Ekstrakcija proteina potpomognuta ultrazvučnom obradom iz tumorskog tkiva – protokol

Ovaj protokol opisuje metodu ekstrakcije proteina iz tumorskog tkiva potpomognutu ultrazvučnom obradom (sonikacijom), koja unapređuje standardni CPTAC tok rada lize ureom dodavanjem kontrolirane koraka sonikacije sondom tokom razgradnje tkiva. Nadograđujući se na uspostavljenu CPTAC strategiju pripreme proteoma i fosfoproteoma velikih razmjera, ova modifikacija poboljšava razgradnju ćelija i subćelijskih struktura, smanjuje viskoznost uzorka i pospješuje oslobađanje proteina koje je obično teže izdvojiti samom lizom ureom, posebno proteina vezanih za membrane te proteina koji vežu DNK ili su povezani s jezgrom. U studiji na kojoj se protokol zasniva, tok rada potpomognut sonikacijom povećao je detekciju i proteina i fosfopeptida, uz očuvanu kompatibilnost s kasnijim procesom u stilu CPTAC-a: digestijom, TMT označavanjem, frakcioniranjem, obogaćivanjem fosfopeptida i LC-MS/MS analizom.

Ekstrakcija proteina iz tumorskog tkiva potpomognuta ultrazvučnom obradom za dubinsku proteomsku i fosfoproteomsku analizu

Sljedeći protokol optimiziran je za ekstrakciju proteina iz kriopulveriziranog tumorskog tkiva u puferu za lizu s 8 M ureom: dodatni korak sonikacije sondom poboljšava izdvajanje teških klasa proteina, posebno proteina povezanih s membranom te proteina povezanih s DNK/jezgrom, prije digestije i nizvodne LC-MS/MS analize. U studiji Li i sur. (2025), dodavanje sonikacije povećalo je detekciju proteina povezanih s membranom i jezgrom te omogućilo pokrivenost velikih razmjera od >12.000 proteina i >25.000 fosfopeptida u okviru njihovog toka rada.

Područje primjene protokola

Koristite ovaj postupak za:

• svježe smrznuto, kriopulverizirano tumorsko tkivo
• ćelijske pelete ili druge biološke uzorke za koje je ekstrakcija na bazi uree već uspostavljena
• tokove rada globalne proteomike i fosfoproteomike s tripsinskom digestijom i opcionalnim TMT označavanjem

Studija Li i sur. (2025) navodi da je tok rada primjenjiv i na druge vrste uzoraka, kao što su ćelijske linije, krv i urin, no optimizacija može biti potrebna ovisno o vrsti uzorka.

Optimizirani tok rada pripreme uzoraka s implementiranim korakom sonikacije. Optimizirani tok rada i eksperimentalni dizajn zasnovani su na CPTAC protokolu pripreme uzoraka za globalnu proteomsku i fosfoproteomsku analizu.
Studija i shema: ©Li et al., 2025

Princip rada

Originalna studija dodala je sonikaciju standardnom CPTAC toku rada lize ureom i utvrdila poboljšanu detekciju proteina povezanih s membranama i jezgrama. Autori navode da se parametri sonikacije moraju fino podesiti s obzirom na veličinu/koncentraciju uzorka – odabirom veličine sonotrode, unosa energije i vremena pulsa.

Primjera radi, za Hielscher UP200Ht i UP200St to znači:

• koristite amplitudu i pulsni način rada kao glavne kontrolne varijable
• držite uzorke hladnima cijelo vrijeme (tj. na ledu)
• počnite s konzervativnim postavkama
• optimizirajte prema bistrini uzorka, temperaturi, prinosu proteina i kvaliteti peptida u daljnjim koracima

Oba Hielscher sonikatora snage 200 watts, modeli UP200Ht i UP200St, namijenjena su malim i srednjim volumenima uzoraka, s podesivim postavkama amplitude i pulsa; oba ultrazvučna homogenizatora nude digitalno upravljanje putem ekrana osjetljivog na dodir za preciznu prilagodbu parametara, automatsko bilježenje podataka, priključni temperaturni senzor, daljinsko upravljanje i osvjetljenje uzorka.

Reagensi za ekstrakciju proteina potpomognutu sonikacijom

Pufer za lizu s ureom

Pripremite svjež neposredno prije upotrebe:

• 8 M urea
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL aprotinin
• 10 µg/mL leupeptin
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 2, 1:100 (v/v)
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 3, 1:100 (v/v)

Urea mora biti potpuno otopljena prije dodavanja aditiva; inhibitore treba dodati neposredno prije upotrebe; pufer treba držati na ledu; a nakon dodavanja aditiva preporučuje se lagano miješanje kružnim pokretima umjesto snažnog vorteksiranja.

Dodatni reagensi:

• reagensi za BCA test proteina
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• jodoacetamid
• LysC
• tripsin
• mravlja kiselina
• TMT reagensi, ako se koristi multipleksna kvantitativna proteomika
• IMAC reagensi, ako se provodi obogaćivanje fosfopeptida

Oprema za ekstrakciju proteina potpomognutu sonikacijom

Potrebno

Preporučeni izbor sonde

Za uzorke od oko 200–1000 µL koristite sonotrodu malog promjera, prikladnu za direktnu obradu malih volumena visokim intenzitetom. Hielscher nudi sonotrode više promjera, a manji promjeri vrha daju veći intenzitet na vrhu.

Praktična napomena: Koristite najmanju sondu koja omogućava efikasno miješanje bez pretjeranog pjenjenja ili dodira sa stijenkom posude.

Ako istovremeno radite s više uzoraka, mogli biste razmotriti višecijevni sonikator VialTweeter ili mikropločni sonikator UIP400MTP!

Upute korak po korak: postupak ekstrakcije proteina potpomognute sonikacijom

A. Prethodno hlađenje i priprema

1. Ohladite centrifugu na 4°C.
2. Pripremite svjež pufer za lizu s ureom i držite ga na ledu.
3. Postavite UP200Ht ili UP200St na stalak unutar zvučno izolirane kabine.
4. Pripremite ledenu kupku dovoljno veliku da epruvete s uzorcima stoje uspravno i stabilno.

Priprema svježeg pufera i rad na hladnom ključni su.

B. Početna ekstrakcija ureom

1. Držite kriopulverizirano tkivo na ledu.
2. Dodajte 200 µL ohlađenog pufera za lizu s ureom na 50 mg vlažnog tkiva.
3. Vorteksirajte 5–10 s pri velikoj brzini.
4. Inkubirajte 15 min na 4°C.
5. Ponovite korak vorteksiranja i inkubacije još jednom.
6. Centrifugirajte pri 20.000g tokom 10 min na 4°C.
7. Prenesite lizat/supernatant u čistu epruvetu s niskim vezanjem proteina.

C. Sonikacija pomoću UP200Ht ili UP200St

Početni uvjeti sonikacije

• Amplituda: počnite s 20–30%
• Trajanje pulsa: 5 s UKLJUČENO
• Hlađenje: 2 min na ledu između pulseva
• Broj ciklusa: 4 ciklusa
• Ukupno vrijeme aktivne sonikacije: 20 s
• Ukupno trajanje procesa uključujući hlađenje: oko 8–10 min

Koraci sonikacije

1. Prenesite lizat u epruvetu pogodnu za sonikaciju. Koristite usku epruvetu tankih stijenki koja omogućava dobru izmjenu topline i sigurno uranjanje sonde.
2. Stavite epruvetu u ledenu kupku. Rad identificira hlađenje tokom sonikacije kao ključno za sprječavanje oštećenja toplinom.
3. Uronite vrh sonde u uzorak. Držite vrh dovoljno uronjenim za stabilnu kavitaciju, ali ne dopustite da dotakne stijenku ili dno epruvete.
4. Pokrenite jedan puls od 5 s pri početnoj amplitudi.
5. Odmah vratite uzorak potpuno na led na 2 min.
6. Ponavljajte dok se ne završe 4 ciklusa.
7. Pregledajte lizat nakon ciklusa.
8. Nastavite samo ako je potrebno, koristeći po jedan dodatni puls od 5 s, uvijek praćen potpunim hlađenjem.
9. Zaustavite se kada lizat postane ujednačeniji i manje vlaknast/viskozan.
   Krajnja tačka je prozirniji lizat koji stvara kapi umjesto kontinuiranog viskoznog toka.
10. Centrifugirajte pri oko 16.000g tokom 15 min na 4°C.
11. Prenesite izbistreni supernatant u svježu epruvetu i izmjerite koncentraciju proteina.

Usporedba globalne proteomike i fosfoproteomike između uzoraka obrađenih i neobrađenih ultrazvukom.
a. Broj identificiranih proteina (globalna proteomika) u svim PDX tumorskim tkivima sa sonikacijom i bez nje. b. Broj identificiranih fosfopeptida (IMAC obogaćivanje) u svim PDX tumorskim tkivima sa sonikacijom i bez nje. Računati su samo proteini i fosfopeptidi s omjerom abundancije većim od ili jednakim 25. percentilu. Omjer abundancije izračunat je između istih vrsta uzoraka.
Studija i grafikoni: ©Li et al., 2025

Daljnja digestija i analiza

Nakon sonikacije i bistrenja nastavite kako je opisano u originalnom toku rada u stilu CPTAC-a:

1. Razrijedite lizat 1:3 (v/v) s 50 mM Tris-HCl pH 8,0 kako biste smanjili ureu na <2 M.
2. Dodajte LysC u omjeru 1 mAU na 50 µg proteina i inkubirajte 2 h na 25°C.
3. Dodajte tripsin u omjeru 1:49 enzim:supstrat (w/w) i digestirajte preko noći na 25°C.
4. Zaustavite reakciju mravljom kiselinom do 1% završne koncentracije.
5. Nastavite s odsoljavanjem, TMT označavanjem, frakcioniranjem, obogaćivanjem fosfopeptida i LC-MS/MS analizom prema potrebi.

Diferencijalna ekspresija fosfopeptida iz TMT-označene MS.
a. Bazalni podtip, s istaknutim nekim humanim fosfopeptidima (početak i kraj protein-sekvence) s pojačanom ekspresijom u uzorcima obrađenim ultrazvukom u poređenju s uzorcima koji nisu obrađeni ultrazvukom. b. Luminalni podtip, s istaknutim nekim humanim fosfopeptidima (početak i kraj protein_sequence) s pojačanom ekspresijom u uzorcima obrađenim ultrazvukom u poređenju s uzorcima koji nisu obrađeni ultrazvukom. c. Obogaćeni KEGG putevi na osnovu proteina fosfopeptida s pojačanom ekspresijom u bazalnom podtipu tumora obrađenom ultrazvukom. d. Obogaćeni KEGG putevi na osnovu proteina fosfopeptida s pojačanom ekspresijom u luminalnom podtipu tumora obrađenom ultrazvukom.
Studija i grafikoni: ©Li et al., 2025

Dizajn, proizvodnja i savjetovanje – kvalitet proizveden u Njemačkoj

Hielscher ultrazvučni uređaji poznati su po najvišem kvalitetu i standardima dizajna. Robusnost i jednostavan rad omogućavaju nesmetanu integraciju naših ultrazvučnih uređaja u industrijske pogone. Hielscher ultrazvučni uređaji lako podnose teške uvjete i zahtjevna okruženja.

Hielscher Ultrasonics je ISO certificirana kompanija koja posebnu pažnju posvećuje visokoučinkovitim ultrazvučnim uređajima s najsavremenijom tehnologijom i jednostavnošću korištenja. Naravno, Hielscher ultrazvučni uređaji su u skladu s CE oznakom i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.

Literatura / reference

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.