Ultrazvuková lýza bioinženýrských buněk v průmyslové výrobě

Bioinženýrské druhy bakterií, jako je E. coli, stejně jako geneticky modifikované typy savčích a rostlinných buněk, jsou v biotechnologiích široce používány k expresi molekul. Aby se tyto syntetizované biomolekuly uvolnily, je nutná spolehlivá technika narušení buněk. Vysoce výkonná ultrazvuku je osvědčená metoda pro účinnou a spolehlivou lýzu buněk – Snadno škálovatelné na velké propustnosti. Hielscher Ultrasonics vám nabízí vysoce výkonné ultrazvukové zařízení pro účinnou lýzu buněk za účelem výroby velkých objemů vysoce kvalitních biomolekul.

Extrakce molekul z buněčných továren

Pro výrobu široké škály biomolekul lze jako továrny na mikrobiální buňky použít různé upravené mikroby a rostlinné buňky, včetně Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Sinice, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana a řasy a mnoho dalších. Tyto buněčné továrny mohou vyrábět proteiny, lipidy, biochemikálie, polymery, biopaliva a oleochemikálie, které se používají jako potraviny nebo suroviny pro průmyslové aplikace. Články používané jako buněčné továrny jsou kultivovány v uzavřených bioreaktorech, kde mohou dosáhnout vysoké účinnosti, specifičnosti a nízkých energetických nároků.
Aby bylo možné izolovat cílové molekuly z bioinženýrských buněčných kultur, musí být buňky narušeny tak, aby se uvolnil intracelulární materiál. Ultrazvukové buněčné disruptory jsou dobře zavedeny jako vysoce spolehlivá a účinná technika pro rozpad buněk a uvolňování sloučenin.

Mikrobiální buněčné továrny jsou metabolicky upravené buňky používané pro syntézu různých cenných sloučenin. Ultrazvukové narušení buněk je účinná a spolehlivá metoda uvolňování cenných sloučenin z vnitřku buňky.
studie a grafika: ©Villaverde, 2010.

Výhody ultrazvukových buněčných disruptorů

Jako netepelná, mírná, ale vysoce účinná technologie se ultrazvukové disruptory používají v laboratořích a průmyslu k lýze buněk a k výrobě vysoce kvalitních extraktů, např. používaných k izolaci molekul z buněčných továren.

Výkonový ultrazvuk pro efektivní narušení továren na mikrobiální buňky

Mechanismus a účinky ultrazvukových buněčných disruptorů:
Ultrazvukové narušení buněk využívalo sílu ultrazvukových vln. Ultrazvukový homogenizátor / buněčný disruptor je vybaven sondou (neboli sonotrodou) vyrobenou ze slitiny titanu, která kmitá na vysoké frekvenci cca. 20 kHz. To znamená, že ultrazvuková sonda spojuje 20 000 vibrací za sekundu do sonikované kapaliny. Ultrazvukové vlny spojené s kapalinou se vyznačují střídáním vysokotlakých / nízkotlakých cyklů. Během nízkotlakého cyklu se kapalina rozpíná a vznikají nepatrné vakuové bubliny. Tyto velmi malé bublinky rostou v několika cyklech střídavého tlaku, dokud nemohou absorbovat žádnou další energii. V tomto bodě kavitační bubliny prudce implodují a vytvářejí lokálně mimořádné prostředí s vysokou energetickou hustotou. Tento jev je známý jako akustická kavitace a je charakterizován lokálně velmi vysokými teplotami, velmi vysokými tlaky a smykovými silami. Tato smyková napětí účinně rozbíjejí buněčné stěny a zvyšují přenos hmoty mezi vnitřkem článku a okolním rozpouštědlem. Jako čistě mechanická technika jsou ultrazvukem generované smykové síly široce používány a doporučený postup pro narušení bakteriálních buněk, stejně jako pro izolaci proteinů. Jako jednoduchá a rychlá metoda narušení buněk je sonikace ideální pro izolaci malých, středních a velkých objemů. Hielscherovy digitální ultrasonicators jsou vybaveny přehlednou nabídkou nastavení pro přesné ovládání ultrazvuku. Všechna data o ultrazvuku jsou automaticky ukládána na vestavěnou SD kartu a jsou jednoduše přístupná. Sofistikované možnosti odvodu tepla, jako je externí chlazení, sonikace v pulzním režimu atd. Během procesu ultrazvukového dezintegru, zajišťují udržení ideální procesní teploty a tím i neporušenost extrahovaných sloučenin citlivých na teplo.

Výzkum zdůrazňuje silné stránky ultrazvukového narušení a extrakce buněk

Prof. Chemat et al. (2017) ve své studii pokračuje, že "ultrazvukem asistovaná extrakce je zelenou a ekonomicky životaschopnou alternativou ke konvenčním technikám pro potraviny a přírodní produkty. Hlavními přínosy jsou zkrácení doby extrakce a zpracování, snížení množství použité energie a rozpouštědel, jednotkových operací a CO₂ emisí."
Gabig-Ciminska et al. (2014) použili ve své studii vysokotlaký homogenizátor a ultrazvukový buněčný dsintegrátor pro lýzu spor za účelem uvolnění DNA. Porovnáním obou metod narušení buněk výzkumný tým dospěl k závěru, že pokud jde o buněčnou lýzu pro DNA spor, "analýza byla provedena pomocí buněčných lyzátů z vysokotlaké homogenizace. Poté jsme si uvědomili, že ultrazvukové narušení buněk má pro tento účel vynikající výhody. Je poměrně rychlý a lze jej zpracovat pro malé objemy vzorků." (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolekuly z buněčných továren na výrobu potravin

Mikrobiální buněčné továrny jsou životaschopnou a efektivní výrobní metodikou využívající mikrobiální organismy k produkci vysokých výnosů nativních a nepůvodních metabolitů metabolickým bioinženýrstvím mikrobiálních mikroorganismů, jako jsou bakterie, kvasinky, houby atd. Objemové enzymy se například vyrábějí pomocí mikroorganismů, jako je Aspergillus oryzae, hub a bakterií. Tyto objemové enzymy se používají při výrobě potravin a nápojů, stejně jako v zemědělství, bioenergetice a péči o domácnost.
Některé bakterie, jako je Acetobacter xylinum a Gluconacetobacter xylinus, produkují celulózu během fermentačního procesu, kdy jsou nanovlákna syntetizována v procesu zdola nahoru. Bakteriální celulóza (známá také jako mikrobiální celulóza) je chemicky ekvivalentní rostlinné celulóze, ale má vysoký stupeň krystalinity a vysokou čistotu (bez ligninu, hemicelulózy, pektinu a dalších biogenních složek) a také jedinečnou strukturu celulózové nanovlákenné trojrozměrné (3D) síťované sítě. (srov. Zhong, 2020) Ve srovnání s celulózou rostlinného původu je bakteriální celulóza udržitelnější a vyrobená celulóza je čistá a nevyžaduje složité kroky čištění. Ultrazvuku a extrakce rozpouštědlem pomocí NaOH nebo SDS (dodecylsulfát sodný) jsou velmi účinné pro izolaci bakteriální celulózy z bakteriálních buněk.

Biomolekuly z buněčných továren pro farmaceutickou výrobu a výrobu vakcín

Jedním z nejvýznamnějších farmaceutických produktů odvozených z buněčných továren je lidský inzulín. Pro bioinženýrskou produkci inzulínu se používají převážně E. coli a Saccharomyces cerevisiae. Vzhledem k tomu, že biosyntetizované nanočástice nabízejí vysokou biokompatibilitu, jsou biologické nanočástice, jako je feritin, výhodné pro řadu biovýrobních aplikací. Produkce metabolicky upravených mikrobů je navíc často výrazně efektivnější v získaných výnosech. Například výroba kyseliny artemisinové, resveratrolu a lykopenu se zvýšila desetinásobně až několik set krát a je již zavedena nebo je ve vývoji pro průmyslovou výrobu. (srov. Liu et al.; Mikrob. Fakt o buňce. 2017)
Například nano-velké biomolekuly na bázi proteinů se samouspořádacími vlastnostmi, jako je feritin a částice podobné virům, jsou pro vývoj vakcín obzvláště zajímavé, protože napodobují velikost i strukturu patogenů a jsou přístupné povrchové konjugaci antigenů, aby podpořily interakci s imunitními buňkami. Takové molekuly jsou exprimovány v takzvaných buněčných továrnách (např. uměle vytvořené kmeny E. coli), které produkují určitou cílovou molekulu.

