Ultrazvuková lyze bioinženýrsky upravených buněk v průmyslové výrobě

Bioinženýrsky upravené bakteriální druhy, jako je E. coli, a také geneticky modifikované typy savčích a rostlinných buněk se v biotechnologiích široce používají k expresi molekul. K uvolnění těchto syntetizovaných biomolekul je zapotřebí spolehlivá technika dezintegrace buněk. Vysoce výkonná sonikace je osvědčenou metodou pro účinnou a spolehlivou lyzi buněk – snadno škálovatelnou na velké objemy zpracování. Hielscher Ultrasonics vám nabízí vysoce výkonná ultrazvuková zařízení pro účinnou lyzi buněk za účelem výroby velkých objemů vysoce kvalitních biomolekul.

Extrakce molekul z buněčných továren

Pro výrobu široké škály biomolekul lze jako mikrobiální buněčné továrny použít různé upravené mikroby a rostlinné buňky, mimo mnoha dalších včetně Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, sinic (Cyanobacteria), Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana a řas. Tyto buněčné továrny mohou produkovat proteiny, lipidy, biochemikálie, polymery, biopaliva a oleochemikálie, které se používají jako potraviny nebo suroviny pro průmyslové aplikace. Buňky používané jako buněčné továrny se kultivují v uzavřených bioreaktorech, kde mohou dosahovat vysoké účinnosti a specificity při nízkých energetických nárocích.
K izolaci cílových molekul z bioinženýrsky upravených buněčných kultur je nutné buňky dezintegrovat, aby se uvolnil intracelulární materiál. Ultrazvukové dezintegrátory buněk jsou dobře zavedené jako vysoce spolehlivá a účinná technika dezintegrace buněk a uvolňování látek.

Mikrobiální buněčné továrny jsou metabolicky upravené buňky používané k syntéze různých cenných látek. Ultrazvuková dezintegrace buněk je účinná a spolehlivá metoda k uvolnění cenných látek z nitra buněk.
studie a grafika: ©Villaverde, 2010.

Výhody ultrazvukových dezintegrátorů buněk

Jako netermální, šetrná, a přesto vysoce účinná technologie se ultrazvukové dezintegrátory používají v laboratoři i v průmyslu k lyzi buněk a k výrobě vysoce kvalitních extraktů, které se používají např. k izolaci molekul z buněčných továren.

Výkonový ultrazvuk pro účinnou dezintegraci mikrobiálních buněčných továren

Mechanismus a účinky ultrazvukových dezintegrátorů buněk:
Ultrazvuková dezintegrace buněk využívá sílu ultrazvukových vln. Ultrazvukový homogenizátor / dezintegrátor buněk je vybaven sondou (známou též jako sonotroda) ze slitiny titanu, která kmitá o vysoké frekvenci přibl. 20 kHz. To znamená, že ultrazvuková sonda přenáší do sonikované kapaliny 20 000 kmitů za sekundu. Ultrazvukové vlny přenesené do kapaliny se vyznačují střídajícími se cykly vysokého tlaku / nízkého tlaku. Během cyklu nízkého tlaku se kapalina rozpíná a vznikají drobné vakuové bublinky. Tyto velmi malé bublinky rostou v průběhu několika střídavých tlakových cyklů, dokud nemohou absorbovat žádnou další energii. V tomto okamžiku kavitační bublinky prudce implodují a lokálně vytvářejí mimořádně energeticky husté prostředí. Tento jev je známý jako akustická kavitace a vyznačuje se lokálně velmi vysokými teplotami, velmi vysokými tlaky a smykovými silami. Tato smyková napětí účinně narušují buněčné stěny a zvyšují přenos hmoty mezi nitrem buňky a okolním rozpouštědlem. Jako čistě mechanická technika jsou ultrazvukem generované smykové síly široce používaným a doporučeným postupem pro dezintegraci bakteriálních buněk i pro izolaci proteinů. Jako jednoduchá a rychlá metoda dezintegrace buněk je sonikace ideální pro izolaci v malých, středních i velkých objemech. Digitální sonikátory Hielscher jsou vybaveny přehledným menu nastavení pro přesné řízení sonikace. Všechna data sonikace se automaticky ukládají na vestavěnou SD kartu a jsou snadno přístupná. Propracované možnosti odvodu tepla, jako je externí chlazení, sonikace v pulzním režimu atd., během procesu ultrazvukové dezintegrace zajišťují udržení ideální procesní teploty, a tím i neporušenost extrahovaných tepelně citlivých látek.

Výzkum podtrhuje přednosti ultrazvukové dezintegrace buněk a extrakce

Prof. Chemat et al. (2017) ve své studii shrnují, že „ultrazvukem asistovaná extrakce je ekologická a ekonomicky životaschopná alternativa ke konvenčním technikám pro potraviny a přírodní produkty. Hlavními přínosy jsou snížení doby extrakce a zpracování, množství použité energie a rozpouštědel, počtu jednotkových operací a CO₂ emisí.“
Gabig-Ciminska et al. (2014) ve své studii použili vysokotlaký homogenizátor a ultrazvukový dezintegrátor buněk k lyzi spor za účelem uvolnění DNA. Při porovnání obou metod dezintegrace buněk dospěl výzkumný tým ohledně lyze buněk pro sporovou DNA k závěru, že „analýza byla provedena s použitím buněčných lyzátů z vysokotlaké homogenizace. Poté jsme zjistili, že ultrazvuková dezintegrace buněk má pro tento účel vynikající výhody. Je poměrně rychlá a lze ji provádět i pro malé objemy vzorků.“ (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolekuly z buněčných továren pro výrobu potravin

Mikrobiální buněčné továrny jsou životaschopnou a účinnou výrobní metodikou, která využívá mikrobiální organismy k produkci vysokých výtěžků nativních i nenativních metabolitů prostřednictvím metabolického bioinženýrství mikroorganismů, jako jsou bakterie, kvasinky, houby atd. Hromadně vyráběné enzymy se vyrábějí například pomocí mikroorganismů, jako jsou Aspergillus oryzae, houby a bakterie. Tyto hromadně vyráběné enzymy se používají při výrobě potravin a nápojů, jakož i v zemědělství, bioenergetice a v péči o domácnost.
Některé bakterie, jako Acetobacter xylinum a Gluconacetobacter xylinus, produkují během fermentačního procesu celulózu, přičemž nanovlákna se syntetizují procesem zdola nahoru (bottom-up). Bakteriální celulóza (známá také jako mikrobiální celulóza) je chemicky ekvivalentní rostlinné celulóze, má však vysoký stupeň krystalinity a vysokou čistotu (bez ligninu, hemicelulózy, pektinu a dalších biogenních složek), jakož i jedinečnou strukturu trojrozměrné (3D) retikulární sítě utkané z celulózových nanovláken. (srov. Zhong, 2020) Ve srovnání s celulózou rostlinného původu je bakteriální celulóza udržitelnější a vyrobená celulóza je čistá, takže nevyžaduje složité purifikační kroky. Sonikace a extrakce rozpouštědlem s použitím NaOH nebo SDS (dodecylsulfát sodný) jsou velmi účinné pro izolaci bakteriální celulózy z bakteriálních buněk.

Biomolekuly z buněčných továren pro výrobu léčiv a vakcín

Jedním z nejvýznamnějších farmaceutických produktů získávaných z buněčných továren je lidský inzulin. Pro bioinženýrskou výrobu inzulinu se používají převážně E. coli a Saccharomyces cerevisiae. Protože biosyntetizované molekuly nanometrové velikosti nabízejí vysokou biokompatibilitu, jsou biologické nanočástice, jako je feritin, výhodné pro řadu biovýrobních aplikací. Navíc je výroba v metabolicky upravených mikrobech často výrazně efektivnější z hlediska dosažených výtěžků. Například produkce kyseliny artemisinové, resveratrolu a lykopenu vzrostla desetinásobně až několikasetnásobně a výroba v průmyslovém měřítku je již zavedena nebo se vyvíjí. (srov. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Například proteinové biomolekuly nanometrové velikosti se samoskladebnými vlastnostmi, jako je feritin a virům podobné částice, jsou obzvláště zajímavé pro vývoj vakcín, protože napodobují velikost i strukturu patogenů a umožňují povrchovou konjugaci antigenů, která podporuje interakci s imunitními buňkami. Takové molekuly se exprimují v tzv. buněčných továrnách (např. upravených kmenech E. coli), které produkují určitou cílovou molekulu.

Protokol pro ultrazvukovou lyzi E. coli BL21 za účelem uvolnění feritinu

Feritin je protein, jehož primární funkcí je ukládání železa. Feritin vykazuje slibné vlastnosti jako samoskladebné nanočástice ve vakcínách, kde se používá jako nosič pro dopravu vakcíny (např. spike proteinů SARS-Cov-2). Vědecký výzkum Sun et. al. (2016) ukazuje, že rekombinantní feritin lze z Escherichia coli uvolnit v rozpustné formě při nízkých koncentracích NaCl (≤50 mmol/L). K expresi feritinu v E. coli BL21 a k uvolnění feritinu byl úspěšně použit následující protokol. Rekombinantní plazmid pET-28a/ferritin byl transformován do kmene E coli BL21 (DE3). Buňky E coli BL21 (DE3) s feritinem byly kultivovány v růstovém médiu LB s 0,5% kanamycinu při 37°C a indukovány při OD600 0,6 pomocí 0,4% isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosidu po dobu 3 hodin při 37°C. Výsledná kultura byla poté sklizena centrifugací při 8000g po dobu 10 minut při 4°C a pelet byl odebrán. Poté byl pelet resuspendován v médiu LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% kvasničný extrakt)/lyzačním pufru (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) a v různých koncentracích roztoku NaCl (0, 50, 100, 170 a 300 mmol/L), v uvedeném pořadí. Pro lyzi bakteriálních buněk byla použita sonikace v pulzním režimu: např. s použitím sonikátoru UP400St při 100% amplitudě s pracovním cyklem 5 sekund zapnuto, 10 sekund vypnuto, po 40 cyklů) a následně proběhla centrifugace při 10 000g po dobu 15 minut při 4°C. Supernatant a precipitát byly analyzovány elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE). Všechny gely obarvené dodecylsulfátem sodným byly naskenovány skenerem s vysokým rozlišením. Snímky gelů byly analyzovány pomocí softwaru Magic Chemi 1D. Pro optimální zřetelnost byly proteinové proužky detekovány úpravou parametrů. Data pro proužky byla získána z technických triplikátů. (srov. Sun et al., 2016)

Ultrazvukové dezintegrátory buněk pro průmyslovou lyzi buněčných továren

Ultrazvuková lyze a extrakce je spolehlivá a pohodlná metoda uvolňování metabolitů z buněčných továren, která tak napomáhá účinné výrobě cílových molekul. Ultrazvukové dezintegrátory buněk jsou k dispozici od laboratorní až po průmyslovou velikost a procesy lze škálovat zcela lineárně.
Hielscher Ultrasonics je vaším kompetentním partnerem pro vysoce výkonné ultrazvukové dezintegrátory a má dlouholeté zkušenosti v oblasti instalace ultrazvukových systémů ve stolním i průmyslovém provozu.
Pokud jde o sofistikovaný hardware a software, systémy pro dezintegraci buněk Hielscher Ultrasonics splňují všechny požadavky na optimální řízení procesu, snadnou obsluhu a uživatelskou přívětivost. Zákazníci a uživatelé sonikátorů Hielscher oceňují výhodu, že ultrazvukové dezintegrátory buněk a extraktory Hielscher umožňují přesné monitorování a řízení procesu – prostřednictvím digitálního dotykového displeje a vzdáleného ovládání přes prohlížeč. Všechna důležitá data sonikace (např. čistá energie, celková energie, amplituda, doba trvání, teplota, tlak) se automaticky ukládají jako soubor CSV na integrovanou SD kartu. To pomáhá dosahovat reprodukovatelných a opakovatelných výsledků a usnadňuje standardizaci procesů i splnění požadavků správné výrobní praxe (cGMP).
Ultrazvukové procesory Hielscher jsou samozřejmě konstruovány pro provoz 24/7 při plném zatížení, a lze je proto spolehlivě provozovat v průmyslových výrobních podmínkách. Díky vysoké robustnosti a nízké údržbě jsou prostoje ultrazvukového zařízení opravdu nízké. Funkce CIP (clean-in-place, čištění na místě) a SIP (sterilize-in-place, sterilizace na místě) minimalizují pracné čištění, zejména proto, že všechny smáčené díly mají hladké kovové povrchy (žádné skryté otvory ani trysky).

Níže uvedená tabulka vám poskytuje orientační přehled o přibližné kapacitě zpracování našich sonikátorů: