A-agaróza (Invitrogen) a proteinu G agaróza po dobu další 1 hodiny.
• Agarózové pelety třikrát omyjte IP pufrem. Poté extrahujte vázané proteiny pomocí plnicího pufru SDS-PAGE zahříváním na 95 °C po dobu 5 minut.

C. Imunoprecipitace

• Vezměte 200 μl buněčného lyzátu a přidejte primární protilátku. Inkubujte s jemným houpáním přes noc při teplotě 4 °C.
• Přidejte buď proteinové kuličky A nebo G agarózu (20 μl 50% korálkové kaše). Inkubujte za jemného houpání po dobu 1–3 hodin při teplotě 4 °C.
• Mikrocentrifuga po dobu 30 sekund při 4 °C. Peletu pětkrát promyjte 500 μl pufru pro lýzu buněk 1X. Během praní uchovávejte na ledu.
• Peletu promíchejte s 20 μl 3X SDS vzorkovacího pufru. Vír, poté mikrocentrifuga po dobu 30 sekund.
• Vzorek se zahřeje na 95–100 °C po dobu 2–5 minut a mikrocentrifuga po dobu 1 minuty při 14 000 X g.
• Naplňte vzorek (15–30 μl) gelem SDS-PAGE (12–15 %).
• Analyzujte vzorek pomocí Western blottingu.

Analýza Western Blot pomocí Sonikator UP50H

Při studiu Kriebisch et al. (2011) byl použit následující protokol používající sonikátor typu sondy UP50H:
Celkový protein byl izolován z buněk MC3T3-E1 ošetřených 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) nebo vozidlo. Buňky byly lyzovány pufrem obsahujícím 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% dodecylsulfát sodný (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) a 0,5% deoxycholát sodný (Merck). Buněčný lyzát byl sonikován po dobu 2 × 10 s v cyklu 1 a amplitudě 80 s Ultrazvukový procesor UP50H (Hielscher, ultrazvuková technologie, Teltow, Německo). Poté byl materiál odstředěn po dobu 10 minut při 14 000 otáčkách za minutu a supernatant byl použit pro Western blotting. Dvacet pět μg proteinu bylo vařeno ve vzorkovém pufru a redukčním činidle (Invitrogen) a následně odděleno pomocí SDS-PAGE pomocí 4–12% polyakrylamidových gelů (Invitrogen) a přeneseno na nitrocelulózovou membránu (GE health care). Membrána byla blokována po dobu 1 hodiny TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) obsahujícím 1 % kaseinu (Sigma-Aldrich) a 1 % Tris (1 M). Po zablokování byla membrána inkubována s mírným mícháním přes noc při teplotě 4 °C s primární protilátkou (králičí antihumánní CBS 1/500, vyvinutý v laboratoři Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). Inkubace se sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou (HPR) (Dako) byla provedena po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Všechny bloty byly vyvinuty pomocí zvýšené chemiluminiscence (Perkin Elmer).
 

Klikněte zde a přečtěte si více o osvědčených postupech pro ultrazvukovou lýzu a extrakci buněk, přípravě lyzátu a doporučeních pro zlepšení procesů!
 
Níže uvedená tabulka vám poskytuje přibližnou kapacitu zpracování našich laboratorních ultrasonicators:

Literatura / Reference