Liza ćelija BL21 ultrazvučnom obradom

Ćelije BL21 su soj bakterije E. coli koji se široko koristi u istraživačkim laboratorijama, biotehnologiji i industrijskoj proizvodnji zbog sposobnosti vrlo efikasne ekspresije proteina. Ultrazvučna razgradnja ćelija, liza i ekstrakcija proteina uobičajena je metoda za izolaciju i prikupljanje ciljanih proteina iz unutrašnjosti ćelija BL21. Ultrazvučna obrada potpuno razgrađuje ćeliju i oslobađa sve zarobljene proteine, čime je 100% proteina dostupno.

Ćelije BL21 za ekspresiju proteina

Ćelija BL21 je hemijski kompetentan bakterijski soj E. coli, pogodan za transformaciju i ekspresiju proteina na visokom nivou pomoću indukcijskog sistema T7 RNA polimeraza–IPTG. Ćelije BL21 omogućavaju visokoefikasnu ekspresiju proteina bilo kojeg gena koji je pod kontrolom T7 promotora. Soj E. coli BL21(DE3) je soj za proizvodnju proteina zasnovan na T7 RNA polimerazi, kombinovan s ekspresijskim vektorima zasnovanim na T7 promotoru, a široko se primjenjuje u laboratorijama i industriji za proizvodnju rekombinantnih proteina. U soju BL21(DE3) ekspresija gena koji kodira rekombinantni protein transkribuje se pomoću T7 RNA polimeraze (T7 RNAP) kodirane na hromosomu, koja transkribuje osam puta brže od konvencionalne RNAP bakterije E. coli. Zbog toga je soj BL21(DE3) vrlo efikasan i ubraja se u najpoželjnije ćelijske sisteme za ekspresiju proteina.

Protokol za ultrazvučnu lizu i ekstrakciju proteina iz ćelija BL21

Liza ćelija BL21 uglavnom se provodi ultrazvučnom obradom u kombinaciji s natrijevim lauroil sarkozinatom (poznatim i kao sarkosil) kao puferom za lizu. Prednosti ultrazvučne razgradnje ćelija i ekstrakcije proteina leže u pouzdanosti, ponovljivosti te jednostavnom, sigurnom i brzom radu ultrazvučnih uređaja. Protokol u nastavku daje upute korak po korak za ultrazvučnu lizu ćelija BL21:

• Da bi se uklonili šaperonski proteini, bakterijski peleti BL21 resuspendirani su u 50 ml ledeno hladnog natrijevog Tris-EDTA (STE) pufera (koji se sastoji od 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl uz dodatak 100 mM PMSF).
• Zatim se dodaje 500 ul lizozima (10 mg/ ml) i ćelije se inkubiraju na ledu 15 min.
• Nakon toga se dodaje 500 ul DTT-a i 7 ml sarkosila (10% (w/v) pripremljenog u STE puferu).
• Ključno je da svi puferi za pročišćavanje budu ledeno hladni i da se uzorci cijelo vrijeme drže na ledu. Svi koraci pročišćavanja trebaju se, ako je moguće, provoditi u hladnoj prostoriji.



• Za ultrazvučnu lizu i ekstrakciju proteina uzorci se ultrazvučno obrađuju u uređaju VialTweeter MultiSample Ultrasonicator 4 x 30 sek pri amplitudi od 100% s intervalom od 2 min između pojedinačnih sonikacija. Alternativno se može koristiti ultrazvučni homogenizator sa sondom i mikrovrhom, npr. UP200Ht sa S26d2 (3 x 30 sek, pauza od 2 min između ultrazvučnih ciklusa, amplituda 80%).
• Za dalje korake pročišćavanja uzorci se moraju držati na ledu ili alternativno pohraniti na -80°C do daljnje obrade.

Ultrazvučna liza uz preciznu kontrolu temperature

Precizna i pouzdana kontrola temperature ključna je pri radu s biološkim uzorcima. Visoke temperature pokreću termički uzrokovanu razgradnju proteina u uzorcima.
Kao i sve mehaničke tehnike pripreme uzoraka, ultrazvučna obrada stvara toplinu. Međutim, temperatura uzoraka može se dobro kontrolisati pri korištenju uređaja VialTweeter. Predstavljamo vam različite mogućnosti praćenja i kontrole temperature vaših uzoraka tokom njihove pripreme za analizu pomoću uređaja VialTweeter i VialPress.

1. Praćenje temperature uzorka: Ultrazvučni procesor UP200St, koji pokreće VialTweeter, opremljen je inteligentnim softverom i temperaturnim senzorom koji se može priključiti. Priključite temperaturni senzor na UP200St i uvedite vrh temperaturnog senzora u jednu od epruveta s uzorkom. Putem digitalnog ekrana osjetljivog na dodir u boji, u meniju uređaja UP200St možete postaviti određeni temperaturni raspon za ultrazvučnu obradu uzorka. Ultrazvučni uređaj će se automatski zaustaviti kada se dosegne maksimalna temperatura i ostati u pauzi dok temperatura uzorka ne padne na nižu vrijednost zadane temperature ∆. Zatim se ultrazvučna obrada ponovo automatski pokreće. Ova pametna funkcija sprječava razgradnju uzrokovanu toplinom.
2. Blok VialTweeter može se prethodno ohladiti. Stavljanje bloka VialTweeter (samo sonotrode bez pretvarača!) u frižider ili zamrzivač radi prethodnog hlađenja titanskog bloka pomaže odgoditi porast temperature u uzorku. Ako je moguće, i sam uzorak se može prethodno ohladiti.
3. Za hlađenje tokom ultrazvučne obrade koristite suhi led. Koristite plitku posudu napunjenu suhim ledom i postavite VialTweeter na led tako da se toplina može brzo odvoditi.

Kupci širom svijeta koriste VialTweeter i VialPress za svakodnevnu pripremu uzoraka u biološkim, biohemijskim, medicinskim i kliničkim laboratorijama. Zahvaljujući inteligentnom softveru i kontroli temperature procesora UP200St temperatura se pouzdano kontroliše, a razgradnja uzoraka uzrokovana toplinom se izbjegava. Ultrazvučna priprema uzoraka pomoću uređaja VialTweeter i VialPress daje vrlo pouzdane i ponovljive rezultate!

Pronađite optimalan ultrazvučni dezintegrator za vašu primjenu liziranja

Hielscher Ultrasonics je dugogodišnji iskusni proizvođač visokoučinkovitih ultrazvučnih dezintegratora ćelija i homogenizatora za laboratorije, stolne i industrijske sisteme. Veličina vaše bakterijske ćelijske kulture, vaš istraživački ili proizvodni cilj i količina ćelija koje treba obraditi po satu ili danu ključni su faktori za pronalaženje pravog ultrazvučnog dezintegratora ćelija za vašu primjenu.
Hielscher Ultrasonics nudi različita rješenja za istovremenu ultrazvučnu obradu više uzoraka (do 10 bočica s uređajem VialTweeter) i masovnih uzoraka (tj. mikrotitarskih ploča / ELISA ploča s uređajem UIP400MTP), kao i klasične laboratorijske ultrazvučne uređaje sa sondom s različitim nivoima snage od 50 do 400 vati te potpuno industrijske ultrazvučne procesore snage do 16,000vati po jedinici za komercijalnu razgradnju ćelija i ekstrakciju proteina u velikoj proizvodnji. Svi Hielscher ultrazvučni uređaji izrađeni su za rad 24/7/365 pod punim opterećenjem. Robusnost i pouzdanost su ključne karakteristike naših ultrazvučnih uređaja.
Svi digitalni ultrazvučni homogenizatori opremljeni su pametnim softverom, ekranom osjetljivim na dodir u boji i automatskim protokolisanjem podataka, zbog čega ultrazvučni uređaj postaje praktičan radni alat u laboratorijama i proizvodnim pogonima.
Recite nam koju vrstu ćelija, koji volumen, s kojom frekvencijom i s kojim ciljem trebate obraditi svoje biološke uzorke. Preporučit ćemo vam najprikladniji ultrazvučni dezintegrator ćelija za zahtjeve vašeg procesa.

Tabela u nastavku daje okvirni pregled približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih sistema, od kompaktnih ručnih homogenizatora i višeuzoračkih ultrazvučnih uređaja MultiSample do industrijskih ultrazvučnih procesora za komercijalne primjene:

Literatura / reference

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.