Hajelscher ultrazvuk tehnologije

Ultrazvučno lizu E. Coli

  • E. coli bakterije su najčešće koriste bakterija u mikrobiologiji i biotehnologije.
  • Ultrazvučni ćelija disruptore pružaju pouzdane i ponovljive rezultate za lizu E. coli.
  • Intense još precizno kontrolirati kavitacije i smicanja dovesti u potpuni prekid i visoke prinose ekstrakcije (npr proteina, DNA).

Cell Prekid po Kavitacija

Escherichia coli bakterije pouzdano lysed koristi ultrazvučne Homogenizatori tkiva.Ultrazvučne sonde tipa Homogenizatori rade sa cca. 20.000 ciklusa u sekundi (na 20kHz) i uzrokovati kavitacije u tekućine ili supsensions. Akustične kavitacije mikroskopski područja pritisaka vakuum kao i visoke temperature koje poderati ćelije raspada. Iako temperatura može dostići nekoliko hiljada stepeni Celzijusa, volumeni kavitacija su toliko mali da ne znatno zagrijati proces. Ultrazvuk generira akustične kavitacije i smicanja perforaciju ili slomiti stanične membrane od E. coli – ovisno o postavci uređaja ultrazvučnog homogenizator.

Prednosti Ultrazvučni Lysis

  • preciznu kontrolu lize (intenzitet, amplituda, temperatura)
  • optimalno prilagođavanje specifičnim uzorcima
  • kontrolu temperature
  • za vrlo malih do vrlo velikih uzoraka (μL do litara)
  • čisto mehanički tretman
  • linearna skala-up iz laboratorija na proizvodnju
Ultrazvučni uređaj VialTweeter omogućava istovremenu pripremu uzorka do 10 bočica pod istim uvjetima procesa. (Klikni za veću sliku!)

VialTweeter za ultrazvučno lizu

Informativni zahtev




Zabilježi naš Politika privatnosti.


Dok kemijske i enzymtic lize može biti problematična – od kemijskih lize može mijenjati struktura proteina i uvesti problema pročišćavanje i enzimskih lize zahtijeva duže vreme inkubacije i nije ponovljivi – ultrazvučnog poremećaj je sofisticirani, brzo ćelija metoda prekida.
Ultrasonična lysis zasnovana je na mehaničkim snagama. Ne dodaju se hemikalije, sonicacija lomi zid ćelija od Shear snaga. Hemijska lira može izmijeniti proteinsku strukturu i uvesti probleme sa pročišćavanju. enmatski poremećaj zahtijeva dugo inkubaciju vremena i nije reproducible.

Opšte preporuke

UP400St ultrasonicator sa protokom reaktorSonication je najpopularnija tehnika za rasvjeta vrlo male, srednje i velike količine mobilnih suspenzije – od pico-litara do 100L / h (pomoću ultrazvučnih protok ćelija). Ćelije su lysed tečnim smicanje i kavitacije. DNK se također smaknutih tijekom sonication, tako da nije potrebno dodavati DNase suspenzije ćeliju.
Kontrola temperature:
By prethlađivanje uzorka i čuvanje uzorka tijekom sonication na ledu, uzorak termalne degradacije uzorka mogu se lako spriječiti.
U idealnoj mjeri, uzorci bi se trebali držati na ledu tokom lyze, ali za većinu uzoraka je dostatan ako se temperatura ne izdiže iznad temperature kulture ili tkiva. Stoga je preporučeno, da zadrži suspenziju na ledu i sonicata sa nekoliko kratkih ultrasoničkih otkucaja od 5-10 sekundi i pauze od 10-30 sec. Tokom pauze, toplota može da se rasipa kako bi se uspostavite niska temperatura. Za veće uzorke ćelija, dostupni su različiti reaktori ćelija sa rashladnom jaknama.

Protokoli za pripremu E. Coli lizatima

analiza izražavanja i pročišćavanje rekombinantnog proteina

E. coli peleta je sonicated sa sistemom ultrazvučnog UP100H (Hielscher). Za tu svrhu, mobilni peleta je resuspendovani u rashlađeno pufera za lizu (50 mm Tris-HCl pH = 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) i ohlađen na ledu za 10 min. Zatim ćelija suspenzija je sonicated s 10 na rafale 10 e slijedi interval od 30 e za hlađenje. Konačno, ćelija krhotine je uklonjena ultracentrifugiranje na 4 ° C za 15 min na 14000 obrtaja u minuti. Za potvrdu RPR izražavanja, supernatant je raditi na 12% poliakrilamid gel i analizirani SDS-PAGE i Western blotting. Prečišćavanje RPR je učinjeno pomoću Ni2 +-NTA smole (Invitrogen, SAD) prema vodič proizvođača. U ovoj fazi, native metoda za pročišćavanje je korištena. Čistoća pročišćene proteina je postignuta putem elektroforeza na 12% poliakrilamid gel i naknadne Coomassie plava bojenja. koncentracija pročišćeni protein je mjerena Micro BCA protein test kit (PIERCE, SAD). (Azarnezhad et al. 2016.)

