Ultrazvuku je spolehlivá technika fragmentace plazmid DNA. Přesně regulovatelná amplituda, režim pulzace a regulace teploty jsou nejdůležitějšími rysy ultrasonicator pro nepoškozování fragmentace plazmidu. Použití některých látek navíc pomáhá chránit před degradací plazmidu. Hielscher Ultrasonics nabízí různá řešení pro řízenou fragmentaci plazmidů z jednotlivých lahviček, současně sonikaci mnoha vzorků i desek s více jamkami. Další informace o úspěšné ultrazvukové fragmentaci plazmidů!

Plazmidové stříhání pomocí ultrazvuku

Když jsou vzorky DNA vystaveny ultrazvukovým vlnám, ultrazvukem generované vibrace vytvářejí akustickou kavitaci v kapalině, která stříhá nebo rozbíjí molekuly DNA s vysokou molekulovou hmotností mechanickými silami. Sonikace je nejpoužívanější metodou pro experimenty s hromadným stříháním DNA, včetně aplikací, jako je Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), pro které jsou malé velikosti fragmentů naprosto zásadní pro dosažení vysokého rozlišení. (srov. Tseng et al., 2012)
Plazmidová DNA (pDNA) je specifická forma DNA, charakterizovaná tvarem prstence a nachází se v bakteriích a některých eukaryotech.
Supercoiled pDNA je požadovaná forma plazmidové DNA, protože vykazuje nejlepší výsledky v procesech, jako je automatizované sekvenování a transfekce. Ultrazvuku je vhodné fragmentovat pDNA, včetně supercoiled pDNA, úspěšně.
Thompson et al. (2008) prokázali, že plazmidová sonikace, o které je známo, že fragmentuje supersouvřenou DNA, je účinným způsobem, jak zlepšit délku čtení sekvence phred20 do té míry, že se významně neliší od kontrolní šablony Beckmana Coultera nebo enzymaticky linearizovaných plazmidů.

Použití plazmidových vektorů

Plazmidy se často používají jako nástroje pro klonování, přenos a manipulaci s geny. Když se plazmidy používají experimentálně pro tyto účely, nazývají se vektory. Fragmenty DNA nebo geny mohou být vloženy do plazmidového vektoru, čímž vzniká takzvaný rekombinantní plazmid. Plazmidové vektory se používají jako nosiče k pohonu rekombinantní DNA do hostitelské buňky a jsou klíčovou složkou molekulárního klonování.
“Nevirové vektory jsou rozsáhle studovány pro jejich potenciální použití v genové terapii k léčbě různých komplikovaných onemocnění. Nevirové vektory chrání plazmidovou DNA před fyzikální, chemickou a enzymatickou degradací a dodávají molekulu DNA do cílového místa. Například kationtové liposomy, chitosan a další kladně nabité nanočástice tvoří komplexy s plazmidovou DNA prostřednictvím elektrostatických interakcí. Snadno vytvořené komplexy kationtových liposomů/plazmidové DNA jsou však relativně velké (tj. 300–400 nm) a heterogenní povahy, což ztěžuje jejich použití ve farmaceutických aplikacích. Velké a heterogenní plazmidové DNA / lipozomy, plazmidové DNA / aerosoly a plazmidové DNA / peptidy komplexy mohou být redukovány na menší a homogenní částice pomocí ultrazvuku.” (Sarker et al., 2019)
Prominentním příkladem použití plazmidových vektorů je CRISPR–Cas9. Systém CRISPR–Cas9 je obvykle dodáván do buněk jako jeden velký plazmid nebo několik menších plazmidů, které kódují cílovou sekvenci, vodítko CRISPR a Cas9.

Ultrazvuková příprava DNA nabitých PLGA nanočástic nanoprecipitací

Jo et al. (2020) použili poly(kyselinu mléčnou-ko-glykolovou) (PLGA) k vytvoření nosiče nanočástic pro dodávku modelu CRISPR–Cas9 plazmidu do primárních makrofágů odvozených z kostní dřeně. Pro nanoprecipitaci nanočástic PLGA byly použity PLGA se dvěma různými koncovými skupinami (esterové a aminové skupiny) s cílem, aby kladně nabité aminové koncové uzávěry zvýšily účinnost zapouzdření a zatížení v důsledku interakcí náboje mezi ním a záporně nabitou páteří DNA. V 50 ml polypropylenové kuželové odstředivkové trubici bylo 100 mg Pluronic F127 rozpuštěno ve 20 ml autoklávované DI vodě vírovým mícháním následovaným 30 minutami jemné sonikace pomocí ultrazvukové lázně (viz CupHorn). Byla přidána autoklávovaná magnetická míchací tyč a roztok byl míchán při 600 ot / min po dobu 30 minut, zatímco ostatní roztoky byly vyrobeny. Plastové laboratorní nádobí bylo použito místo skla, aby se minimalizovala nespecifická adsorpce DNA. Roztoky PLGA rozpuštěné v DMF (44,48 mg/ml) a TIPS pentacen rozpuštěné v THF (0,667 mg/ml) byly vyrobeny odděleně. PLGA byla ponechána v klidu vlhká v DMF po dobu 30 minut, než byla sonikována po dobu 30 minut. (úplný protokol viz Jo et al., 2020)

Ochrana plazmidové DNA během sonikace

DNA včetně plazmidů a supercákových plazmidů je vysoce citlivá degradace. Všechny dostupné metody fragmentace jsou známy určitými nevýhodami. Ultrazvuková fragmentace DNA je jednou z preferovaných metod, protože řízená sonikace v kombinaci s ochrannými opatřeními umožňuje snížit poškození řetězců DNA vyvolané smykem a teplem.
Kromě nastavení nízké amplitudy, pulzačního režimu a regulace teploty během ultrazvukového stříhání DNA vykazovalo použití některých látek významný ochranný účinek proti degradaci DNA. Například různé polymery, peptidy a lipidy chrání plazmidovou DNA během ultrazvuku.

Stabilita plazmidové DNA a plazmidových DNA/IL nanokomplexů proti ultrazvukovému smykovému stresu byla zkoumána pomocí testu elektroforézy agarózového gelu. Jak plazmidová DNA, tak plazmidové DNA / IL nanokomplexy byly vystaveny ultrazvukovému smykovému stresu pro různé časové body. Plazmidová DNA byla vystavena ultrazvukovému smykovému stresu po dobu 0, 10, 20, 30 a 40 minut. Nicméně, plazmid DNA / IL nanokomplexy byly vystaveny ultrazvukovému smykovému stresu po dobu 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 a 120 minut.
(studie a obrázek: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) prokázali, že když byly nanostruktury plazmidové DNA / iontové kapaliny (pDNA / IL) vystaveny ultrazvukovému smykovému stresu po dobu 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 a 120 minut a v komplexu s komerčně dostupným činidlem pro dodávání kationtových genů lipofectaminem, procento fluorescenčních pozitivních buněk bylo 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65 % a 50 % (viz graf níže). Procento fluorescenčních pozitivních buněk se zvýšilo, když byly nanostruktury vystaveny ultrazvukovému smykovému stresu po dobu 10 a 20 minut, a poté se pomalu snižovaly.

Vliv iontové kapaliny [Bmim][PF6] na dodávku plazmidové DNA do buněk COS7. Plazmidové DNA / IL (iontové kapaliny) nanokomplexy byly vystaveny ultrazvukovému smykovému stresu po dobu až 120 minut a komplexu s LA před dodáním do buněk COS7. Data ukazují průměrný počet (%) GFP pozitivních HeLa buněk počítaných v 10 různých mikroskopických polích a experiment byl proveden několikrát ve třech různých dnech. (Studie a graf: ©Sarker et al., 2019)

Ultrazvukový přípravek lyzátu

Ultrazvukový protokol lýzy buněk
Začněte obohaceným vzorkem buněk, který byl připraven metodou buněčné separace (např. imunomagnetická separace buněk, třídění buněk aktivované fluorescencí (FACS), centrifugace gradientu hustoty, izolace buněk imunodenzity).
Vzorky buněk musí vykazovat objem lyzačního pufru, který je vhodný pro experimentální cíl a ultrazvukový sondový typ.
Hypotonické pufry jsou upřednostňovány, protože zvyšují ultrazvukovou lýzu buněk. Je důležité, aby přísady a koncentrace soli byly používány vhodným způsobem.
Vyberte své ultrazvukové lyzační zařízení: Pro nepřímou sonikaci lahviček se doporučuje VialTweeter nebo CupHorn. Pro multiwell-desky, UIP400MTP je ideální ultrasonicator. A klasická sondová sonikace, ultrazvukový homogenizátor jako UP100H nebo UP200Ht s mikrokontipem jsou nejvhodnější.
Protokol pro sondu typu sonikace: Umístěte ultrazvukovou sondu do objemu vzorku v mikrocentrifugní trubici a sonikujte po dobu cca. 10 sekund. V závislosti na vzorku DNA může být sonikace opakována ještě jednou nebo dvakrát. Požadovaný ultrazvukový vstup energie (Ws / ml) závisí na viskozitě vzorku a typu DNA. Chlazení pomocí ledové lázně a pulzačního režimu ultrasonicator pomáhá zabránit tomu, aby byl vzorek tepelně degradován.
Po ultrazvukové lýze se vzorek odstředí, aby se oddělily zbytky pelet (obsahující nelyzované buňky, jádra a nelyzované organely)
Pokud není vzorek okamžitě dále zpracován, může být skladován při vhodné teplotě, aby byla zachována jeho životaschopnost.

Ultrasonicators pro fragmentaci DNA

Hielscher Ultrasonics nabízí různé ultrazvukové platformy pro FRAGMENTACI DNA, RNA a chromatinu. Tyto různé platformy zahrnují ultrazvukové sondy (sonotrody), nepřímé sonikační roztoky pro současnou přípravu vzorku více trubek nebo víceúčelových desek (např. desky 96-well, mikrotitrační desky), sonoreaktory a ultrazvukové cuphorny. Všechny platformy pro stříhání DNA jsou poháněny frekvenčními, vysoce výkonnými ultrazvukovými procesory, které jsou přesně kontrolovatelné a poskytují reprodukovatelné výsledky.

Ultrazvukové procesory pro jakékoli číslo vzorku a velikost

S Hielscherovými vícevzorkovými ultrasonicators VialTweeter (až pro 10 zkumavek) a UIP400MTP (pro mikrodestičky / vícejamkové desky) je snadné zkrátit dobu zpracování vzorku díky intenzivní a přesně kontrolovatelné ultrazvuku při současném získání požadované distribuce a výtěžnosti fragmentu DNA. Ultrazvuková fragmentace DNA činí kroky přípravy plazmidu efektivní, spolehlivé a škálovatelné. Protokoly lze lineárně škálovat z jednoho na mnoho vzorků použitím konstantních ultrazvukových parametrů.
Sondy ultrasonicators s jedním až pěti prsty jsou ideální pro přípravu menších počtu vzorků. Hielscherovy laboratorní ultrasonicators jsou k dispozici s různými úrovněmi výkonu, takže si můžete vybrat ideální ultrazvukový disruptor pro vaši aplikaci související s DNA.