Ultrazvuková příprava vzorků C. Elegans

C. elegans, hlístice, je v biologii široce používaný modelový organismus. Příprava vzorků před analýzou vyžaduje lyzi, extrakci proteinů a lipidů a také fragmentaci RNA, které lze spolehlivě provést pomocí sonikace. Ultrazvukové dezintegrátory buněk jsou spolehlivá, vyspělá a snadno ovladatelná zařízení pro rychlou přípravu vzorků C. elegans.

Ultrazvuková příprava vzorků C. elegans

Caenorhabditis elegans jsou hlístice, které se ve výzkumných laboratořích široce využívají ke zkoumání genomiky, vývojové biologie a nemocí. Mnoho genů v genomu C. elegans má funkční protějšky u člověka. Díky tomu je tato hlístice mimořádně užitečným modelem lidských onemocnění. Dalšími výhodami, které vedou k širokému využití C. elegans, jsou jeho snadná a levná kultivace na plotnách s bakteriemi (např. E. coli), jeho průhlednost, pohodlná manipulace a také možnost červy zmrazit a uchovávat po delší dobu.
Analýza proteinů a lipidů patří k běžným laboratorním postupům a ultrazvuková příprava vzorků je zavedenou metodou lyze hlístic C. elegans ve všech vývojových stadiích (tj. embrya, larvy L1-L4, dospělci). Jelikož se C. elegans používá také jako expresní systém k nadměrné expresi cílových proteinů, je zapotřebí spolehlivá a reprodukovatelná metoda lyze a extrakce proteinů, která poskytuje vysoké výtěžky proteinů. Ultrazvukové systémy pro dezintegraci buněk a extrakci jsou k dispozici jako homogenizátory sondového typu a jako ultrazvukové přístroje pro více vzorků. Pro pohodlnou přípravu vzorků a pro všechny velikosti a počty vzorků má Hielscher Ultrasonics ideální ultrazvukový dezintegrátor buněk pro Váš laboratorní postup.

Ultrazvukové protokoly pro dezintegraci a lyzi C. Elegans

Ultrazvukovou homogenizaci a lyzi C. elegans a následnou extrakci proteinů a lipidů lze provádět různými postupy s použitím různých homogenizačních a lyzačních pufrů atd. Všechny protokoly lyze mají společné to, že vzorky musí být nepřetržitě uchovávány na ledu, aby se zabránilo degradaci proteinů. Níže Vám představujeme několik spolehlivých a rychlých protokolů ultrazvukové lyze a extrakce pro přípravu vysoce kvalitních vzorků C. elegans obsahujících proteiny nebo lipidy.

Výhody ultrazvukové lyze C. elegans

• spolehlivá
• reprodukovatelná
• s přesnou regulací teploty
• spolehlivé řízení procesu
• šetrná metoda
• snadné použití
• bezpečná

Ultrazvuková extrakce proteinů ze vzorků C. elegans

Ultrazvukovou lyzi a extrakci proteinů z červů C. elegans lze provádět pomocí různých protokolů. Níže Vám představujeme několik spolehlivých a rychlých protokolů lyze pro reprodukovatelné výsledky extrakce proteinů.

Rychlá příprava cytosolového extraktu z červů C. elegans sonikací

S následujícím protokolem můžete připravit lyzáty C. elegans za méně než 30 minut.
Odběr C. elegans
Přeneste požadované červy C. elegans do 1,5ml zkumavky s fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem (PBS) nebo je spláchněte z plotny pomocí 1,5ml PBS. Centrifugujte po dobu 1min při 2000rpm, aby se vytvořila peleta. Vzorky mějte po celou dobu na ledu.
Poté červy dvakrát promyjte PBS.
Následně červy dvakrát promyjte ddH₂O.
Červy resuspendujte alespoň v 500ul homogenizačního pufru (HB). Vzorky červů jsou nyní připraveny k ultrazvukové lyzi.
Pro vyšší kvalitu proteinového extraktu můžete snížit bakteriální kontaminaci promytím červů vždy po dobu 5min v PBS a ve sterilní ultračisté vodě (ddH₂O) nebo provést flotaci v sacharóze. Vzorky červů mějte nepřetržitě na ledu.