Ultrazvučni ćelija disruptor UP100H (100W) za lize, ćelije poremećaja i DNK smicanje.

Ultrazvučni homogenizator UP100H (100W)

Cell rasta, Crosslinking i priprema E. coli ćelije Ekstrakti

Za SeqA i RNK polimeraze CHIP-Chip E. coli MG1655 ili MG1655 ΔseqA je narasla na 37 ° C do OD600 od oko 0,15 u 50 ml LB (+ 0,2% glukoze) pre dodavanja 27 μl formaldehida (37%) na ml medijum (konačna koncentracija 1%). Premošćavanje je obavljeno pri sporijoj tresenju (100 o / min) na sobnoj temperaturi tokom 20 min, nakon čega se kaljenje sa 10 ml 2,5 M glicina (konačna koncentracija 0,5 M). Za eksperimente toplotnog šoka, E. coli MG1655 je uzgajan u 65 ml LB medijuma na 30 ° C do OD600 od oko 0,3. Nakon toga 30 ml kulture je prebačen na prethodno zagrejan bocu na 43 ° C, a ostatak drži na 30 ° C. Umrežavanja i gašenje je kao što je opisano gore, osim što su ćelije drži na 30 ili 43 ° C za 5 min prije nego što dalje sporo trese na sobnoj temperaturi. Ćelije su prikupljeni centrifugiranjem i oprati dva puta sa hladnim TBS (pH7.5). Nakon resuspendiranje u 1 ml pufera za lizu (10 mm Tris (pH 8.0), 20% saharoze, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lizozim) i inkubacije na 37 ° C u trajanju od 30 min a zatim dodavanjem 4 ml IP tampon, ćelije su sonicated na ledu sa 12 puta 30 sekundi i 30 sekundi pauze po UP400St ultrazvučnog procesor (Hielscher Ultrasonics GmbH) sa 100% snage. Nakon centrifugiranja 10 minuta na 9000 g, 800 μl aliquotes supernatanta su pohranjeni na -20 ° C. (Waldminghaus 2010.)

Hiperprodukcija i pročišćavanje enzima.

Za hiperprodukcije decahistidine (His10) -tagged proteina, E. coli BL21 (DE3) je pretvoren u pET19b konstruira. Preko noći preculture je bere centrifugiranje, a 1% je korišten za inokulišite izraz kulture. Ćelije nošenje pET19mgtB su uzgajane na 22 ° C do optičke gustoće na 600 nm (OD600) Od 0,7. Kultura je prebačen na 17 ° C, a izazvana 100 μM IPTG. Nakon 16 h, kultura je bere centrifugiranjem na 7.500 × g na 4 ° C. Ćelije su resuspendovani u 50 mM fosfat puferom soli (PBS) sa 0,3 M NaCl na pH 7,4 i prekinut ultrasonication sa S2 mikro-tip dihtovanje na UP200St ultrasonicator (Hielscher, Teltow, Njemačka) na ciklus od 0,5 i amplitudom od 75%.
Hiperprodukciju decahistidine-tagged GTFC izazvan je na 37 ° C pri OD600 od 0,6 sa 100 μM IPTG. Ćelije su potom inkubiraju za 4 h, bere, i lysed kako je gore navedeno za MgtB.
Sirova ćeliji ekstrakti su centrifugira na 15.000 x g i 4 ° C taloženja krhotine ćelije. Prečišćeni ekstrakti su učitan na 1 ml HisTrap FF Sirova kolone koristeći ÄKTAprime Plus sistem (GE Healthcare). Enzimi su pročišćen prema protokolu proizvođača za gradijent elucija Njegove-tagged proteina. Eluted proteina rješenja su dva puta dijalizu protiv 1.000 svezaka 50 mm PBS, pH 7,4, 0,3 M NaCl na 4 ° C. Pročišćavanje je analiziran od 12% SDS-PAGE. Koncentracija proteina je određena metodom Bradford koristeći Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Njemačka). (Rabausch et al. 2013.)

