Ultrazvučna priprema uzoraka C. Elegans

C. elegans, valjkasti crv (nematoda), široko je korišten model-organizam u biologiji. Priprema uzoraka prije analize zahtijeva lizu, ekstrakciju proteina i lipida te fragmentaciju RNK, što se pouzdano može izvesti ultrazvučnom obradom (sonikacijom). Ultrazvučni uređaji za razgradnju ćelija pouzdani su, sofisticirani i jednostavni za upotrebu za brzu pripremu uzoraka C. elegans.

Ultrazvučna priprema uzoraka C. elegans

Caenorhabditis elegans su valjkasti crvi koji se široko koriste u istraživačkim laboratorijama za proučavanje genomike, razvojne biologije i bolesti. Mnogi geni u genomu C. elegans imaju funkcionalne pandane kod ljudi. Stoga je ovaj nematodni crv iznimno koristan model za bolesti ljudi. Druge prednosti široke upotrebe C. elegans su jednostavno i jeftino uzgajanje na pločama s bakterijama (npr. E. coli), njegova prozirnost, praktično rukovanje, kao i mogućnost zamrzavanja i dugotrajnijeg čuvanja crva.
Analiza proteina i lipida redovni su postupci u laboratorijama, a ultrazvučna priprema uzoraka etablirana je metoda za lizu nematoda C. elegans u svakoj razvojnoj fazi (tj. embriji, larve L1-L4, odrasle jedinke). Budući da se C. elegans koristi i kao sistem za ekspresiju proteina radi prekomjerne ekspresije ciljnih proteina, potrebna je pouzdana, ponovljiva metoda lize i ekstrakcije proteina koja daje visoke prinose proteina. Sistemi za ultrazvučnu razgradnju ćelija i ekstrakciju dostupni su kao homogenizatori sa sondom i kao ultrazvučni uređaji za više uzoraka. Uz praktičnu pripremu uzoraka i sve veličine i brojeve uzoraka, Hielscher Ultrasonics ima idealan ultrazvučni uređaj za razgradnju ćelija za vaš laboratorijski postupak.

Ultrazvučni protokoli za razgradnju i lizu C. Elegans

Ultrazvučna homogenizacija i liza C. elegans te naknadna ekstrakcija proteina i lipida mogu se izvesti različitim postupcima uz različite homogenizacijske i lizne pufere itd. Svim protokolima lize zajedničko je da se uzorci moraju neprekidno držati na ledu kako bi se spriječila razgradnja proteina. U nastavku vam predstavljamo nekoliko pouzdanih i brzih protokola ultrazvučne lize i ekstrakcije za pripremu visokokvalitetnih uzoraka C. elegans koji sadrže proteine ili lipide.

Prednosti ultrazvučne lize C. elegans

• pouzdana
• ponovljiva
• precizno temperaturno kontrolirana
• pouzdana kontrola procesa
• nježna metoda
• jednostavna za primjenu
• sigurna

Ultrazvučna ekstrakcija proteina iz uzoraka C. elegans

Ultrazvučna liza i ekstrakcija proteina iz crva C. elegans mogu se izvesti različitim protokolima. U nastavku vam predstavljamo nekoliko pouzdanih i brzih protokola lize za ponovljive rezultate ekstrakcije proteina.

Brza priprema citosolnog ekstrakta iz crva C. elegans sonikacijom

Sljedećim protokolom možete pripremiti lizate C. elegans za manje od 30 minuta.
Prikupljanje C. elegans
Prenesite željene crve C. elegans u epruvetu od 1,5ml s fosfatnim puferiranim fiziološkim rastvorom (PBS) ili ih isperite s ploče pomoću 1,5ml PBS-a. Centrifugirajte 1min pri 2000rpm da se dobije talog. Uzorke cijelo vrijeme držite na ledu.
Zatim crve dvaput isperite PBS-om.
Nakon toga crve dvaput isperite pomoću ddH₂O.
Resuspendirajte crve u najmanje 500ul homogenizacijskog pufera (HB). Uzorci crva sada su spremni za ultrazvučnu lizu.
Za veći kvalitet ekstrakta proteina možete smanjiti bakterijsku kontaminaciju ispiranjem crva po 5min u PBS-u i sterilnoj ultračistoj vodi (ddH₂O) ili provođenjem flotacije u saharozi. Uzorke crva neprekidno držite na ledu.

Protokol ultrazvučne lize C. elegans

• Pobrinite se da ultrazvučni uređaj unaprijed pripremite tako da je ultrazvučni homogenizator spreman za upotrebu (sonda montirana, program sonikacije prethodno podešen). 

Ako je vaš ultrazvučni uređaj montiran na stativ, postavite ledenu kupelj s epruvetama s uzorcima ispod ultrazvučne sonde i uronite ultrazvučnu sondu u epruvetu od 1,5ml.

• Za lizu C. elegans pomoću UP200St ili UP200Ht ultrazvučnu obradu treba izvoditi mikrosondom (npr. sonda od 2mm S26d2; vidi sliku lijevo) pri amplitudi od 40% tokom 1sec uz pauze od 30sec između impulsa. 5 ciklusa sonikacije od po 1 sekunde s pauzama od 30sec idealno je za lizu C. elegans. Ako lizu provodite prvi put, napredak lize možete provjeravati u malim alikvotima uzorka nakon svakog impulsa pomoću mikroskopa.
• Liza je uspješno završena kada su crvi razgrađeni. Prekomjerna sonikacija dovodi do pucanja jedara, što postaje vidljivo kada uzorak postane viskozan ili se pjeni. Da biste spriječili razgradnju uzorka, po potrebi koristite više impulsa. Ne produžujte trajanje svakog ultrazvučnog impulsa kako biste dobili visokokvalitetne ekstrakte proteina.
• Očistite ćelijski lizat centrifugiranjem ultrazvučno liziranih crva pri 14.000rpm tokom 10min na 4ºC.
• Zatim prenesite supernatant u svježu epruvetu i pripremite ga za imunoprecipitaciju ili druge testove.

Napomena o homogenizacijskom puferu: Homogenizacijski pufer za gore navedeni protokol ultrazvučne lize pripremite na sljedeći način:

Lizu C. elegans visokog protoka uzoraka u pločama s 96 jažica pomoću ploča-sonikatora UIP400MTP

Liza C. elegans (odrasle nematode)
UIP400MTP, amplituda 80%, 20 ciklusa (svaki ciklus sonikacije: 30 sec UKLJ., 30 sec ISKLJ.)
Lizni pufer:

• Opcija 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Opcija 2) za koimunoprecipitaciju (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (kompletni koktel inhibitora proteinaza)

Fragmentacija DNK visokog protoka uzoraka
C. elegans (odrasle nematode) DNK 200-300bp: ploča-sonikator UIP400MTP – podešeno na amplitudu 80%, 30 impulsa – svaki 30sec uključeno, 30sec isključeno

Ploča-sonikator UIP400MTP za pripremu uzoraka visokog protoka uzoraka ravnomjerno ultrazvučno obrađuje uzorke u višejažičnim mikrotitarskim pločama i pločama s 96 jažica

Ultrazvučna liza C. elegans za kvantitativne testove afinitetnog prečišćavanja

Embriji C. elegans (∼2 miliona po replikatu) svježe su prikupljeni u biološkom triplikatu bijeljenjem mladih gravidnih hermafrodita i ultrazvučno obrađeni na ledu (ciklus: 0,5 s, amplituda: 40–45%, 5 udara/sesija, 5 sesija, razmak između sesija: 30 s; UP200S ultrazvučni procesor s mikrosondom S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) u liznom puferu (ukupni volumen: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glicerol, smjesa inhibitora proteaza, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). Nakon sonikacije dodan je Nonidet P-40 Substitute do 1%, a lizati su inkubirani uz rotaciju “head over tail” (preokretanje) na 4°C tokom 30 min, nakon čega je slijedilo centrifugiranje pri 20.000 × g tokom 20 min na 4°C. Bistri lizat zatim je aspiriran bez uznemiravanja gornjeg lipidnog sloja i podijeljen napola na anti-GFP agarozne kuglice ili blokirane kontrolne kuglice (40–50 μl). Nakon rotacije “head over tail” na 4°C tokom 60–90 min kuglice su jednom isprane liznim puferom koji sadrži 0,1% Nonidet P-40 Substitute, a zatim dvaput isprane puferom I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) ili puferom II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) ili oboma. Za pull-down eksperimente GFP:MBK-2 provedena su dva odvojena eksperimenta s različitim uslovima ispiranja. Proteini su eluirani orbitalnim mućkanjem u 50 μl 6 m uree/2 M tiouree na sobnoj temperaturi. Za pull-down eksperimente MBK-1::GFP proteini su eluirani dvaput mućkanjem u 50μl 8 m gvanidinijum-hlorida na 90°C, nakon čega je slijedilo taloženje etanolom. Eluirani uzorci proteina zatim su razgrađeni u rastvoru.
(usp. Chen et al., 2016)

Ultrazvučna homogenizacija i liza crva

Za postupak lize C. elegans i ekstrakcije proteina prikupljeno je 30.000 nematoda odgovarajuće faze po uzorku i isprano u ledeno hladnom S-basal puferu, koncentrirano centrifugiranjem pri 1500 rpm tokom 2 min., šest puta isprano ledeno hladnim S-basal puferom radi uklanjanja zaostalih bakterija, a zatim čuvano na ledu do upotrebe. Za ekstrakciju proteina gravidnim odraslim crvima omogućeno je da formiraju kompaktan talog nakon posljednjeg ispiranja S-basal puferom. Talozi crva zatim su resuspendirani u 1 ml ledeno hladnog ekstrakcijskog pufera [20 mM kalijum-fosfat, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, inhibitori proteaza (Sigma P2714)] i odmah obrađeni.
∼30.000 gravidnih odraslih crva (što odgovara ∼100 mg mokre mase) ultrazvučno je obrađeno na ledu pomoću ultrazvučnog uređaja sa sondom (npr. UP50H s mikrosondom MS2) pri amplitudi od 40% u 10 ciklusa od po 3 sec uključeno, 30 sec isključeno, u 1 ml ledeno hladnog ekstrakcijskog pufera. (usp. Baskharan et al. 2012)

Ultrazvučna ekstrakcija lipida iz C. elegans

U lipidomici, grani metabolomike, karakteriše se i analizira lipidni komplement bioloških sistema. C. elegans se široko koristi u lipidomici za proučavanje interakcije metaboličkih lipida i njihovih učinaka na zdravlje i životni vijek.
Ultrazvučna liza i ekstrakcija koriste se za oslobađanje lipida, kao što su sfingolipidi, iz embrija, larvi i odraslih crva C. elegans. Ultrazvučna obrada koristi se za pripremu homogenata crva, a zatim za ekstrakciju lipida iz uzorka.
Protokol za ultrazvučnu ekstrakciju lipida iz C. elegans
Odmrznite talog C. elegans na ledu i resuspendirajte ga u 0,5 ml ultrawater. Ultrazvučno obradite uzorke C. elegans u epruvetama od 1,5mL, uz neprekidno držanje uzoraka na ledu.
Ultrazvučna obrada može se izvesti ultrazvučnim uređajem sa sondom kao što je UP200Ht, ultrazvučnom jedinicom za pripremu uzoraka VialTweeter (istovremena ultrazvučna obrada 10 uzoraka) ili UIP400MTP (za ultrazvučnu obradu višejažičnih ploča kao što su ploče s 96 jažica). Za ultrazvučnu lizu pomoću UP200Ht koristite mikrosondu S26d2. Prethodno podesite način rada ultrazvučnog ciklusa u digitalnom meniju. Podesite amplitudu na 10% i način ciklusa sonikacije od 20 ciklusa impulsa od po 2 sec s pauzom od 30 sec. između svakog ultrazvučnog niza impulsa.
Prenesite supernatante u staklene epruvete sa zavrtnim čepom. Izvedite Folchovu ekstrakciju dodavanjem 1 ml ultrawater u svaku staklenu epruvetu, a zatim dodavanjem 6 ml smjese hloroforma i metanola (omjer = 2:1) u svaku staklenu epruvetu.
Vorteksirajte svaku staklenu epruvetu 30 sec, 4 puta. Centrifugirajte epruvete pri 1.258 x g tokom 15 min (Eppendorf, 5810 R) radi daljeg poboljšanja razdvajanja faza. Prenesite donju hidrofobnu frakciju u čistu staklenu epruvetu staklenom Pasteurovom pipetom. Osušite donju hidrofobnu frakciju u struji dušika u uparivaču dušika. Osušeni talog čuvajte u zamrzivaču na -80 °C do upotrebe. 


Ultrazvučna priprema lizata crva

Lizat crva: Crvi u fazi L4 prikupljeni su i triput isprani M9 puferom (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl i 0,87 mM MgSO₄) kako bi se uklonile sve bakterije. Nakon što je uklonjena što veća količina M9 pufera, crvi su resuspendirani u liznom puferu: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM fosfat β-glicerol, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM natrijum-fluorid, 1 mM natrijum-ortovanadat, 5 mM natrijum-pirofosfat, 0,2 mM fenilmetansulfonilfluorid i inhibitor proteaza. Crvi su triput zamrznuti u tečnom dušiku i odmrznuti na 37°C, a zatim ultrazvučno obrađeni na suhom ledu ultrazvučnom jedinicom VialTweeter za istovremenu pripremu 10 epruveta s uzorcima. Sonikacija je provedena pri amplitudi od 50% u 10 ciklusa od po 2 sec. s pauzom od 30 sec između nizova ultrazvučnih impulsa. Nakon toga su uzorci centrifugirani pri 12.000 rpm na 4°C tokom 15 min. Supernatant je prikupljen i pohranjen na -70°C. Alikvot je korišten za kvantifikaciju proteina Bradfordovim testom.
Određivanje ukupnog glutationa, GSH i GSSG: Za kvantifikaciju glutationa lizati i određivanje izvedeni su istog dana. Larve L4 hranjene glukozom i kontrolne larve prikupljene su i triput isprane M9 puferom. Nakon što je uklonjena što veća količina M9 pufera, crvi su resuspendirani u ledeno hladnoj metafosfornoj kiselini (5% w/v), a zatim ultrazvučno obrađeni u ledu ultrazvučnim uređajem VialTweeter pri amplitudi od 50% u deset ciklusa sonikacije od po 2 sec. s pauzom od 30 sec. između svakog ciklusa. Nakon toga je centrifugirano pri 12.000 rpm na 4 ̊C tokom 15 min.
(usp. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Priprema uzoraka C. elegans prije imunoprecipitacije i Western bloda

Ukratko, za embrionalne ekstrakte larve C. elegans L1 uzgajane su u velikim tečnim kulturama S-medijuma do odrasle dobi. Embriji su prikupljeni standardnom metodom bijeljenja i suspendirani u liznom puferu (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glicerol, 0,05% NP-40, 1􏰅 koktel inhibitora proteaza i 1􏰅 koktel inhibitora fosfataza I i II), brzo zamrznuti u tečnom dušiku i lizirani ultrazvučnom razgradnjom ćelija pomoću ultrazvučnog uređaja s mikrosondom, kao što je UP200Ht sa S26d2, 10 impulsa tokom 10 s pri amplitudi od 30%. Ako se mora pripremiti veći broj uzoraka, preporučuju se ultrazvučni VialTweeter ili ultrazvučni uređaj za više uzoraka UIP400MTP za ploče s jažicama. Nakon sonikacije ekstrakti su prethodno očišćeni centrifugiranjem pri 30.000g tokom 20 min na 4°C. Prethodno očišćeni ekstrakt (300µg ukupnih proteina) inkubiran je s 40µ􏰂g afinitetno prečišćenog antitijela anti-CDC-25.1 (ova studija) umreženog s proteinom A-agarozom, ili je kao kontrola korištena slična količina imunoglobulina (Ig)G zeca umreženog s proteinom A-agarozom, u ukupnom volumenu od 200µl liznog pufera koji sadrži 1% NP-40, čije je uključivanje smanjilo nespecifično vezanje proteina za matriks. Uzorci su rotirani 1 h na 4°C, kuglice su triput isprane liznim puferom i eluirane s 30µl glicina/HCl i 200 mM NaCl, pH 2,2. Nakon imunoprecipitacije eluati su razrijeđeni u 30µ􏰂l SDS puferu za uzorke, zagrijani na 95°C tokom 4 min, a tipično 3% ukupne količine za ulaz i 30% za eluate naneseno je na SDS-PAGE, nakon čega je slijedio Western blot s antitijelima anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubikvitin (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) ili anti-􏰁β-aktin (1:2000). Kada ekstrakti nisu podvrgnuti imunoprecipitaciji, ista količina ukupnih proteina dobivenih iz tih ekstrakata resuspendirana je u SDS puferu za uzorke, zagrijana na 95°C, a zatim direktno nanesena na SDS-PAGE i analizirana Western blotom. (usp. Segref et al. 2020)

Ultrazvučna liza uz preciznu kontrolu temperature

Precizna i pouzdana kontrola temperature ključna je pri rukovanju biološkim uzorcima. Visoke temperature pokreću termički izazvanu razgradnju proteina u uzorcima.
Kao i sve mehaničke tehnike pripreme uzoraka, sonikacija stvara toplinu. Međutim, temperatura uzoraka može se dobro kontrolirati pri korištenju uređaja VialTweeter. Predstavljamo vam različite opcije za praćenje i kontrolu temperature vaših uzoraka tokom njihove pripreme za analizu pomoću VialTweeter i VialPress.

1. Praćenje temperature uzorka: Ultrazvučni procesor UP200St, koji pokreće VialTweeter, opremljen je inteligentnim softverom i priključnim temperaturnim senzorom. Priključite temperaturni senzor na UP200St i uronite vrh temperaturnog senzora u jednu od epruveta s uzorcima. Putem digitalnog kolor ekrana osjetljivog na dodir u meniju UP200St možete podesiti određeni temperaturni raspon za ultrazvučnu obradu uzorka. Ultrazvučni uređaj automatski će se zaustaviti kada se dostigne maksimalna temperatura i pauzirati dok temperatura uzorka ne padne na nižu vrijednost podešenog temperaturnog ∆. Zatim se sonikacija ponovo automatski pokreće. Ova pametna funkcija sprječava razgradnju izazvanu toplinom.
2. Blok VialTweeter može se prethodno ohladiti. Stavljanje bloka VialTweeter (samo sonotrode bez pretvarača!) u frižider ili zamrzivač radi prethodnog hlađenja titanijumskog bloka pomaže da se odgodi porast temperature u uzorku. Ako je moguće, i sam uzorak može se prethodno ohladiti.
3. Koristite suhi led za hlađenje tokom sonikacije. Koristite plitku posudu napunjenu suhim ledom i postavite VialTweeter na suhi led kako bi se toplina mogla brzo odvoditi.

Pronađite optimalan ultrazvučni uređaj za razgradnju ćelija za vašu primjenu lize

Hielscher Ultrasonics je dugogodišnji iskusni proizvođač visokoučinkovitih ultrazvučnih uređaja za razgradnju ćelija i homogenizatora za laboratorije, stolne i industrijske sisteme. Veličina vaše bakterijske ćelijske kulture, vaš istraživački ili proizvodni cilj i volumen ćelija koji se obrađuje po satu ili danu ključni su faktori za pronalaženje pravog ultrazvučnog uređaja za razgradnju ćelija za vašu primjenu.
Hielscher Ultrasonics nudi različita rješenja za istovremenu ultrazvučnu obradu više uzoraka (do 10 bočica) kao i masovnih uzoraka (tj. mikrotitarske ploče / ploče s 96 jažica), od klasičnog laboratorijskog ultrazvučnog uređaja sa sondom s različitim nivoima snage od 50 do 400 vati do potpuno industrijskih ultrazvučnih procesora sa do 16,000vati po jedinici za komercijalnu razgradnju ćelija i ekstrakciju proteina u velikoj proizvodnji. Svi Hielscher ultrazvučni uređaji izrađeni su za rad 24/7/365 pod punim opterećenjem. Robusnost i pouzdanost osnovne su karakteristike naših ultrazvučnih uređaja.
Svi digitalni ultrazvučni homogenizatori opremljeni su pametnim softverom, kolor ekranom osjetljivim na dodir i automatskim protokolisanjem podataka, što ultrazvučni uređaj čini praktičnim radnim alatom u laboratorijama i proizvodnim pogonima.
Recite nam koju vrstu ćelija, koji volumen, s kojom učestalošću i s kojim ciljem trebate obraditi svoje biološke uzorke. Preporučit ćemo vam najprikladniji ultrazvučni uređaj za razgradnju ćelija za zahtjeve vašeg procesa.

Tabela u nastavku daje vam orijentacijski prikaz približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih sistema, od kompaktnih ručnih homogenizatora i ultrazvučnih uređaja za više uzoraka do industrijskih ultrazvučnih procesora za komercijalne primjene: