Příprava plazmidu pomocí ultrazvuku

Ultrazvuku je spolehlivá technika fragmentace plazmidové DNA. Přesně regulovatelná amplituda, pulzační režim a regulace teploty jsou nejdůležitějšími vlastnostmi ultrazvuku pro nepoškozující fragmentaci plazmidu. Kromě toho použití určitých látek pomáhá chránit před degradací plazmidů. Hielscher Ultrasonics nabízí různá řešení pro řízenou fragmentaci plazmidů z jednotlivých lahviček, současně sonikace mnoha vzorků, stejně jako vícejamkové destičky. Zjistěte více o úspěšné fragmentaci ultrazvukového plazmidu!

Stříhání plazmidů pomocí ultrazvuku

Když jsou vzorky DNA vystaveny ultrazvukovým vlnám, ultrazvukem generované vibrace vytvářejí akustickou kavitaci v kapalině, která stříhá nebo láme molekuly DNA s vysokou molekulovou hmotností prostřednictvím mechanických sil. Sonikace je nejrozšířenější metodou pro experimenty s hromadným stříháním DNA, včetně aplikací, jako je imunoprecipitace chromatinu (ChIP), pro kterou jsou malé velikosti fragmentů naprosto zásadní pro dosažení vysokého rozlišení. (srov. Tseng et al., 2012)
Plazmidová DNA (pDNA) je specifická forma DNA, která se vyznačuje prstencovým tvarem a nachází se u bakterií a některých eukaryot.
Supercoiled pDNA je požadovanou formou plazmidové DNA, protože vykazuje nejlepší výsledky v navazujících procesech, jako je automatizované sekvenování a transfekce. Ultrazvuku je vhodný k úspěšné fragmentaci pDNA, včetně nadšroubovicové pDNA.
Thompson et al. (2008) prokázali, že plazmidová sonikace, o které je známo, že fragmentuje nadšroubovicovou DNA, je účinným způsobem, jak zlepšit délky čtení sekvence phred20 do té míry, že se významně neliší od kontrolní šablony Beckmana Coultera nebo enzymaticky linearizovaných plazmidů.

Použití plazmidových vektorů

Plazmidy se často používají jako nástroje pro klonování, přenos a manipulaci s geny. Když se plazmidy pro tyto účely experimentálně používají, nazývají se vektory. Fragmenty DNA nebo geny mohou být vloženy do plazmidového vektoru a vytvořit tak tzv. rekombinantní plazmid. Plazmidové vektory se používají jako nosiče k pohonu rekombinantní DNA do hostitelské buňky a jsou klíčovou součástí molekulárního klonování.
“Nevirové vektory jsou rozsáhle studovány pro jejich potenciální využití v genové terapii k léčbě různých komplikovaných onemocnění. Nevirové vektory chrání plazmidovou DNA před fyzikální, chemickou a enzymatickou degradací a doručují molekulu DNA do cílového místa. Například kationtové liposomy, chitosan a další kladně nabité nanočástice tvoří komplexy s plazmidovou DNA prostřednictvím elektrostatických interakcí. Snadno se tvořící komplexy kationtových lipozomů/plazmidové DNA jsou však relativně velké (tj. 300–400 nm) a heterogenní povahy, což ztěžuje jejich použití ve farmaceutických aplikacích. Velké a heterogenní plazmidové DNA/liposomy, plazmidové DNA/aerosoly a plazmidové DNA/peptidové komplexy lze redukovat na menší a homogenní částice pomocí ultrazvuku.” (Sarker et al., 2019)
Významným příkladem použití plazmidových vektorů je CRISPR–Cas9. Systém CRISPR-Cas9 je obvykle dodáván do buněk jako jeden velký plazmid nebo více menších plazmidů, které kódují cílovou sekvenci, průvodce CRISPR a Cas9.

Ultrazvuková příprava DNA-nabitých PLGA nanočástic pomocí nanoprecipitace

Jo et al. (2020) použili poly(mléčno-ko-glykolovou kyselinu) (PLGA) k vytvoření nosiče nanočástic pro dodání modelového plazmidu CRISPR-Cas9 do primárních makrofágů odvozených z kostní dřeně. Pro nanoprecipitaci nanočástic PLGA byly použity PLGA se dvěma různými koncovými skupinami (esterové a aminové skupiny) s cílem, aby kladně nabité aminové koncovky zvýšily účinnost zapouzdření a zatížení v důsledku interakcí náboje mezi ním a záporně nabitou páteří DNA. V 50 ml polypropylenové kónické centrifugační zkumavce byl 100 mg Pluronic F127 rozpuštěn ve 20 ml autoklávované DI vody vírovým mícháním, po kterém následovalo 30 minut jemné sonikace pomocí ultrazvukové lázně (viz CupHorn). Byla přidána autoklávovaná magnetická míchací tyč a roztok byl míchán při 600 otáčkách za minutu po dobu 30 minut, zatímco byly připravovány ostatní roztoky. Místo skla bylo použito plastové laboratorní nádobí, aby se minimalizovala nespecifická adsorpce DNA. Samostatně byly připraveny roztoky PLGA rozpuštěné v DMF (44,48 mg/ml) a TIPS pentacenu rozpuštěné v THF (0,667 mg/ml). PLGA byla ponechána v klidu navlhčit v DMF po dobu 30 minut, než byla sonikována po dobu 30 minut. (úplný protokol viz Jo et al., 2020)

Ochrana plazmidové DNA během sonikace

DNA včetně plazmidů a nadšroubovicových plazmidů je vysoce citlivá degradace. Všechny dostupné metody fragmentace jsou známy pro určité nevýhody. Ultrazvuková fragmentace DNA je jednou z preferovaných metod, protože řízená sonikace v kombinaci s ochrannými opatřeními umožňuje snížit poškození řetězců DNA vyvolané smykem a teplem.
Kromě nastavení nízké amplitudy, pulzačního režimu a řízení teploty během ultrazvukového stříhání DNA vykazovalo použití určitých látek významný ochranný účinek proti degradaci DNA. Například různé polymery, peptidy a lipidy chrání plazmidovou DNA během ultrazvuku.

Stabilita plazmidové DNA a plazmidových DNA/IL nanokomplexů proti ultrazvukovému smykovému stresu byla zkoumána pomocí testu elektroforézy na agarózovém gelu. Jak plazmidová DNA, tak plazmidové DNA/IL nanokomplexy byly vystaveny ultrazvukovému smykovému napětí v různých časových bodech. Plazmidová DNA byla vystavena ultrazvukovému smykovému napětí po dobu 0, 10, 20, 30 a 40 minut. Plazmidové DNA/IL nanokomplexy však byly vystaveny ultrazvukovému smykovému stresu po dobu 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 a 120 minut.
(studie a obrázek: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) prokázali, že když byly nanostruktury plazmidové DNA / iontové kapaliny (pDNA/IL) vystaveny ultrazvukovému smykovému napětí po dobu 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 a 120 minut a byly spojeny s komerčně dostupným kationtovým činidlem pro dodávání genů lipofektaminem, procento fluorescenčních pozitivních buněk bylo 80 %, 98 %, 97 %, 85 %, 78 %, 65 %, 65 %, resp. 50 % (viz graf níže). Procento fluorescenčních pozitivních buněk se zvýšilo, když byly nanostruktury vystaveny ultrazvukovému smykovému napětí po dobu 10 a 20 minut, a poté pomalu klesalo.

