Ultrazvučno smicanje DNK

Tokom smicanja DNK i RNK dugi molekuli DNK fragmentiraju se na manje dijelove, što je ključni korak u pripremi uzoraka za izradu biblioteka za sekvenciranje sljedeće generacije (NGS). Ultrazvučno smicanje DNK koristi sile akustične kavitacije za razlaganje DNK ili RNK na fragmente veličine od 100 bp do 5 kb. Ova metoda omogućava preciznu kontrolu veličine fragmenata, čime se olakšava prilagođavanje željenoj dužini DNK za optimalne rezultate sekvenciranja.

Smicanje DNK ultrazvučnom obradom

Hielscher Ultrasonics nudi različita rješenja zasnovana na ultrazvuku za smicanje DNK, RNK i hromatina. Birajte između ultrazvučnih uređaja sa sondom (npr. UP100H) za direktnu ultrazvučnu obradu pomoću mikrovrha ili koristite VialTweeeter ili ultrazvučni cuphorn za indirektnu pripremu DNK iz različitih uzoraka istovremeno. Hielscher nudi idealan uređaj za vaše potrebe: bilo da imate 1 ili do 10 uzoraka, zapremine od mikrolitarskih do litarskih – Hielscher sonikatori ispunit će vaše zahtjeve za pripremu fragmenata DNK, RNK i hromatina odgovarajuće dužine. Ponovljivost, jednostavno rukovanje i precizna kontrola omogućavaju pouzdanu biblioteku za sekvenciranje sljedeće generacije.
Za razliku od enzimske fragmentacije DNK, ultrazvučno smicanje primjenjuje isključivo mehaničke smične sile bez dodavanja ikakvih kemikalija. Preciznim podešavanjem procesnih parametara ultrazvučno smicanje daje fragmente DNK velike molekulske mase (plazmidna i genomska DNK).
Pročišćene nukleinske kiseline mogu se amplificirati prije ili poslije koraka fragmentacije.
Parametri ultrazvučne obrade (snaga, pulsni ciklus / impulsi, vrijeme i temperatura) mogu se pouzdano kontrolirati putem postavki softvera.

Protokoli za ultrazvučno smicanje DNK

Za test hromatinske imunoprecipitacije

Ukratko, ćelije su zasijane u posude promjera 60mm (400.000 po posudi) i transficirane RhoA siRNK (kako je opisano); nakon 72 h inkubirane su s formaldehidom (konačna koncentracija, 1%) tokom 10 min na 37°C radi umrežavanja proteina s DNK. Reakcija umrežavanja zaustavljena je dodatkom jedne desetine zapremine 1,25 mol/L glicina, čime je dobivena konačna koncentracija od 125 mmol/L. Ćelije su dvaput isprane ledeno hladnim PBS-om, resuspendirane u puferu za radioimunoprecipitacijski test [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoksiholata, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] koji je sadržavao 1 mmol/L fenilmetilsulfonil fluorida, 1 Ag/mL aprotinina i 1 Ag/mL pepstatina A, te držane na ledu 30 min. Zatim su ćelijski lizati ultrazvučno obrađeni na ledu pomoću Hielscher UP200S ultrazvučnog sonikatora (3 x 40 s, amplituda 40%, ciklus 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) sve dok umreženi hromatini nisu izmičeni u fragmente DNK veličine između 200 i 1.000 bp. Jedna desetina cijelog lizata korištena je za kvantifikaciju količine DNK prisutne u različitim uzorcima i smatrana je „ukupnom ulaznom DNK”. Supernatanti su inkubirani sa suspenzijom DNK iz sperme lososa/protein agaroza-50% radi smanjenja nespecifične pozadine. Imunoprecipitacija je zatim provedena preko noći na 4°C s 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) ili bez antitijela (negativna kontrola). Ovim supernatantima dodano je 5 mol/L NaCl te su zagrijavani preko noći na 65°C radi poništavanja umreženja protein-DNK. Imunokompleksi su dodatno tretirani proteinazom K bez DNaza i RNaza, a DNK je pročišćena ekstrakcijom fenolom/hloroformom i taloženjem etanolom. PCR je izveden sa specifičnim početnicama koje odgovaraju sekvenci unutar promotorske regije humanog gena iNOS (p1 početnica: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 početnica: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Studije ekspresije EGFP-a

Za studije ekspresije rekombinantni soj L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Germany) s genom za EGFP (poboljšani zeleni fluorescentni protein), kromosomski integriranim u ssu, uzgajan je u različitim medijima kako je prethodno opisano i dodatno nadopunjen sa 100 mg l^-1 Nourseothricina (Jena Bioscience, Germany). Tokom uzgoja uzimani su uzorci od 1 ml, centrifugirani (2000 × g, 20°C, 10 min) i isprani 0,9% otopinom NaCl. Talog je resuspendiran u puferu (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) i razgrađen sonifikacijom ultrazvučnim procesorom UP400S (primijenjena energija ∼ 400 Ws). Ćelijski ostaci uklonjeni su centrifugiranjem (6000 × g, 4°C, 5 min) i analizirani natrijum dodecil sulfat – poliakrilamidnom gel elektroforezom (SDS-PAGE) u redukcijskim uvjetima prema metodi Laemmlija (1970) na 12,5% poliakrilamidnim gelovima. Ekspresija EGFP-a ispitivana je u kulturi s miješanjem. (Fritsche et al. 2007)

Hromatinska imunoprecipitacija

Test hromatinske imunoprecipitacije izveden je pomoću ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) prema uputama proizvođača uz neke izmjene. Ukratko, diferencirani humani podociti umreženi su 1% formaldehidom tokom 10 min na sobnoj temperaturi. Ćelije su isprane ledeno hladnim PBS-om, a reakcija fiksacije zaustavljena je dodavanjem 0,125 M glicina tokom 5 min na sobnoj temperaturi. Ćelije su ponovo isprane ledeno hladnim PBS-om i sastrugane s posude. Ćelije su sedimentirane centrifugiranjem i resuspendirane u puferu za lizu. Nakon centrifugiranja sedimentirana jezgra resuspendirana su u puferu za smicanje, inkubirana na ledu 30 min, a hromatin je izmičen sonikacijom, npr. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Germany) pri 25% snage, 5 impulsa od po 20 sec na ledu, u fragmente od približno 200–600 bp. Izmičeni hromatin je zatim centrifugiran i supernatant je prikupljen. Za imunoprecipitacije je 60 μl hromatina inkubirano s 1 μg antitijela Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) ili NF-κB p50 (Abcam) ili s IgG kunića (Zymed Laboratories), kao negativnom kontrolom, preko noći na 4°C uz blago rotiranje. Imunokompleksi vezani za magnetne kuglice prikupljeni su pomoću magnetnog stalka, temeljito isprani, a umreženja protein/DNK su poništena i DNK eluirana za analizu PCR-om u realnom vremenu. (Ristola et al. 2009)

Priprema DNK iz bakterije EHEC za analizu na čip nizu

Priprema ćelijskih lizata i ekstrahirane DNK
Bakterijski talozi suspendirani u PBS-u do željene konačne koncentracije obrađeni su ultrazvučnim dezintegratorom UP100H (Hielscher GmbH, Germany) opremljenim mikrovrhom MS1 (promjera 1mm). Radna frekvencija bila je 30 kHz, a efektivna izlazna snaga 100 W. Tokom rada uzorci su hlađeni u kupelji od leda i vode, miješani i centrifugirani. Uzorci su korišteni za studije protočne citometrije, dok su za kasniju obradu uzorci podvrgnuti toplinskom tretmanu (95°C, 5 min). Sirovi ćelijski lizati obrađeni su smjesom fenola, hloroforma i izoamil alkohola (25:24:1). Jednaka zapremina ove smjese dodana je uzorku lizata, otopina je snažno miješana na vorteksu 15 s i centrifugirana na 15.000 x g tokom 2 min na sobnoj temperaturi (RT) od oko 22°C. Gornja vodena faza koja sadrži genomsku DNK pažljivo je odvojena i prikupljena u novu sterilnu Eppendorf epruvetu.
Potom su uzorci ultrazvučno obrađeni radi fragmentacije DNK. Korak ultrazvučne obrade proveden je pod istim uvjetima kako je opisano gore. Za procjenu učinaka fragmentacije na genomsku DNK uzorci su analizirani agaroznom gel elektroforezom.
(…) Uzorci prethodno ultrazvučno obrađeni 2,5 min podvrgnuti su koraku ekstrakcije nakon toplinskog tretmana i centrifugiranja. Oslobođena DNK ekstrahirana je dvaput smjesom fenola, hloroforma i izoamil alkohola, a zatim podvrgnuta drugoj ultrazvučnoj obradi u trajanju od 0 – 15 min. Agarozna gel elektroforeza korištena je za određivanje raspodjele veličine DNK podvrgnute ultrazvučnoj fragmentaciji nakon ekstrakcije (sl. gore desno). Jaka fragmentacija DNK bila je očita po prisustvu razmazane trake DNK umjesto traka velike molekulske mase, koje su nestale iz uzoraka ultrazvučno obrađenih 2,5 min ili duže. Duža ultrazvučna obrada postupno je smanjivala dužinu fragmenata na približno 150 – 600 bp, a ultrazvučna obrada od 15 min dodatno je razgradila ove fragmente, što se uglavnom vidi po gornjem dijelu razmazane trake. Dakle, prosječna veličina fragmenata DNK postupno se smanjivala s trajanjem ultrazvučne obrade, a tretman od 5 min omogućio je dobivanje veličina fragmenata DNK najpogodnijih za testove na čip nizu. Naposljetku je uspostavljen postupak pripreme DNK analita koji obuhvata prvih 2 min ultrazvučnog tretmana, ekstrakciju DNK (2×) i naknadnu ultrazvučnu obradu od 5 min. (Basselet et al. 2008)

Hromatinska imunoprecipitacija (ChIP)

Ćelije HEK293 uzgajane su kako je opisano gore i fiksirane s 2 mM disuccinimidil glutaratom tokom 45 min na sobnoj temperaturi. Potom su ćelije dvaput isprane PBS-om. Hromatin je umrežen tokom 10 min na sobnoj temperaturi pomoću 1% (v/v) formaldehida i dvaput ispran ledeno hladnim PBS-om. Reakcija umrežavanja zaustavljena je inkubacijom s glicinom u konačnoj koncentraciji od 0,125 M tokom 5 min na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije s tripsinom ćelije su sastrugane s posude za ćelijsku kulturu i dvaput isprane PBS-om. Ćelijski talog resuspendiran je u puferu za lizu (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl i 0,5% (v/v) Nonidet P-40), inkubiran na ledu 10 min i homogeniziran Dounceovim homogenizatorom. Potom su jezgra sedimentirana centrifugiranjem (3500 x g, 5 min, 4 °C) i resuspendirana u puferu za jezgra (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA i 1% (w/v) SDS). Jezgra su razgrađena ultrazvučnom obradom s tri impulsa od po 20 s u UP50H sonikatoru (Hielscher Ultraschall Technologie) pri postavci ciklusa 0,5 i amplitudi 30%, čime su dobiveni fragmenti genomske DNK s pretežnom veličinom od 200 – 1000 bp. Za ChIP je 50g DNK razrijeđeno 4 puta u puferu za imunoprecipitaciju (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 i 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Analiza modifikacija histona hromatinskom imunoprecipitacijom (ChIP)

Ukratko, 6 x 10⁶ ćelija dvaput je isprano PBS-om i umreženo na kulturnoj ploči tokom 15 min na sobnoj temperaturi u prisustvu 0,5% formaldehida. Reakcija umrežavanja zaustavljena je dodavanjem 0,125 M glicina. Svi sljedeći koraci izvedeni su na 48°C. Svi puferi bili su prethodno ohlađeni i sadržavali su inhibitore proteaza (Complete Mini, Roche). Ćelije su dvaput isprane PBS-om i zatim sastrugane. Prikupljeni talozi otopljeni su u 1 ml pufera za lizu (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) i ultrazvučno obrađeni u kupelji od hladnog etanola tokom 10 ciklusa pri 100% amplitude pomoću UP50H sonikatora (Hielscher, Teltow, Germany). Fragmentacija hromatina vizualizirana je na 1% agaroznom gelu. Dobiveni fragmenti bili su u rasponu od 200–500pb. Topivi hromatin dobiven je centrifugiranjem ultrazvučno obrađenih uzoraka na 14.000g tokom 10 min na 48°C. Topiva frakcija razrijeđena je 1/10 u puferu za razrjeđivanje (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), zatim razdijeljena u alikvote i pohranjena na 80°C do upotrebe. (Rodriguez et al. 2008)