Protokol ultrazvukové lyze C. elegans

• Ultrazvukový přístroj si připravte předem, aby byl ultrazvukový homogenizátor připraven k použití (sonda namontována, sonikační program přednastaven). 

Pokud je Váš ultrazvukový přístroj upevněn na stojanu, umístěte ledovou lázeň se zkumavkami se vzorky pod ultrazvukovou sondu a ultrazvukovou sondu zasuňte do 1,5ml zkumavky.

• Pro lyzi C. elegans pomocí UP200St nebo UP200Ht by se sonikace měla provádět s mikrohrotem (např. 2mm sonda S26d2; viz obrázek vlevo) při 40% amplitudě po dobu 1sec s 30sec pauzami mezi pulzy. Pro lyzi C. elegans je ideálních 5 sonikačních cyklů, každý po 1 sekundě, s 30sec pauzami. Pokud lyzi provádíte poprvé, můžete průběh lyze po každém pulzu kontrolovat v malých alikvotech vzorku pod mikroskopem.
• Lyze je úspěšně dokončena, jakmile jsou červi rozrušeni. Nadměrná sonikace vede k rozbití jader a projeví se tím, že vzorek zviskózní nebo začne pěnit. Abyste zabránili degradaci vzorku, použijte v případě potřeby více pulzů. Pro získání vysoce kvalitních proteinových extraktů neprodlužujte dobu jednotlivých ultrazvukových pulzních cyklů.
• Buněčný lyzát vyčeřte centrifugací ultrazvukem lyzovaných červů při 14 000rpm po dobu 10min při 4ºC.
• Poté přeneste supernatant do čisté zkumavky a připravte jej pro imunoprecipitaci nebo jiné testy.

Poznámka k homogenizačnímu pufru: Homogenizační pufr pro výše uvedený protokol ultrazvukové lyze připravte takto:

Vysokokapacitní lyze C. elegans na 96jamkových destičkách pomocí destičkového sonikátoru UIP400MTP

Lyze C. elegans (dospělé hlístice)
UIP400MTP 80% amplituda, 20 cyklů (každý sonikační cyklus: 30 sec ZAP, 30 sec VYP)
Lyzační pufr:

• Možnost 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Možnost 2) pro koimunoprecipitaci (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (kompletní koktejl inhibitorů proteináz)

Vysokokapacitní fragmentace DNA
C. elegans (dospělé hlístice) DNA 200–300bp: destičkový sonikátor UIP400MTP – nastavte 80% amplitudu, 30 pulzů – každý 30sec zap., 30sec vyp.

Destičkový sonikátor UIP400MTP pro vysokokapacitní přípravu vzorků rovnoměrně sonikuje vzorky v multijamkových a mikrotitračních destičkách a 96jamkových destičkách

Ultrazvuková lyze C. elegans pro kvantitativní afinitní purifikační testy

Embrya C. elegans (∼2 miliony na replikát) byla čerstvě sklizena v biologickém triplikátu bělením mladých gravidních hermafroditů a sonikována na ledu (cyklus: 0,5 s, amplituda: 40–45%, 5 pulzů/sezení, 5 sezení, interval mezi sezeními: 30 s; ultrazvukový procesor UP200S s mikrohrotem S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) v lyzačním pufru (celkový objem: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glycerol, směs inhibitorů proteáz, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). Po sonikaci byl přidán Nonidet P-40 Substitute až do 1% a lyzáty byly inkubovány za rotace přes hlavu při 4°C po dobu 30 min, s následnou centrifugací při 20 000 × g po dobu 20 min při 4°C. Vyčeřený lyzát byl poté odsát bez porušení horní lipidové vrstvy a rozdělen napůl buď k agarózovým kuličkám s anti-GFP, nebo k blokovaným kontrolním kuličkám (40–50 μl). Po rotaci přes hlavu při 4°C po dobu 60–90 min byly kuličky jednou promyty lyzačním pufrem obsahujícím 0,1% Nonidet P-40 Substitute a následně dvakrát promyty buď pufrem I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2), nebo pufrem II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2), případně oběma. Pro pull-downy GFP:MBK-2 byly provedeny dva samostatné experimenty s různými podmínkami promývání. Proteiny byly eluovány orbitálním třepáním v 50 μl 6 m močoviny/2 M thiomočoviny při pokojové teplotě. Pro pull-down experimenty s MBK-1::GFP byly proteiny eluovány dvakrát třepáním v 50μl 8 m guanidiniumchloridu při 90°C, s následnou precipitací ethanolem. Eluované proteinové vzorky byly poté štěpeny v roztoku.
(srov. Chen et al., 2016)