Protokol pro ultrazvukovou lýzu a uvolňování E. coli BL21 pro uvolňování feritinu

Feritin je protein, jehož primární funkcí je ukládání železa. Feritin vykazuje slibné schopnosti jako samoskládající se nanočástice ve vakcínách, kde se používá jako nosič vakcín (např. spike proteiny SARS-Cov-2). Vědecký výzkum Sun et. al. (2016) ukazuje, že rekombinantní feritin může být uvolňován jako rozpustná forma z Escherichia coli při nízkých koncentracích NaCl (≤50 mmol/l). Aby bylo možné exprimovat feritin v E. coli BL21 a uvolnit fertin, byl úspěšně aplikován následující protokol. Rekombinantní plazmid pET-28a/feritin byl transformován na kmen E coli BL21 (DE3). Feritinové buňky E coli BL21 (DE3) byly kultivovány v růstovém médiu LB s 0,5% kanamycinem při 37 °C a indukovány při OD600 0,6 s 0,4% isopropyl-β-D-thiogalaktoparanosidem po dobu 3 hodin při 37 °C. Konečná kultura byla poté sklizena centrifugací při 8000 g po dobu 10 minut při teplotě 4 °C a pelety byly shromážděny. Poté byla peleta resuspendována v LB médiu (1% NaCl, 1% Typon, 0,5% kvasnicový extrakt)/lyzačním pufru (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) a různých koncentracích roztoku NaCl (0, 50, 100, 170 a 300 mmol/L). Pro lýzu bakteriálních buněk byla sonikace aplikována v pulzním režimu: např. Ultrasonicator UP400St při 100% amplitudě s pracovním cyklem 5 sekund zapnuto, 10 sekund vypnuto, po dobu 40 cyklů) a poté odstředěn při 10 000 g po dobu 15 minut při 4 °C. Supernatant a sraženina byly analyzovány polyakrylamidovou gelovou elektroforézou dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE). Všechny gely obarvené dodecylsulfátem sodným byly naskenovány skenerem s vysokým rozlišením. Gelové snímky byly analyzovány pomocí softwaru Magic Chemi 1D. Pro optimální přehlednost byly proteinové pásy detekovány úpravou parametrů. Data pro pásma byla generována z technických trojic. (srov. Sun et al., 2016)

Ultrazvukové buněčné disruptory pro průmyslovou lýzu buněčných továren

Ultrazvuková lýza a extrakce je spolehlivá a pohodlná metoda uvolňování metabolitů z buněčných továren, čímž napomáhá účinné produkci cílových molekul. Ultrazvukové disruptory článků jsou k dispozici od laboratorní až po průmyslovou velikost a procesy lze škálovat zcela lineárně.
Hielscher Ultrasonics je váš kompetentní partner pro vysoce výkonné ultrazvukové disruptory a má dlouholeté zkušenosti v oblasti implantace ultrazvukových systémů ve stolním a průmyslovém prostředí.
Pokud jde o sofistikovaný hardware a software, systémy narušení buněk Hielscher Ultrasonics splňují všechny požadavky na optimální řízení procesu, snadnou obsluhu a uživatelskou přívětivost. Zákazníci a uživatelé Hielscher ultrasonikators oceňují výhodu, že Hielscher ultrazvukové buněčné disruptory a extraktory umožňují přesné monitorování a řízení procesu – prostřednictvím digitálního dotykového displeje a dálkového ovládání prohlížeče. Všechna důležitá data o sonikaci (např. čistá energie, celková energie, amplituda, doba trvání, teplota, tlak) se automaticky ukládají jako soubor CSV na integrovanou SD kartu. To pomáhá získat reprodukovatelné a opakovatelné výsledky a usnadňuje standardizaci procesů i plnění správné výrobní praxe (cGMP).
Ultrazvukové procesory Hielscher jsou samozřejmě konstruovány pro provoz 24 hodin denně, 7 dní v týdnu při plném zatížení, a proto je lze spolehlivě provozovat v prostředí průmyslové výroby. Díky vysoké robustnosti a nízké údržbě je prostoje ultrazvukového zařízení opravdu nízké. Funkce CIP (clean-in-place) a SIP (sterilize-in-place) minimalizují pracné čištění, zejména proto, že všechny mokré části jsou hladké kovové povrchy (žádné skryté otvory nebo trysky).

Níže uvedená tabulka vám poskytuje přibližný přehled o zpracovatelské kapacitě našich ultrasonicators: