Liza ćelija BL21 ćelija ultrazvukom
BL21 ćelije su soj E. coli koji se široko koristi u istraživačkim laboratorijama, biotehnologiji i industrijskoj proizvodnji zbog svoje sposobnosti da visoko efikasno eksprimiraju proteine. Ultrazvučno uništavanje ćelija, liza i ekstrakcija proteina uobičajena je metoda za izolaciju i prikupljanje ciljanih proteina iz ćelijske unutrašnjosti BL21 ćelija. Ultrazvučna obrada potpuno razbija ćeliju i oslobađa sve zarobljene proteine, čineći 100% proteina dostupnim.
BL21 ćelije za ekspresiju proteina
BL21 ćelija je hemijski kompetentan soj bakterije E. coli pogodan za transformaciju i ekspresiju proteina visokog nivoa korišćenjem sistema za indukciju T7 RNA polimeraze-IPTG. BL21 ćelije omogućavaju visokoefikasnu ekspresiju proteina bilo kojeg gena koji je pod kontrolom T7 promotora. E. coli soj BL21(DE3) je soj za proizvodnju proteina baziran na T7 RNA polimerazi u kombinaciji sa ekspresijskim vektorima baziranim na T7 promotoru i široko se primjenjuje u laboratorijama i industriji za proizvodnju rekombinantnih proteina. U BL21(DE3), ekspresija gena koji kodira rekombinantni protein se transkribuje hromozomski kodiranom T7 RNA polimerazom (T7 RNAP), koja se transkribuje osam puta brže od konvencionalnog E. coli RNAP. Ovo čini soj BL21(DE3) visoko efikasnim i pretvara ga u jedan od najpoželjnijih ćelijskih sistema za ekspresiju proteina.
Protokol za ultrazvučnu lizu i ekstrakciju proteina iz BL21 ćelija
Ćelijska liza BL21 ćelija se uglavnom izvodi pomoću ultrazvučne obrade u kombinaciji sa natrijum lauroil sarkozinatom (također poznatim kao sarkozil) kao puferom za lizu. Prednosti ultrazvučnog prekidanja ćelija i ekstrakcije proteina leže u pouzdanosti, ponovljivosti kao i jednostavnom, sigurnom i brzom radu ultrazvučnih aparata. Protokol u nastavku daje korak po korak smjernice za ultrazvučnu lizu BL21 ćelija:
- Da bi se uklonili proteini šaperona, BL21 bakterijske pelete su resuspendirane u 50 ml ledeno hladnog Natrijum Tris-EDTA (STE) pufera (koji se sastoji od 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl 0 dodatkom 10 mM NaCl PMSF).
- Doda se 500 ul lizozima (10 mg/ml) i ćelije se inkubiraju na ledu 15 minuta.
- Nakon toga se dodaje 500 ul DTT-a i 7 ml sarkozila (10% (w/v) sastavljeno u STE puferu).
- Od suštinske je važnosti da sve pufere za pročišćavanje držite ledeno hladnim i da uzorke održavate na ledu cijelo vrijeme. Sve korake pročišćavanja treba izvoditi u hladnoj prostoriji ako je moguće.
- Za ultrazvučnu lizu i ekstrakciju proteina, uzorci se sonikiraju u VialTweeter MultiSample Ultrasonicator za 4 x 30 sekundi pri 100% amplitude sa intervalom od 2 minute između svake ultrazvučne obrade. Alternativno, ultrazvučni homogenizator tipa sonde sa mikro vrhom, npr. UP200Ht sa S26d2 (3 x 30 sekundi, 2 min. pauze između ultrazvučnih ciklusa, 80% amplituda) može se koristiti.
- Za dalje korake prečišćavanja, uzorci se moraju držati na ledu ili alternativno čuvati na -80°C do daljnje obrade.
Ultrazvučni disruptor ćelija UP200St sa mikro vrhom S26d2 za lizu i ekstrakciju proteina
Ultrazvučna liza pod preciznom kontrolom temperature
Precizna i pouzdana kontrola temperature ključna je pri rukovanju biološkim uzorcima. Visoke temperature pokreću termički izazvanu razgradnju proteina u uzorcima.
Kao i sve tehnike mehaničke pripreme uzoraka, sonikacija stvara toplinu. Međutim, temperatura uzoraka se može dobro kontrolisati kada se koristi VialTweeter. Predstavljamo vam različite opcije za praćenje i kontrolu temperature vaših uzoraka dok ih pripremate pomoću VialTweeter-a i VialPress-a za analizu.
- Praćenje temperature uzorka: Ultrazvučni procesor UP200St, koji pokreće VialTweeter, opremljen je inteligentnim softverom i senzorom temperature koji se može priključiti. Uključite senzor temperature u UP200St i umetnite vrh senzora temperature u jednu od epruveta za uzorke. Preko digitalnog ekrana osetljivog na dodir u boji, možete podesiti u meniju UP200St određeni temperaturni opseg za vaš uzorak ultrazvuka. Ultrasonikator će se automatski zaustaviti kada se dostigne maksimalna temperatura i pauzirati dok temperatura uzorka ne padne na nižu vrijednost postavljene temperature ∆. Tada ultrazvuk počinje automatski ponovo. Ova pametna karakteristika sprečava degradaciju izazvanu toplotom.
- VialTweeter blok se može prethodno ohladiti. Stavite VialTweeter blok (samo sonotrodu bez sonde!) u frižider ili zamrzivač kako biste prethodno ohladili blok od titana koji pomaže da se odgodi porast temperature u uzorku. Ako je moguće, sam uzorak se također može prethodno ohladiti.
- Koristite suvi led za hlađenje tokom ultrazvučne obrade. Koristite plitku tacnu napunjenu suvim ledom i postavite VialTweeter na led tako da se toplota brzo rasprši.
Kupci širom svijeta koriste VialTweeter i VialPres za svoj svakodnevni rad na pripremi uzoraka u biološkim, biohemijskim, medicinskim i kliničkim laboratorijama. Inteligentni softver i kontrola temperature UP200St procesora, temperatura se pouzdano kontroliše i izbegava se degradacija uzorka izazvana toplotom. Ultrazvučna priprema uzorka sa VialTweeterom i VialPressom daje visoko pouzdane i ponovljive rezultate!
Pronađite optimalni ultrazvučni disruptor za vašu aplikaciju za lizu
Hielscher Ultrasonics je dugogodišnji iskusan proizvođač ultrazvučnih disruptora ćelija visokih performansi i homogenizatora za laboratorije, stolne i industrijske sisteme. Veličina vaše bakterijske ćelijske kulture, vaš istraživački ili proizvodni cilj i volumen ćelije za obradu po satu ili danu su ključni faktori za pronalaženje pravog ultrazvučnog disruptora ćelija za vašu primjenu.
Hielscher Ultrasonics nudi različita rješenja za istovremenu ultrazvučnu obradu više uzoraka (do 10 bočica sa VialTweeterom) i masovnih uzoraka (tj. mikrotitarske ploče / ELISA ploče sa UIP400MTP), kao i klasični laboratorijski ultrasonikator tipa sonde sa različitim nivoi snage od 50 do 400 vati do potpuno industrijskih ultrazvučnih procesora sa do 16.000 vati po jedinici za komercijalno uništavanje ćelija i ekstrakciju proteina u velikoj proizvodnji. Svi Hielscher ultrasonikatori su napravljeni za rad 24/7/365 pod punim opterećenjem. Robusnost i pouzdanost su osnovne karakteristike naših ultrazvučnih uređaja.
Svi digitalni ultrazvučni homogenizatori opremljeni su pametnim softverom, ekranom na dodir u boji i automatskim protokoliranjem podataka, što ultrazvučni uređaj čini praktičnim radnim alatom u laboratorijima i proizvodnim pogonima.
Javite nam koje vrste ćelija, koji volumen, kojom frekvencijom i sa kojim ciljem morate da obrađujete svoje biološke uzorke. Preporučit ćemo vam najprikladniji ultrazvučni disruptor ćelija za vaše zahtjeve procesa.
Tabela u nastavku daje vam indikaciju približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih sistema od kompaktnih ručnih homogenizatora i MultiSample Ultrasonicatora do industrijskih ultrazvučnih procesora za komercijalne primjene:
| Batch Volume | Flow Rate | Preporučeni uređaji |
|---|---|---|
| 96 jažica / mikrotitarske ploče | N / A | UIP400MTP |
| 10 bočica od 0,5 do 1,5 ml | N / A | VialTweeter na UP200St |
| 00,01 do 250 ml | 5 do 100 ml/min | UP50H |
| 00,01 do 500 ml | 10 do 200 ml/min | UP100H |
| 10 do 2000 ml | 20 do 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 do 20L | 0.2 do 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 do 100L | 2 do 10 l/min | UIP4000hdT |
| N / A | 10 do 100L/min | UIP16000 |
| N / A | veći | klaster of UIP16000 |
Kontaktiraj nas! / Pitajte nas!
UIP400MTP Sonicator ploča za razbijanje ćelija visokog protoka u pločama sa 96 jažica
ultrasonicator UP200Ht sa mikrovrhom od 2 mm S26d2 za sonikaciju malih uzoraka
Pročitajte više o tome kako možete koristiti svoj ultrazvučni homogenizator tkiva za efikasnu i pouzdanu pripremu puferskih otopina!
Činjenice koje vrijedi znati
Bakterije Escherichia Coli
Escherichia coli je vrsta bakterije, koja ne stvara spore, gram-negativna i karakterizira je oblik ravnog štapića. Bakterije E.coli prisutne su u životnoj sredini, hrani i crijevima ljudi i životinja. E. coli je obično pokretna pomoću peritrihoznih flagela, ali postoje i nepomični tipovi. E.coli su takozvani fakultativno anaerobni hemoorganotrofni organizmi, što znači da su sposobni i za respiratorni i za fermentativni metabolizam. Većina vrsta E.coli su benigne i ispunjavaju korisne funkcije u tijelu, npr. potiskuju rast štetnih vrsta bakterija, sintetiziraju vitamine itd.
Ćelije bakterije Escherichia coli takozvanog B tipa su posebna kategorija sojeva E.coli, koji se široko koriste u istraživanjima za ispitivanje mehanizama kao što su osjetljivost bakteriofaga ili sistemi restrikcijske modifikacije. Nadalje, bakterije E.coli cijenjene su kao pouzdani radni konj za ekspresiju proteina u biotehnološkim i laboratorijama prirodnih znanosti. Na primjer, E.coli se koristi za sintetizaciju jedinjenja kao što su proteini i oligosaharidi u industrijskom obimu. Zbog specifičnih karakteristika kao što su nedostatak proteaze, niska proizvodnja acetata pri visokom nivou glukoze i povećana permeabilnost, E. coli B ćelije su najčešće korišćene ćelije domaćini za proizvodnju genetski modifikovanih proteina.
Rekombinantni protein
Rekombinantni proteini (rProt) dobijaju značajan značaj u raznim granama, uključujući hemijsku proizvodnju, farmaceutsku, kozmetičku, humanu i životinjsku medicinu, poljoprivredu, prehrambenu industriju kao i industriju tretmana otpada.
Proizvodnja rekombinantnog proteina zahteva upotrebu ekspresionog sistema. Kao ekspresioni ćelijski sistemi za proizvodnju rekombinantne DNK, mogu se koristiti i prokariotske i eukariotske ćelije. Dok se bakterijske ćelije najčešće koriste za ekspresiju proteina zbog faktora kao što su niska cijena, laka skalabilnost i jednostavni uvjeti medija, sistemi sisara, kvasaca, algi, insekata i bez ćelija su uspostavljene alternative. Tip proteina, funkcionalna aktivnost, kao i potreban prinos eksprimiranog proteina utiču na izbor ćelijskog sistema koji će se koristiti za ekspresiju proteina.
Da bi se eksprimirao rekombinantni protein, određena ćelija mora biti transficirana sa DNK vektorom koji sadrži šablon rekombinantne DNK. Ćelije transficirane šablonom se zatim uzgajaju. Kao posljedica ćelijskog mehanizma, stanice transkribiraju i prevode protein od interesa, proizvodeći na taj način ciljani protein.
Kako su eksprimirani proteini zarobljeni u ćelijskom matriksu, ćelija mora biti lizirana (poremećena i razbijena) da bi se proteini oslobodili. U sljedećem koraku prečišćavanja, protein se odvaja i prečišćava.
Prvi rekombinantni protein korišten u liječenju bio je rekombinantni humani inzulin 1982. godine. Danas se širom svijeta proizvodi više od 170 vrsta rekombinantnog proteina za medicinske tretmane. Uobičajeni rekombinantni proteini koji se koriste u medicini su na primjer rekombinantni hormoni, interferoni, interleukini, faktori rasta, faktori tumorske nekroze, faktori zgrušavanja krvi, trombolitici i enzimi za liječenje glavnih bolesti kao što su dijabetes, patuljastost, infarkt miokarda, kongestivno zatajenje srca, cerebralna apopleksija, multipla skleroza, neutropenija, trombocitopenija, anemija, hepatitis, reumatoidni artritis, astma, Crohnova bolest i terapije raka. (usp. Phuc V. Pham, u Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Literatura / Reference
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
VialTweeter Sonicator za simultanu sonikaciju 10 uzoraka, npr. da se poremete BL21 ćelije
Ultrazvuk visokih performansi! Hielscherov asortiman proizvoda pokriva cijeli spektar od kompaktnog laboratorijskog ultrazvučnog aparata preko stolnih jedinica do potpuno industrijskih ultrazvučnih sistema.