Ultrazvuková příprava vzorků C. elegans

C. elegans, hlístice, je široce používaný modelový organismus v biologii. Příprava vzorku před analýzou vyžaduje lýzu, extrakci proteinů a lipidů a také fragmentaci RNA, kterou lze spolehlivě provést pomocí sonikace. Ultrazvukové buněčné disruptory jsou spolehlivá, sofistikovaná a snadno použitelná zařízení pro rychlou přípravu vzorků C. elegans.

Ultrazvuková příprava vzorků C. elegans

C. elegans jsou škrkavky, které jsou široce používány ve výzkumných laboratořích k vyšetřování genomiky, vývojové biologie a nemocí. Mnoho genů v genomu C. elegans má funkční protějšky u lidí. Háďátko je tak mimořádně užitečným modelem pro lidské nemoci. Dalšími výhodami pro široké využití C. elegans jsou její snadná a levná kultivace na destičkách obsahujících bakterie (např. E. coli), její průhlednost, pohodlná manipulace a také možnost zmrazit a skladovat červy na delší dobu.
Analýza proteinů a lipidů jsou pravidelné postupy v laboratořích a ultrazvuková příprava vzorků je zavedenou metodou lýzy hlístic C. elegans v každé vývojové fázi (tj. embrya, larvy L1-L4, dospělci). Vzhledem k tomu, že C. elegans se také používá jako systém exprese proteinů k nadměrné expresi cílených proteinů, je nutná spolehlivá, reprodukovatelná metoda lýzy a extrakce proteinů, která poskytuje vysoké výtěžky proteinů. Ultrazvukové systémy pro narušení a extrakci buněk jsou k dispozici jako homogenizátory typu sondy a jako vícevzorkové ultrazvukové přístroje. Stravování pro pohodlnou přípravu vzorků a všechny druhy velikostí vzorků, Hielscher Ultrasonics má ideální ultrazvukový buněčný disruptor pro váš laboratorní postup.

Ultrazvukové protokoly pro disrupci a lýzu C. elegans

Ultrazvuková homogenizace a lýza C. elegans a následná extrakce proteinů a lipidů může být provedena pomocí různých postupů s použitím různých homogenizačních a lyzačních pufrů atd. Všechny protokoly lýzy mají společné to, že vzorky musí být kontinuálně uchovávány na ledu, aby se zabránilo degradaci proteinů. Níže vám představujeme některé spolehlivé a rychlé protokoly ultrazvukové lýzy a extrakce pro přípravu vysoce kvalitních vzorků C. elegans obsahujících proteiny nebo lipidy.

Výhody ultrazvukové lýzy C. elegans

• Spolehlivý
• reprodukovatelný
• Přesně řízená teplota
• Spolehlivé řízení procesu
• Jemná metoda
• Snadná aplikace
• Trezor

Ultrazvuková extrakce proteinů ze vzorků C. elegans

Ultrazvuková lýza a extrakce proteinů červů C. elegans lze provádět pomocí různých protokolů. Níže vám představujeme několik spolehlivých a rychlých lytických protokolů pro reprodukovatelné výsledky extrakce proteinů.

Rychlá příprava cytosolického extraktu z červů C. elegans zvukovou nikotou

S následujícím protokolem můžete připravit lyzáty C. elegans za méně než 30 minut.
Sbírka C. elegans
Vyberte požadované červy C. elegans do 1,5 ml zkumavky s fosfátovým pufrovaným fyziologickým roztokem (PBS) nebo je omyjte z talíře 1,5 ml PBS. Centrifugujte po dobu 1 minuty při 2000 ot./min na peletu. Uchovávejte vzorky po celou dobu na ledu.
Poté červy dvakrát omyjte PBS.
Poté červy dvakrát omyjte ddH₂O.
Resuspendujte červy v alespoň 500ul homogenizačního pufru (HB). Vzorky červů jsou nyní připraveny pro ultrazvukovou lýzu.
Pro vyšší kvalitu proteinového extraktu můžete chtít snížit bakteriální kontaminaci tím, že červy promyjete po dobu 5 minut v PBS a sterilní, ultračisté vodě (ddH₂O) nebo provést floataci sacharózy. Vzorky červů uchovávejte nepřetržitě na ledu.

Ultrazvukový protokol lýzy C. elegans

• Ujistěte se, že jste připravili ultrasonicator předem, aby byl ultrazvukový homogenizátor připraven k použití (namontovaná sonda, přednastavený program sonikace).

Pokud je váš ultrasonicator namontován na stojanu, umístěte ledovou lázeň se vzorkovacími zkumavkami pod ultrazvukovou sondu a vložte ultrazvukovou sondu do 1,5ml zkumavky.

• Pro lýzu C. elegans s UP200St nebo UP200Ht, ultrazvuku by měla být provedena pomocí mikrohrotu (např. 2mm sonda S26d2; viz obrázek vlevo) při 40% amplitudě po dobu 1 sekundy s 30sekundovými pauzami mezi nimi. 5 sonikačních cyklů pro každou 1 sekundu s 30sec pauzami jsou ideální pro lýzu C. elegans. Pokud provádíte lýzu poprvé, můžete průběh lýzy zkontrolovat v malých alikvotách vzorku po každém pulzu pomocí mikroskopu.
• Lýza je úspěšně dokončena, když jsou červi narušeni. Nadměrná sonikace má za následek rozbití jader a stává se viditelným, když se vzorek stane viskózním nebo pěnivým. Abyste zabránili degradaci vzorku, použijte v případě potřeby více pulzů. Neprodlužujte dobu každého ultrazvukového pulzního cyklu, abyste získali vysoce kvalitní proteinové extrakty.
• Čirý buněčný lyzát odstředěním ultrazvukem lyzovaných červů při 14 000 ot./min po dobu 10 minut při 4 ° C.
• Poté se supernatant přenese do čerstvé zkumavky a připraví se na imunoprecipitaci nebo jiné testy.

Poznámka k homogenizačnímu pufru: Připravte homogenizační pufr pro výše uvedený protokol ultrazvukové lýzy následujícím způsobem:

Vysoce výkonná lýza C. elegans v 96-jamkových deskách pomocí UIP400MTP deskového sonikátoru

C. elegans Lysis (dospělé hlístice)
UIP400MTP 80% amplituda, 20 cyklů (každý cyklus ultrazvuku: 30 sekund zapnuto, 30 sekund vypnuto)
Lýzní pufr:

• Možnost 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Možnost 2) pro koimunoprecipitaci (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (kompletní koktejl inhibitorů proteinázy)

Fragmentace DNA s vysokou propustností
C. elegans (dospělé hlístice) DNA 200-300bp: UIP400MTP talířový sonikátor – nastavit 80% amplitudu, 30 pulzů – každých 30 sekund zapnuto, 30 sekund vypnuto

UIP400MTP Plate Sonikator pro přípravu vzorků s vysokou propustností rovnoměrně sonikuje vzorky ve vícejamkových, mikrotitračních destičkách a 96jamkových destičkách

Ultrazvuková lýza C. elegans pro kvantitativní afinitní purifikační testy

Embrya C. elegans (∼2 miliony na replikát) byla čerstvě sklizena v biologickém triplikátu bělením mladých gravidních hermafroditů a sonikována na ledu (cyklus: 0,5 s, amplituda: 40–45 %, 5 tahů/sezení, 5 sezení, interval mezi sezeními: 30 s; Ultrazvukový procesor UP200S s mikrohrotem S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) v lyzačním pufru (celkový objem: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glycerol, směs inhibitorů proteázy, 0,1% Nonidet P-40 náhrada). Po sonikaci byla přidána náhrada Nonidet P-40 až na 1% a lyzáty byly inkubovány s rotací hlavy přes ocas při 4 °C po dobu 30 minut, následované centrifugací při 20 000 × g po dobu 20 minut při 4 °C. Vyčištěný lyzát byl poté odsát, aniž by došlo k narušení horní lipidové vrstvy, a rozdělen na polovinu buď na anti-GFP agarózové kuličky, nebo na blokované kontrolní kuličky (40–50 μl). Po rotaci hlavy nad ocasem při teplotě 4 °C po dobu 60–90 minut byly kuličky jednou promyty lyzačním pufrem obsahujícím 0,1% Nonidet P-40 Substitute, následované dvěma promytími buď v pufru I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) nebo pufru II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) nebo obojí. Pro pull-downy GFP:MBK-2 byly provedeny dva samostatné experimenty s použitím různých promývacích podmínek. Proteiny byly eluovány orbitálním třesením v 50 μl 6 M močoviny / 2 M thiomočoviny při pokojové teplotě. Pro experimenty MBK-1::GFP pull-down byly proteiny eluovány dvakrát protřepáním v 50 μl 8 m guanidiniumchloridu při 90 °C, následovaným srážením ethanolu. Eluované vzorky proteinů byly poté tráveny v roztoku.
(srov. Chen et al., 2016)

Ultrazvuková homogenizace a lýza šneků

Pro lýzu C.elegans a extrakci proteinů bylo odebráno 30 000 nemotod příslušného stupně na vzorek a promyto v ledově studeném S-bazálu, koncentrováno centrifugací při 1500 otáčkách za minutu po dobu 2 minut, šestkrát promyto ledově studeným S-bazálem, aby se odstranily zbytkové bakterie, a poté skladováno na ledu, dokud nebyly připraveny k použití. Pro extrakci proteinů bylo gravidovitým červům umožněno vytvořit kompaktní peletu po posledním S-bazálním promytí. Šnekové pelety byly poté resuspendovány v 1 ml ledově studeného extrakčního pufru [20 mM fosforečnanu draselného, pH 7,4, 2 mM EDTA, 1% Triton-X-100, inhibitory proteázy (Sigma P2714)] a okamžitě zpracovány.
∼30 000 gravidních dospělých červů (což odpovídá ∼100 mg mokré hmotnosti), bylo sonikováno na ledu pomocí ultrazvuku typu sondy (např. UP50H s mikrohrotem MS2) při 40% amplitudě po dobu 10 cyklů po 3 sekundách zapnuto, 30 sekund vypnuto, v 1 ml ledově studeného extrakčního pufru. (srov. Baskharan et al. 2012)

Ultrazvuková extrakce lipidů z C. elegans

V lipidomice, odvětví metabolomiky, je charakterizován a analyzován lipidový komplement biologických systémů. C. elegans jsou široce používány v lipidomice ke zkoumání interakce metabolických lipidů a jejich účinků na zdraví a délku života.
Ultrazvuková lýza a extrakce se používá k uvolňování lipidů, jako jsou sfingolipidy z embryí, larev a dospělých červů C. elegans. Ultrazvuku se používá k přípravě homogenátů červů a následně k extrakci lipidů ze vzorku.
Protokol pro ultrazvukovou extrakci lipidů z C. elegans
Rozmrazte pelety C. elegans na ledu a znovu promíchejte s 0,5 ml ultra vody. 
Sonikujte vzorky C. elegans ve zkumavkách o objemu 1,5 ml, přičemž vzorky uchovávejte nepřetržitě na ledu.
Sonikace může být provedena pomocí sondy-ultrazvuku, jako je UP200Ht, ultrazvuková jednotka pro přípravu vzorků VialTweeter (simultánní sonikace 10 vzorků) nebo UIP400MTP (pro sonikaci vícejamkových destiček, jako jsou 96jamkové destičky). Pro ultrazvukovou lýzu s UP200Ht použijte mikrohrot S26d2. Přednastavte režim ultrazvukového cyklu v digitální nabídce. Nastavte amplitudu na 10% a režim cyklu ultrazvuku 2 sekundy, pulzy po 20 cyklech s pauzou 30 sekund mezi každým ultrazvukovým pulzačním výbuchem.
Supernatanty se přenesou do skleněných zkumavek se šroubovacím uzávěrem. 
Proveďte Folchovu extrakci přidáním 1 ml ultravody do každé skleněné zkumavky a následným přidáním 6 ml směsi chloroform/methanol (poměr = 2:1) do každé skleněné zkumavky.
Vortex každou skleněnou trubici po dobu 30 sekund 4krát. 
Centrifugujte zkumavky při 1 258 x g po dobu 15 minut (Eppendorf, 5810 R) pro další zlepšení fázové separace. 
Dolní hydrofobní frakce se přenese do čisté skleněné zkumavky skleněnou Pasteurovou pipetou. 
Nižší hydrofobní frakce se vysuší pod proudem dusíku ve výparníku dusíku. 
Sušené pelety skladujte až do použití v mrazáku při teplotě -80 °C.

Ultrazvuková příprava lyzátů šneků

Šnekový lyzát: Červi ve fázi L4 byli sklizeni a třikrát promyti pufrem M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22.04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl a 0,87 mM MgSO₄), aby se odstranily všechny bakterie. Po odstranění co největšího množství pufru M9 byli červi resuspendováni v lyzačním pufru: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 5 mM fosfátu β-glycerolu, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM fluoridu sodného, 1 mM ortovanadičnanu sodného, 5 mM pyrofosforečnanu sodného, 0,2 mM fenylmethansulfonylfluoridu a inhibitoru proteázy. Červi byli zmrazeni v tekutém dusíku a třikrát rozmraženi při 37 °C, poté byli červi sonikováni na suchém ledu pomocí ultrazvukové jednotky VialTweeter pro současnou přípravu 10 zkumavek se vzorky. Sonikace byla provedena při 50% amplitudě v 10 cyklech po 2 sec. s 30 sec pauzou mezi sonikačními výbuchy. Poté byly vzorky odstřeďovány při 12000 ot./min při 4 °C po dobu 15 minut. Supernatant byl shromažďován a skladován při teplotě -70 °C. Alikvot byl použit pro kvantifikaci proteinů Bradfordovým testem.
Stanovení celkového glutathionu, GSH a GSSG: Pro kvantifikaci glutathionu byly lyzáty a stanovení provedeny ve stejný den. Glukózou krmené a kontrolní larvy L4 byly odebrány a třikrát promyty pufrem M9. Po odstranění co největšího množství pufru M9 byli červi resuspendováni v ledově chladné kyselině metafosforečné (5% w/v), pak byli červi sonikováni v ledu s ultrazvukovým VialTweeter na 50% amplitudě v deseti sonikačních cyklech po 2 sec. s 30 sec. pauza mezi každým cyklem. Poté odstřeďuje při 12000 ot./min při 4 ̊C po dobu 15 minut.
(srov. Alcántar-Fernández et al., 2018)

C. elegans Příprava vzorku před imunoprecipitací a Western Blotting

Stručně řečeno, pro embryonální extrakty byly larvy C. elegans L1 pěstovány ve velkých tekutých S-medium kulturách až do dospělosti. Embrya byla odebrána pomocí standardní bělicí metody a suspendována v lyzačním pufru (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glycerol, 0,05% NP-40, 1 koktejl inhibitoru proteázy a 1��� koktejl inhibitorů fosfatázy I a II), rychle zmrazená v tekutém dusíku a lyzovaná ultrazvukovým narušením buněk pomocí ultrazvukového zařízení s mikrohrotem, jako je UP200Ht s S26d2 pro 10 pulzů po dobu 10 s při 30% amplitudě. Pokud je třeba připravit větší počet vzorků, ultrazvuk VialTweeter nebo se doporučují UIP400MTP MultiSample-Ultrasonicator pro dobře desky. Po sonikaci byly extrakty předem vyčištěny centrifugací při 30 000 g po dobu 20 minut při 4 °C. Předem vyčištěný extrakt (300 μg celkového proteinu) byl inkubován se 40 μgramy anti-CDC-25.1 afinitně purifikované protilátky (tato studie) zesíťované s proteinem A-agarózou, nebo jako kontrola bylo použito podobné množství králičího imunoglobulinu (Ig)G zesíťovaného s proteinem A-agarózou v celkovém objemu 200 μl lyzačního pufru obsahujícího 1% NP-40, jehož zahrnutí snížilo nespecifickou vazbu proteinů na matrici. Vzorky byly rotovány po dobu 1 hodiny při 4 °C, kuličky byly třikrát promyty lýzovým pufrem a eluovány 30 μl glycinu/HCl a 200 mM NaCl, pH 2,2. Po imunoprecipitaci byly eluáty zředěny v 30 μgravitativních l vzorkového pufru SDS, zahřáté na 95 °C po dobu 4 minut a obvykle 3 % z celkového množství pro vstup a 30 % pro eluáty byly aplikovány na SDS-PAGE s následným Western blottingem s protilátkami anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubikvitin (1:1000), anti-GSK3 (1:500) nebo anti-READ β-aktin (1:2000). Tam, kde extrakty nebyly podrobeny imunoprecipitaci, bylo stejné množství celkového proteinu získaného z těchto extraktů resuspendováno ve vzorkovém pufru SDS, zahřáto na 95 °C a poté přímo aplikováno na SDS-PAGE a analyzováno pomocí Western blotting. (srov. Segref et al. 2020)

Ultrazvuková lýza pod Prescise Temperature Control

Přesná a spolehlivá regulace teploty je při manipulaci s biologickými vzorky klíčová. Vysoké teploty iniciují tepelně indukovanou degradaci proteinů ve vzorcích.
Stejně jako všechny techniky mechanické přípravy vzorků, sonikace vytváří teplo. Teplota vzorků však může být dobře kontrolována při použití VialTweeter. Představujeme vám různé možnosti sledování a řízení teploty vašich vzorků při jejich přípravě pomocí VialTweeter a VialPress pro analýzu.

1. Monitorování teploty vzorku: Ultrazvukový procesor UP200St, který pohání VialTweeter, je vybaven inteligentním softwarem a zásuvným teplotním senzorem. Zapojte teplotní senzor do UP200St a vložte špičku teplotního senzoru do jedné ze vzorkových trubic. Prostřednictvím digitálního barevného dotykového displeje můžete v nabídce UP200St nastavit konkrétní teplotní rozsah pro sonikaci vzorku. Ultrasouckator se automaticky zastaví, když je dosaženo maximální teploty, a pozastaví se, dokud teplota vzorku neklesne na nižší hodnotu nastavené teploty ∆. Poté se sonikace spustí automaticky znovu. Tato chytrá funkce zabraňuje degradaci vyvolané teplem.
2. Blok VialTweeter lze předchladit. Vložte blok VialTweeter (pouze sonotroda bez převodníku!) do lednice nebo mrazničky, aby se titanový blok předchladil, což pomáhá odložit nárůst teploty ve vzorku. Pokud je to možné, lze předchladit i samotný vzorek.
3. Během sonikace použijte k chlazení suchý led. Použijte mělký tác naplněný suchým ledem a umístěte VialTweeter na suchý led, aby se teplo mohlo rychle rozptýlit.

Najděte optimální ultrazvukový buněčný disruptor pro vaši aplikaci lýzy

Hielscher Ultrasonics je dlouholetým zkušeným výrobcem vysoce výkonných ultrazvukových buněčných disruptorů a homogenizátorů pro laboratoře, stolní a průmyslové měřítkové systémy. Velikost vaší bakteriální buněčné kultury, váš výzkumný nebo výrobní cíl a objem buňky, která se má zpracovat za hodinu nebo den, jsou základními faktory pro nalezení správného ultrazvukového buněčného disruptoru pro vaši aplikaci.
Hielscher Ultrasonics nabízí různá řešení pro současné sonikaci více vzorků (až 10 lahviček), stejně jako hromadné vzorky (tj. mikrotitrační desky / 96jamkové desky), klasický laboratorní ultrazvuk typu sondy s různými úrovněmi výkonu od 50 do 400 wattů až po plně průmyslové ultrazvukové procesory s až 16 000 wattů na jednotku pro komerční narušení buněk a extrakci proteinů ve velké výrobě. Všechny Hielscher ultrasonicators jsou vyrobeny pro provoz 24/7/365 při plném zatížení. Robustnost a spolehlivost jsou základními vlastnostmi našich ultrazvukových přístrojů.
Všechny digitální ultrazvukové homogenizátory jsou vybaveny chytrým softwarem, barevným dotykovým displejem a automatickým protokolováním dat, díky čemuž se ultrazvukové zařízení stává pohodlným pracovním nástrojem v laboratorních a výrobních zařízeních.
Dejte nám vědět, jaké buňky, jaký objem, s jakou frekvencí a s jakým cílem musíte zpracovávat své biologické vzorky. Doporučíme vám nejvhodnější ultrazvukový disruptor článků pro vaše procesní požadavky.

Níže uvedená tabulka vám poskytuje přibližnou kapacitu zpracování našich ultrazvukových systémů od kompaktních ručních homogenizátorů a MultiSample Ultrasonicators až po průmyslové ultrazvukové procesory pro komerční aplikace: