Ultrazvučno lizu E. Coli

  • E. coli bakterije su najčešće koriste bakterija u mikrobiologiji i biotehnologije.
  • Ultrazvučni ćelija disruptore pružaju pouzdane i ponovljive rezultate za lizu E. coli.
  • Intense još precizno kontrolirati kavitacije i smicanja dovesti u potpuni prekid i visoke prinose ekstrakcije (npr proteina, DNA).

Zašto je poremećaj ultrazvučnih ćelija E. coli preferirana metoda?

Ultrazvučni homogenizatori ili ultrazvučnici tipa sonde nude nekoliko prednosti za lizu E. coli jer intenzivni ultrazvuk efikasno remeti ćelijske zidove i membrane. Ultrazvučnici tipa sonde široko se koriste za lizu E. coli iz sljedećih razloga:

  • Efikasno ometanje ćelijskih zidova: E. coli ima polukruti ćelijski zid sastavljen od peptidoglikana, koji može biti teško slomiti tradicionalnim metodama lize. Ultrazvučni sistem sonde generiše intenzivne ultrazvučne talase koji stvaraju mehuriće kavitacije u tečnosti koja okružuje ćelije. Kada se ovi mehurići uruše, oni generišu tečne mlazove velike brzine i udarne talase koji rezultiraju mehaničkim poremećajem ćelijskih zidova, efikasno oslobađajući ćelijske sadržaje kao što su biomolekule.
  • Pojačana penetracija: Ultrazvučni talasi koje generiše sonda/sonotroda mogu da prodru duboko u uzorak, dostižući veći broj ćelija Ešerihija koli i ravnomerno ih tretiraju. Ovo pomaže da se osigura da je liza ujednačenija u cijelom uzorku, što rezultira većom efikasnošću poremećaja ćelija.
  • Smanjeno vrijeme obrade: Energija koju isporučuje ultrazvučni sistem sonde je visoko koncentrisana i lokalizovana, što dovodi do brze i efikasne lize ćelija. U poređenju sa drugim metodama kao što su premlaćivanje perli ili enzimska liza, sonifikacija može postići lizu E. coli u roku od nekoliko minuta ili čak sekundi. Iako mnoge alternativne tehnike kao što je odmrzavanje zamrzavanja zahtevaju nekoliko rundi lečenja, ultrazvučna liza otvara ćelije u jednom koraku procesa.
  • Kontrola temperature: Najsavremeniji ultrazvučnici opremljeni su temperaturnim senzorima i pametnim softverom, koji omogućava podešavanje maksimalne temperature procesa. Ultrazvučni sistem se automatski zaustavlja kada se dostigne temperaturna granica i započinje proces zvučne izolacije kada se dostigne određena temperaturna tačka. Hlađenje uzoraka u ledenoj kupki je jednostavna metoda za održavanje niske temperature uzorka i sprečavanje degradacije uzorka izazvanih toplotom.
  • Skalabilnost: Ultrazvučnici tipa sonde dostupni su u različitim veličinama, od ručnih uređaja do velikih industrijskih modela. To ih čini pogodnim za obradu malih količina u laboratoriji ili za povećanje za veće bioprocesne aplikacije, npr. proizvodnju vakcina ili biosintezu molekula.
  • Svestranost: Ultrazvučnici se mogu koristiti za različite primjene izvan ćelijske lize, kao što su DNK smicanje, ekstrakcija proteina, homogenizacija tkiva, disperzija nanočestica i emulzifikacija. Stoga, ulaganje u ultrazvučni sistem tipa sonde pruža svestranost u istraživačkim ili industrijskim okruženjima.
  • Ultrazvučnici tipa sonde kao što je UP200St su pouzdani homogenizatori tkiva i drobilice ćelija, stoga se široko koriste za pripremu uzoraka u genetici, npr. za lizu E.coli.

    Ekstrakcija proteina iz E.coli ćelija se efikasno izvodi sa ultrazvučna sonda UP200St

    Ultrazvučni sistem sonde nudi mnoge prednosti za E. coli lizu. Pouzdana i precizna kontrola nad parametrima ultrazvučnog procesa omogućava optimizaciju operativnih parametara kao što su snaga, trajanje i rukovanje uzorkom kako bi se postigli željeni rezultati.
     

    Informativni zahtev




    Zabilježi naš Politika privatnosti.


     

    Ovaj tutorijal objašnjava koji tip sonicatora je najbolji za zadatke pripreme uzorka kao što su liza, poremećaj ćelija, izolacija proteina, fragmentacija DNK i RNK u laboratorijama, analiza i istraživanja. Odaberite idealan tip sonicatora za vašu primjenu, volumen uzorka, broj uzorka i propusnost. Hielscher Ultrasonics ima idealan ultrazvučni homogenizator za vas!

    Kako pronaći savršen sonicator za poremećaje ćelija i ekstrakciju proteina u nauci i analizi

    Video sličica

    Ultrazvučna fragmentacija DNK se često koristi kao korak pripreme uzoraka u sekvenciranju sljedeće generacije (NGS)

    Electrophoretic analyses of genomic DNA of E. coli EDL933 subjected to 0 – 15 min ultrasonication. L označava DNK ljestve.
    (studija i slika: ©Basselet et al. 2008)

    Poremećaj ćelija pomoću ultrazvučne kavitacije

    Ultrazvučni homogenizatori sonde rade sa oko 20.000 ciklusa u sekundi (na 20kHz) i uzrokuju kavitaciju u tečnostima ili suspenzijama. Akustična kavitacija mikroskopska područja vakuumskih pritisaka i visokih temperatura koje razdvajaju ćelije. Iako temperature mogu dostići nekoliko hiljada stepeni Celzijusa, zapremine kavitacije su toliko male da ne zagrevaju proces značajno. Ultrazvuk generiše akustičnu kavitaciju i sile smicanja perforiraju ili razbijaju ćelijsku membranu bakterijskih ćelija kao što je E.coli. Hielscher ultrazvučnici omogućavaju preciznu kontrolu parametara procesa kao što su ultrazvučni intenzitet, amplituda, unos energije i temperatura. Na taj način, proces ultrazvučne lize može se optimalno prilagoditi tipu ćelija, kulturi ćelija i cilju procesa.
     

    Prednosti Ultrazvučni Lysis

    • preciznu kontrolu lize (intenzitet, amplituda, temperatura)
    • Pouzdani, ponovljivi rezultati
    • optimalno prilagođavanje specifičnim uzorcima
    • kontrolu temperature
    • za vrlo malih do vrlo velikih uzoraka (μL do litara)
    • Čisto mehanički tretman
    • Bezbedan i bezbedan rad
    • linearna skala-up iz laboratorija na proizvodnju
    Ultrazvučni uređaj VialTweeter omogućava istovremenu pripremu uzorka do 10 bočica pod istim uvjetima procesa. (Klikni za veću sliku!)

    VialTweeter za ultrazvučno lizu

    Informativni zahtev




    Zabilježi naš Politika privatnosti.


    Ultrazvučni homogenizator vs druge tehnike lize

    Hemijska i enzimska liza može biti problematična – od kemijskih lize može mijenjati struktura proteina i uvesti problema pročišćavanje i enzimskih lize zahtijeva duže vreme inkubacije i nije ponovljivi – ultrazvučnog poremećaj je sofisticirani, brzo ćelija metoda prekida.
    Ultrazvučna liza se zasniva samo na mehaničkim silama. Ne dodaju se kemikalije, sonicacija razbija ćelijski zid silama smicanja. Hemijska liza može promijeniti strukturu proteina i uvesti probleme sa prečišćavanjem. Enzimski poremećaj zahtijeva dugo vrijeme inkubacije i nije reproducibilan. Poremećaj ultrazvučnih ćelija bakterija E.coli je brz, jednostavan, pouzdan i reproducibilan. Zbog toga se Hielscher ultrazvučnici koriste u biološkim i biohemijskim laboratorijama širom sveta za pripremu uzoraka, pre-ananalitike, in vitro dijagontiku i višestruke testove.

    Opšte preporuke za ultrazvučnu lizu

    Sonication je najpopularnija tehnika za rasvjeta vrlo male, srednje i velike količine mobilnih suspenzije – od pico-litara do 100L / h (pomoću ultrazvučnih protok ćelija). Ćelije su lysed tečnim smicanje i kavitacije. DNK se također smaknutih tijekom sonication, tako da nije potrebno dodavati DNase suspenzije ćeliju.
     

    Kontrola temperature tokom ultrazvučne E.coli lize
    Ultrazvučni ćelijski disruptor UP100H (100W) za ćelijski poremećaj i ekstrakciju biljnih spojeva.By prethlađivanje uzorka i čuvanje uzorka tijekom sonication na ledu, uzorak termalne degradacije uzorka mogu se lako spriječiti.
    U idealnom slučaju, uzorke treba držati hladnim tokom lize, ali za većinu uzoraka dovoljno je ako temperatura ne izraste iznad temperature kulture ili izvora tkiva. Zbog toga se preporučuje, zadržati suspenziju na ledu i sonicirati sa nekoliko kratkih ultrazvučnih impulsa od 5-10 sekundi i pauzama od 10-30 sekundi. Tokom pauza, toplota se može raspršiti kako bi se ponovo uspostavila niska temperatura. Za veće uzorke ćelija dostupni su različiti reaktori protočnih ćelija sa jaknama za hlađenje.
    Ovdje pročitajte detaljne savjete i preporuke za uspješnu ultrazvučnu lizu!

    Protokoli za ultrazvučnu pripremu E. coli lizata

    Istraživači koriste Hielscher ultrazvučne homogenizatore za poremećaj ćelija E.coli. Ispod možete pronaći različite testirane i dokazane protokole za E.coli lizu pomoću Hielscher ultrazvučnih homogenizatora za različite aplikacije povezane s E. coli.
     

    Ovaj video klip pokazuje Hielscherov ultrazvučni homogenizer UP100H, ultrasonikator koji se široko koristi za pripremu uzoraka u laboratorijama.

    Ultrazvučni homogenizer UP100H

    Video sličica

    Rast ćelija, unakrsno povezivanje i priprema ekstrakata ćelija E. coli pomoću ultrazvuka

    Za SeqA i RNK polimeraze CHIP-Chip E. coli MG1655 ili MG1655 ΔseqA je narasla na 37 ° C do OD600 od oko 0,15 u 50 ml LB (+ 0,2% glukoze) pre dodavanja 27 μl formaldehida (37%) na ml medijum (konačna koncentracija 1%). Premošćavanje je obavljeno pri sporijoj tresenju (100 o / min) na sobnoj temperaturi tokom 20 min, nakon čega se kaljenje sa 10 ml 2,5 M glicina (konačna koncentracija 0,5 M). Za eksperimente toplotnog šoka, E. coli MG1655 je uzgajan u 65 ml LB medijuma na 30 ° C do OD600 oko 0,3. Nakon toga, 30 ml kulture je prebačeno u prethodno zagrijanu bocu na 43°C, a ostatak na 30°C. Unakrsno povezivanje i gašenje je bilo kao što je gore opisano, osim što su ćelije držane na 30 ili 43 °C 5 min prije daljeg sporog drhtanja na sobnoj temperaturi. Ćelije su prikupljene centrifugiranjem i oprane dva puta hladnim TBS (pH7.5). Nakon ponovnog suspenzije u baferu za lizu od 1 ml (10 mM Tris (pH 8,0), 20% saharoze, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lizozima) i inkubacije na 37 °C tokom 30 min nakon čega je uslijedilo dodavanje 4 ml IP bafera, ćelije su sonicirane na ledu sa 12 puta 30 sekundi i 30 sekundi UP0. Nakon centrifugiranja 10 min na 9000 g, 800 μl alicitata supernatanta pohranjeno je na -20°C. (Waldminghaus 2010.)
     

    Prekomjerna proizvodnja i prečišćavanje enzima ultrazvučnom sondom

    Ultrasonicator UP100H je laboratorijski homogenizer koji se često koristi za pripremu uzoraka ćelijskih ploča kulture.Za prekomjernu proizvodnju dekahistidina (His10)-označenih proteina, E. coli BL21(DE3) transformirana je sa pET19b konstruktima. Prekultura preko noći je ubrana centrifugiranjem, a 1% je korišteno za cijepljenje kulture izraza. Ćelije koje nose pET19mgtB uzgajane su na 22 °C do optičke gustoće na 600 nm (OD600) od 0,7. Kultura je prenesena na 17°C i inducirana sa 100 μM IPTG. Nakon 16 sati, kultura je ubrana centrifugiranjem na 7.500 × g na 4°C. Ćelije su ponovo suspendovane u 50 mM fosfatno puferisanoj fiziološkoj otopini (PBS) sa 0,3 M NaCl pri pH 7,4 i poremećene ultrazvučnošću sa S2 mikro-vrhom sonotrode na Hielscher ultrazvučniku UP200St u ciklusu od 0,5 i amplitudi od 75%.
    Hiperprodukciju decahistidine-tagged GTFC izazvan je na 37 ° C pri OD600 od 0,6 sa 100 μM IPTG. Ćelije su potom inkubiraju za 4 h, bere, i lysed kako je gore navedeno za MgtB.
    Ekstrakti sirovih ćelija centrifugirani su na 15.000 × g i 4 °C za sedimentiranje ćelijskih ostataka. Razjašnjeni ekstrakti su utovareni na 1-ml HisTrap FF Crude kolona koristeći ÄKTAprime Plus sistem. Enzimi su pročišćeni prema protokolu proizvođača za gradijentno eluciju His-označenih proteina. Eluirani proteinski rastvori su dva puta dijalizirani u odnosu na 1.000 volumena 50 mM PBS, pH 7,4, sa 0,3 M NaCl na 4°C. Pročišćavanje je analiziralo 12% SDS-PAGE. Koncentracija proteina određena je Bradfordovom metodom pomoću Roti-Quanta. (Rabausch et al. 2013.)
     

    Ultrazvučna ekstrakcija proteina iz bakterija E. coli
    A mamac protein od interesa (u ovom slučaju, MTV1 od Arabidopsis thaliana) je spojen na GST oznaku i izražena u BL21 Escherichia coli (E. coli) ćelija.

    1. Uzmite jedan pelet GST-MTV1 i GST (što odgovara bakterijskoj kulturi od 50 ml) i ponovo suspendujte svaki u baferu za ekstrakciju od 2,5 ml leda.
    2. Koristite ultrazvučni UP100H (opremljen MS3 mikrotip-sonotrodom za male zapremine od oko 2-5mL) da poremetite bakterijske ćelije dok se ne liziraju, što je indikovano smanjenom neprozirnošću i povećanom viskoznošću. Ovo se mora izvesti na ledu, a preporučuje se sonikat u intervalima (npr. soniciranje od 10 sekundi nakon čega slijedi pauza od 10 sekundi na ledu i tako dalje). Treba voditi računa da se ne sonicira sa previsokim intenzitetom. Ako se otkrije pjena ili formiranje bijelog taloga, intenzitet se mora smanjiti.
    3. Prebacite lizirani rastvor bakterija na 1,5 mL mikrocentrifuge cijevi i centrifugu na 4°C, 16.000 x g tokom 20 minuta.

     

    Ultrazvučne sonde koriste sile akustične kavitacije za ometanje ćelija i izdvajanje molekula i DNK iz E.coli.

    Ultrazvučni sistemi tipa sonde kao što je UP400St Koristite princip rada akustične kavitacije za efikasnu lizu E.coli.

    Analiza ekspresije i prečišćavanje rekombinantnih proteina pomoću sonikacije

    Pelet E. coli soniciran je Hielscherovim ultrazvučnikom UP100H. U tu svrhu, ćelijski pelet je ponovo suspendovan u rashlađenom baferu za lizu (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) i hlađen na ledu 10 min. Zatim je ćelijska suspenzija sonicirana sa 10 kratkih rafala od 10 s praćenih intervalom od 30 s za hlađenje. Konačno, ostaci ćelija su uklonjeni ultracentrifugiranjem na 4°C tokom 15 min pri 14000 o/min. Za potvrdu rPR ekspresije, supernatant je pokrenut na 12% poliakrilamidnom gelu i analiziran od strane SDS-PAGE i Western blotting. Pročišćavanje rPR-a urađeno je korišćenjem Ni2+-NTA smole (Invitrogen, SAD) prema vodiču proizvođača. U ovoj fazi korištena je metoda nativnog prečišćavanja. Čistoća pročišćenog proteina procijenjena je elektroforezom na 12% poliakrilamidnom gelu i naknadnim Coomassie plavim bojenjem. Koncentracija pročišćenih proteina mjerena je kompletom za ispitivanje proteina Micro BCA (PIERCE, SAD). (Azarnezhad et al. 2016)
     

    Ovaj video pokazuje 200 vata ultrazvučnog cuphorna za raspršivanje, homogeniziranje, izvlačenje ili degasing uzoraka laboratorija.

    Ultrazvučni Cuphorn (200 Watts)

    Video sličica

    Ultrazvučni homogenizatori za E. coli lizu

    Hielscher Ultrasonics dizajnira, proizvodi i isporučuje ultrazvučne homogenizatore visokih performansi za pouzdanu i efikasnu lizu bakterija E. coli i drugih tipova ćelija, tkiva i ćelijskih kultura.
    Širok portfolio ultrazvučnih sondi, kao i indirektnih soničnih sistema omogućava nam da vam ponudimo idealan ultrazvučni homogenizator tkiva za vaš ćelijski poremećaj i primenu ekstrakcije.

    Dizajn, proizvodnja i konsalting – Kvalitet proizveden u Nemačkoj

    Hielscher ultrasonicators se može daljinski kontrolirati putem kontrole preglednika. Parametri sonikacije se mogu pratiti i podesiti upravo na procesne zahtjeve.Hielscher ultrazvučni sistemi su poznati po svojim najvišim standardima kvaliteta i dizajna. Pametni softver, intuitivni meni, programabilne postavke i automatsko protokoliranje podataka samo su neke od značajki Hielscher ultrazvučnika. Robusnost i jednostavan rad omogućavaju nesmetanu integraciju naših ultrazvučnika u istraživačke i biotehnološke objekte. Čak i teškim uslovima i zahtevnim okruženjima lako upravljaju Hielscher ultrazvučnici.

    Hielscher Ultrasonics je ISO sertifikovana kompanija i stavlja poseban naglasak na ultrazvučnike visokih performansi sa najsavremenijom tehnologijom i jednostavnošću upotrebe. Naravno, Hielscher ultrazvučnici su usklađeni sa CE i ispunjavaju zahteve UL, CSA i RoHs.

    Tabela u nastavku daje naznaku približan kapacitet prerade naših ultrasonicators:

    Batch VolumenprotokPreporučeni uređaji
    multi-well / mikrotiterske ploceN / A.UIP400MTP
    CupHorn za bočice ili peharN / A.Ultrazvučni cuphorn
    Ultrazvučni mikro-protočni reaktorN / A.GDmini2
    Do 10 bočica sa 0,5 do 1,5 mlN / A.VialTweeter
    00,5 do 1.5mLN / A.VialTweeter
    1 do 500ml10 do 200ml / minUP100H
    10 do 2000mL20 do 400mL / minUf200 ः t, UP400St
    00,1 do 20L00,2 do 4L / minUIP2000hdT
    10 do 100l2 do 10L / minUIP4000
    N / A.10 do 100L / minUIP16000
    N / A.većiklaster UIP16000

    Kontaktiraj nas! / Pitajte nas!

    Traži više informacija

    Molimo vas da koristite obrazac ispod da zatražite dodatne informacije o ultrazvučnim homogenizatorima tkiva i drobilicama ćelija, aplikacijama za lizu i cenama. Biće nam zadovoljstvo da razgovaramo o Vašem procesu sa Vama i da Vam ponudimo ultrazvučni homogenizator koji ispunjava Vaše zahteve!









    Molim vas, obratite se našem Politika privatnosti.


    Video prikazuje ultrazvučni sistem pripreme uzoraka UIP400MTP, koji omogućava pouzdanu pripremu uzoraka bilo koje standardne multi-well ploče pomoću ultrazvuka visokog inteziteta. Tipične primjene UIP400MTP uključuju lizu ćelija, DNK, RNK, i šariranje hromatina kao i ekstrakciju proteina.

    Ultrasonicator UIP400MTP za multi-well sonication ploča

    Video sličica

    Dodatni protokoli za ultrazvučnu E. coli lizu

    Allicin-modificirani proteini u E. coli pomoću ultrazvučnog VialTweetera

    VialTweeter na ultrazvučnom procesoru UP200STOdređivanje sulfhidril Sadržaj po 5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoic kiselina) (DTNB) Assay
    Kultura E. coli MG1655 preko noći korištena je za cijepljenje MOPS minimalnog medija (1:100). Kultura je aerobno rasla sve dok nije dostignut A600 od 0,4. Kultura je podijeljena u tri kulture od 15 ml za liječenje stresa. Netretirana kultura je služila kao negativna kontrola. 0,79 mM alicina (128 μg ml-1) ili 1 mM diamida dodano je jednoj od preostale dvije kulture svaka. Kulture su inkubirane 15 min. 5 ml svake kulture je ubrano centrifugiranjem (8.525 × g, 4°C, 10 min). Ćelije su oprane dva puta sa 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, pohranjene anaerobno prije upotrebe) i centrifugirane (13.000 × g, 4°C, 10 min). Ćelije su ponovo suspendovane u baferu za lizu (PBS sa 6 mM guanidinium HCl, pH 7,4) pre poremećaja na 4°C ultrazvučnošću (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Njemačka) (3 × 1 min). Ćelijski ostaci su peletirani centrifugiranjem (13.000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatant je prebačen u 3,5-ml QS-makro kivetu (10 mm) sa magnetnom šipkom za miješanje i pomiješan sa 1 ml bafera za lizu. Izumiranje uzoraka praćeno je na 412 nm pomoću Jasco V-650 spektrofotometra opremljenog držačem ćelija sa kontrolom temperature PSC-718 na sobnoj temperaturi. Dodano je 100 μl rastvora 3 mM ditiobisa (2-nitrobenzojeve kiseline). Izumiranje je praćeno dok nije došlo do zasićenja. Izračunavanje koncentracije tiola izvršeno je pomoću koeficijenta izumiranja ε412 = 13.700 M-1 Cm-1 za tio-2-nitrobenzoic kiselina (TNB). Cellular thiol koncentracije izračunate su na volumenu od E. coli ćelija od 6,7 × 10-15 litar i gustoća ćelija A600 = 0,5 (ekvivalentno 1 × 108 ćelija ml-1 kulture). (Müller i dr. 2016.)
     

    In vivo određivanje glutationa pomoću drobilice ultrazvučnih ćelija

    E.coli MG1655 se uzgajala u MOPS minimalnom mediju u ukupnoj zapremini od 200ml dok nije dostignut A600 od 0,5. Kultura je podeljena na kulture od 50 ml za lečenje stresa. Nakon 15 min inkubacije sa 0,79 mM alicinom, 1 mM diamidom ili dimetil sulfoksidom (kontrola), ćelije su ubrane na 4.000g na 4°C tokom 10 min. Ćelije su oprane dva puta KPE baferom prije ponovnog suspenzije peleta u 700 μl KPE bafera. Za deproteinaciju, 300l od 10% (w/v) sulfosalicilne kiseline dodano je prije poremećaja ćelija ultrasonicacijom (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Supernatants su prikupljeni nakon centrifugiranja (30 min, 13,000g, 4 ° C). Koncentracije sulfosalicilnom kiselina su smanjeni za 1% dodavanjem 3 toma KPE tampon. su izvršena mjerenja ukupnog glutationa i GSSG kao što je gore opisano. Cellular koncentracije glutation izračunate su na volumenu od E. coli ćelija od 6,7×10-15 litar i gustoća ćelija od A600 0,5 (ekvivalentno 1)×108 ćelija ml-1 kulture). koncentracije GSH izračunate su oduzimanjem od 2 [GSSG] od ukupno glutation. (Müller i dr. 2016.)

    Ekspresija ljudskog mAspAT u E. coli pomoću ultrazvučnog homogenizatora

    Ultrazvučni ćelija disruptor UP400St (400W) za ekstrakciju intracelularne materije (npr proteina, organele, DNA, RNA i sl)Singl kolonija E. coli BL21 (DE3) skrivanje vektor izražavanja u 30 ml Luria-Bertani (LB) medij koji sadrži 100μg / mL ampicilin, a zatim uzgaja na 37ºC do optičke gustoće (OD600) Dostigao 0,6. Ćelije su bere centrifugiranjem na 4000 × g za 10 min, a resuspendovani u 3L svježi LB medij koji sadrže 100μg / mL ampicilin.
    Nakon toga, ekspresija proteina je inducirana sa 1 mM izopropil β-ᴅ-1-tiogalaktopiranoidida (IPTG) tokom 20 sati na 16ºC. Ćelije su uzete centrifugiranjem na 8.000 × g tokom 15 min i oprane baferom A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Približno 45g (mokra težina) ćelija dobijeno je iz 3 L kulture. Nakon centrifugiranja, ćelijski peleti su ponovo suspendovani u 40 mL (za 1 L kulturu) ledeno hladni bafer za ekstrakciju A, a lizirani ultrazvučnošću na ledeno-hladnoj temperaturi pomoću Hielscherovog drobilice ultrazvučnih ćelija UP400St. Liza ćelija je centrifugirana na 12.000 o/min tokom 15 min kako bi se odvojile rastvorljive (supernatantne) i istaložene (peletne) frakcije. (Jiang et al. 2015.)
     



    Činjenice vredi znati

    E. coli

    Escherichia coli (E. coli) je gram-negativna, fakultativno anaerobnih, štap u obliku, koliformnih bakterija iz roda Escherichia koji se obično nalazi u donjem creva toplokrvne organizme (endotherms). Postoji veliki broj E. coli sojeva (ili podtipova) sa različitim karakteristikama. Većina E. coli sojeva bezopasan za ljude, npr B i K-12 sojeva koji se obično koriste za istraživanje aplikacija u laboratorijima. Međutim, neki sojevi su štetne i mogu uzrokovati ozbiljne bolesti.
    E. coli igra važnu ulogu u modernim biološkim inženjering i industrijskih mikrobiologija od bakterija je lako manipulirati. Zajednički Lab aplikacije koje uključuju često korištenje E. coli, npr stvoriti rekombinantne dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) ili da djeluje kao model organizam.
    E. coli je vrlo svestran domaćin za proizvodnju heterologne proteine ​​i višestruki proteinske ekspresije sistemi su na raspolaganju za proizvodnju rekombinantnog proteina u E. coli. Koristeći plazmidi koji dozvoljavaju visoke ekspresije proteina nivou, geni mogu uvesti u bakterija, koja omogućava da proizvode takve proteine ​​u visokim količinama u industrijskim procesima fermentacije.
    E.coli se koristi kao fabrika ćelija za proizvodnju insulina. Dalje primjene uključuju upotrebu modificiranih ćelija E. coli za razvoj i proizvodnju vakcina i imobiliziranih enzima, za proizvodnju biogoriva, kao i za bioremedijaciju.
    Soj K-12 je mutant oblik E. coli da je preko-izražava enzima alkalne fosfataze (ALP). Ova mutacija nastaje zbog defekta u gen koji stalno kodira enzim. Ako je gen proizvodi proizvod bez ikakvih inhibicija ovo je poznato kao konstitutivni aktivnost. Ova specifična mutant obrazac se koristi za izolaciju i pročišćavanje ALP enzima.
    Bakterije E. coli se također široko koriste kao ćelijske tvornice. Inženjerski mikrobi (npr. bakterije) i biljne ćelije mogu se koristiti kao tako zvane ćelijske tvornice. Ove genetski modificirane ćelije proizvode molekule, hemikalije, polimere, proteine i druge supstance, koje se koriste na primjer u farmaceutskoj, hrani i hemijskoj industriji. Kako bi se oslobodile molekule proizvedene u unutrašnjosti takvih bioinžinjerenih ćelija, ultrazvučna liza je česta metoda za ometanje ćelijskih zidova i prijenos ciljnih supstanci u okolnu tekućinu. Pročitajte više o lizi bioinžinjerenih ćelija!

    Ultrazvučni DNK Shearing

    Ultrazvučne sile smicanja su najčešće korištena metoda za oslobađanje molekula, organela i proteina iz ćelijske unutrašnjosti, kao i za razbijanje DNK lanaca na komade. Akustična kavitacija razbija ćelijske zidove i membrane kako bi izdvojila DNK iz ćelija i generisala fragmente od oko 600 ćelija. – 800 bp u dužini, što je idealno za analizu.
    Kliknite ovdje da biste saznali više o ultrazvučnom Homogenizatori za DNA fragmentacije!

    Književnost/reference


    Ultrazvuka visokih performansi! Hielscherov raspon proizvoda pokriva cijeli spektar od kompaktnog labaratorijskog ultrasonikatora preko klupa-top jedinica do puno-industrijskih ultrazvučnih sistema.

    Hielscher Ultrasonics proizvodi ultrazvučne homogenizatore visokih performansi od laboratorija u industrijske veličine.


    Biće nam drago da razgovaramo o vašem procesu.

    Stupimo u kontakt.