Plazmidová příprava pomocí ultrazvuku

Ultrazvuku je spolehlivá technika fragmentace plazmid DNA. Přesně regulovatelná amplituda, režim pulzace a regulace teploty jsou nejdůležitějšími rysy ultrasonicator pro nepoškozování fragmentace plazmidu. Použití některých látek navíc pomáhá chránit před degradací plazmidu. Hielscher Ultrasonics nabízí různá řešení pro řízenou fragmentaci plazmidů z jednotlivých lahviček, současně sonikaci mnoha vzorků i desek s více jamkami. Další informace o úspěšné ultrazvukové fragmentaci plazmidů!

Žádost o informace





Ultrazvuková fragmentace DNA je spolehlivá a účinná technika běžně používaná v sekvenování nové generace (NGS)

The UIP400MTP umožňuje přesně řízenou ultrazvuku vícejamkových desek. Jednou z aplikací UIP400MTP je fragmentace plazmidové DNA za účelem získání fragmentů specificky cílené délky.

Plazmidové stříhání pomocí ultrazvuku

Když jsou vzorky DNA vystaveny ultrazvukovým vlnám, ultrazvukem generované vibrace vytvářejí akustickou kavitaci v kapalině, která stříhá nebo rozbíjí molekuly DNA s vysokou molekulovou hmotností mechanickými silami. Sonikace je nejpoužívanější metodou pro experimenty s hromadným stříháním DNA, včetně aplikací, jako je Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), pro které jsou malé velikosti fragmentů naprosto zásadní pro dosažení vysokého rozlišení. (srov. Tseng et al., 2012)
Plazmidová DNA (pDNA) je specifická forma DNA, charakterizovaná tvarem prstence a nachází se v bakteriích a některých eukaryotech.
Supercoiled pDNA je požadovaná forma plazmidové DNA, protože vykazuje nejlepší výsledky v procesech, jako je automatizované sekvenování a transfekce. Ultrazvuku je vhodné fragmentovat pDNA, včetně supercoiled pDNA, úspěšně.
Thompson et al. (2008) prokázali, že plazmidová sonikace, o které je známo, že fragmentuje supersouvřenou DNA, je účinným způsobem, jak zlepšit délku čtení sekvence phred20 do té míry, že se významně neliší od kontrolní šablony Beckmana Coultera nebo enzymaticky linearizovaných plazmidů.

Výhody ultrazvukové fragmentace DNA

  • Přesně kontrolovatelné
  • Reprodukovatelné výsledky
  • Nastavitelné podle cílových délek fragmentů DNA
  • regulace teploty
  • Škálovatelné na libovolnou velikost vzorku
Video ukazuje ultrazvukový systém přípravy vzorků UIP400MTP, který umožňuje spolehlivou přípravu vzorků všech standardních vícejamkových desek pomocí ultrazvuku s vysokou intenzitou. Typické aplikace UIP400MTP zahrnují buněčnou lýzu, DNA, RNA a stříhání chromatinu, stejně jako extrakci proteinů.

Ultrasonicator UIP400MTP pro více-well deskové použití ultrazvuku

Použití plazmidových vektorů

Plazmidy se často používají jako nástroje pro klonování, přenos a manipulaci s geny. Když se plazmidy používají experimentálně pro tyto účely, nazývají se vektory. Fragmenty DNA nebo geny mohou být vloženy do plazmidového vektoru, čímž vzniká takzvaný rekombinantní plazmid. Plazmidové vektory se používají jako nosiče k pohonu rekombinantní DNA do hostitelské buňky a jsou klíčovou složkou molekulárního klonování.
“Nevirové vektory jsou rozsáhle studovány pro jejich potenciální použití v genové terapii k léčbě různých komplikovaných onemocnění. Nevirové vektory chrání plazmidovou DNA před fyzikální, chemickou a enzymatickou degradací a dodávají molekulu DNA do cílového místa. Například kationtové liposomy, chitosan a další kladně nabité nanočástice tvoří komplexy s plazmidovou DNA prostřednictvím elektrostatických interakcí. Snadno vytvořené komplexy kationtových liposomů/plazmidové DNA jsou však relativně velké (tj. 300–400 nm) a heterogenní povahy, což ztěžuje jejich použití ve farmaceutických aplikacích. Velké a heterogenní plazmidové DNA / lipozomy, plazmidové DNA / aerosoly a plazmidové DNA / peptidy komplexy mohou být redukovány na menší a homogenní částice pomocí ultrazvuku.” (Sarker et al., 2019)
Prominentním příkladem použití plazmidových vektorů je CRISPR–Cas9. Systém CRISPR–Cas9 je obvykle dodáván do buněk jako jeden velký plazmid nebo několik menších plazmidů, které kódují cílovou sekvenci, vodítko CRISPR a Cas9.

Ultrazvuková příprava DNA nabitých PLGA nanočástic nanoprecipitací

Jo et al. (2020) použili poly(kyselinu mléčnou-ko-glykolovou) (PLGA) k vytvoření nosiče nanočástic pro dodávku modelu CRISPR–Cas9 plazmidu do primárních makrofágů odvozených z kostní dřeně. Pro nanoprecipitaci nanočástic PLGA byly použity PLGA se dvěma různými koncovými skupinami (esterové a aminové skupiny) s cílem, aby kladně nabité aminové koncové uzávěry zvýšily účinnost zapouzdření a zatížení v důsledku interakcí náboje mezi ním a záporně nabitou páteří DNA. V 50 ml polypropylenové kuželové odstředivkové trubici bylo 100 mg Pluronic F127 rozpuštěno ve 20 ml autoklávované DI vodě vírovým mícháním následovaným 30 minutami jemné sonikace pomocí ultrazvukové lázně (viz CupHorn). Byla přidána autoklávovaná magnetická míchací tyč a roztok byl míchán při 600 ot / min po dobu 30 minut, zatímco ostatní roztoky byly vyrobeny. Plastové laboratorní nádobí bylo použito místo skla, aby se minimalizovala nespecifická adsorpce DNA. Roztoky PLGA rozpuštěné v DMF (44,48 mg/ml) a TIPS pentacen rozpuštěné v THF (0,667 mg/ml) byly vyrobeny odděleně. PLGA byla ponechána v klidu vlhká v DMF po dobu 30 minut, než byla sonikována po dobu 30 minut. (úplný protokol viz Jo et al., 2020)

Související aplikace:

  • Extrakce DNA
  • Zapouzdření DNA
  • Disperze DNA potažené nanočásticemi
  • Dodávka plazmidové DNA do buněk
UP200St TD_CupHorn pro nepřímou použití ultrazvuku vzorků

UP200St CupHorn pro nepřímou sonikaci vzorků, např. Pro extrakci DNA a fragmentaci.

Žádost o informace





Ochrana plazmidové DNA během sonikace

DNA včetně plazmidů a supercákových plazmidů je vysoce citlivá degradace. Všechny dostupné metody fragmentace jsou známy určitými nevýhodami. Ultrazvuková fragmentace DNA je jednou z preferovaných metod, protože řízená sonikace v kombinaci s ochrannými opatřeními umožňuje snížit poškození řetězců DNA vyvolané smykem a teplem.
Kromě nastavení nízké amplitudy, pulzačního režimu a regulace teploty během ultrazvukového stříhání DNA vykazovalo použití některých látek významný ochranný účinek proti degradaci DNA. Například různé polymery, peptidy a lipidy chrání plazmidovou DNA během ultrazvuku.

Iontové kapaliny mohou chránit plazmidovou DNA před poškozením během sonikace.

Stabilita plazmidové DNA a plazmidových DNA/IL nanokomplexů proti ultrazvukovému smykovému stresu byla zkoumána pomocí testu elektroforézy agarózového gelu. Jak plazmidová DNA, tak plazmidové DNA / IL nanokomplexy byly vystaveny ultrazvukovému smykovému stresu pro různé časové body. Plazmidová DNA byla vystavena ultrazvukovému smykovému stresu po dobu 0, 10, 20, 30 a 40 minut. Nicméně, plazmid DNA / IL nanokomplexy byly vystaveny ultrazvukovému smykovému stresu po dobu 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 a 120 minut.
(studie a obrázek: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) prokázali, že když byly nanostruktury plazmidové DNA / iontové kapaliny (pDNA / IL) vystaveny ultrazvukovému smykovému stresu po dobu 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 a 120 minut a v komplexu s komerčně dostupným činidlem pro dodávání kationtových genů lipofectaminem, procento fluorescenčních pozitivních buněk bylo 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65 % a 50 % (viz graf níže). Procento fluorescenčních pozitivních buněk se zvýšilo, když byly nanostruktury vystaveny ultrazvukovému smykovému stresu po dobu 10 a 20 minut, a poté se pomalu snižovaly.

Ultrazvuková fragmentace plazmidové DNA

Vliv iontové kapaliny [Bmim][PF6] na dodávku plazmidové DNA do buněk COS7. Plazmidové DNA / IL (iontové kapaliny) nanokomplexy byly vystaveny ultrazvukovému smykovému stresu po dobu až 120 minut a komplexu s LA před dodáním do buněk COS7. Data ukazují průměrný počet (%) GFP pozitivních HeLa buněk počítaných v 10 různých mikroskopických polích a experiment byl proveden několikrát ve třech různých dnech. (Studie a graf: ©Sarker et al., 2019)

Plazmidová DNA může být chráněna přidáním činidla před ultrazvukovou fragmentací.

Plazmidová DNA může být chráněna přidáním činidla před ultrazvukovou fragmentací: Degradace nahé pDNA (A) a pDNA vyvolaná ultrazvukem s 1,5 mM CaCl2 a 20 % (v / v) t-butanolu (B)
Vzorky byly sonikovány 20W sondou po dobu až 120 s, jak je uvedeno v horní části každého pruhu. Pruh H odpovídá značce Hyperladder I ™️. Jsou indikována pásma PLAZMIDu OC a SC.
(studie a obrázky: ©Wu et al., 2009)

Ultrazvukový přípravek lyzátu

Ultrazvukový protokol lýzy buněk
Ultrasonicator UP200Ht s mikrotipem S26d2 pro ultrazvukovou lýzu biologických vzorkůZačněte obohaceným vzorkem buněk, který byl připraven metodou buněčné separace (např. imunomagnetická separace buněk, třídění buněk aktivované fluorescencí (FACS), centrifugace gradientu hustoty, izolace buněk imunodenzity).
Vzorky buněk musí vykazovat objem lyzačního pufru, který je vhodný pro experimentální cíl a ultrazvukový sondový typ.
Hypotonické pufry jsou upřednostňovány, protože zvyšují ultrazvukovou lýzu buněk. Je důležité, aby přísady a koncentrace soli byly používány vhodným způsobem.
Vyberte své ultrazvukové lyzační zařízení: Pro nepřímou sonikaci lahviček se doporučuje VialTweeter nebo CupHorn. Pro multiwell-desky, UIP400MTP je ideální ultrasonicator. A klasická sondová sonikace, ultrazvukový homogenizátor jako UP100H nebo UP200Ht s mikrokontipem jsou nejvhodnější.
Protokol pro sondu typu sonikace: Umístěte ultrazvukovou sondu do objemu vzorku v mikrocentrifugní trubici a sonikujte po dobu cca. 10 sekund. V závislosti na vzorku DNA může být sonikace opakována ještě jednou nebo dvakrát. Požadovaný ultrazvukový vstup energie (Ws / ml) závisí na viskozitě vzorku a typu DNA. Chlazení pomocí ledové lázně a pulzačního režimu ultrasonicator pomáhá zabránit tomu, aby byl vzorek tepelně degradován.
Po ultrazvukové lýze se vzorek odstředí, aby se oddělily zbytky pelet (obsahující nelyzované buňky, jádra a nelyzované organely)
Pokud není vzorek okamžitě dále zpracován, může být skladován při vhodné teplotě, aby byla zachována jeho životaschopnost.

Ultrasonicators pro fragmentaci DNA

Hielscher Ultrasonics nabízí různé ultrazvukové platformy pro FRAGMENTACI DNA, RNA a chromatinu. Tyto různé platformy zahrnují ultrazvukové sondy (sonotrody), nepřímé sonikační roztoky pro současnou přípravu vzorku více trubek nebo víceúčelových desek (např. desky 96-well, mikrotitrační desky), sonoreaktory a ultrazvukové cuphorny. Všechny platformy pro stříhání DNA jsou poháněny frekvenčními, vysoce výkonnými ultrazvukovými procesory, které jsou přesně kontrolovatelné a poskytují reprodukovatelné výsledky.

Ultrazvukové procesory pro jakékoli číslo vzorku a velikost

S Hielscherovými vícevzorkovými ultrasonicators VialTweeter (až pro 10 zkumavek) a UIP400MTP (pro mikrodestičky / vícejamkové desky) je snadné zkrátit dobu zpracování vzorku díky intenzivní a přesně kontrolovatelné ultrazvuku při současném získání požadované distribuce a výtěžnosti fragmentu DNA. Ultrazvuková fragmentace DNA činí kroky přípravy plazmidu efektivní, spolehlivé a škálovatelné. Protokoly lze lineárně škálovat z jednoho na mnoho vzorků použitím konstantních ultrazvukových parametrů.
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s lab ultrasonicators are available with different power levels so that you can choose the ideal ultrasonic disruptor for your DNA-related application.

The VialTweeter is a MultiSample Ultrasonicator that allows for reliable sample preparation under precisely controlled temperature conditions.

Ultrazvuková jednotka pro přípravu více vzorků VialTweeter umožňuje současnou použití ultrazvuku až 10 lahviček. S upnutým zařízením VialPress lze pro intenzivní použití ultrazvuku přitlačit až 4 další trubky dopředu.

přesné řízení procesu

Hielscher ultrasonicators mohou být dálkově ovládány pomocí ovládání prohlížeče. Parametry sonikace lze sledovat a přesně přizpůsobit požadavkům procesu.Přesné kontrolovatelné nastavení ultrazvuku je rozhodující, protože vyčerpávající sonifikace může zničit DNA, RNA a chromatin, ale nedostatečné ultrazvukové stříhání vede k příliš dlouhým fragmentům DNA a chromatinu. Hielscherovy digitální ultrasonicators lze snadno nastavit na přesný parametr ultrazvuku. Specifická nastavení ultrazvuku lze také uložit jako naprogramované nastavení pro rychlé opakování stejného postupu.
Veškerá použití ultrazvuku jsou automaticky protokolována a uložena jako soubor CSV na vestavěné SD kartě. To umožňuje přesnou dokumentaci provedených zkoušek a umožňuje snadno revidovat zvukové běhy.
Prostřednictvím dálkového ovládání prohlížeče lze všechny digitální ultrasonicators ovládat a monitorovat prostřednictvím jakéhokoli standardního prohlížeče. Instalace dalšího softwaru není nutná, protože připojení LAN je velmi jednoduché nastavení plug-n-play.

Nejvyšší uživatelská přívětivost během ultrazvukové přípravy DNA

Všechny Hielscher ultrasonicators jsou navrženy tak, aby poskytovaly vysoce výkonný ultrazvuk, a zároveň jsou vždy velmi uživatelsky přívětivé a snadno ovlyžovat. Všechna nastavení jsou dobře strukturovaná v jasné nabídce, ke které lze snadno přistupovat pomocí barevného dotykového displeje nebo dálkového ovládání prohlížeče. Chytrý software s programovatelným nastavením a automatickým záznamem dat zajišťuje optimální nastavení ultrazvuku pro spolehlivé a reprodukovatelné výsledky. Čisté a snadno ovladatelné rozhraní nabídky mění ultrasonicators Hielscher na uživatelsky přívětivá a účinná zařízení.
Níže uvedená tabulka vám dává informaci o přibližné kapacitě zpracování našich laboratorních ultrasonicators pro lýzu buněk a fragmentaci DNA:

Hromadná dávka průtok Doporučené Devices
vícejamkové desky není k dispozici UIP400MTP
injekční lahvičky, malá kádinka není k dispozici ultrazvukové cuphorn
až 10 injekčních lahviček není k dispozici VialTweeter
1 až 500 ml 10 až 200 ml / min UP100H
10 až 2000ml 20 až 400 ml / min Uf200 ः t, UP400St

Kontaktujte nás! / Zeptej se nás!

Požádejte o další informace

Použijte prosím níže uvedený formulář a vyžádejte si další informace o ultrazvukových homogenizátorech pro extrakci a fragmentaci DNA, aplikační protokoly a ceny. Rádi s vámi prodiskutujeme váš proces a nabídneme vám ultrazvukový systém splňující vaše požadavky!









Uvědomte si prosím naši Zásady ochrany osobních údajů,




Literatura / Reference

Fakta Worth Knowing

Co jsou plazmidy?
Plazmid je malá kruhová molekula DNA, která je fyzicky oddělena od chromozomální DNA a replikuje se nezávisle. Plazmidy jsou často spojovány s geny, které přispívají k přežití organismu a poskytují specifické výhody, např. rezistenci vůči antibiotikům. Plazmidy se nejčastěji vyskytují jako malé kruhové, dvouvláknové molekuly DNA v bakteriích; plazmidy jsou však někdy přítomny v archea a eukaryotických organismech. Plazmidy jsou důležitými nástroji v molekulární biologii, genetice, biochemii a vědě o životě. Plazmidy, známé jako vektory v genetickém inženýrství, se používají k replikaci nebo expresi určitých genů. Cílená změna vektoru se nazývá vektorový design.

Analýza GFP v buněčném výzkumu
Zelený fluorescenční protein (GFP) je univerzální biologický marker pro monitorování fyziologických procesů, vizualizaci lokalizace proteinů a detekci transgenní exprese in vivo. GFP může být excitován laserovou linkou 488 nm a je optimálně detekován při 510 nm.


Vysoce výkonný ultrazvuk! Hielscherův sortiment pokrývá celé spektrum od kompaktního laboratorního ultrasonicatoru přes bench-top jednotky až po plně průmyslové ultrazvukové systémy.

Hielscher Ultrasonics vyrábí vysoce výkonné ultrazvukové homogenizátory od Laboratoř na průmyslové velikosti.