Biosyntetická výroba oligosacharidů lidského mléka

Biosyntéza oligosacharidů lidského mléka (HMO) prostřednictvím fermentace nebo enzymatických reakcí je složitý, na zdroje náročný a často málo výtěžný proces. Ultrazvukové ošetření zvyšuje přenos hmoty mezi substrátem a buněčnými továrnami a stimuluje růst a metabolismus buněk. Sonikace tak intenzifikuje fermentační a biochemické procesy, což vede k rychlejší a efektivnější výrobě HMO.

Oligosacharidy lidského mléka

Oligosacharidy lidského mléka (HMO), známé také jako glykany lidského mléka, jsou molekuly cukrů, které patří do skupiny oligosacharidů. Mezi významné příklady HMO patří 2’-fukosyllaktóza (2′-FL), lakto-N-neotetraóza (LNnT), 3’-galaktosyllaktóza (3′-GL) a difukosyllaktóza (DFL).
Zatímco lidské mateřské mléko obsahuje více než 150 různých struktur HMO, v současnosti se na komerční úrovni vyrábějí a jako nutriční přísady do kojenecké výživy používají pouze 2′-fukosyllaktóza (2′-FL) a lakto-N-neotetraóza (LNnT).
Oligosacharidy lidského mléka (HMO) jsou známé svým významem ve výživě kojenců. Oligosacharidy lidského mléka jsou jedinečným typem živin, které ve střevě kojence působí jako prebiotika, antiadhezivní antimikrobiální látky a imunomodulátory a podstatně přispívají k vývoji mozku. HMO se vyskytují výhradně v lidském mateřském mléce; jiná savčí mléka (např. kravské, kozí, ovčí, velbloudí atd.) tuto specifickou formu oligosacharidů neobsahují.
Oligosacharidy lidského mléka jsou třetí nejhojnější pevnou složkou lidského mléka a mohou být ve vodě přítomny v rozpuštěné, emulgované nebo suspendované formě. Laktóza a mastné kyseliny jsou nejhojnějšími pevnými látkami v lidském mléce. HMO jsou přítomny v koncentraci 0,35–0,88 unce (9,9–24,9 g)/ L. Je známo přibližně 200 strukturně odlišných oligosacharidů lidského mléka. Dominantním oligosacharidem u 80% všech žen je 2′-fukosyllaktóza, která je v lidském mateřském mléce přítomna v koncentraci přibližně 2,5 g/ L.
Protože se HMO netráví, kaloricky k výživě nepřispívají. Jako nestravitelné sacharidy fungují jako prebiotika a jsou selektivně fermentovány žádoucí střevní mikroflórou, zejména bifidobakteriemi.

Biosyntéza oligosacharidů lidského mléka

Buněčné továrny a enzymatické / chemoenzymatické systémy jsou současné technologie používané k syntéze HMO. Pro výrobu HMO v průmyslovém měřítku jsou fermentace mikrobiálních buněčných továren, biochemická syntéza a různé enzymatické reakce proveditelnými způsoby bioprodukce HMO. Z ekonomických důvodů je biosyntéza pomocí mikrobiálních buněčných továren v současnosti jedinou technikou používanou při průmyslové výrobě HMO.

Fermentace HMO pomocí mikrobiálních buněčných továren

E.coli, Saccharomyces cerevisiae a Lactococcus lactis jsou běžně používané buněčné továrny pro bioprodukci biologických molekul, jako jsou HMO. Fermentace je biochemický proces, při kterém mikroorganismy přeměňují substrát na cílové biologické molekuly. Mikrobiální buněčné továrny využívají jako substrát jednoduché cukry, které přeměňují na HMO. Protože jednoduché cukry (např. laktóza) jsou hojně dostupným a levným substrátem, zůstává proces biosyntézy nákladově efektivní.
Růst a rychlost biokonverze jsou ovlivňovány především přenosem hmoty živin (substrátu) k mikroorganismům. Rychlost přenosu hmoty je hlavním faktorem, který ovlivňuje syntézu produktu během fermentace. Je dobře známo, že ultrazvukové ošetření podporuje přenos hmoty.
Během fermentace musí být podmínky v bioreaktoru neustále sledovány a regulovány tak, aby buňky mohly růst co nejrychleji a následně produkovat cílové biomolekuly (např. oligosacharidy, jako jsou HMO; inzulin; rekombinantní proteiny). Teoreticky tvorba produktu začíná, jakmile buněčná kultura začne růst. Zejména u geneticky modifikovaných buněk, jako jsou upravené mikroorganismy, je však obvykle indukována později přidáním chemické látky do substrátu, která zvyšuje expresi cílové biomolekuly. Ultrazvukové bioreaktory (sono-bioreaktor) lze přesně řídit a umožňují cílenou stimulaci mikrobů. To vede k rychlejší biosyntéze a vyšším výtěžkům.
Ultrazvuková lýza a extrakce: Fermentace komplexních HMO může být omezena nízkými fermentačními titry a produkty, které zůstávají uvnitř buněk. Ultrazvuková lýza a extrakce se používá k uvolnění intracelulárního materiálu před purifikací a navazujícími (down-stream) procesy.

Fermentace podpořená ultrazvukem

Rychlost růstu mikrobů, jako jsou Escherichia coli, upravená E.coli, Saccharomyces cerevisiae a Lactococcus lactis, lze urychlit zvýšením rychlosti přenosu hmoty a propustnosti buněčné stěny pomocí řízeného nízkofrekvenčního ultrazvukového ošetření. Jako šetrná, netepelná technika zpracování vnáší ultrazvukové ošetření do fermentačního média čistě mechanické síly.
Akustická kavitace: Princip fungování sonikace je založen na akustické kavitaci. Ultrazvuková sonda (sonotroda) přenáší nízkofrekvenční ultrazvukové vlny do média. Ultrazvukové vlny procházejí kapalinou a vytvářejí střídavé cykly vysokého tlaku (komprese) / nízkého tlaku (zředění). Stlačováním a natahováním kapaliny ve střídavých cyklech vznikají drobné vakuové bubliny. Tyto malé vakuové bubliny rostou během několika cyklů, dokud nedosáhnou velikosti, při které již nemohou absorbovat žádnou další energii. V tomto bodě maximálního růstu vakuová bublina prudce imploduje a lokálně vytváří extrémní podmínky, což je jev známý jako kavitace. V kavitačním „hot-spotu“ lze pozorovat vysoké tlakové a teplotní rozdíly a intenzivní smykové síly s kapalinovými proudy o rychlosti až 280m/sec. Díky těmto kavitačním účinkům se dosahuje důkladného přenosu hmoty a sonoporace (perforace buněčných stěn a buněčných membrán). Živiny ze substrátu jsou unášeny k živým celým buňkám a do nich, takže buněčné továrny jsou optimálně vyživovány a rychlost růstu i konverze se zvyšuje. Ultrazvukové bioreaktory představují jednoduchou, a přesto vysoce účinnou strategii zpracování biomasy v jednonádobovém (one-pot) procesu biosyntézy.
Je dobře známo, že přesně řízená, šetrná sonikace intenzifikuje fermentační procesy.
Sonikace zlepšuje „produktivitu mnoha bioprocesů zahrnujících živé buňky prostřednictvím zvýšeného příjmu substrátu, zvýšené produkce nebo růstu díky zvýšené pórovitosti buněk a potenciálně zvýšeného uvolňování buněčných složek.“ (Naveena et al. 2015)
Přečtěte si více o fermentaci podporované ultrazvukem!

Naveena et al. (2015) zjistili, že ultrazvuková intenzifikace nabízí při bioprocesech několik výhod, včetně nízkých provozních nákladů ve srovnání s jinými možnostmi podpůrného ošetření, jednoduchosti obsluhy a mírných požadavků na příkon.

Vysoce výkonné ultrazvukové fermentační reaktory

Fermentační procesy zahrnují živé mikroorganismy, jako jsou bakterie nebo kvasinky, které fungují jako buněčné továrny. Zatímco se sonikace používá k podpoře přenosu hmoty a ke zvýšení rychlosti růstu a konverze mikroorganismů, je zásadní přesně řídit intenzitu ultrazvuku, aby nedošlo ke zničení buněčných továren.
Hielscher Ultrasonics se specializuje na vývoj, výrobu a distribuci vysoce výkonných sonikátorů, které lze přesně řídit a monitorovat, a zajistit tak vynikající výtěžky fermentace.

Řízení procesu je nezbytné nejen pro vysoké výtěžky a vynikající kvalitu, ale také umožňuje opakovat a reprodukovat výsledky. Zejména pokud jde o stimulaci buněčných továren, je přizpůsobení parametrů sonikace konkrétním buňkám zásadní pro dosažení vysokých výtěžků a pro zabránění degradaci buněk. Proto jsou všechny digitální modely sonikátorů Hielscher vybaveny inteligentním softwarem, který vám umožňuje nastavovat, sledovat a upravovat parametry sonikace. Parametry ultrazvukového procesu, jako je amplituda, teplota, tlak, doba sonikace, pracovní cykly a vstupní energie, jsou nezbytné pro podporu produkce HMO fermentací.
Chytrý software sonikátorů Hielscher automaticky zaznamenává všechny důležité parametry procesu na integrovanou SD kartu. Automatický záznam dat procesu sonikace je základem standardizace procesu a reprodukovatelnosti / opakovatelnosti, které jsou vyžadovány pro správnou výrobní praxi (GMP).

Ultrazvukové reaktory pro fermentaci

Hielscher nabízí ultrazvukové sondy různých velikostí, délek a geometrií, které lze použít pro vsádkové i kontinuální průtokové zpracování. Ultrazvukové reaktory, známé také jako sono-bioreaktory, jsou k dispozici pro jakýkoli objem a pokrývají ultrazvukové bioprocesy od malých laboratorních vzorků až po pilotní a plně komerční výrobní úroveň.
Je dobře známo, že umístění ultrazvukové sonotrody v reakční nádobě ovlivňuje rozložení kavitace a mikroproudění v médiu. Sonotroda a ultrazvukový reaktor by měly být zvoleny podle zpracovávaného objemu buněčného bujónu. Zatímco sonikaci lze provádět ve vsádkovém i kontinuálním režimu, pro velké výrobní objemy se doporučuje použití kontinuálního průtokového zařízení. Při průchodu ultrazvukovou průtokovou celou je veškeré buněčné médium vystaveno přesně stejné sonikaci, což zajišťuje nejúčinnější zpracování. Široká nabídka ultrazvukových sond a reaktorů s průtokovou celou od Hielscher Ultrasonics umožňuje sestavit ideální ultrazvukovou sestavu pro bioprocesy.

Hielscher Ultrasonics – od laboratoře přes pilotní provoz až po výrobu

Hielscher Ultrasonics pokrývá celé spektrum ultrazvukových zařízení – od kompaktních ručních ultrazvukových homogenizátorů pro přípravu vzorků přes stolní a pilotní systémy až po výkonné průmyslové ultrazvukové jednotky, které snadno zpracují celé kamionové náklady za hodinu. Díky všestrannosti a flexibilitě možností instalace a montáže lze sonikátory Hielscher snadno integrovat do všech druhů vsádkových reaktorů, přítokovaných vsádek (fed-batch) nebo kontinuálních průtokových sestav.
Rozmanité příslušenství i díly na míru umožňují ideální přizpůsobení vaší ultrazvukové sestavy požadavkům vašeho procesu.
Ultrazvukové procesory Hielscher jsou konstruovány pro nepřetržitý provoz 24/7 při plném zatížení a pro těžký provoz v náročných podmínkách, jsou spolehlivé a vyžadují jen nízkou údržbu.
Následující tabulka uvádí orientační zpracovatelskou kapacitu našich sonikátorů: