Ekstrakcija proteina uz pomoć sonifikacije iz tumorskog tkiva – Protokol

Ovaj protokol opisuje metodu ekstrakcije proteina uz pomoć sonifikacije za tumorsko tkivo koja unapređuje standardni CPTAC proces lize uree dodavanjem kontrolisanog koraka sonifikacije tokom poremećaja tkiva. Nadovezujući se na uspostavljenu strategiju pripreme proteoma i fosfoproteoma u dubokom obimu, ova modifikacija poboljšava poremećaj ćelijske i subćelijske strukture, smanjuje viskoznost uzorka i pojačava oslobađanje proteina koji su obično teže za oporavak samo lizom uree, posebno proteina vezanih za membranu i vezanih za DNK ili proteina povezanih sa jezgrom. U osnovnoj studiji, radni tok uz pomoć sonifikacije povećao je detekciju i proteina i fosfopeptida, uz očuvanje kompatibilnosti sa CPTAC-stilom digestije, TMT označavanjem, frakcionacijom, obogaćivanjem fosfopeptida i LC-MS/MS analizom.

Ekstrakcija proteina uz pomoć sonifikacije iz tumorskog tkiva za dubinsku proteomsku i fosfoproteomsku analizu

The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.

Područje primjene protokola

Koristite ovu proceduru za:

• Svježe zamrznuto, kriopulverizirano tumorsko tkivo
• Ćelijski peleti ili drugi biološki uzorci gdje je ekstrakcija na bazi uree već uspostavljena
• Globalni radni tokovi proteomike i fosfoproteomike koristeći triptičnu digestiju i opcionalno označavanje TMT-a

Studija Li i saradnika (2025) navodi da je radni tok primjenjiv i na druge tipove uzoraka kao što su ćelijske linije, krv i urin, ali optimizacija može biti potrebna prema tipu uzorka.

Optimiziran radni tok pripreme uzorka sa implementiranim korakom sonifikacije. Optimizirani radni tok i eksperimentalni dizajn zasnovani su na CPTAC protokolu za pripremu uzoraka za globalnu proteomsku i fosfoproteomsku analizu.
Studija i šema: ©Li i dr., 2025

Princip rada

Originalna studija je dodala sonikaciju standardnom CPTAC procesu lize uree i pronašla poboljšanu detekciju proteina povezanih s membranama i jezgrama. Autori navode da parametri sonikacije moraju biti fino podešavani u pogledu veličine/koncentracije uzorka – odabirom veličine sonotroda, unosa energije i vremena impulsa.

Primjer, za Hielscher UP200Ht i UP200St, to znači:

• Koristite amplitudu i pulsni režim kao glavne kontrolne varijable
• Držite uzorke hladnim tokom cijelog procesa (npr. na ledu)
• Počnite sa konzervativnim okruženjima
• Optimizirajte prema bistrini uzorka, temperaturi, prinosu proteina i kvalitetu peptida u nastavku

 
Oba Hielscher modela sonicatora od 200 vati UP200Ht i UP200St dizajnirana su za male i srednje zapremine uzoraka, sa podesivim postavkama amplitude i pulsa; Oba ultrazvučna homogenizatora omogućavaju digitalnu kontrolu na dodiru za precizno podešavanje parametara, automatsko snimanje podataka, priključni senzor temperature, daljinsko upravljanje, osvjetljenje uzorka.
 

Reagensi za ekstrakciju proteina uz pomoć sonifikacije

Pufer za lizu uree

Pripremite svježe neposredno prije upotrebe:

• 8 M urea
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8.0
• 1 mM EDTA
• 2 μg/mL aprotinin
• 10 μg/mL leupeptin
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 μM PUGNAc
• Koktel inhibitora fosfataze 2, 1:100 (v/v)
• Koktel inhibitora fosfataze 3, 1:100 (v/v)

Urea mora biti potpuno rastvorena prije dodavanja dodataka; inhibitori se trebaju dodati neposredno prije upotrebe; tampon treba držati na ledu; i preporučuje se vrtloženje umjesto intenzivnog vrtloga nakon dodavanja dodataka.
 

Dodatni reagensi:

• Reagensi BCA proteinskog testa
• 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
• DTT
• Jodoacetamid
• LysC
• tripsin
• Mravlja kiselina
• TMT reagensi, ako se koristi multipleksirana kvantitativna proteomika
• IMAC reagensi, ako se vrši obogaćivanje fosfopeptidima

Oprema za ekstrakciju proteina uz pomoć sonifikacije

Obavezno

Preporučeni izbor sonde

Za uzorke oko 200–1000 μL, koristite sonotrodu malog prečnika prikladnu za direktnu visokointenzivnu obradu malih volumena. Hielscher nudi više promjera sonotroda, a manji prečnici vrhova daju veći intenzitet na vrhu.

Praktična napomena: Koristite najmanju sondu koja omogućava efikasno miješanje bez prekomjernog pjenjenja ili kontakta sa zidom posude.

Ako radite sa više uzoraka istovremeno, možda biste mogli razmotriti Multi-Tube Sonicator VialTweeter ili Microplate Sonicator UIP400MTP!

Upute korak po korak: Procedura ekstrakcije proteina uz pomoć sonifikacije

A. Prethodno ohladite i pripremite

1. Ohladite centrifugu na 4°C.
2. Pripremite svježi pufer za lizu uree i držite ga na ledu.
3. Postavite UP200Ht ili UP200St na stalak unutar zvučnog kućišta.
4. Pripremite ledenu kupku dovoljno veliku da drži epruvete uspravne i stabilne.

Priprema svježih pufera i hladno rukovanje su ključni.

B. Početna ekstrakcija uree

1. Držite kriopulverizirano tkivo na ledu.
2. Dodajte 200 μL ohlađenog pufera za lizu uree na 50 mg vlažnog tkiva.
3. Vortex 5–10 s velikom brzinom.
4. Inkubirajte 15 minuta na 4°C.
5. Ponovite korak vrtloga plus inkubacije još jednom.
6. Centrifugirajte na 20.000g 10 minuta na 4°C.
7. Prenesite lizat/supernatant u čistu cijev sa niskim vezivanjem.

C. Sonication sa korištenjem UP200Ht ili UP200St

Početni uslovi za Sonication

• Amplituda: počnite sa 20–30%
• Dužina pulsa: 5 s ON
• Hlađenje: 2 minute na ledu između impulsa
• Broj ciklusa: 4 ciklusa
• Ukupno vrijeme aktivne sonikacije: 20 s
• Ukupno vrijeme procesa uključujući hlađenje: oko 8–10 minuta

Koraci sonifikacije

1. Prenesite lizat u cijev pogodnu za sonikaciju. Koristite usku, tanku cijev koja omogućava dobru izmjenu toplote i sigurno uranjanje sonde.
2. Stavite cijev u ledenu kupku. Rad navodi hlađenje tokom sonikacije kao ključno za sprječavanje oštećenja od toplote.
3. Uronite vrh sonde u uzorak. Držite vrh dovoljno uronjen za stabilnu kavitaciju, ali nemojte dozvoliti da dodiruje zid cijevi ili dno.
4. Pusti jedan puls od 5 sekundi na početnoj amplitudi.
5. Odmah vratite uzorak potpuno u led na 2 minute.
6. Ponavljajte dok se ne završe 4 ciklusa.
7. Pregledajte lizat nakon ciklusa.
8. Nastavite samo ako je potrebno, koristeći jedan dodatni puls od 5 sekundi, uvijek praćen potpunim hlađenjem.
9. Prekini kada lizat postane ujednačeniji i manje vlaknast/viskozan.
   Krajnja tačka je prozirniji lizat koji formira kapljice umjesto kontinuiranog viskoznog toka.
10. Centrifugirajte na oko 16.000g 15 minuta na 4°C.
11. Prebacite pročišćeni supernatant u svježu epruvetu i izmjerite koncentraciju proteina.

Poređenje globalne proteomike i fosfoproteomike između sonikiranih i nesonikiranih uzoraka.
a. Broj identificiranih proteina (globalna proteomika) u svim tkivima tumora PDX-a sa ili bez sonikacije. b. Broj identificiranih fosfopeptida (IMAC obogaćenje) u svim tkivima tumora PDX-a sa ili bez sonikacije. Brojani su samo proteini i fosfopeptidi sa omjerom zastupljenosti većim ili jednakim 25. percentilu. Omjer zastupljenosti je izračunat između istih tipova uzoraka.
Studija i grafikoni: ©Li i saradnici, 2025

Daljnja digestija i analiza

Nakon sonizacije i pojašnjenja, nastavite prema originalnom CPTAC-stilu radnog toka:

1. Razrijedite lizat 1:3 (v/v) sa 50 mM Tris-HCl pH 8.0 kako biste reducirali ureu na <2 M.
2. Dodajte LysC na 1 mAU na 50 μg proteina i inkubirajte 2 sata na 25°C.
3. Dodajte tripsin u omjeru 1:49 enzim:supstrat (w/w) i varite preko noći na 25°C.
4. Kaljenje mravljom kiselinom do 1% finala.
5. Nastavite sa odsoljivanjem, TMT označavanjem, frakcionacijom, obogaćivanjem fosfopeptida i LC-MS/MS po potrebi.

Diferencijalna ekspresija fosfopeptida iz TMT-obilježene MS.
a. Bazalni podtip, koji ističe neke ljudske fosfopeptide (početak i kraj proteinske sekvence) su pojačani u sonikiranim uzorcima u poređenju sa nesonikiranim uzorcima. b. Luminalni podtip, koji ističe neke ljudske fosfopeptide (početak i kraj) protein_sequence su povećani u sonikiranim uzorcima u poređenju sa nesonikiranim uzorcima. c. Obogaćeni KEGG putevi zasnovani na proteinima povećanih fosfopeptida u sonikiranim bazalnim podtipovima tumora. d. Obogaćene KEGG puteve zasnovane na proteinima pojačanih fosfopeptida u sonikiranom luminalnom podtipu tumora.
Studija i grafikoni: ©Li i saradnici, 2025

Dizajn, proizvodnja i konsalting – Kvaliteta Made in Germany

Hielscher ultrasonicatori su poznati po najvišoj kvaliteti i standardima dizajna. Robusnost i jednostavan rad omogućavaju nesmetanu integraciju naših ultrazvučnih aparata u industrijske objekte. Hielscher ultrasonikatori lako se nose sa teškim uslovima i zahtevnim okruženjima.

Hielscher Ultrasonics je ISO sertifikovana kompanija i stavlja poseban naglasak na ultrazvučne aparate visokih performansi koji se odlikuju najsavremenijom tehnologijom i lakoćom korišćenja. Naravno, Hielscher ultrasonikatori su usklađeni sa CE i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoH.

Literatura / Reference