Vliv iontové kapaliny [Bmim][PF6] na doručení plazmidové DNA do buněk COS7. Plazmidové DNA/IL (iontové kapalné) nanokomplexy byly vystaveny ultrazvukovému smykovému stresu po dobu až 120 minut a před dodáním do buněk COS7 byly spojeny s LA. Data ukazují průměrný počet (%) GFP pozitivních HeLa buněk spočítaných v 10 různých mikroskopických polích a experiment byl proveden několikrát ve třech různých dnech. (Studie a graf: ©Sarker et al., 2019)

Ultrazvuková příprava lyzátu

Ultrazvukový protokol lýzy buněk
Začněte s obohaceným vzorkem buněk, který byl připraven metodou buněčné separace (např. imunomagnetická separace buněk, fluorescenčně aktivované třídění buněk (FACS), centrifugace s hustotním gradientem, izolace buněk s imunohustotou).
Vzorky buněk musí vykazovat objem lytického pufru, který je vhodný pro experimentální cíl a ultrazvuk typu sondy.
Upřednostňují se hypotonické pufry, protože zvyšují ultrazvukovou lýzu buněk. Je důležité, aby přísady a koncentrace soli byly používány vhodným způsobem.
Vyberte si ultrazvukové lýzové zařízení: Pro nepřímou sonikaci lahviček se doporučuje VialTweeter nebo CupHorn. Pro vícejamkové desky je UIP400MTP ideálním ultrasonicatorem. A klasická sonizace typu sondy, ultrazvukový homogenizátor jako UP100H nebo UP200Ht s mikrohrotem jsou nejvhodnější.
Protokol pro sonikaci typu sondy: Umístěte sondu ultrasonicator do objemu vzorku v mikrocentrifugační zkumavce a sonikujte po dobu cca. 10 sekund. V závislosti na vzorku DNA může být sonikace opakována ještě jednou nebo dvakrát. Požadovaný vstup ultrazvukové energie (Ws/ml) závisí na viskozitě vzorku a typu DNA. Chlazení pomocí ledové lázně a pulzačního režimu ultrasonicator pomáhá zabránit tepelné degradaci vzorku.
Po ultrazvukové lýze se vzorek odstředí, aby se oddělily zbytky pelet (obsahující nelyzované buňky, jádra a nelyzované organely)
Pokud není vzorek okamžitě dále zpracováván, může být skladován při vhodné teplotě, aby byla zachována jeho životaschopnost.

Ultrasonicators pro fragmentaci DNA

Hielscher Ultrasonics nabízí různé platformy založené na ultrazvuku pro fragmentaci DNA, RNA a chromatinu. Tyto různé platformy zahrnují ultrazvukové sondy (sonotrody), nepřímá sonikační řešení pro současnou přípravu vzorků více zkumavek nebo vícejamkových destiček (např. 96jamkové destičky, mikrotitrační desky), sonoreaktory a ultrazvukové cuphorny. Všechny platformy pro stříhání DNA jsou poháněny frekvenčně laděnými, vysoce výkonnými ultrazvukovými procesory, které jsou přesně ovladatelné a poskytují reprodukovatelné výsledky.

Ultrazvukové procesory pro libovolný počet a velikost vzorku

S Hielscherovými vícevzorkovými ultrasonicators VialTweeter (až pro 10 zkumavek) a UIP400MTP (pro mikrodestičky / vícejamkové desky) je snadno možné zkrátit dobu zpracování vzorku v důsledku intenzivní a přesně kontrolovatelné ultrazvuku při získávání požadované distribuce velikosti fragmentů DNA a výtěžku. Díky ultrazvukové fragmentaci DNA jsou kroky přípravy plazmidů efektivní, spolehlivé a škálovatelné. Protokoly lze lineárně škálovat od jednoho po více vzorků použitím konstantních ultrazvukových parametrů.
Sonda ultrasonicators s jedním až pěti prsty jsou ideální pro přípravu menších počtů vzorků. Hielscherovy laboratorní ultrasonicators jsou k dispozici s různými úrovněmi výkonu, takže si můžete vybrat ideální ultrazvukový disruptor pro vaši aplikaci související s DNA.