Ultrazvuková lýza bioinženýrských buněk v průmyslové výrobě

Bioinženýrské druhy bakterií, jako je E. coli, stejně jako geneticky modifikované typy savců a rostlinných buněk, jsou široce používány v biotechnologiích k expresi molekul. Aby bylo možné uvolnit tyto syntetizované biomolekuly, je nutná spolehlivá technika narušení buněk. Vysoce výkonná ultrazvuku je osvědčená metoda pro účinnou a spolehlivou lýzu buněk – snadno škálovatelné na velké propustnosti. Hielscher Ultrasonics vám nabízí vysoce výkonné ultrazvukové zařízení pro účinnou lýzu buněk za účelem výroby velkých objemů vysoce kvalitních biomolekul.

Extrakce molekul z buněčných továren

Pro výrobu široké škály biomolekul mohou být různé umělé mikroby a rostlinné buňky použity jako továrny na mikrobiální buňky, včetně Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana a řasy, mezi mnoha dalšími. Tyto buněčné továrny mohou vyrábět bílkoviny, lipidy, biochemikálie, polymery, biopaliva a oleochemikálie, které se používají jako potraviny nebo suroviny pro průmyslové aplikace. Buňky používané jako buněčné továrny jsou kultivovány v uzavřených bioreaktorech, kde mohou dosáhnout vysoké účinnosti, specifičnosti a nízkých energetických požadavků.
Pro izolaci cílových molekul z bioinženýrských buněčných kultur musí být buňky narušeny tak, aby se uvolnil intracelulární materiál. Ultrazvukové buněčné disruptory jsou dobře zavedeny jako vysoce spolehlivá a účinná technika pro rozpad buněk a uvolňování sloučenin.

Továrny na mikrobiální buňky jsou metabolicky inženýrské buňky používané pro syntézu různých cenných sloučenin. Ultrazvukové narušení buněk je účinná a spolehlivá metoda pro uvolnění cenných sloučenin z vnitřku buňky.
studie a grafika: ©Villaverde, 2010.

Výhody ultrazvukových buněčných disruptorů

Jako netepelná, mírná, ale vysoce účinná technologie se ultrazvukové disruptory používají v laboratoři a průmyslu k lyzaci buněk a k výrobě vysoce kvalitních extraktů, např. Používaných pro izolaci molekul z buněčných továren.

Power-Ultrazvuk pro efektivní narušení továren na mikrobiální buňky

Mechanismus a účinky ultrazvukových buněčných disruptorů:
Ultrazvukové narušení buněk používalo sílu ultrazvukových vln. Ultrazvukový homogenizátor / buněčný disruptor je vybaven sondou (aka sonotroda) vyrobená ze slitiny titanu, která osciluje při vysoké frekvenci cca. 20 kHz. To znamená, že ultrazvuková sonda spojuje 20 000 vibrací za sekundu do sonikované kapaliny. Ultrazvukové vlny spojené s kapalinou jsou charakterizovány střídáním vysokotlakých / nízkotlakých cyklů. Během nízkotlakého cyklu se kapalina rozpíná a vznikají nepatrné vakuové bubliny. Tyto velmi malé bubliny rostou v průběhu několika střídavých tlakových cyklů, dokud nemohou absorbovat žádnou další energii. V tomto okamžiku kavitační bubliny prudce implodují a vytvářejí lokálně mimořádně energeticky husté prostředí. Tento jev je známý jako akustická kavitace a je charakterizován lokálně velmi vysokými teplotami, velmi vysokými tlaky a smykovými silami. Tato smyková napětí účinně narušují buněčné stěny a zvyšují přenos hmoty mezi vnitřkem buňky a okolním rozpouštědlem. Jako čistě mechanická technika jsou široce používány ultrazvukem generované smykové síly a doporučený postup pro narušení bakteriálních buněk, stejně jako pro izolaci proteinů. Jako jednoduchá a rychlá metoda narušení buněk je sonikace ideální pro izolaci malých, středních a velkých objemů. Hielscherovy digitální ultrasonicators jsou vybaveny jasným menu nastavení pro přesné řízení sonikace. Všechna data sonikace jsou automaticky uložena na vestavěné SD kartě a jsou jednoduše přístupná. Sofistikované možnosti odvodu tepla, jako je externí chlazení, sonikace v pulzním režimu atd. Během ultrazvukového dezintegračního procesu zajišťují udržení ideální procesní teploty a tím neporušenost extrahovaných sloučenin citlivých na teplo.

Výzkum zdůrazňuje silné stránky ultrazvukového narušení buněk a extrakce

Prof. Chemat et al. (2017) ve své studii pokračuje, že "ultrazvukem asistovaná extrakce je zelenou a ekonomicky životaschopnou alternativou ke konvenčním technikám pro potraviny a přírodní produkty. Hlavními přínosy jsou zkrácení doby extrakce a zpracování, množství použité energie a rozpouštědel, jednotkové operace a CO₂ emisí."
Gabig-Ciminska et al. (2014) použili ve své studii vysokotlaký homogenizátor a ultrazvukový buněčný dsintegrator pro lýzu spór za účelem uvolnění DNA. Porovnáním obou metod narušení buněk dospěl výzkumný tým k závěru, že pokud jde o buněčnou lýzu pro DNA spór, "analýza byla provedena použitím buněčných lyzátů z vysokotlaké homogenizace. Poté jsme si uvědomili, že narušení ultrazvukových buněk má pro tento účel vynikající výhody. Je poměrně rychlý a může být zpracován pro malé objemy vzorků." (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolekuly z buněčných továren pro výrobu potravin

Továrny na mikrobiální buňky jsou životaschopnou a efektivní výrobní metodikou využívající mikrobiální organismy k produkci vysokých výnosů nativních a nepůvodních metabolitů metabolickým bioinženýrstvím mikrobiálních mikroorganismů, jako jsou bakterie, kvasinky, houby atd. Hromadné enzymy jsou například produkovány pomocí mikroorganismů, jako je Aspergillus oryzae, hub a bakterií. Tyto sypké enzymy se používají pro výrobu potravin a nápojů, jakož i v zemědělství, bioenergii a péči o domácnost.
Některé bakterie, jako je Acetobacter xylinum a Gluconacetobacter xylinus, produkují celulózu během fermentačního procesu, kde jsou nanovlákna syntetizována v procesu zdola nahoru. Bakteriální celulóza (také známá jako mikrobiální celulóza) je chemicky ekvivalentní rostlinné celulóze, ale má vysoký stupeň krystalinity a vysoké čistoty (bez ligninu, hemicelulózy, pektinu a dalších biogenních složek), stejně jako jedinečnou strukturu trojrozměrné (3D) síťované celulózou nanovlákennou. (srov. Zhong, 2020) Ve srovnání s celulózou rostlinného původu je bakteriální celulóza udržitelnější a vyrobená celulóza je čistá a nevyžaduje složité kroky čištění. Ultrazvuku a extrakce rozpouštědlem pomocí NaOH nebo SDS (dodecylsulfát sodný) jsou velmi účinné pro izolaci bakteriální celulózy z bakteriálních buněk.

Biomolekuly z buněčných továren pro farmacii a výrobu vakcín

Jedním z nejvýznamnějších farmaceutických produktů odvozených z buněčných továren je lidský inzulín. Pro bioinženýrskou produkci inzulínu se používají převážně E. coli a Saccharomyces cerevisiae. Vzhledem k tomu, že biosyntetizované nanočástice nabízejí vysokou biokompatibilitu, biologické nanočástice, jako je ferritin, jsou výhodné pro řadu biovýrobních aplikací. Produkce metabolicky inženýrských mikrobů je navíc často výrazně účinnější v získaných výnosech. Například výroba kyseliny artemisinové, resveratrolu a lykopenu se zdesetinásobila až několikasetnásobně a je již zavedena nebo je ve vývoji k výrobě v průmyslovém měřítku. (srov. Liu et al.; Mikrob. Buněčný fakt. 2017)
Například nanobiomolekuly na bázi proteinů se samouspořádanými vlastnostmi, jako je ferritin a virové částice, jsou obzvláště zajímavé pro vývoj vakcíny, protože napodobují velikost i strukturu patogenů a jsou přístupné povrchové konjugaci antigenů, aby podpořily interakci s imunitními buňkami. Takové molekuly jsou exprimovány v takzvaných buněčných továrnách (např. inženýrské kmeny E. coli), které produkují určitou cílovou molekulu.

Protokol pro ultrazvukovou lýzu a E. coli BL21 pro uvolňování feritinu

Ferritin je protein, jehož primární funkcí je skladování železa. Ferritin vykazuje slibné schopnosti jako samouspořádané nanočástice ve vakcínách, kde se používá jako prostředek pro dodávání vakcín (např. SARS-Cov-2 spike proteiny). Vědecký výzkum Sun et. (2016) ukazuje, že rekombinantní ferritin může být uvolněn jako rozpustná forma z Escherichia coli při nízkých koncentracích NaCl (≤50 mmol / l). Pro expresi feritinu v E. coli BL21 a uvolnění ferrtinu byl úspěšně použit následující protokol. Rekombinantní plazmid pET-28a/feritin byl přeměněn na kmen E coli BL21 (DE3). Feritinové buňky E coli BL21 (DE3) byly kultivovány v LB růstovém médiu s 0,5% kanamycinem při 37 °C a indukovány při OD600 0,6 s 0,4 % isopropyl-β-D-thioglaktopyranosidem po dobu 3 hodin při 37 °C. Konečná kultura byla poté sklizena centrifugací při 8000 g po dobu 10 minut při teplotě 4 °C a peleta byla odebrána. Poté byla peleta resuspendována v LB médiu (1 % NaCl, 1 % Typone, 0,5% kvasnicový extrakt)/lyzační pufr (20 mmol/l Tris, 50 mmol/l NaCl, 1 mmol/l EDTA, pH 7,6) a v různých koncentracích roztoku NaCl (0, 50, 100, 170 a 300 mmol/l). Pro lýzu bakteriálních buněk byla sonikace aplikována v pulzním režimu: např. Pomocí ultrasonicator UP400St při 100% amplitudě s pracovním cyklem 5 sekund ON, 10 sekund OFF, po dobu 40 cyklů) a poté odstřeďováno při 10 000 g po dobu 15 minut při 4 °C. Supernatant a sraženina byly analyzovány polyakrylamidovou gelovou elektroforézou dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE). Všechny gely obarvené dodecylsulfátem sodným byly naskenovány skenerem s vysokým rozlišením. Gelové snímky byly analyzovány pomocí softwaru Magic Chemi 1D. Pro optimální jasnost byly proteinové pásy detekovány úpravou parametrů. Údaje pro pásma byly generovány z technických triplicátů. (srov. Sun et al., 2016)

Ultrazvukové buněčné disruptory pro průmyslovou lýzu buněčných továren

Ultrazvuková lýza a extrakce je spolehlivá a pohodlná metoda uvolňování metabolitů z buněčných továren, čímž pomáhá účinné produkci cílových molekul. Ultrazvukové buněčné disruptory jsou k dispozici od laboratorní až po průmyslovou velikost a procesy mohou být škálovány zcela lineárně.
Hielscher Ultrasonics je vaším kompetentním partnerem pro vysoce výkonné ultrazvukové disruptory a má dlouholeté zkušenosti v oblasti implantace ultrazvukových systémů v bench-top a průmyslovém prostředí.
Pokud jde o sofistikovaný hardware a software, Hielscher Ultrasonics systémy narušení buněk splňují všechny požadavky na optimální řízení procesu, snadnou obsluhu a uživatelskou přívětivost. Zákazníci a uživatel Hielscher ultrasonicators oceňují výhodu, že Hielscher ultrazvukové buněčné disruptory a extraktory umožňují přesné sledování a kontrolu procesu – prostřednictvím digitálního dotykového displeje a dálkového ovládání prohlížeče. Všechny důležité údaje o sonikaci (např. čistá energie, celková energie, amplituda, trvání, teplota, tlak) jsou automaticky uloženy jako soubor CSV na integrované SD kartě. To pomáhá získat reprodukovatelné a opakovatelné výsledky a usnadňuje standardizaci procesů a plnění správné výrobní praxe (cGMP).
Samozřejmě, Hielscher ultrazvukové procesory jsou postaveny pro provoz 24/7 při plném zatížení, a proto mohou být spolehlivě provozovány v průmyslové výrobě. Vzhledem k vysoké robustnosti a nízké údržbě je prostoje ultrazvukového zařízení opravdu nízká. Vlastnosti CIP (clean-in-place) a SIP (sterilize-in-place) minimalizují namáhavé čištění, zejména proto, že všechny mokré části jsou hladké kovové povrchy (žádné skryté otvory nebo trysky).

Níže uvedená tabulka vám dává informaci o přibližné zpracovatelské kapacity našich ultrasonicators: