Syntéza peptidů na pevné fázi – efektivnější díky sonikaci

Syntéza peptidů na pevné fázi (SPPS) je běžnou metodou syntézy peptidů. Ultrazvuk je spolehlivým nástrojem pro intenzifikaci syntézy peptidů na pevné fázi, jejímž výsledkem jsou vyšší výtěžky, lepší čistota, žádná racemizace a výrazně zrychlená reakce. Hielscher Ultrasonics nabízí různá ultrazvuková řešení pro syntézu peptidů, jejich odštěpování a rozpouštění.

Ultrazvuková syntéza peptidů na pevné fázi

Ultrazvuk se již široce používá jako intenzifikační metoda v organické syntéze a je dobře známý svými výhodami, jako jsou drasticky zkrácené reakční doby, vyšší výtěžky, méně vedlejších produktů, iniciace reakčních cest, kterých by nebylo možné dosáhnout jinými způsoby, a/nebo lepší selektivita. Velkých přínosů lze dosáhnout také tehdy, když se sonikace zapojí do reakcí syntézy peptidů. Výsledky výzkumu prokázaly, že ultrazvukem asistovaná syntéza peptidů dosahuje optimalizovaného výtěžku peptidů s vysokou čistotou, bez racemizace a v krátké reakční době.

Výhody ultrazvukové syntézy peptidů

Vysoké výtěžky peptidů
Výrazně rychlejší syntéza
Vyšší čistota peptidů
Žádná racemizace
Paralelní syntéza různých peptidů
Škálovatelné na jakýkoli objem

Ultrazvukový cuphorn pro rovnoměrnou sonikaci několika reakčních nádob, např. pro zlepšenou syntézu peptidů.

Ultrazvukový cuphorn pro rovnoměrnou sonikaci několika reakčních nádob pro zlepšenou syntézu peptidů.

Schematické znázornění Merrifieldovy syntézy peptidů na pevné fázi, kterou lze intenzifikovat sonikací.

Grafika znázorňující Merrifieldovu syntézu peptidů na pevné fázi. Ultrazvuk se používá k podpoře a zesílení syntézní reakce a také k odštěpení syntetizovaných peptidů z pryskyřice.
Grafika: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)

Studie	Studované peptidy	Reakční doba (klasická vs US-SPPS)	Čistota surového produktu (klasická vs US-SPPS)	Racemizace a vedlejší reakce	Klíčová zjištění
Wołczański et al. (2019)	Met-enkefalin, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-endorfin	600–1920 min → 48–284 min	24,2–71,3% → 60,6–89,9%	U Cys/His nepozorována, a to ani při 70°C	~7–12x rychlejší syntéza; výrazné zlepšení čistoty, zejména u sekvencí náchylných k agregaci, jako je TAT.
Silva et al. (2021)	Pep1 (12-mer), Pep2 (9-mer), Pep3 (25-mer)	>3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (pouze US)	73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2)	Netestováno; zaznamenán mírný pokles čistoty u Pep2	14x zkrácení doby u Pep1; výtěžky surového produktu výrazně vzrostly.
Merlino et al. (2019)	Modelové pentapeptidy, peptidy až do 44-meru, „obtížné sekvence“ (Aβ 1-42, ACP 65-74)	60 min → 30 min (model)	84% → 93% (model); výrazně vyšší než při tepelném ohřevu (~45°C)	Žádný významný nárůst enantiomerů Cys/His	Vysoce účinná u obtížných sekvencí a sekvencí náchylných k agregaci; umožňuje snížit nadbytek činidel při zachování vysoké čistoty.

Syntéza peptidů na pevné fázi zlepšená ultrazvukem

Syntéza peptidů na pevné fázi (SPPS) je chemická reakce, která umožňuje sestavení peptidového řetězce postupnými reakcemi derivátů aminokyselin na nerozpustném porézním nosiči. Tradiční syntéza peptidů na pevné fázi je však poměrně neefektivní a pomalý proces. Ultrazvuková intenzifikace syntézy peptidů je proto vysoce ceněným nástrojem pro účinnější a rychlejší syntézu peptidů.
Silva et al. (2021) porovnali „klasickou“ syntézu peptidů na pevné fázi (SPPS) s fluorenylmethoxykarbonylovou (Fmoc) ochranou s ultrazvukem (US) asistovanou SPPS na základě přípravy tří peptidů, konkrétně peptidu Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2) specifického pro receptor 3 fibroblastového růstového faktoru (FGFR3) a nových peptidů Pep2 (RQMATADEA-NH2) a Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
US-asistovaná SPPS vedla ve srovnání s „klasickou“ metodou ke 14násobnému (Pep1) a 4násobnému (Pep2) zkrácení doby sestavení peptidu. Zajímavé je, že ultrazvukem asistovaná SPPS poskytla Pep1 ve vyšší čistotě (82%) než „klasická“ SPPS (73%). Výrazné zkrácení doby v kombinaci s dosaženou vysokou čistotou surového peptidu přimělo výzkumný tým aplikovat US-asistovanou SPPS na velký peptid Pep3, který obsahuje vysoký počet hydrofobních aminokyselin a homooligomerních sekvencí. Pozoruhodné je, že syntézy tohoto 25-merního peptidu bylo dosaženo za méně než 6 hodin (347 min) se střední čistotou (přibližně 49%).