Ultrazvuková homogenizace a lyze červů

Pro postup lyze C.elegans a extrakce proteinů bylo na každý vzorek odebráno 30 000 hlístic příslušného stadia, které byly promyty v ledově studeném S-basal, zkoncentrovány centrifugací při 1500 rpm po dobu 2 min., šestkrát promyty ledově studeným S-basal k odstranění zbytkových bakterií a poté uchovávány na ledu až do použití. Pro extrakci proteinů byli gravidní dospělí červi po posledním promytí v S-basal ponecháni, aby vytvořili kompaktní peletu. Pelety červů byly poté resuspendovány v 1 ml ledově studeného extrakčního pufru [20 mM fosforečnan draselný, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, inhibitory proteáz (Sigma P2714)] a ihned zpracovány.
∼30 000 gravidních dospělých červů (odpovídajících ∼100 mg vlhké hmotnosti) bylo sonikováno na ledu pomocí ultrazvukového přístroje sondového typu (např. UP50H s mikrohrotem MS2) při 40% amplitudě v 10 cyklech 3 sec zap., 30 sec vyp., v 1 ml ledově studeného extrakčního pufru. (srov. Baskharan et al. 2012)

Ultrazvuková extrakce lipidů z C. elegans

V lipidomice, odvětví metabolomiky, se charakterizuje a analyzuje lipidový komplement biologických systémů. C. elegans se v lipidomice široce využívá ke zkoumání interakcí metabolických lipidů a jejich vlivu na zdraví a délku života.
Ultrazvuková lyze a extrakce se používá k uvolnění lipidů, jako jsou sfingolipidy, z embryí, larev a dospělých červů C. elegans. Ultrazvuk se používá k přípravě homogenátů červů a následně k extrakci lipidů ze vzorku.
Protokol ultrazvukové extrakce lipidů z C. elegans
Peletu C. elegans rozmrazte na ledu a resuspendujte v 0,5 ml ultravody (ultrawater). Vzorky C. elegans sonikujte v 1,5mL zkumavkách, přičemž je nepřetržitě udržujte na ledu.
Sonikaci lze provádět pomocí sondového ultrazvukového přístroje, jako je UP200Ht, ultrazvuková jednotka pro přípravu vzorků VialTweeter (současná sonikace 10 vzorků) nebo UIP400MTP (pro sonikaci multijamkových destiček, jako jsou 96jamkové destičky). Pro ultrazvukovou lyzi s UP200Ht použijte mikrohrot S26d2. V digitálním menu přednastavte ultrazvukový cyklický režim. Nastavte amplitudu na 10% a cyklický režim sonikace 2 sec pulzů ve 20 cyklech s pauzou 30 sec. mezi jednotlivými ultrazvukovými pulzy.
Supernatanty přeneste do skleněných zkumavek se šroubovacím uzávěrem. Proveďte Folchovu extrakci přidáním 1 ml ultravody (ultrawater) do každé skleněné zkumavky a následným přidáním 6 ml směsi chloroform/methanol (poměr = 2:1) do každé skleněné zkumavky.
Každou skleněnou zkumavku vortexujte 4krát po 30 sec. Zkumavky centrifugujte při 1 258 x g po dobu 15 min (Eppendorf, 5810 R) pro další zlepšení separace fází. Spodní hydrofobní frakci přeneste skleněnou Pasteurovou pipetou do čisté skleněné zkumavky. Spodní hydrofobní frakci vysušte v proudu dusíku v dusíkovém odpařovači. Vysušenou peletu uchovávejte až do použití v mrazničce při -80 °C. 


Ultrazvuková příprava lyzátů červů

Lyzát červů: červi ve stadiu L4 byli sklizeni a třikrát promyti pufrem M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl a 0,87 mM MgSO₄) za účelem odstranění všech bakterií. Po odstranění co největšího množství pufru M9 byli červi resuspendováni v lyzačním pufru: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM fosfát β-glycerol, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM fluorid sodný, 1 mM orthovanadičnan sodný, 5 mM pyrofosforečnan sodný, 0,2 mM fenylmethansulfonylfluorid a inhibitor proteáz. Červi byli zmrazeni v tekutém dusíku a třikrát rozmrazeni při 37°C, poté byli sonikováni na suchém ledu pomocí ultrazvukové jednotky VialTweeter pro současnou přípravu 10 zkumavek se vzorky. Sonikace byla prováděna při 50% amplitudě v 10 cyklech po 2 sec. s 30 sec pauzou mezi sonikačními pulzy. Poté byly vzorky centrifugovány při 12 000 rpm při 4°C po dobu 15 min. Supernatant byl odebrán a uchováván při -70°C. Alikvot byl použit ke kvantifikaci proteinů Bradfordovou metodou.
Stanovení celkového glutathionu, GSH a GSSG: Pro kvantifikaci glutathionu byly lyzáty připraveny a stanovení provedeno ve stejný den. Larvy L4 krmené glukózou a kontrolní larvy byly sklizeny a třikrát promyty pufrem M9. Po odstranění co největšího množství pufru M9 byli červi resuspendováni v ledově studené kyselině metafosforečné (5% w/v), poté byli sonikováni v ledu pomocí ultrazvukového zařízení VialTweeter při 50% amplitudě v deseti sonikačních cyklech po 2 sec. s 30 sec. pauzou mezi jednotlivými cykly. Poté následovala centrifugace při 12 000 rpm při 4 ̊C po dobu 15 min.
(srov. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Příprava vzorků C. elegans před imunoprecipitací a Western blottingem

Stručně: pro embryonální extrakty byly larvy L1 C. elegans pěstovány ve velkoobjemových kapalných kulturách v S-médiu až do dospělosti. Embrya byla odebrána standardní metodou bělení a suspendována v lyzačním pufru (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glycerol, 0,05% NP-40, 1􏰅 koktejl inhibitorů proteáz a 1􏰅 koktejl inhibitorů fosfatáz I a II), rychle zmrazena v tekutém dusíku a lyzována ultrazvukovou dezintegrací buněk pomocí ultrazvukového přístroje s mikrohrotem, jako je UP200Ht se S26d2, v 10 pulzech během 10 s při 30% amplitudě. Pokud je třeba připravit větší počet vzorků, doporučují se ultrazvukový VialTweeter nebo ultrazvukový přístroj MultiSample UIP400MTP pro jamkové destičky. Po sonikaci byly extrakty předčištěny centrifugací při 30 000g po dobu 20 min při 4°C. Předčištěný extrakt (300µg celkového proteinu) byl inkubován se 40µ􏰂g afinitně purifikované protilátky anti-CDC-25.1 (tato studie) zesíťované s agarózou s proteinem A, nebo bylo jako kontrola použito obdobné množství králičího imunoglobulinu (Ig)G zesíťovaného s agarózou s proteinem A, a to v celkovém objemu 200µl lyzačního pufru obsahujícího 1% NP-40, jehož přítomnost snížila nespecifickou vazbu proteinů na matrici. Vzorky byly rotovány 1 h při 4°C, kuličky byly třikrát promyty lyzačním pufrem a eluovány 30µl glycin/HCl a 200 mM NaCl, pH 2,2. Po imunoprecipitaci byly eluáty zředěny ve 30µ􏰂l vzorkového pufru SDS, zahřáty na 95°C po dobu 4 min a typicky byla 3% celku pro vstup a 30% pro eluáty nanesena na SDS-PAGE s následným Western blottingem s protilátkami anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitin (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) nebo anti-􏰁β-actin (1:2000). V případech, kdy extrakty nebyly podrobeny imunoprecipitaci, bylo stejné množství celkového proteinu z těchto extraktů resuspendováno ve vzorkovém pufru SDS, zahřáto na 95°C a poté přímo naneseno na SDS-PAGE a analyzováno Western blottingem. (srov. Segref et al. 2020)

