Příprava plazmidů pomocí ultrazvukové sonikace

Ultrazvuková sonikace je spolehlivá technika fragmentace plazmidové DNA. Přesně regulovatelná amplituda, pulzní režim a regulace teploty jsou nejdůležitějšími vlastnostmi ultrazvukového přístroje pro fragmentaci plazmidů bez jejich poškození. Použití určitých činidel navíc pomáhá chránit plazmidy před degradací. Hielscher Ultrasonics nabízí různá řešení pro řízenou fragmentaci plazmidů – od jednotlivých lahviček přes současnou sonikaci mnoha vzorků až po multijamkové destičky. Zjistěte více o úspěšné ultrazvukové fragmentaci plazmidů!

Smykové štěpení plazmidů pomocí ultrazvukové sonikace

Když jsou vzorky DNA vystaveny ultrazvukovým vlnám, ultrazvukem generované vibrace vytvářejí v kapalině akustickou kavitaci, která mechanickými silami smykově štěpí nebo láme molekuly DNA s vysokou molekulovou hmotností. Sonikace je nejrozšířenější metodou pro experimenty hromadného smykového štěpení DNA, včetně aplikací, jako je imunoprecipitace chromatinu (ChIP), u nichž jsou malé velikosti fragmentů naprosto zásadní pro dosažení vysokého rozlišení. (srov. Tseng et al., 2012)
Plazmidová DNA (pDNA) je specifická forma DNA, charakterizovaná svým kruhovým tvarem, která se vyskytuje v bakteriích a některých eukaryotech.
Superhelikální pDNA je žádoucí formou plazmidové DNA, protože vykazuje nejlepší výsledky v navazujících procesech, jako je automatizované sekvenování a transfekce. Ultrazvuková sonikace je vhodná k úspěšné fragmentaci pDNA, včetně superhelikální pDNA.
Thompson et al. (2008) prokázali, že sonikace plazmidů, o níž je známo, že fragmentuje superhelikální DNA, je účinným způsobem, jak prodloužit délky čtení sekvence phred20 do té míry, že se významně neliší od kontrolního templátu společnosti Beckman Coulter nebo od enzymaticky linearizovaných plazmidů.

Použití plazmidových vektorů

Plazmidy se často používají jako nástroje ke klonování, přenosu a manipulaci s geny. Když se plazmidy pro tyto účely používají experimentálně, nazývají se vektory. Fragmenty DNA nebo geny lze vložit do plazmidového vektoru, čímž vznikne tzv. rekombinantní plazmid. Plazmidové vektory slouží jako nosiče k vnesení rekombinantní DNA do hostitelské buňky a jsou klíčovou součástí molekulárního klonování.
„Nevirové vektory jsou intenzivně studovány pro své potenciální využití v genové terapii k léčbě různých komplikovaných onemocnění. Nevirové vektory chrání plazmidovou DNA před fyzikální, chemickou a enzymatickou degradací a dopravují molekulu DNA do cílového místa. Například kationtové liposomy, chitosan a další kladně nabité nanočástice tvoří s plazmidovou DNA komplexy prostřednictvím elektrostatických interakcí. Snadno vznikající komplexy kationtové liposomy/plazmidová DNA jsou však relativně velké (tj. 300–400 nm) a svou povahou heterogenní, což ztěžuje jejich použití ve farmaceutických aplikacích. Velké a heterogenní komplexy plazmidová DNA/liposomy, plazmidová DNA/aerosoly a plazmidová DNA/peptidy lze pomocí ultrazvukové sonikace zmenšit na menší a homogenní částice.“ (Sarker et al., 2019)
Významným příkladem použití plazmidových vektorů je CRISPR–Cas9. Systém CRISPR–Cas9 se do buněk obvykle dopravuje jako jeden velký plazmid nebo několik menších plazmidů, které kódují cílovou sekvenci, vodicí složku CRISPR a Cas9.

Ultrazvuková příprava nanočástic PLGA nesoucích DNA nanoprecipitací

Jo et al. (2020) použili poly(kyselinu mléčnou-co-glykolovou) (PLGA) k vytvoření nanočásticového nosiče pro dodání modelového plazmidu CRISPR–Cas9 do primárních makrofágů odvozených z kostní dřeně. Pro nanoprecipitaci nanočástic PLGA byla použita PLGA se dvěma různými koncovými skupinami (esterovými a aminovými skupinami) s cílem, aby kladně nabité aminové koncové skupiny zvýšily účinnost enkapsulace a míru naložení díky nábojovým interakcím mezi nimi a záporně nabitou páteří DNA. V 50 mL polypropylenové kónické centrifugační zkumavce bylo 100 mg Pluronic F127 rozpuštěno ve 20 mL autoklávované deionizované (DI) vody vortexováním a následně 30 min šetrnou sonikací v ultrazvukové lázni (viz CupHorn). Byla přidána autoklávovaná magnetická míchací tyčinka a roztok byl míchán při 600 RPM po dobu 30 min, zatímco se připravovaly ostatní roztoky. Po celou dobu bylo místo skla používáno plastové laboratorní vybavení, aby se minimalizovala nespecifická adsorpce DNA. Odděleně byly připraveny roztoky PLGA rozpuštěné v DMF (44,48 mg/ ml) a TIPS pentacenu rozpuštěného v THF (0,667 mg/ml). PLGA byla ponechána 30 min v klidu smáčet v DMF a poté byla 30 min sonikována. (úplný protokol viz Jo et al., 2020)

Ochrana plazmidové DNA během sonikace

DNA včetně plazmidů a superhelikálních plazmidů je vysoce citlivá na degradaci. U všech dostupných metod fragmentace jsou známy určité nevýhody. Ultrazvuková fragmentace DNA patří mezi preferované metody, protože řízená sonikace v kombinaci s ochrannými opatřeními umožňuje omezit poškození řetězců DNA vyvolané smykem a teplem.
Kromě nízkého nastavení amplitudy, pulzního režimu a regulace teploty během ultrazvukového smykového štěpení DNA vykazovalo použití určitých činidel významný ochranný účinek proti degradaci DNA. Například různé polymery, peptidy a lipidy chrání plazmidovou DNA během ultrazvukové sonikace.

Stabilita plazmidové DNA a nanokomplexů plazmidová DNA/IL vůči ultrazvukovému smykovému namáhání byla zkoumána pomocí elektroforézy v agarózovém gelu. Plazmidová DNA i nanokomplexy plazmidová DNA/IL byly vystaveny ultrazvukovému smykovému namáhání po různě dlouhou dobu. Plazmidová DNA byla vystavena ultrazvukovému smykovému namáhání po dobu 0, 10, 20, 30 a 40 minut. Nanokomplexy plazmidová DNA/IL však byly vystaveny ultrazvukovému smykovému namáhání po dobu 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 a 120 minut.
(studie a obrázek: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) prokázali, že když byly nanostruktury plazmidová DNA / iontová kapalina (pDNA/IL) vystaveny ultrazvukovému smykovému namáhání po dobu 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 a 120 min a komplexovány s komerčně dostupným kationtovým činidlem pro dodávání genů lipofectaminem, podíl fluorescenčně pozitivních buněk činil v uvedeném pořadí 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% a 50% (viz graf níže). Podíl fluorescenčně pozitivních buněk se zvýšil, když byly nanostruktury vystaveny ultrazvukovému smykovému namáhání po dobu 10 a 20 min, a poté pomalu klesal.

Vliv iontové kapaliny [Bmim][PF6] na dodání plazmidové DNA do buněk COS7. Nanokomplexy plazmidová DNA/IL (iontová kapalina) byly vystaveny ultrazvukovému smykovému namáhání po dobu až 120 minut a před dodáním do buněk COS7 komplexovány s LA. Data ukazují průměrný počet (%) GFP pozitivních buněk HeLa spočítaných v 10 různých mikroskopických polích; experiment byl proveden opakovaně ve třech různých dnech. (Studie a graf: ©Sarker et al., 2019)

Ultrazvuková příprava lyzátu

Protokol ultrazvukové lyze buněk
Začněte s obohaceným vzorkem buněk, který byl připraven metodou separace buněk (např. imunomagnetická separace buněk, fluorescenčně aktivované třídění buněk (FACS), centrifugace v hustotním gradientu, imunodenzitní izolace buněk).
Vzorky buněk musí obsahovat takový objem lyzačního pufru, který odpovídá experimentálnímu cíli a sondovému ultrazvukovému přístroji.
Upřednostňují se hypotonické pufry, protože zesilují ultrazvukovou lyzi buněk. Je důležité, aby aditiva a koncentrace solí byly použity vhodným způsobem.
Zvolte si ultrazvukový přístroj pro lyzi: Pro nepřímou sonikaci lahviček se doporučuje VialTweeter nebo CupHorn. Pro multijamkové destičky je ideálním ultrazvukovým přístrojem UIP400MTP. A pro klasickou sondovou sonikaci je nejvhodnější ultrazvukový homogenizátor, jako je UP100H nebo UP200Ht s mikrohrotem.
Protokol pro sondovou sonikaci: Vložte sondu ultrazvukového přístroje do objemu vzorku v mikrocentrifugační zkumavce a sonikujte přibližně 10 sekund. V závislosti na vzorku DNA může být sonikace zopakována ještě jednou nebo dvakrát. Potřebný vstup ultrazvukové energie (Ws/mL) závisí na viskozitě vzorku a typu DNA. Chlazení v ledové lázni a pulzní režim ultrazvukového přístroje pomáhají zabránit tepelné degradaci vzorku.
Po ultrazvukové lyzi se vzorek centrifuguje, aby se oddělily zbytky v peletě (obsahující nelyzované buňky, jádra a nelyzované organely)
Pokud vzorek není ihned dále zpracován, lze jej uchovávat při vhodné teplotě, aby se zachovala jeho viabilita.

Ultrazvukové přístroje pro fragmentaci DNA

Hielscher Ultrasonics nabízí různé platformy založené na ultrazvuku pro fragmentaci DNA, RNA a chromatinu. Tyto různé platformy zahrnují ultrazvukové sondy (sonotrody), řešení nepřímé sonikace pro současnou přípravu vzorků ve více zkumavkách nebo multijamkových destičkách (např. 96jamkových destičkách, mikrotitračních destičkách), sonoreaktory a ultrazvukové cuphorny. Všechny platformy pro smykové štěpení DNA jsou poháněny frekvenčně laděnými vysoce výkonnými ultrazvukovými procesory, které jsou přesně regulovatelné a poskytují reprodukovatelné výsledky.

Ultrazvukové procesory pro jakýkoli počet a velikost vzorků

S multivzorkovými ultrazvukovými přístroji Hielscher VialTweeter (až pro 10 zkumavek) a UIP400MTP (pro mikrodestičky/ multijamkové destičky) lze díky intenzivní a přesně regulovatelné ultrazvukové sonikaci snadno zkrátit dobu zpracování vzorků při současném dosažení požadované distribuce velikosti fragmentů DNA a výtěžku. Ultrazvuková fragmentace DNA činí kroky přípravy plazmidů účinnými, spolehlivými a škálovatelnými. Protokoly lze lineárně škálovat z jednoho na mnoho vzorků použitím konstantních parametrů ultrazvuku.
Sondové ultrazvukové přístroje s jedním až pěti prsty jsou ideální pro přípravu menšího počtu vzorků. Laboratorní ultrazvukové přístroje Hielscher jsou k dispozici s různými úrovněmi výkonu, takže si můžete zvolit ideální ultrazvukový dezintegrátor pro svou aplikaci související s DNA.