Ultrazvuková syntéza peptidů na pevné fázi (US-SPPS) je účinná technika syntézy peptidů, která zabraňuje racemizaci.

Rychlejší syntéza peptidů na pevné fázi s využitím ultrazvukového míchání.
(Studie a analýza: Wołczański et al., 2019)

Merlino et al. (2019) rovněž provedli komplexní studii účinků ultrazvuku na syntézu peptidů na pevné fázi založenou na Fmoc, která umožnila syntézu různých biologicky aktivních peptidů (až do 44-meru) s pozoruhodnou úsporou materiálu a reakční doby. Prokázali, že ultrazvuk nezhoršil hlavní vedlejší reakce a zlepšil syntézu peptidů s „obtížnými sekvencemi“, čímž zařadili ultrazvukem podporovanou syntézu peptidů na pevné fázi (US-SPPS) mezi současné vysoce účinné strategie syntézy peptidů.

Dostupnost vysoce výkonných systémů pro ultrazvukovou (sonikační) syntézu peptidů umožňuje výrazně zvýšit rychlost syntézy a čistotu surových produktů. (srov. Wołczański et al., 2019)

Ultrazvuková syntéza peptidů poskytuje vysoké výtěžky peptidů s vysokou čistotou a zároveň zabraňuje racemizaci.

Zkoumání racemizace. Srovnání významných 1H NMR spekter modelových peptidů syntetizovaných ručně klasickým postupem při pokojové teplotě a ultrazvukovou metodou při zvýšené teplotě. Chemické posuny α-protonů His a Cys a methylenové skupiny Acm (levé panely) a ɣ-methylových protonů Val (pravé panely) ukazují, že sonikace při 70°C nezpůsobuje racemizaci.
(Studie a analýza: Wołczański et al., 2019)

Ultrazvukové odštěpování peptidů

Po syntéze peptidů na pevné fázi (SPPS) je nutné syntetizované peptidy odštěpit z polymerních pryskyřic. Tento krok je známý také jako deprotekce. Při srovnání běžného třepání a ultrazvuku pro odštěpení peptidů z pryskyřice vyžaduje metoda třepání přibližně 1 hodinu, zatímco ultrazvukové odštěpení lze provést za 15 až 20 min. Ultrazvukové odštěpování peptidů lze použít k odštěpení chráněných aminokyselin a peptidů vázaných na polystyrenové pryskyřice prostřednictvím benzylesterových vazeb.

Ultrazvukové odštěpování je rychlá a spolehlivá technika oddělení syntetizovaných peptidů od polystyrenové pryskyřice.

Ultrazvukové odštěpení peptidů z polystyrenové pryskyřice poskytuje vysoké výtěžky peptidů ve vysoké čistotě, bez racemizace, v rámci rychlého postupu.
(studie a grafika: ©Anuradha a Ravindranath, 1995)

Ultrazvukem míchaný reaktor pro zlepšenou syntézu peptidů.

Ultrazvukem míchaný reaktor pro zlepšenou a zrychlenou syntézu peptidů. Na obrázku je ultrazvukový přístroj UP200St ve skleněném reaktoru s míchadlem.

Vysoce výkonné ultrazvukové přístroje pro syntézu peptidů

Hielscher Ultrasonics nabízí různá ultrazvuková řešení pro přímou a nepřímou sonikaci. Výkonné a přesně regulovatelné ultrazvukové procesory dodávají do reakční nádoby přesně správné množství ultrazvukové energie. Ať už jako syntézní nádobu používáte stříkačky, zkumavky, multijamkové destičky nebo skleněné reaktory, Hielscher Ultrasonics nabízí nejvhodnější ultrazvukový přístroj pro Vaši peptidovou aplikaci.

Ultrazvukové systémy Hielscher jsou ideální pro

syntézu peptidů na míru
velkovýrobu peptidů
syntézu peptidových knihoven

Mnoho syntéz peptidů se provádí ve stříkačkách (např. ve stříkačkových reaktorech s fritou). Ultrazvukový míchač stříkaček Hielscher sonikuje roztok peptidu tak, že přenáší ultrazvukové vlny stěnou stříkačky do kapaliny. Ultrazvukový míchač stříkaček patří k nejoblíbenějším ultrazvukovým řešením pro ultrazvukem asistovanou syntézu peptidů.
Ultrazvukový cuphorn je vhodným nástrojem pro sonikaci až 5 reakčních nádob, zatímco VialTweeter pojme až deset reakčních zkumavek a navíc pět větších nádob pomocí nasazovacího příslušenství.
Pro další typy reaktorů, jako je Merrifieldův nebo Kamyszův reaktor pro syntézu na pevné fázi, a další polypropylenové nebo borosilikátové nádoby a reaktory nabízí Hielscher sonikátory pro nepřímou a přímou sonikaci s upínáním nebo přírubou na míru.

Větší skleněné reaktory s míchadlem, např. pro syntézu v roztoku, lze samozřejmě snadno vybavit ultrazvukovými sondami (též označovanými jako sonotrody, angl. ultrasonic horns) libovolné velikosti.

Výhody ultrazvukových přístrojů Hielscher pro syntézu peptidů

různé typy ultrazvukových přístrojů
přímá a nepřímá sonikace
přesná regulace intenzity
přesná regulace teploty
kontinuální nebo pulzní ultrazvuk
chytré funkce, programovatelná zařízení
k dispozici pro jakýkoli objem
lineární škálovatelnost

Pro syntézu peptidů na pevné fázi v multijamkových/mikrotitračních destičkách je ideálním zařízením UIP400MTP. Ultrazvuková kavitace se nepřímo a rovnoměrně přenáší do četných jamek se vzorky, což zajišťuje vynikající přenos hmoty a průběh syntézní reakce. Podívejte se na video níže, kde uvidíte sonikátor mikrodestiček UIP400MTP v akci!

Ultrazvukový homogenizátor UIP400MTP umožňuje sonikaci vícejamkových a mikrotitračních destiček pro lýzu buněk, fragmentaci DNA, dispergaci nebo homogenizaci.

Kontaktujte nás! / Zeptejte se nás!

Ultrazvukové homogenizátory s vysokými smykovými silami se používají v laboratorním, stolním, pilotním a průmyslovém zpracování.

Hielscher Ultrasonics vyrábí vysoce výkonné ultrazvukové homogenizátory pro míchání, dispergaci, emulgaci a extrakci v laboratorním, pilotním a průmyslovém měřítku.

Související témata

Užitečná fakta o ultrazvukové syntéze peptidů

Co jsou peptidy?

Peptidy jsou sloučeniny, v nichž je více aminokyselin spojeno amidovými vazbami, tzv. peptidovými vazbami. Pokud jsou vázány ve složitých strukturách – obvykle tvořených 50 nebo více aminokyselinami –, označují se tyto velké peptidové struktury jako proteiny. Peptidy jsou základním stavebním kamenem života a plní v těle řadu funkcí.

Jak funguje syntéza peptidů?

V organické chemii, molekulární biologii a vědách o živé přírodě je syntéza peptidů procesem výroby peptidů. Peptidy se chemicky syntetizují kondenzační reakcí karboxylové skupiny jedné aminokyseliny s aminoskupinou jiné aminokyseliny. K zamezení nežádoucích vedlejších reakcí s různými postranními řetězci aminokyselin se obvykle používají strategie chránících skupin (též ochranných skupin).
Chemická (in vitro) syntéza peptidů nejčastěji začíná navázáním karboxylové skupiny přicházející aminokyseliny (C-konec) na N-konec rostoucího peptidového řetězce. Na rozdíl od této syntézy ve směru C→N probíhá přirozená biosyntéza proteinů dlouhých peptidů v živých organismech opačným směrem. To znamená, že při biosyntéze se N-konec přicházející aminokyseliny váže na C-konec proteinového řetězce (N→C).
Většina výzkumných a vývojových protokolů pro syntézu peptidů je založena na metodách na pevné fázi, zatímco metody syntézy v roztoku se uplatňují ve velkovýrobě peptidů v průmyslovém měřítku.

Jaký je současný stav techniky v syntéze peptidů?
SUS-SPPS (udržitelná ultrazvukem asistovaná SPPS) podle prokázaných výsledků zkracuje proces na pouhé dva kroky v každém cyklu (kombinované navázání/capping/deprotekce + jediné promytí), čímž výrazně snižuje spotřebu rozpouštědel i časovou náročnost. (srov. Mottola et al., 2025)
Ultrazvukem asistovaná TAPS je nově se rozvíjející kombinace s prokázaným úspěchem v totálních syntézách (např. lipobactin), kterou CDMO zkoumají pro výrobu API.
Objevte výhody ultrazvukem asistované syntézy peptidů s využitím TAGGING!
Kontinuální zpracování se zkoumá jako další vylepšení – byly popsány platformy kontinuální one-pot syntézy asistované silylovanými tagy.
Obor směřuje k principům zelené chemie, přičemž ultrazvuk i TAPS přispívají ke snížení spotřeby rozpouštědel, nižšímu množství činidel a lepší udržitelnosti.

Literatura / Reference

Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.

Vysoce výkonný ultrazvuk! Sortiment výrobků Hielscher pokrývá celé spektrum od kompaktních laboratorních ultrazvukových přístrojů přes stolní jednotky až po plně průmyslové ultrazvukové systémy.

Hielscher Ultrasonics vyrábí vysoce výkonné ultrazvukové homogenizátory od laboratorní po průmyslovou velikost.