Syntéza peptidů v pevné fázi – Vyšší účinnost díky sonikaci
Syntéza peptidů v pevné fázi (SPPS) je běžná metoda syntézy peptidů. Ultrazvuku je spolehlivým nástrojem pro zintenzivnění syntézy peptidů v pevné fázi, což vede k vyšším výtěžkům, zlepšené čistotě, žádné racemizaci a výrazně zrychlené rychlosti reakce. Hielscher Ultrasonics nabízí různá ultrazvuková řešení pro syntézu peptidů, štěpení a rozpouštění.
Ultrazvuková syntéza peptidů v pevné fázi
Ultrazvuku je již široce používán jako zesilující metoda v organické syntéze a je dobře známý pro své výhody, jako je drasticky snížené reakční doby, vyšší výnosy, méně vedlejších produktů, iniciace cest, kterých nelze dosáhnout jinými způsoby, a / nebo lepší selektivita. Velké výhody lze také získat, když je sonikace spojena s reakcemi syntézy peptidů. Výsledky výzkumu prokázaly, že ultrazvukem asistovaná syntéza peptidů dosahuje optimalizovaného výtěžku peptidů s vysokou čistotou, bez racemizace během krátké reakční doby.
- Vysoké výtěžky peptidů
- Výrazně rychlejší syntéza
- Vyšší čistota peptidů
- Žádná racemizace
- Paralelní syntéza různých peptidů
- Škálovatelné pro jakýkoli objem
Ultrazvukový cuphorn pro rovnoměrnou sonikaci několika reaktorových nádob pro zlepšení syntézy peptidů.
Schéma znázorňující syntézu peptidů v pevné fázi podle metody Merrifielda. Ultrazvuk se používá k urychlení a zefektivnění syntetické reakce, jakož i k odštěpení syntetizovaných peptidů od pryskyřice.
Grafika: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| Studie | Studované peptidy | Reakční doba (klasická metoda vs. US-SPPS) | Čistota surové ropy (klasická metoda vs. US-SPPS) | Racemizace a vedlejší reakce | Hlavní body |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański a kol. (2019) | Met-enkefalin, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-endorfin | 600–1920 min → 48–284 min | 24,2–71,3 % → 60,6–89,9 % | U Cys/His nebylo nic pozorováno, a to ani při 70 °C | ~7–12x rychlejší syntéza; výrazné zlepšení čistoty, zejména u sekvencí náchylných k agregaci, jako je TAT. |
| Silva a kol. (2021) | Pep1 (12-mer), Pep2 (9-mer), Pep3 (25-mer) | >3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (pouze v USA) | 73–84 % → 72–82 % (Pep1/Pep2) | Nebylo testováno; u Pep2 byl zaznamenán mírný pokles čistoty | 14násobné zkrácení doby reakce u Pep1; výrazné zvýšení výtěžnosti surového produktu. |
| Merlino a kol. (2019) | Modelové pentapeptidy, peptidy o délce až 44 aminokyselin, “Obtížné sekvence” (Aβ 1–42, ACP 65–74) | 60 min → 30 min (model) | 84 % → 93 % (model); výrazně vyšší než při tepelném ohřevu (~45 °C) | U enantiomerů Cys/His nedošlo k žádnému významnému nárůstu | Vysoce účinná metoda pro obtížné sekvence nebo sekvence náchylné k agregaci; umožňuje snížit přebytek reagencií při zachování vysoké čistoty. |
Syntéza peptidů v pevné fázi vylepšená ultrazvukem
Syntéza peptidů v pevné fázi (SPPS) je chemická reakce, která umožňuje sestavení peptidového řetězce prostřednictvím postupných reakcí derivátů aminokyselin na nerozpustném porézním nosiči. Tradiční syntéza peptidů v pevné fázi je však relativně neefektivní a pomalý proces. Proto je ultrazvuková intenzifikace syntézy peptidů vysoce ceněným nástrojem pro účinnější a rychlejší syntézu peptidů.
Silva a kol. (2021) porovnali “klasický” syntéza peptidů v pevné fázi (SPPS) s použitím fluorenylmethoxykarbonylu (Fmoc) a ultrazvuku (US) na základě přípravy tří peptidů, a to peptidu Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2) specifického pro receptor 3 růstového faktoru fibroblastů (FGFR3) a nových peptidů Pep2 (RQMATADEA-NH2) a Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
SPPS s podporou USA vedlo ke 14násobnému (Pep1) a 4násobnému zkrácení doby (Pep2) při sestavování peptidů ve srovnání s “klasický” metoda. Je zajímavé, že pomocí ultrazvuku podporovaná SPPS poskytla Pep1 v vyšší čistotě (82 %) než “klasický” SPPS (73 %). Výrazné zkrácení doby syntézy v kombinaci s dosaženou vysokou čistotou surového peptidu vedlo výzkumný tým k tomu, aby metodu SPPS podporovanou ultrazvukem aplikoval na velký peptid Pep3, který vykazuje vysoký počet hydrofobních aminokyselin a homooligosekvencí. Je pozoruhodné, že syntéza tohoto 25-merového peptidu byla dokončena za méně než 6 hodin (347 min) s přiměřenou čistotou (přibližně 49 %).
Rychlejší syntéza peptidů prostřednictvím syntézy peptidů v pevné fázi pomocí ultrazvukového míchání.
(Studie a analýza: Wołczański et al., 2019)
Merlino a kol. (2019) rovněž provedli komplexní studii vlivu ultrazvuku na syntézu peptidů v pevné fázi založenou na Fmoc, která umožnila syntézu různých biologicky aktivních peptidů (až 44-merů) s výraznou úsporou materiálu a reakčního času. Prokázali, že ultrazvuková léčba nezhoršila hlavní vedlejší reakce a zlepšila syntézu peptidů vybavených “Obtížné sekvence”, čímž se ultrazvukem podporovaná syntéza peptidů v pevné fázi (US-SPPS) řadí mezi současné vysoce účinné syntetické strategie peptidů.
Dostupnost vysoce výkonných systémů pro ultrazvukovou (sonickou) syntézu peptidů umožňuje výrazně zlepšit rychlost syntézy a zvýšit čistotu surovin. (srov. Wołczański et al., 2019)
Vyšetřování racemizace. Porovnání významných 1H NMR spekter modelových peptidů syntetizovaných ručně klasickým přístupem při pokojové teplotě vs. ultrazvukovou metodou při zvýšené teplotě. Chemické posuny His a Cys α-protonů a methylenové skupiny Acm (levé panely), ɣ-methylprotonů Val (pravé panely) ukazují, že sonikace při 70 °C nezpůsobuje racemizaci.
(Studie a analýza: Wołczański et al., 2019)
Ultrazvukové štěpení peptidů
Po syntéze peptidů v pevné fázi (SPPS) musí být syntetizované peptidy odštěpeny z polymerních pryskyřic. Tento krok se také označuje jako zrušení ochrany. Když se porovná běžné třepání a ultrazvuku pro štěpení peptidů z pryskyřice, metoda třepání vyžaduje cca. 1 hodinu, zatímco ultrazvukové štěpení lze provést za 15 až 20 min. Ultrazvukové štěpení peptidů lze aplikovat na štěpení chráněných aminokyselin a peptidů spojených s polystyrenovými pryskyřicemi prostřednictvím benzylových esterových vazeb.
Ultrazvukové štěpení peptidů z polystyrenové pryskyřice poskytuje vysoké výtěžky peptidů ve vysoké čistotě, bez racemizace, v rámci rychlého postupu.
(studie a grafika: ©Anuradha a Ravindranath, 1995)
Ultrazvukem míchaný reaktor pro zlepšenou a urychlenou syntézu peptidů. Na obrázku je znázorněn ultrasonicator UP200St v reaktoru s míchaným sklem.
Vysoce výkonné ultrasonicators pro syntézu peptidů
Hielscher Ultrasonics nabízí různé ultrazvukové řešení pro přímé a nepřímé sonikace. Výkonné a přesně ovladatelné ultrazvukové procesory dodávají do reakční cévy přesně to správné množství ultrazvukové energie. Ať už používáte injekční stříkačky, zkumavky, vícejamkové desky nebo skleněné reaktory jako syntetickou nádobu, Hielscher Ultrasonics nabízí nejvhodnější ultrasonikátor pro vaši peptidovou aplikaci.
- peptidy na míru
- Výroba peptidů ve velkém měřítku
- Peptidové knihovny
Mnoho peptidových syntéz se provádí v injekčních stříkačkách (např. fritované injekční relikty). Hielscherův ultrazvukový míchadlo injekční stříkačky sonikuje peptidový roztok a spojuje ultrazvukové vlny přes stěnu injekční stříkačky do kapaliny. Ultrazvukový míchač injekčních stříkaček je jedním z nejpopulárnějších ultrazvukových řešení pro ultrazvukem asistovanou syntézu peptidů.
Ultrazvukový cuphorn je vhodným nástrojem pro sonikaci až 5 reaktorových nádob, zatímco VialTweeter pojme až deset reakčních zkumavek plus navíc pět větších nádob pomocí upínacího příslušenství.
Pro další typy reaktorů, jako jsou například reaktory s pevnou fází typu Merrifield nebo Kamysz, a další nádoby a reaktory z polypropylenu či borosilikátu, nabízí společnost Hielscher ultrazvukové přístroje pro nepřímou i přímou sonikaci s přizpůsobeným upínacím nebo přírubovým uchycením.
Větší skleněné reaktory s mícháním, například pro syntézu v roztokové fázi, lze samozřejmě snadno vybavit ultrazvukovými sondami (známými také jako sonotrody nebo ultrazvukové rohy) libovolné velikosti.
- Různé typy ultrasonicator
- Přímá a nepřímá sonikace
- Přesné ovládání intenzity
- Přesná regulace teploty
- kontinuální nebo pulzní ultrazvuk
- chytré funkce, programovatelná zařízení
- K dispozici pro libovolný svazek
- Lineární škálovatelnost
Pro syntézu peptidů v pevné fázi v destičkách s více jamkami/mikrotitračních destičkách je přístroj UIP400MTP ideálním řešením. Ultrazvuková kavitace je nepřímo a rovnoměrně přenášena do četných jamek se vzorky, což zajišťuje vynikající přenos hmoty a syntetickou reakci. Podívejte se na video níže, kde uvidíte Sonikátor pro mikrodestičky UIP400MTP v akci!
Kontaktujte nás! / Zeptejte se nás!
Hielscher Ultrasonics vyrábí vysoce výkonné ultrazvukové homogenizátory pro míchání aplikací, disperze, emulgaci a extrakci v laboratorním, pilotním a průmyslovém měřítku.
Zajímavosti o ultrazvukové syntéze peptidů
Co jsou peptidy?
Peptidy jsou sloučeniny, kde je více aminokyselin spojeno amidovými vazbami, tzv. peptidovými vazbami. Při vazbě ve složitých strukturách – Obvykle se skládají z 50 nebo více aminokyselin -, tyto velké peptidové struktury se nazývají proteiny. Peptidy jsou základním stavebním kamenem života a v těle plní řadu funkcí.
Jak funguje syntéza peptidů?
V organické chemii, molekulární biologii a vědách o živé přírodě je syntéza peptidů proces produkce peptidů. Peptidy jsou chemicky syntetizovány kondenzační reakcí karboxylové skupiny jedné aminokyseliny na aminoskupinu jiné aminokyseliny. Strategie ochranných skupin (také ochranných skupin) se obvykle používají, aby se zabránilo nežádoucím vedlejším reakcím s různými postranními řetězci aminokyselin.
Chemická syntéza (in-vitro) peptidů nejčastěji začíná spojením karboxylové skupiny příchozí aminokyseliny (C-konec) s N-koncem rostoucího peptidového řetězce. Na rozdíl od této syntézy C-to-N probíhá přirozená proteinová biosyntéza dlouhých peptidů v živých organismech v opačném směru. To znamená, že při biosyntéze je N-konec příchozí aminokyseliny spojen s C-koncem proteinového řetězce (N-to-C).
Většina výzkumných a vývojových protokolů pro syntézu peptidů je založena na metodách v pevné fázi, zatímco metody syntézy v roztokové fázi lze nalézt ve velkokapacitní průmyslové výrobě peptidů.
Jaký je současný stav techniky v oblasti syntézy peptidů?
SUS-SPPS (udržitelná SPPS s využitím ultrazvuku) Bylo prokázáno, že tento postup zkracuje celý proces na pouhé dva kroky v jednom cyklu (kombinované navázání/uzavření/odstranění ochranné skupiny + jediné promytí), čímž se výrazně snižuje spotřeba rozpouštědla i časová náročnost. (viz Mottola et al., 2025)
TAPS s využitím ultrazvuku jedná se o nově se prosazující kombinaci, která prokázala svou účinnost při totálních syntézách (např. lipobaktin) a kterou společnosti CDMO zkoumají z hlediska výroby účinných látek (API).
Objevte výhody syntézy peptidů metodou TAGGING za pomoci ultrazvuku!
kontinuální zpracování je zkoumáno jako další vylepšení – Byly popsány platformy pro kontinuální jednokrokovou syntézu s využitím silylovaných značek.
Tento obor se ubírá směrem k principům zelené chemie, přičemž jak ultrazvuk, tak systém TAPS přispívají ke snížení spotřeby rozpouštědel, menšímu množství použitých činidel a větší udržitelnosti.
Literatura / Reference
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonics vyrábí vysoce výkonné ultrazvukové homogenizátory od laboratoř k průmyslová velikost.