Vađenje proteina iz E. coli bakterije
A mamac protein od interesa (u ovom slučaju, MTV1 od Arabidopsis thaliana) je spojen na GST oznaku i izražena u BL21 Escherichia coli (E. coli) ćelija.
1. Uzmite jednu kuglicu GST-MTV1 i PDV (odgovara 50 ml bakterijske kulture) i resuspendirajte svaki na 2,5 mL ledene ekstrakcije tampon.
2. Koristite ultrasonicator UP100H (Opremljena sa MS3 microtip-dihtovanje za male količine (2-5mL)) poremetiti bakterijske ćelije dok se ne lysed, što ukazuje smanjena neprozirnost i povećane viskoznosti. Ovo mora biti izvršena na ledu, a preporučuje se sonikacija u intervalima (npr 10 sec sonikatora zatim 10 sekundi na ledu i tako dalje). Njega se mora uzeti da ne sonikacija sa suviše visokog intenziteta. Ako pjeni ili je otkriven formiranje bijelog taloga, intenzitet treba da se spusti.
3. Prenesite bakterija rješenje lysed 1,5 mL Microcentrifuge cijevi i centrifuge na 4 ° C, 16.000 x g 20 min.

Alicin-modifikovanih proteina u E. coli

Je VialTweeter je udoban ultrasonicator za malog uzorka homogenizacijuOdređivanje sulfhidril Sadržaj po 5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoic kiselina) (DTNB) Assay
Jedan E. coli MG1655 preko noći kulture je korišten za vakcinisati MOPS minimalne medij (1: 100). Kultura je odrasla aerobno dok je postignut A600 od 0,4. Kultura je podijeljen na tri 15-ml kulturama za liječenje stresa. Nelečenog kulture služio kao negativna kontrola. 0.79 mM alicin (128 g ml-1) Ili 1 mM diamide je dodan u jednom od preostala dva kulture svaki. Kulture su inkubirani 15 min. 5 ml svake kulture su bere centrifugiranje (8.525 × g, 4 ° C, 10 min). Ćelije su dva puta isprana sa 1 ml PBS (137 mm NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4PH 7,4, čuvati anaerobno prije upotrebe) i centrifugira (13.000 × g, 4 ° C, 10 min). Ćelije su resuspendovani u pufera za lizu (PBS sa 6 mm guanidinium HCl, pH 7,4) prije prekida na 4 ° C za ultrasonication (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Njemačka) (3 × 1 min). Phagocytosis je peletirane centrifugiranjem (13.000 × g, 4 ° C, 15 min). Supernatant je prebačen u 3,5 ml QS-makro kivete (10 mm) sa magnetnom pometnju bar i miješa s 1 ml pufera za lizu. Izumiranje uzoraka je prati na 412 nm sa Jasco V-650 spektrofotometar opremljen PSC-718 temperaturom držač ćelije (Jasco) na sobnoj temperaturi. 100μl od 3 mm dithiobis (2-nitrobenzoic kiselina) rješenje je dodao. Extinction je pratio dok je dostigao zasićenja. Obračun thiol koncentracije je izvršena pomoću koeficijenta izumiranja ε412 = 13.700 M-1 Cm-1 za tio-2-nitrobenzoic kiselina (TNB). Cellular thiol koncentracije izračunate su na volumenu od E. coli ćelija od 6,7 × 10-15 litar i gustoću ćelija A600 = 0,5 (ekvivalent za 1 × 108 ćelija ml-1 kulture). (Müller i dr. 2016.)

In Vivo Glutation Određivanje

E.coli MG1655 je odrasla u MOPS minimalne srednje ukupne zapremine 200ml dok se A600 0.5 je postignut. Kultura je podijeljen na 50 ml kulture za liječenje stresa. Nakon 15 min inkubacije s 0,79 mM alicin, 1 mM diamide ili sulfoksid (kontrola), ćelije su bere u 4,000g na 4 ° C u trajanju od 10 min. Ćelije su dva puta isprana sa KPE tampon prije resuspendiranje peleta u 700μl od KPE tampon. Za deproteination, 300l od 10% (w / v) sulfosalicilnom kiselina su dodani prije poremećaja ćelija ultrasonication (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Supernatants su prikupljeni nakon centrifugiranja (30 min, 13,000g, 4 ° C). Koncentracije sulfosalicilnom kiselina su smanjeni za 1% dodavanjem 3 toma KPE tampon. su izvršena mjerenja ukupnog glutationa i GSSG kao što je gore opisano. Cellular koncentracije glutation izračunate su na volumenu od E. coli ćelija od 6,7×10-15 litar i gustoću ćelija A600 00,5 (ekvivalent za 1×108 ćelija ml-1 kulture). koncentracije GSH izračunate su oduzimanjem od 2 [GSSG] od ukupno glutation. (Müller i dr. 2016.)

Ultrazvučni disruptor za mobilne lizu i vađenje biološkog materijala (Kliknite za veću sliku!)

Sonda tipa ultrasonicator UP400St

Izraz za ljudska mAspAT u E. coli

Ultrazvučni ćelija disruptor UP400St (400W) za ekstrakciju intracelularne materije (npr proteina, organele, DNA, RNA i sl)Singl kolonija E. coli BL21 (DE3) skrivanje vektor izražavanja u 30 ml Luria-Bertani (LB) medij koji sadrži 100μg / mL ampicilin, a zatim uzgaja na 37ºC do optičke gustoće (OD600) Dostigao 0,6. Ćelije su bere centrifugiranjem na 4000 × g za 10 min, a resuspendovani u 3L svježi LB medij koji sadrže 100μg / mL ampicilin.
Nakon toga, protein izraz je inducirana s 1 mM izopropil β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) za 20 h na 16 ° C. Ćelije su bere centrifugiranjem na 8000 × g za 15 min i isprana sa tampon A (20 mm NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Aproksimira 45g (mokre težine) ćelije su dobijeni od 3 L kulture. Nakon centrifugiranja, ćelija peleta je resuspendovani u 40 ml (za 1 L kulturu) ledene ekstrakcije tampon A, i lysed po ultrasonication na ledene temperature pomoću UP400St instrument (Dr. Hielscher GmbH, Njemačka). Lize ćelija centrifugirana na 12.000 min za 15 min da se odvoji rastvorljivi (supernatant) i ubrzao (pelet) frakcije. (Jiang et al. 2015.)

Tabela u nastavku daje naznaku približan kapacitet prerade naših ultrasonicators:

Batch Volumen protok Preporučeni uređaji
00,5 do 1.5mL N / A. VialTweeter
1 do 500ml 10 do 200ml / min UP100H
10 do 2000mL 20 do 400mL / min Uf200 ः t, UP400St
00,1 do 20L 00,2 do 4L / min UIP2000hdT
10 do 100l 2 do 10L / min UIP4000
N / A. 10 do 100L / min UIP16000
N / A. veći klaster UIP16000

Kontaktiraj nas! / Pitajte nas!

Molimo koristite obrazac ispod, ako želite da zatražite dodatne informacije o ultrazvučnoj homogenizaciji. Biće nam drago da vam ponudimo ultrazvučni sistem koji odgovara vašim zahtevima.









Molim vas, obratite se našem Politika privatnosti.


Literatura / Reference



Činjenice vredi znati

E. coli

Escherichia coli (E. coli) je gram-negativna, fakultativno anaerobnih, štap u obliku, koliformnih bakterija iz roda Escherichia koji se obično nalazi u donjem creva toplokrvne organizme (endotherms). Postoji veliki broj E. coli sojeva (ili podtipova) sa različitim karakteristikama. Većina E. coli sojeva bezopasan za ljude, npr B i K-12 sojeva koji se obično koriste za istraživanje aplikacija u laboratorijima. Međutim, neki sojevi su štetne i mogu uzrokovati ozbiljne bolesti.
E. coli igra važnu ulogu u modernim biološkim inženjering i industrijskih mikrobiologija od bakterija je lako manipulirati. Zajednički Lab aplikacije koje uključuju često korištenje E. coli, npr stvoriti rekombinantne dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) ili da djeluje kao model organizam.
E. coli je vrlo svestran domaćin za proizvodnju heterologne proteine ​​i višestruki proteinske ekspresije sistemi su na raspolaganju za proizvodnju rekombinantnog proteina u E. coli. Koristeći plazmidi koji dozvoljavaju visoke ekspresije proteina nivou, geni mogu uvesti u bakterija, koja omogućava da proizvode takve proteine ​​u visokim količinama u industrijskim procesima fermentacije.
E.coli se koriste kao tvornice ćelija za proizvodnju insulina. Daljnje aplikacije uključuju korištenje modifikovane E. coli ćelije za razvoj i proizvodnju vakcina i imobilisanih enzima, za proizvodnju biogoriva, kao i pri bioremedijaciji.
Soj K-12 je mutant oblik E. coli da je preko-izražava enzima alkalne fosfataze (ALP). Ova mutacija nastaje zbog defekta u gen koji stalno kodira enzim. Ako je gen proizvodi proizvod bez ikakvih inhibicija ovo je poznato kao konstitutivni aktivnost. Ova specifična mutant obrazac se koristi za izolaciju i pročišćavanje ALP enzima.

Ultrazvučni DNK Shearing

Ultrazvučni sile smicanja su najčešće korištena metoda da se odvoji od ćelije i razbiti DNK u komade. Akustične kavitacije razbija ćelijske zidove i membrane za izdvajanje DNK iz ćelija i stvaraju fragmenti od oko 600 – 800 bp u dužini, što je idealno za analizu.
Kliknite ovdje da biste saznali više o ultrazvučnom Homogenizatori za DNA fragmentacije!