Ultrazvučna priprema uzoraka C. Elegans

C. elegans, nematoda, je široko korišten modelni organizam u biologiji. Priprema uzorka prije analize zahtijeva lizu, ekstrakciju proteina i lipida, kao i fragmentaciju RNK, što se može pouzdano izvesti ultrazvukom. Ultrazvučni disruptori ćelija su pouzdani, sofisticirani i laki za upotrebu uređaji za brzu pripremu uzoraka C. elegans.

Ultrazvučna priprema uzoraka C. Elegans

C. elegans su okrugli crvi, koji se široko koriste u istraživačkim laboratorijama za istraživanje genomike, razvojne biologije i bolesti. Mnogi geni u genomu C. elegans imaju funkcionalne parnjake kod ljudi. Stoga je crv nematoda izuzetno koristan model za ljudske bolesti. Druge prednosti za široku upotrebu C. elegans su laka i jeftina kultivacija na pločama koje sadrže bakterije (npr. E. coli), transparentnost, praktično rukovanje, kao i mogućnost zamrzavanja i čuvanja crva na duži period.
Analiza proteina i lipida su redovne procedure u laboratorijama, a ultrazvučna priprema uzoraka je ustaljena metoda za lizu nematoda C. elegans u svakoj razvojnoj fazi (npr. embrioni, larve L1-L4, odrasle osobe). Pošto se C. elegans takođe koristi kao sistem za ekspresiju proteina za prekomernu ekspresiju ciljanih proteina, potrebna je pouzdana, ponovljiva metoda lize i ekstrakcije proteina, koja daje visoke prinose proteina. Ultrazvučni sistemi za razbijanje ćelija i ekstrakciju dostupni su kao homogenizatori tipa sonde i ultrazvučni uređaji za više uzoraka. Uz praktičnu pripremu uzoraka i sve vrste brojeva uzoraka, Hielscher Ultrasonics ima idealan ultrazvučni disruptor ćelija za vašu laboratorijsku proceduru.

Ultrazvučni protokoli za C. Elegans disrupciju i lizu

Ultrazvučna homogenizacija i liza C. elegans i naknadna ekstrakcija proteina i lipida mogu se izvesti korištenjem različitih procedura koristeći različite pufere za homogenizaciju i lizu itd. Svim protokolima za lizu zajedničko je da se uzorci moraju kontinuirano držati na ledu kako bi se spriječila degradacija proteina. U nastavku vam predstavljamo neke pouzdane i brze ultrazvučne protokole za lizu i ekstrakciju za pripremu visokokvalitetnih uzoraka C. elegans koji sadrže proteine ili lipide.

Prednosti ultrazvučnog C. elegans Lysis

• pouzdan
• reproducibilan
• precizno kontrolisan temperaturom
• pouzdana kontrola procesa
• nježna metoda
• lako se nanosi
• sigurno

Ultrazvučna ekstrakcija proteina iz uzoraka C. elegans

Ultrazvučna liza i ekstrakcija proteina crva C. elegans mogu se izvesti korištenjem različitih protokola. U nastavku vam predstavljamo nekoliko pouzdanih i brzih protokola za lizu za ponovljive rezultate ekstrakcije proteina.

Brza priprema citosolnog ekstrakta iz C. elegans crva ultrazvukom

Sa sljedećim protokolom možete pripremiti lizate C. elegans za manje od 30 minuta.
Zbirka C. elegans
Odaberite željene crve C. elegans u 1,5 ml epruvete sa fosfatnim puferom (PBS) ili ih operite sa ploče sa 1,5 ml PBS. Centrifugirajte 1 min na 2000 okretaja u minuti do peleta. Držite uzorke cijelo vrijeme na ledu.
Zatim, dva puta operite crve sa PBS-om.
Nakon toga, dva puta operite crve sa ddH₂O.
Resuspendirajte crve u najmanje 500ul pufera za homogenizaciju (HB). Uzorci crva su sada spremni za ultrazvučnu lizu.
Za veći kvalitet proteinskog ekstrakta, možda ćete htjeti smanjiti bakterijsku kontaminaciju pranjem crva 5 minuta svaki u PBS-u i sterilnoj, ultra čistoj vodi (ddH₂O) ili izvršite floataciju saharoze. Držite uzorke crva neprekidno na ledu.

Ultrasonic C. elegans Lysis Protocol

• Pobrinite se da unaprijed pripremite ultrazvučni aparat tako da ultrazvučni homogenizator bude spreman za upotrebu (sonda montirana, program za sonikaciju unaprijed postavljen).

Ako je vaš ultrasonikator montiran na postolje, postavite ledenu kupku sa vašim epruvetama za uzorke ispod ultrazvučne sonde i umetnite ultrazvučnu sondu u epruvetu od 1,5 ml.

• Za lizu C. elegans sa UP200St ili UP200Ht, ultrazvučnu obradu treba izvesti pomoću mikrovrha (npr. sonde od 2 mm S26d2; vidi sliku lijevo) pri 40% amplitude tokom 1 sekunde sa pauzama od 30 sekundi između. 5 ciklusa sonikacije za svaku 1 sekundu sa pauzama od 30 sekundi su idealni za lizu C. elegans. Ako lizu izvodite prvi put, možete provjeriti napredak lize u malim alikvotima uzorka nakon svakog impulsa pomoću mikroskopa.
• Liza se uspješno završava kada se crvi poremete. Prekomjerna sonikacija rezultira lomljenjem jezgri i postaje vidljiva kada uzorak postane viskozan ili se zapjeni. Da biste spriječili degradaciju uzorka, koristite više impulsa ako je potrebno. Nemojte povećavati vrijeme svakog ultrazvučnog pulsnog ciklusa kako biste dobili visokokvalitetne proteinske ekstrakte.
• Očistite ćelijski lizat centrifugiranjem ultrazvučno liziranih crva na 14.000 rpm tokom 10 minuta na 4ºC.
• Zatim prenesite supernatant u svježu epruvetu i pripremite se za imunoprecipitaciju ili druge testove.

Napomena za pufer za homogenizaciju: Pripremite pufer za homogenizaciju za gornji protokol ultrazvučne lize kako slijedi:

Visoko propusna liza C. elegans u pločama sa 96 jažica pomoću UIP400MTP Plate Sonicator

C. elegans Lysis (odrasle nematode)
UIP400MTP 80% amplituda, 20 ciklusa (svaki ciklus sonikacije: 30 sekundi uključeno, 30 sekundi isključeno)
pufer za lizu:

• Opcija 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Opcija 2) za ko-imunoprecipitaciju (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (kompletni koktel inhibitora proteinaze)

Fragmentacija DNK visoke propusnosti
C. elegans (odrasle nematode) DNK 200-300bp: UIP400MTP pločasti sonikator – podesiti 80% amplitude, 30 impulsa – svakih 30 sekundi uključeno, 30 sekundi isključeno

UIP400MTP sonikator za ploče za pripremu uzoraka visokog protoka jednoliko ultrazvučno obrađuje uzorke u pločama s više jažica, mikrotitarskim pločama i pločama sa 96 jažica

Ultrazvučna liza C. elegans za kvantitativne testove pročišćavanja afiniteta

Embrioni C. elegans (∼2 miliona po replikatu) su svježe sakupljeni u biološkom trostrukom primjerku izbjeljivanjem mladih gravidnih hermafrodita i sonikirani na ledu (ciklus: 0,5 s, amplituda: 40–45%, 5 poteza po sesiji, 5 sesija, interval između sesija : 30 s; UP200S ultrazvučni procesor sa mikro vrhom S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) u puferu za lizu (ukupni volumen: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glicerol , mješavina inhibitora proteaze, 0,1% Nonidet P-40 zamjena). Nakon ultrazvuka, Nonidet P-40 Substitute je dodan do 1% i lizati su inkubirani sa rotacijom glave preko repa na 4°C 30 minuta, nakon čega je uslijedilo centrifugiranje na 20,000 × g 20 minuta na 4°C. Očišćeni lizat je zatim aspiriran bez ometanja gornjeg sloja lipida i podijeljen na pola ili na zrnca anti-GFP agaroze ili na blokirane kontrolne kuglice (40-50 μl). Nakon rotacije glave preko repa na 4°C u trajanju od 60-90 minuta, kuglice su jednom isprane puferom za lizu koji je sadržavao 0,1% Nonidet P-40 zamjene, nakon čega je slijedilo dva puta ispiranje u bilo kojem puferu I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) ili pufer II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) ili oboje. Za GFP:MBK-2 pull-down, izvedena su dva odvojena eksperimenta koristeći različite uslove pranja. Proteini su eluirani orbitalnim mućkanjem u 50 μl 6 m uree/2 M tioureje na sobnoj temperaturi. Za MBK-1::GFP pull-down eksperimente, proteini su eluirani dva puta mućkanjem u 50 μl 8 m gvanidinijum hlorida na 90°C, nakon čega je usledilo taloženje etanolom. Eluirani proteinski uzorci su zatim digestirani u rastvoru.
(usp. Chen et al., 2016.)

Ultrazvučna homogenizacija i liza crva

Za C.elegans lizu i proceduru ekstrakcije proteina, 30.000 nemotoda relevantne faze je sakupljeno po uzorku i isprano u ledeno hladnom S-bazalu, koncentrirano centrifugiranjem na 1500 rpm u trajanju od 2 min., isprano šest puta ledeno hladnim S-basalom. bazal za uklanjanje ostataka bakterija, a zatim se čuva na ledu dok ne bude spreman za upotrebu. Za ekstrakciju proteina, gravidno-odraslim crvima je dozvoljeno da formiraju kompaktnu kuglicu nakon posljednjeg S-bazalnog pranja. Pelete crva su zatim resuspendovane u 1 ml ledeno hladnog pufera za ekstrakciju [20 mM kalijum fosfata, pH 7,4, 2 mM EDTA, 1% Triton-X-100, inhibitori proteaze (Sigma P2714)] i odmah obrađene.
∼30.000 gravidno-odraslih crva (što odgovara mokroj težini od ∼100 mg), obrađeno je ultrazvukom na ledu pomoću ultrazvučnog aparata tipa sonde (npr. UP50H sa mikrovrhom MS2) pri 40% amplitude tokom 10 ciklusa od 3 sekunde uključeno, 30 sekundi isključeno, u 1 ml ledeno hladnog pufera za ekstrakciju. (usp. Baskharan et al. 2012)

Ultrazvučna ekstrakcija lipida iz C. elegans

U lipidomici, grani metabolomike, karakterizira se i analizira lipidni komplement bioloških sistema. C. elegans se široko koristi u lipidomici za istraživanje interakcije metaboličkih lipida i njihovih efekata na zdravlje i životni vijek.
Ultrazvučna liza i ekstrakcija se koriste za oslobađanje lipida kao što su sfingolipidi iz C. elegans embrija, ličinki i odraslih crva. Ultrazvuk se koristi za pripremu homogenata crva i zatim za ekstrakciju lipida iz uzorka.
Protokol za ultrazvučnu ekstrakciju lipida iz C. elegans
Odmrznite peletu C. elegans na ledu i resuspendirajte sa 0,5 ml ultravode. Sonicirajte uzorke C. elegans u epruvetama od 1,5 mL, dok uzorke držite kontinuirano na ledu.
Sonikacija se može izvesti pomoću sonde-ultrazvučnika kao što je UP200Ht, ultrazvučna jedinica za pripremu uzoraka VialTweeter (istovremena sonikacija 10 uzoraka) ili UIP400MTP (za sonikaciju ploča sa više jažica kao što su ploče sa 96 jažica). Za ultrazvučnu lizu sa UP200Ht koristite mikrovrh S26d2. Unapred podesite režim ultrazvučnog ciklusa u digitalnom meniju. Postavite amplitudu na 10% i režim ciklusa sonikacije od 2 sekunde impulsa od 20 ciklusa sa pauzom od 30 sekundi. između svake ultrazvučne pulsacije.
Prebacite supernatante u staklene epruvete sa poklopcem na navoj. Izvršite Folch ekstrakciju dodavanjem 1 ml ultravode u svaku staklenu epruvetu, a zatim dodavanjem 6 ml mešavine hloroform/metanol (omjer = 2:1) u svaku staklenu epruvetu.
Vrtljajte svaku staklenu epruvetu 30 sekundi 4 puta. Centrifugirajte epruvete na 1,258 xg 15 minuta (Eppendorf, 5810 R) da dodatno poboljšate razdvajanje faza. Prebacite donju hidrofobnu frakciju u čistu staklenu epruvetu pomoću staklene Pasteurove pipete. Osušiti donju hidrofobnu frakciju pod protokom dušika u isparivaču dušika. Osušeni pelet do upotrebe čuvajte u zamrzivaču na -80 °C.

Ultrazvučna priprema lizata crva

Lizat crva: crvi u fazi L4 su sakupljeni i isprani tri puta sa M9 puferom (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl i 0,87 mM MgSO₄) kako bi se uklonile sve bakterije. Nakon uklanjanja što je više moguće M9 pufera, crvi su resuspendirani u puferu za lizu: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 5 mM fosfat β-glicerol, 0,1% (v/v) 0 Triton 50 mM natrijum fluorida, 1 mM natrijum ortovanadata, 5 mM natrijum pirofosfata, 0,2 mM fenilmetansulfonilfluorida i inhibitora proteaze. Crvi su smrznuti u tekućem dušiku i odmrznuti na 37°C tri puta, a zatim su crvi sonikirani na suhom ledu pomoću ultrazvučne jedinice VialTweeter za istovremenu pripremu 10 epruveta za uzorke. Sonikacija je izvedena pri 50% amplitude u 10 ciklusa od 2 sec. sa pauzom od 30 sekundi između rafala sonikacije. Nakon toga, uzorci su centrifugirani na 12000 o/min na 4°C 15 min. Supernatant je sakupljen i pohranjen na -70°C. Alikvot je korišten za kvantifikaciju proteina Bradfordovim testom.
Određivanje ukupnog glutationa, GSH i GSSG: Za kvantifikaciju glutationa, lizati i određivanje su napravljeni istog dana. Ličinke hranjene glukozom i kontrolne L4 larve su sakupljene i isprane M9 puferom tri puta. Nakon uklanjanja što je više moguće M9 pufera, crvi su resuspendirani u ledeno hladnoj metafosfornoj kiselini (5% w/v), a zatim su crvi sonicirani u ledu ultrazvučnim VialTweeterom pri 50% amplitude u deset ciklusa sonikacije od 2 sec. sa 30 sek. pauze između svakog ciklusa. Nakon toga centrifugirati na 12000 o/min na 4 ̊C 15 min.
(usp. Alcántar-Fernández et al., 2018.)

C. elegans Priprema uzorka prije imunoprecipitacije i Western blottinga

Ukratko, za embrionalne ekstrakte, larve C. elegans L1 uzgajane su u velikim tečnim S-srednjim kulturama do odrasle dobi. Embrioni su sakupljeni standardnom metodom izbeljivanja i suspendovani u puferu za lizu (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glicerola, 0,05% NP-40, 1ase Intail, 100 Intail Co. Koktel inhibitora fosfataze I i II), brzo zamrznut u tekućem dušiku i liziran ultrazvučnim razbijanjem ćelija pomoću ultrazvučnog aparata s mikrovrhom kao što je UP200Ht sa S26d2 za 10 impulsa tokom 10 s pri 30% amplitude. Ako se mora pripremiti veći broj uzoraka ultrazvučno VialTweeter ili MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP za ploče za bušotine se preporučuju. Nakon ultrazvučne obrade, ekstrakti su prethodno očišćeni centrifugiranjem na 30.000 g tokom 20 minuta na 4°C. Prethodno očišćeni ekstrakt (300 µg ukupnog proteina) je inkubiran sa 40 µµg anti-CDC-25.1 afinitetno pročišćenog antitijela (ova studija) umreženog na protein A-agarozu, ili kao kontrola, sličnom količinom zečjeg imunoglobulina (Ig)G umrežen za protein A-agarozu korišten je u ukupnoj zapremini od 200 µl pufera za lizu koji je sadržavao 1% NP-40, čije je uključivanje smanjilo nespecifično vezivanje proteina za matriks. Uzorci su rotirani 1 h na 4°C, perle su tri puta isprane puferom za lizu i eluirane sa 30 µl glicin/HCl i 200 mM NaCl, pH 2,2. Nakon imunoprecipitacije, eluati su razrijeđeni u 30 µϏl SDS pufera za uzorke, zagrijani na 95°C 4 min, i tipično je 3% ukupnog unosa i 30% eluata primijenjeno na SDS-PAGE nakon čega je slijedio Western blot sa anti -CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitin (1:1000), anti-GSK3 (1:500) ili anti-β-aktin (1: 2000) antitela. Tamo gdje ekstrakti nisu bili podvrgnuti imunoprecipitaciji, ista količina ukupnog proteina dobijenog iz tih ekstrakata je resuspendirana u SDS puferu za uzorke, zagrijana na 95°C, a zatim direktno primijenjena na SDS-PAGE i analizirana Western blot-om. (usp. Segref et al. 2020.)

Ultrazvučna liza pod preciznom kontrolom temperature

Precizna i pouzdana kontrola temperature ključna je pri rukovanju biološkim uzorcima. Visoke temperature pokreću termički izazvanu razgradnju proteina u uzorcima.
Kao i sve tehnike mehaničke pripreme uzoraka, sonikacija stvara toplinu. Međutim, temperatura uzoraka se može dobro kontrolisati kada se koristi VialTweeter. Predstavljamo vam različite opcije za praćenje i kontrolu temperature vaših uzoraka dok ih pripremate pomoću VialTweeter-a i VialPress-a za analizu.

1. Praćenje temperature uzorka: Ultrazvučni procesor UP200St, koji pokreće VialTweeter, opremljen je inteligentnim softverom i senzorom temperature koji se može priključiti. Uključite senzor temperature u UP200St i umetnite vrh senzora temperature u jednu od epruveta za uzorke. Preko digitalnog ekrana osetljivog na dodir u boji, možete podesiti u meniju UP200St određeni temperaturni opseg za vaš uzorak ultrazvuka. Ultrasonikator će se automatski zaustaviti kada se dostigne maksimalna temperatura i pauzirati dok temperatura uzorka ne padne na nižu vrijednost postavljene temperature ∆. Tada ultrazvuk počinje automatski ponovo. Ova pametna karakteristika sprečava degradaciju izazvanu toplotom.
2. VialTweeter blok se može prethodno ohladiti. Stavite VialTweeter blok (samo sonotrodu bez sonde!) u frižider ili zamrzivač kako biste prethodno ohladili blok od titana koji pomaže da se odgodi porast temperature u uzorku. Ako je moguće, sam uzorak se također može prethodno ohladiti.
3. Koristite suvi led za hlađenje tokom ultrazvučne obrade. Koristite plitku tacnu napunjenu suvim ledom i postavite VialTweeter na suvi led tako da se toplota brzo rasprši.

Pronađite optimalni ultrazvučni disruptor ćelija za vašu aplikaciju za lizu

Hielscher Ultrasonics je dugogodišnji iskusan proizvođač ultrazvučnih disruptora ćelija visokih performansi i homogenizatora za laboratorije, stolne i industrijske sisteme. Veličina vaše bakterijske ćelijske kulture, vaš istraživački ili proizvodni cilj i volumen ćelije za obradu po satu ili danu su ključni faktori za pronalaženje pravog ultrazvučnog disruptora ćelija za vašu primjenu.
Hielscher Ultrasonics nudi različita rješenja za istovremenu ultrazvučnu obradu više uzoraka (do 10 bočica) kao i masovnih uzoraka (tj. mikrotitarske ploče? ploče sa 96 jažica), klasični laboratorijski ultrasonikator tipa sonde s različitim razinama snage od 50 do 400 vati do potpuno industrijskih ultrazvučnih procesora sa do 16.000 vati po jedinici za komercijalno uništavanje ćelija i ekstrakciju proteina u velikoj proizvodnji. Svi Hielscher ultrasonikatori su napravljeni za rad 24/7/365 pod punim opterećenjem. Robusnost i pouzdanost su osnovne karakteristike naših ultrazvučnih uređaja.
Svi digitalni ultrazvučni homogenizatori opremljeni su pametnim softverom, ekranom na dodir u boji i automatskim protokoliranjem podataka, što ultrazvučni uređaj čini praktičnim radnim alatom u laboratorijima i proizvodnim pogonima.
Javite nam koje vrste ćelija, koji volumen, kojom frekvencijom i sa kojim ciljem morate da obrađujete svoje biološke uzorke. Preporučit ćemo vam najprikladniji ultrazvučni disruptor ćelija za vaše zahtjeve procesa.

Tabela u nastavku daje vam indikaciju približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih sistema od kompaktnih ručnih homogenizatora i MultiSample Ultrasonicatora do industrijskih ultrazvučnih procesora za komercijalne primjene: