Ultrazvučni DNK Shearing

• Tokom DNA i RNK shearinga, MOLEKULE DNK se razbijaju na manje komade. Fragmentacija DNK / RNK je jedan od važnih koraka pripreme uzoraka potrebnih za stvaranje biblioteka za sekvenciranje sljedeće generacije (NGS).
• Ultrazvučni DNK smicanja koristi snage akustične kavitacije razbiti DNK ili RNK u komade od 100 – 5KB bp.
• Ultrazvučni šišanje dozvoljava precizno DNA fragmentacije i prilagođavanje na željenu dužinu DNK.

DNA Shearing koristeći Ultrasonication

Hielscher Ultrasonics nudi različita rješenja ultrazvuka na bazi DNK, RNK i hromatina smicanje. Birati između sonde tipa ultrasonicators (npr UP100H) za direktnu sonication koristeći microtip, ili koristite VialTweeeter ili ultrazvučnog cuphorn za indirektno pripremu DNK različitih uzoraka istovremeno. Hielscher nudi idealan uređaj s obzirom na vaše potrebe: da li mozes imati 1 ili do 10 uzoraka, zapremine od Mikrolitar svezaka litre – Hielscher ultrazvučnog procesori su dostupni u skladu sa vašim zahtjevima za pripremu DNK, RNK i hromatina fragmenata na desnoj dužine. Reproduktivnost, jednostavno rukovanje i preciznu kontrolu omogućavaju pouzdan biblioteka za novu generaciju sekvenciranje.
Za razliku od enzimskih DNA fragmentacije, ultrazvučno šišanje odnosi čisto mehaničke sile smicanja bez dodavanja kemikalija. Do precizno podešavanje parametara procesa, ultrazvučno šišanje proizvodi visoke molekularne težine DNK fragmenata (plazmida i genomske DNK).
Pročišćena nukleinske kiseline mogu biti pojačani prije ili poslije korak fragmentacije.
Sonication parametara (snage, puls ciklus / rafale, vrijeme i temperatura) može sigurno upravljati putem postavke softvera.

Protokoli za ultrazvučno DNK Shearing

Za hromatin Imunoprecipitacija Assay

Ukratko, ćelije su bile pokrivene u posudama prečnika 60 mm (400,000 po posudi) i transfektovane sa RhoA siRNA (kako je opisano); nakon 72 h, inkubirani su sa formaldehidom (konačna koncentracija, 1%) tokom 10 min na 37 ° C do proteina u unakrsnoj vezi sa DNK. Reakcija ukrštanja je ugašena dodatkom jedne desetine zapremine 1,25 mol / L glicina, dajući 125 mmol / L konačnu koncentraciju. Ćelije su isprane dva puta ledeno hladnim PBS, resuspendovano u puferu za testiranje radioimunoprecipitacije [150 mmol / L NaCl, 1% NP40, 0.5% deoksiholata, 0.1% SDS, 5 mmol / L EDTA, 50 mmol / L Tris-HCl )] koji sadrže 1 mmol / L fenilmetilsulfonil fluorida, 1 Ag / ml aprotinina i 1 Ag / ml pepstatina A i čuvaju na ledu 30 min. Tada, ćelijski lizati su sonicirani na ledu sa Hajelscher UP200S ultrazvuk sonicator (3 x 40 e, amplituda 40%, ciklus 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) do umreženog chromatins su smaknutih da daju fragmente DNK između 200 i 1.000 bp. Jedna desetina cijele lizat je korišten za kvantificirati količinu DNK prisutni u različitim uzorcima i smatrati “ukupan unos DNK”. Supernatants su inkubirani sa lososom sperme DNK / proteina agaroznom-50% rastvoru smanjiti nespecifični pozadini. Imuniprecipitaciona je tada učinjeno preko noći na 4 ° C sa 5 Ag anti-NF-NB P65 (Upstate) ili bez antitijela (negativna kontrola). Ove supernatants su dopunjeni sa 5 mol / L NaCl i grije preko noći na 65 ° C da se vrati protein-DNA cross-veze. U immunocomplexes su dodatno tretirani DNase- i RNase bez proteinaze K, a DNA je pročišćen fenol / ekstrakcije kloroform i etanol padavina. PCR je učinjeno sa specifičnim prajmera odgovara slijed u promotor regije ljudskog iNOS gena (P1 prajmer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; P2 prajmer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP izražavanja studije

Za studije izražavanja, rekombinantni soj L. tarentolae P10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Njemačka) sa gen za EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), kromosomskih ssu integrirana je uzgaja u različitim medijima kao što je opisano ranije i dodatno dopunjen sa 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Njemačka). Tokom kultivacije, 1 ml uzeti su uzorci, centrifugirani (2000 × g, 20 ° C, 10 min) i oprana sa 0,9% otopine NaCl. Peleta je resuspendovani u puferu (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) i raspao po sonification sa ultrazvučnom procesora UP400S (Primjena energije ~ 400 Ws). Ćelija krhotine su uklonjeni centrifugiranjem (6000 × g, 4 ° C, 5 min) i analizira natrijev dodecil sulfat - poliakrilamid gel elektroforeza (SDS-PAGE) pod smanjuje uvjetima prema načinu Laemmli (1970) sa 12,5% polyacralamide gelovima . EGFP izražavanja je ispitan u uznemiren kulturi. (Fritsche et al. 2007.)

hromatin Imuniprecipitaciona

Hromatin Imuniprecipitaciona test je izveden pomoću čip-IT^Tm Express (Active Motiv, Carlsbad, Kalifornija, SAD) prema uputama proizvođača sa nekim modifikacijama. Ukratko, diferencirane ljudskih podocytes su međusobno povezana sa 1% formaldehida za 10 min na sobnoj temperaturi. Ćelije su isprane s ledeno hladnim PBS i fiksacija reakcija je zaustavljena dodavanjem 0,125 M glicina za 5 min na sobnoj temperaturi. Ćelije su ponovo oprati ledenom PBS-a i grebao iz jelo. Ćelije su peletirane centrifugiranjem i resuspendovani u pufera za lizu. Nakon centrifugiranja, peletirane jezgra su resuspendovani u striže tampon, inkubirani na ledu 30 minuta i hromatin je smaknutih po sonication, npr UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Njemačka) sa 25% snage 5 impulsa od 20 sec svaki na ledu u fragmente od približno 200-600 bp. Šareni hromatin je zatim centrifugiran i supernatant je sakupljen. Za imunoprecipitacije, 60 μl hromatina je inkubirano sa 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SAD), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) ili antitela NF-κB p50 (Abcam) ili sa zečom IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, SAD), kao negativna kontrola, preko noći na 4 ° C sa nežnom rotacijom. Imunokompleksi koji su vezani za magnetne perle su sakupljeni korišćenjem magnetnog postolja, opranog su se oprali, a proteini / DNA unakrsne veze su obrnute, a DNK eluirana za PCR analizu u realnom vremenu. (Ristola i sar., 2009)

EHEC pripreme DNK za analizu čip niz

Raspored ćelija lizatima i izdvojiti DNK
Bakterijska peleta obustavljena u PBS-u željene konačne koncentracije su tretirane ultrazvuk disruptor UP100H (Hielscher GmbH, Njemačka) opremljen mikrotipom MS1 (prečnika 1mm). Radna frekvencija je iznosila 30 kHz, a efektivna izlazna snaga iznosila je 100 W. Tokom rada, uzorci su se ohladili u ledenom vodenom kupatilu, pomešani i centrifugirani. Uzorci su korišćeni za ispitivanje protočne citometrije, dok su za kasnije rukovanje uzorci podvrgnuti toplotnoj obradi (95 ° C, 5 min). Lizati sirove ćelije su obrađeni mešavinom fenola: hloroform: izoamil alkohol (25: 24: 1). Jednak volumen ove mešavine dodan je u uzorak lizata, rastvor je vorteksiran energično tokom 15 s i centrifugiran na 15000 xg tokom 2 min na sobnoj temperaturi (RT) oko 22 ° C. Vrhna vodena faza koja sadrži genomsku DNK pažljivo je odvojena i sakupljena je u novoj sterilnoj Eppendorf cevi.
Posle toga, uzorci su usijali da fragmentiraju DNK. Korak sonikacije realizovan je u istim uslovima kao što je prethodno opisano. Da bi se procenili efekti fragmentacije na genomsku DNK, uzorci su analizirani pomoću elektroforeze agaroznog gela.
(…) Uzorci koji su prethodno bili prethodno napravljeni 2,5 minuta podvrgnuti su koraku ekstrakcije nakon termičke obrade i centrifugiranja. Dublinska DNK je ekstrahovana dva puta sa fenol: hloroformom: izoamil alkoholom, a nakon toga je podvrgnuta drugoj sonikaciji za 0 - 15 min. Elektroforeza agaroznog gela korišćena je za određivanje raspodele veličine DNK koja je podvrgnuta post-ekstrakcionoj ultrazvučnoj fragmentaciji (slika u gornjem desnom uglu). Visoko fragmentirana DNK je očigledna iz prisustva DNK smeara, a ne sa visokomolekularnim opsezima koji su eliminisani od uzoraka soniciranih 2,5 minuta ili duže. Dalja sonikacija je postepeno smanjila dužinu fragmenata na otprilike 150-600 bp, a sonikacija 15 minuta dalje je degradirala ove fragmente, što se vidi uglavnom gornjim dijelom mrlja. Prema tome, prosečna veličina DNK fragmenta je postepeno opala s ultrasonikacionim vremenom i 5 min tretmanom omogućeno je da dobije veličine fragmenata DNK koji su najpogodniji za ispitivanje arterije sa čipovima. Konačno, postupak pripreme analize DNK koji sadrži prvih 2 min ultrazvučnog tretmana, ekstrakcije DNK (2 ×) i naknadnih 5 min ultrazvukom. (Basselet i sar., 2008)

Hromatina Imunoprecipitacija (chip)

HEK293 ćelije su kultivisane kao što je gore opisano i fiksirano sa 2 mM disukcinimidil-glutarata tokom 45 min na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su isprane dva puta sa PBS. Hromatin je ukršten 10 minuta na sobnoj temperaturi koristeći 1% (v / v) formaldehid i ispran dva puta sa ledenom hladnom PBS. Reakcija ukrštanja je zaustavljena inkubacijom sa glicinom u konačnoj koncentraciji od 0,125 M tokom 5 min na sobnoj temperaturi. Posle inkubacije sa tripsinom, ćelije su oštetile iz ćelijske kulture i isprane dva puta sa PBS. Ćelijska peleta je resuspendovana u puferu za lizu (5 mM cevi, pH 8,0, 85 mM KCl i 0,5% (v / v) Nonidet P-40), inkubirane na ledu 10 minuta i homogenizovane sa homogenizatorom Dounce. Nakon toga, jezgro je peletirano centrifugiranjem (3500 xg, 5 min, 4 ° C) i resuspendovano u nukleinskom puferu (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA i 1% (w / v) SDS). Nukleima je poremećeno ultrazvukom sa tri 20-ih impulsa u a UP50H sonicator (Hielscher Ultraschall Technologie) pri podešavanju ciklusa 0,5 i amplitude 30%, donosi genomske fragmenti DNK s veličinom većina 200-1000 bp. Za Chip, 50g DNK je razrijeđen 4 puta u Imuniprecipitaciona tampon (16,7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl, 1,2 mm EDTA, 1,1% (v / v) Triton X-100, a 0,01% (w / v) SDS). (Weiske et al. 2006)

analiza modifikacija histona po hromatina Imuniprecipitaciona (chip)

Ukratko, 6 x 10⁶ ćelije su dva puta isprana sa PBS-a i umreženi na kulturu ploča za 15 min na sobnoj temperaturi, u prisustvu 0,5% formaldehida. Cross-linking reakcija je zaustavljena dodavanjem 0,125 M glicina. Sve naredne korake su izvršena na 48 ° C. Svi puferi su prethodno ohlađene i sadrži inhibitori proteaze (Cijela Mini, Roche). Ćelije su dva puta isprana sa PBS-a i onda ogrebao. Prikupljeni peleti su otopljen u 1 ml pufera za lizu (1% SDS-a, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) i bili su sonicated na hladnom etanolu kupka za 10 ciklusa na 100% amplitude koristeći UP50H sonicator (Hielscher, Teltow, Njemačka). Hromatina fragmentacija je vizualizirati u 1% agaroznom gelu. Dobijeni fragmenti bili u 200-500pb opsegu. Rastvorljivi hromatina je dobijena centrifugiranjem u sonicated uzoraka na 14,000g 10 minuta na 48 ° C. Topiva frakcija je razblažena 1/10 u razrjeđivanje puferu (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), a zatim podijeljen u alikvote i čuva na 80 ° C do upotrebe. (Rodriguez i dr. 2008)