Ultrazvučno DNK smicanje

• Tokom smicanja DNK i RNK, molekuli DNK se razbijaju na manje komade. DNK/RNA fragmentacija je jedan od važnih koraka pripreme uzorka potrebnih za kreiranje biblioteka za sekvenciranje sljedeće generacije (NGS).
• Ultrazvučno smicanje DNK koristi sile akustične kavitacije da razbije DNK ili RNK na komade od 100 – 5kb bp.
• Ultrazvučno smicanje omogućava preciznu fragmentaciju DNK i prilagođavanje željenoj dužini DNK.

Smicanje DNK pomoću ultrazvuka

Hielscher Ultrasonics nudi različita rješenja zasnovana na ultrazvuku za smicanje DNK, RNK i hromatina. Birajte između ultrazvučnih uređaja tipa sonde (npr. UP100H) za direktnu sonikaciju pomoću mikrotipke ili koristite VialTweeter ili ultrazvučni cuphorn za indirektnu pripremu DNK različitih uzoraka istovremeno. Hielscher nudi idealan uređaj s obzirom na vaše potrebe: bilo da imate 1 ili do 10 uzoraka, zapremine od mikrolitara do litara – Hielscher ultrazvučni procesori su dostupni da zadovolje vaše zahtjeve za pripremu DNK, RNK i hromatinskih fragmenata na pravoj dužini. Reproducibilnost, jednostavan rad i precizna kontrola omogućavaju pouzdanu biblioteku za sekvenciranje sljedeće generacije.
Za razliku od enzimske fragmentacije DNK, ultrazvučno smicanje primjenjuje čiste mehaničke sile smicanja bez dodavanja ikakvih kemikalija. Preciznim podešavanjem parametara procesa, ultrazvučno smicanje proizvodi fragmente DNK visoke molekularne težine (plazmid i genomska DNK).
Prečišćene nukleinske kiseline mogu se amplificirati prije ili nakon koraka fragmentacije.
Parametri ultrazvučne obrade (snaga, pulsni ciklus/rafali, vrijeme i temperatura) mogu se sigurno kontrolirati putem softverskih postavki.

Protokoli za ultrazvučno smicanje DNK

Za analizu imunoprecipitacije hromatina

Ukratko, ćelije su postavljene u posude prečnika 60 mm (400 000 po posudi) i transficirane sa RhoA siRNA (kao što je opisano); nakon 72 h, inkubirani su sa formaldehidom (konačna koncentracija, 1%) tokom 10 minuta na 37°C da bi se proteini poprečno povezali sa DNK. Reakcija umrežavanja je ugašena dodatkom jedne desetine zapremine 1,25 mol/L glicina, dajući konačnu koncentraciju od 125 mmol/L. Ćelije su dva puta isprane ledeno hladnim PBS, resuspendirane u puferu za radioimunoprecipitaciju [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoksiholat, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl.0pH )] koji sadrži 1 mmol/L fenilmetilsulfonil fluorida, 1 Ag/mL aprotinina i 1 Ag/mL pepstatina A, i držan na ledu 30 minuta. Zatim su ćelijski lizati ultrazvučni na ledu sa a Hielscher UP200S ultrazvučni sonikator (3 x 40 s, amplituda 40%, ciklus 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) dok se umreženi hromatini ne preseku kako bi se dobili DNK fragmenti između 200 i 1000 bp. Jedna desetina cijelog lizata korištena je za kvantificiranje količine DNK prisutne u različitim uzorcima i smatrana je kao “ukupna ulazna DNK”. Supernatanti su inkubirani sa DNK sperme lososa/protein agaroza-50% suspenzije da bi se smanjila nespecifična pozadina. Imunoprecipitacija je zatim obavljena preko noći na 4°C sa 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) ili bez antitela (negativna kontrola). Ovi supernatanti su dopunjeni sa 5 mol/L NaCl i zagrevani preko noći na 65°C da bi se povratile unakrsne veze između proteina i DNK. Imunokompleksi su dalje tretirani proteinazom K bez DNaze i RNaze, a DNK je pročišćena ekstrakcijom fenolom/hloroformom i precipitacijom etanolom. PCR je urađen sa specifičnim prajmerima koji odgovaraju sekvenci unutar promotorskog regiona humanog iNOS gena (p1 prajmer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA-GAACCAAG-3¶; p2 prajmer: GCTGGGCTACTGACCCAG-CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008.)

Studije ekspresije EGFP

Za ekspresijske studije, rekombinantni soj L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Njemačka) sa genom za EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), integrisanim hromozomskim ssu, uzgajan je u različitim medijima kako je prethodno opisano i dodatno dopunjen sa 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Njemačka). Tokom kultivacije, uzeti su uzorci od 1 ml, centrifugirani (2000 × g, 20°C, 10 min) i isprani 0,9% rastvorom NaCl. Pelet je resuspendiran u puferu (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) i dezintegriran sonifikacijom pomoću ultrazvučnog procesora UP400S (primjena energije ∼ 400 Ws). Ćelijski ostaci su uklonjeni centrifugiranjem (6000 × g, 4°C, 5 min) i analizirani elektroforezom natrijum dodecil sulfat – poliakrilamid gel (SDS-PAGE) u redukcionim uslovima prema metodi Laemmlija (1970) sa 12,5% poliakralamidnih gelova . Ekspresija EGFP-a je ispitivana u agitiranoj kulturi. (Fritsche et al. 2007.)

hromatinska imunoprecipitacija

Analiza imunoprecipitacije hromatina izvedena je pomoću ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) prema uputama proizvođača uz neke izmjene. Ukratko, diferencirani ljudski podociti su umreženi sa 1% formaldehida 10 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije su isprane ledeno hladnim PBS-om i reakcija fiksacije je zaustavljena dodavanjem 0,125 M glicina tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije su ponovo isprane ledeno hladnim PBS-om i sastrugane sa posude. Ćelije su peletirane centrifugiranjem i resuspendirane u puferu za lizu. Nakon centrifugiranja, peletirana jezgra su resuspendirana u puferu za smicanje, inkubirana na ledu 30 minuta, a kromatin je srezan ultrazvukom, npr. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Njemačka) pri 25% snage 5 impulsa od 20 sekundi svaki na ledu u fragmente od približno 200-600 bp. Odrezani hromatin je zatim centrifugiran i supernatant je sakupljen. Za imunoprecipitacije, 60 μl hromatina je inkubirano sa 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornija, SAD), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) ili NF-κB p50 (Abcam) antitijela ili sa zečjim IgG (Zymed Laboratories, Južni San Francisko, Kalifornija, SAD), kao negativna kontrola, preko noći na 4°C uz laganu rotaciju. Imunokompleksi vezani za magnetne kuglice sakupljeni su pomoću magnetnog postolja, opsežno isprani, a unakrsne veze protein/DNK su obrnute i DNK je eluirana za PCR analizu u realnom vremenu. (Ristola et al. 2009.)

Priprema EHEC DNK za analizu niza čipova

Raspored ćelijskih lizata i ekstrahovanih DNK
Bakterijske pelete suspendirane u PBS do željene konačne koncentracije su tretirane s ultrazvučni disruptor UP100H (Hielscher GmbH, Njemačka) opremljen mikrovrhom MS1 (1 mm u prečniku). Radna frekvencija je bila 30 kHz, a efektivna izlazna snaga je bila 100 W. Tokom rada, uzorci su hlađeni u kupatilu s ledom i vodom, miješani i centrifugirani. Uzorci su korišteni za studije protočne citometrije, dok su za kasnije rukovanje uzorci podvrgnuti toplinskoj obradi (95°C, 5 min). Sirovi ćelijski lizati su obrađeni sa mešavinom fenol:hloroform:izoamil alkohol (25:24:1). Jednaka zapremina ove mešavine je dodata uzorku lizata, rastvor je snažno vorteksan tokom 15 s i centrifugiran na 15,000 xg tokom 2 minuta na sobnoj temperaturi (RT) oko 22°C. Gornja vodena faza koja sadrži genomsku DNK pažljivo je odvojena i sakupljena u novu sterilnu Eppendorf epruvetu.
Nakon toga, uzorci su ultrazvučni radi fragmentacije DNK. Korak sonikacije je realizovan u istim uslovima kao što je gore opisano. Da bi se procenili efekti fragmentacije na genomsku DNK, uzorci su analizirani pomoću elektroforeze u agaroznom gelu.
(…) Uzorci prethodno obrađeni ultrazvukom u trajanju od 2,5 min podvrgnuti su koraku ekstrakcije nakon termičke obrade i centrifugiranja. Oslobođena DNK ekstrahirana je dva puta mješavinom fenol:hloroform:izoamil alkohol, a zatim podvrgnuta drugoj ultrazvučnoj obradi 0 – 15 min. Elektroforeza u agaroznom gelu je korištena za određivanje distribucije veličine DNK podvrgnute ultrazvučnoj fragmentaciji nakon ekstrakcije (slika u gornjem desnom dijelu). Visoko fragmentirana DNK bila je evidentna iz prisustva razmaza DNK, a ne traka visoke molekularne težine koje su eliminirane iz uzoraka obrađenih ultrazvukom 2,5 min ili duže. Duža obrada ultrazvukom postepeno je smanjila dužinu fragmenata na otprilike 150 – 600 bp, a ultrazvuk u trajanju od 15 minuta dodatno je degradirao ove fragmente, što se može vidjeti uglavnom po gornjem dijelu razmaza. Stoga je prosječna veličina DNK fragmenta postepeno opadala s vremenom ultrazvučne obrade, a tretman od 5 minuta omogućio je dobivanje veličina DNK fragmenata najprikladnijih za testove niza čipova. Konačno je uspostavljena procedura pripreme DNK analita koja se sastoji od prve 2 minute ultrazvučnog tretmana, ekstrakcije DNK (2×) i naknadne 5 min ultrazvučne obrade. (Baselet et al. 2008.)

Imunoprecipitacija hromatina (ChIP)

HEK293 ćelije su uzgajane kao što je gore opisano i fiksirane sa 2 mM disukcinimidil-glutarata 45 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su dva puta isprane sa PBS. Hromatin je umrežen 10 minuta na sobnoj temperaturi upotrebom 1% (v/v) formaldehida i dva puta ispran ledeno hladnim PBS. Reakcija umrežavanja je zaustavljena inkubacijom sa glicinom u konačnoj koncentraciji od 0,125 M tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije sa tripsinom, ćelije su sastrugane sa posude za ćelijsku kulturu i dva puta isprane sa PBS. Ćelijska peleta je resuspendirana u puferu za lizu (5 mM cijevi, pH 8,0, 85 mM KCl i 0,5% (v/v) Nonidet P-40), inkubirana na ledu 10 minuta i homogenizirana sa Dounce homogenizatorom. Nakon toga, jezgre su peletirane centrifugiranjem (3500 xg, 5 min, 4 °C) i resuspendirane u puferu za jezgra (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA i 1% (w/v) SDS). Jezgra su poremećena sonikacijom sa tri 20-s impulsa u a UP50H sonikator (Hielscher Ultraschall Technologie) pri postavci ciklusa 0,5 i amplitude 30%, dajući fragmente genomske DNK sa veličinom od 200 – 1000 bp. Za ChIP, 50 g DNK je razrijeđeno 4 puta u puferu za imunoprecipitaciju (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 i 0,01% (težinski/težinski). v) SDS). (Weiske et al. 2006.)

Analiza modifikacije histona imunoprecipitacijom hromatina (ChIP)

Ukratko, 6 x 10⁶ ćelije su isprane dva puta sa PBS i umrežene na ploči kulture 15 minuta na sobnoj temperaturi u prisustvu 0,5% formaldehida. Reakcija umrežavanja je zaustavljena dodavanjem 0,125 M glicina. Svi naredni koraci su izvedeni na 48°C. Svi puferi su prethodno ohlađeni i sadržavali su inhibitore proteaze (Complete Mini, Roche). Ćelije su dva puta isprane sa PBS-om, a zatim sastrugane. Sakupljene pelete su otopljene u 1 ml pufera za lizu (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) i sonikirane u hladnoj etanolnoj kupelji 10 ciklusa pri 100% amplitudi koristeći UP50H sonikator (Hielscher, Teltow, Njemačka). Fragmentacija hromatina je vizualizirana u 1% agaroznom gelu. Dobijeni fragmenti su bili u rasponu od 200–500 pb. Rastvorljivi hromatin je dobijen centrifugiranjem sonikiranih uzoraka na 14.000 g tokom 10 minuta na 48°C. Rastvorljiva frakcija je razrijeđena 1/10 u puferu za razrjeđivanje (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), zatim podijeljena u alikvote i čuvana na 80°C do upotrebe. (Rodriguez et al. 2008.)