Ultrazvuková lyze s přesnou regulací teploty

Přesná a spolehlivá regulace teploty je při práci s biologickými vzorky zásadní. Vysoké teploty iniciují tepelně indukovanou degradaci proteinů ve vzorcích.
Jako všechny mechanické techniky přípravy vzorků vytváří i sonikace teplo. Teplotu vzorků však lze při použití zařízení VialTweeter dobře regulovat. Představujeme Vám různé možnosti, jak monitorovat a regulovat teplotu Vašich vzorků při jejich přípravě k analýze pomocí zařízení VialTweeter a VialPress.

1. Monitorování teploty vzorku: Ultrazvukový procesor UP200St, který pohání VialTweeter, je vybaven inteligentním softwarem a zásuvným teplotním čidlem. Zapojte teplotní čidlo do UP200St a hrot teplotního čidla vložte do jedné ze zkumavek se vzorky. Prostřednictvím digitálního barevného dotykového displeje můžete v menu UP200St nastavit konkrétní teplotní rozsah pro sonikaci vzorku. Ultrazvukový přístroj se po dosažení maximální teploty automaticky zastaví a vyčká, dokud teplota vzorku neklesne na spodní hodnotu nastaveného teplotního ∆. Poté se sonikace automaticky znovu spustí. Tato chytrá funkce zabraňuje degradaci vyvolané teplem.
2. Blok zařízení VialTweeter lze předchladit. Vložení bloku zařízení VialTweeter (pouze sonotrody bez měniče!) do lednice nebo mrazničky k předchlazení titanového bloku pomáhá oddálit nárůst teploty ve vzorku. Je-li to možné, lze předchladit i samotný vzorek.
3. Ke chlazení během sonikace použijte suchý led. Použijte mělkou misku naplněnou suchým ledem a VialTweeter umístěte na suchý led, aby se teplo mohlo rychle odvádět.

Najděte optimální ultrazvukový dezintegrátor buněk pro Vaši aplikaci lyze

Hielscher Ultrasonics je dlouholetým zkušeným výrobcem vysoce výkonných ultrazvukových dezintegrátorů buněk a homogenizátorů pro laboratoře, stolní a průmyslové systémy. Velikost Vaší bakteriální buněčné kultury, cíl Vašeho výzkumu nebo výroby a objem buněk, které je třeba zpracovat za hodinu nebo den, jsou zásadními faktory pro nalezení správného ultrazvukového dezintegrátoru buněk pro Vaši aplikaci.
Hielscher Ultrasonics nabízí různá řešení pro současnou sonikaci více vzorků (až 10 lahviček) i hromadných vzorků (tj. mikrotitrační destičky / 96jamkové destičky), od klasických laboratorních ultrazvukových přístrojů sondového typu s různými výkonovými úrovněmi od 50 do 400 wattů až po plně průmyslové ultrazvukové procesory s výkonem až 16 000 wattů na jednotku pro komerční dezintegraci buněk a extrakci proteinů ve velkovýrobě. Všechny ultrazvukové přístroje Hielscher jsou konstruovány pro provoz 24/7/365 při plném zatížení. Robustnost a spolehlivost jsou klíčovými vlastnostmi našich ultrazvukových zařízení.
Všechny digitální ultrazvukové homogenizátory jsou vybaveny chytrým softwarem, barevným dotykovým displejem a automatickým protokolováním dat, díky čemuž je ultrazvukové zařízení pohodlným pracovním nástrojem v laboratoři i ve výrobních provozech.
Sdělte nám, jaký druh buněk, jaký objem, s jakou četností a s jakým cílem potřebujete své biologické vzorky zpracovávat. Doporučíme Vám ultrazvukový dezintegrátor buněk, který nejlépe odpovídá požadavkům Vašeho procesu.

Níže uvedená tabulka Vám poskytne orientační přehled o přibližné zpracovatelské kapacitě našich ultrazvukových systémů – od kompaktních ručních homogenizátorů a ultrazvukových přístrojů MultiSample až po průmyslové ultrazvukové procesory pro komerční aplikace: