Ultrazvučna liza bakterije E. coli

Bakterije E. coli najčešće su korištene bakterije u mikrobiologiji i biotehnologiji.
Ultrazvučni uređaji za razgradnju ćelija daju pouzdane i ponovljive rezultate pri lizi bakterije E. coli.
Intenzivne, a ipak precizno kontrolisane kavitacijske i smične sile dovode do potpune razgradnje i visokih prinosa ekstrakcije (npr. proteina, DNK).

Zašto je ultrazvučna razgradnja ćelija bakterije E. coli poželjna metoda?

Ultrazvučni homogenizatori ili ultrazvučni uređaji sa sondom nude nekoliko prednosti pri lizi bakterije E. coli, jer intenzivni ultrazvuk efikasno razgrađuje ćelijske zidove i membrane. Ultrazvučni uređaji sa sondom se široko koriste za lizu bakterije E. coli iz sljedećih razloga:

Efikasna razgradnja ćelijskih zidova: E. coli ima poluukrućen ćelijski zid sastavljen od peptidoglikana, koji je teško razgraditi tradicionalnim metodama lize. Ultrazvučni uređaj sa sondom stvara intenzivne ultrazvučne talase koji u tečnosti oko ćelija stvaraju kavitacijske mjehuriće. Kada ti mjehurići kolabiraju, nastaju brzi tečni mlazevi i udarni talasi koji mehanički razgrađuju ćelijske zidove i tako efikasno oslobađaju ćelijski sadržaj, kao što su biomolekule.

Poboljšano prodiranje: Ultrazvučni talasi koje stvara sonda / sonotroda mogu duboko prodrijeti u uzorak, doprijeti do većeg broja ćelija E. coli i ravnomjerno ih obraditi. To pomaže da liza bude ujednačenija u cijelom uzorku, što rezultira većom efikasnošću razgradnje ćelija.

Kraće vrijeme obrade: Energija koju isporučuje ultrazvučni uređaj sa sondom visoko je koncentrisana i lokalizirana, što dovodi do brze i efikasne lize ćelija. U poređenju s drugim metodama, kao što su mlijevenje s kuglicama ili enzimska liza, ultrazvučna obrada može postići lizu bakterije E. coli u roku od nekoliko minuta ili čak sekundi. Dok mnoge alternativne tehnike, poput smrzavanja i odmrzavanja, zahtijevaju nekoliko ciklusa obrade, ultrazvučna liza otvara ćelije u jednom koraku procesa.

Kontrola temperature: Najsavremeniji ultrazvučni uređaji opremljeni su temperaturnim senzorima i pametnim softverom, koji omogućava postavljanje maksimalne temperature procesa. Ultrazvučni uređaj se automatski zaustavlja kada se dostigne temperaturna granica i ponovo pokreće ultrazvučnu obradu kada se dostigne zadana temperaturna tačka. Hlađenje uzoraka u ledenom kupatilu jednostavna je metoda za održavanje niske temperature uzorka i sprječavanje degradacije uzorka uzrokovane toplotom.

Skalabilnost: Ultrazvučni uređaji sa sondom dostupni su u različitim veličinama, od ručnih uređaja do industrijskih modela velikih razmjera. Zbog toga su pogodni za obradu malih zapremina u laboratoriji ili za povećanje razmjera za veće primjene u bioprocesiranju, npr. proizvodnju vakcina ili biosintezu molekula.

Svestranost: Ultrazvučni uređaji se mogu koristiti za različite primjene izvan lize ćelija, kao što su fragmentacija DNK, ekstrakcija proteina, homogenizacija tkiva, disperzija nanočestica i emulgovanje. Stoga ulaganje u ultrazvučni uređaj sa sondom pruža svestranost u istraživačkom ili industrijskom okruženju.

Ultrazvučni uređaji sa sondom poput UP200St pouzdani su homogenizatori tkiva i uređaji za razgradnju ćelija, pa se stoga široko koriste za pripremu uzoraka u genetici, npr. za lizu bakterije E.coli

Ekstrakcija proteina iz ćelija E.coli efikasno se provodi pomoću ultrazvučne sonde UP200St

Ultrazvučni uređaj sa sondom nudi mnoge prednosti pri lizi bakterije E. coli. Pouzdana i precizna kontrola ultrazvučnih procesnih parametara omogućava optimizaciju radnih parametara, kao što su snaga, trajanje i rukovanje uzorkom, radi postizanja željenih rezultata.

Ovaj vodič objašnjava koja vrsta sonikatora najbolje odgovara Vašim zadacima pripreme uzoraka, kao što su liza, razaranje ćelija, izolacija proteina te fragmentacija DNA i RNA u laboratorijima, analitici i istraživanju. Odaberite idealnu vrstu sonikatora za svoju primjenu, zapreminu uzorka, broj uzoraka i kapacitet obrade. Hielscher Ultrasonics ima idealan ultrazvučni homogenizator za Vas!

Ultrazvučna fragmentacija DNK često se koristi kao korak pripreme uzoraka u sekvenciranju sljedeće generacije (NGS)

Elektroforetske analize genomske DNK soja E. coli EDL933 podvrgnute ultrazvučnoj obradi 0 – 15 min. L označava DNK ljestvicu (DNA Ladder).
(studija i slika: ©Basselet et al. 2008)

Razgradnja ćelija pomoću ultrazvučne kavitacije

Ultrazvučni homogenizatori sa sondom rade s oko 20.000 ciklusa u sekundi (na 20kHz) i izazivaju kavitaciju u tečnostima ili suspenzijama. Akustična kavitacija stvara mikroskopska područja podtlaka sličnog vakuumu i visokih temperatura koja razdiru ćelije. Iako temperature mogu dostići nekoliko hiljada stepeni Celzijusa, kavitacijske zapremine su toliko male da proces ne zagrijavaju značajno. Akustična kavitacija i smične sile nastale ultrazvukom perforiraju ili razgrađuju ćelijsku membranu bakterijskih ćelija kao što je E.coli. Hielscher ultrazvučni uređaji omogućavaju preciznu kontrolu procesnih parametara kao što su ultrazvučni intenzitet, amplituda, unos energije i temperatura. Na taj način se proces ultrazvučne lize može optimalno prilagoditi vrsti ćelija, ćelijskoj kulturi i cilju procesa.

Prednosti ultrazvučne lize

precizna kontrola lize (intenzitet, amplituda, temperatura)
pouzdani, ponovljivi rezultati
optimalno prilagođavanje specifičnim uzorcima
kontrola temperature
za vrlo male do vrlo velike uzorke (od µL do litara)
isključivo mehanička obrada
jednostavan i siguran rad
linearno povećanje razmjera od laboratorija do proizvodnje

Ultrazvučni uređaj VialTweeter omogućava istovremenu pripremu do 10 bočica uzoraka pod istim procesnim uvjetima. (Kliknite za povećanje!)

VialTweeter za ultrazvučnu lizu

Ultrazvučni homogenizator u odnosu na druge tehnike lize

Dok hemijska i enzimska liza mogu biti problematične – jer hemijska liza može promijeniti strukture proteina i uzrokovati probleme pri pročišćavanju, a enzimska liza zahtijeva duga vremena inkubacije i nije ponovljiva – ultrazvučna razgradnja je sofisticirana, brza metoda razgradnje ćelija.
Ultrazvučna liza zasniva se isključivo na mehaničkim silama. Ne dodaju se nikakve hemikalije, ultrazvučna obrada razgrađuje ćelijski zid smičnim silama. Hemijska liza može promijeniti strukturu proteina i uzrokovati probleme pri pročišćavanju. Enzimska razgradnja zahtijeva duga vremena inkubacije i nije ponovljiva. Ultrazvučna razgradnja ćelija bakterije E.coli brza je, jednostavna, pouzdana i ponovljiva. Zato se Hielscher ultrazvučni uređaji koriste u biološkim i biohemijskim laboratorijama širom svijeta za pripremu uzoraka, predanalitiku, in-vitro dijagnostiku i brojne testove.

Opće preporuke za ultrazvučnu lizu

Ultrazvučna obrada je najpopularnija tehnika za lizu vrlo malih, srednjih i velikih količina suspenzija ćelija – od piko-litara do 100L/hr (korištenjem ultrazvučne protočne ćelije). Ćelije se liziraju tečnim smicanjem i kavitacijom. DNK se također smiče tokom ultrazvučne obrade, pa nije potrebno dodavati DNazu u suspenziju ćelija.

Kontrola temperature tokom ultrazvučne lize bakterije E.coli
Prethodnim hlađenjem uzorka i držanjem uzorka na ledu tokom ultrazvučne obrade lako se može spriječiti termička degradacija uzorka.
Idealno bi uzorke trebalo držati ledeno hladnim tokom lize, ali za većinu uzoraka dovoljno je da temperatura ne poraste iznad temperature kulture ili izvora tkiva. Stoga se preporučuje držati suspenziju na ledu i provoditi ultrazvučnu obradu s nekoliko kratkih ultrazvučnih impulsa od 5-10 s i pauzama od 10-30 s. Tokom pauza se toplota može rasipati kako bi se ponovo uspostavila niska temperatura. Za veće uzorke ćelija dostupni su različiti reaktori s protočnom ćelijom i rashladnim košuljicama.
Ovdje pročitajte detaljne savjete i preporuke za uspješnu ultrazvučnu lizu!

Protokoli za ultrazvučnu pripremu lizata bakterije E. coli

Istraživači koriste Hielscher ultrazvučne homogenizatore za razgradnju ćelija E.coli. U nastavku možete pronaći različite provjerene i dokazane protokole za lizu E.coli pomoću Hielscher ultrazvučnih homogenizatora za različite primjene vezane za E. coli.

Rast ćelija, umrežavanje i priprema ćelijskih ekstrakata E. coli pomoću ultrazvuka

Za SeqA i RNK polimerazu ChIP-Chip, E. coli MG1655 ili MG1655 ΔseqA uzgajan je na 37°C do OD₆₀₀ od oko 0,15 u 50 ml LB (+ 0,2% glukoze), nakon čega je dodano 27 μl formaldehida (37%) po ml medija (konačna koncentracija 1%). Umrežavanje je provedeno uz sporo mućkanje (100 rpm) na sobnoj temperaturi 20 min, nakon čega je slijedilo gašenje reakcije s 10 ml 2,5 M glicina (konačna koncentracija 0,5 M). Za eksperimente toplotnog šoka, E. coli MG1655 uzgajan je u 65 ml LB medija na 30°C do OD₆₀₀ od oko 0,3. Zatim je 30 ml kulture preneseno u prethodno zagrijanu tikvicu na 43°C, a ostatak je zadržan na 30°C. Umrežavanje i gašenje reakcije provedeni su kako je gore opisano, osim što su ćelije držane na 30 ili 43°C 5 min prije daljeg sporog mućkanja na sobnoj temperaturi. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem i dvaput isprane hladnim TBS-om (pH7.5). Nakon resuspendiranja u 1 ml pufera za lizu (10 mM Tris (pH 8,0), 20% saharoze, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lizozima) i inkubacije na 37°C 30 min, nakon čega je dodano 4 ml IP pufera, ćelije su ultrazvučno obrađene na ledu 12 puta po 30 s uz pauze od 30 s pomoću Hielscher ultrazvučnog procesora UP400St pri postavci snage od 100%. Nakon centrifugiranja 10 min na 9000 g, alikvoti supernatanta od 800 μl pohranjeni su na -20°C. (Waldminghaus 2010)

Prekomjerna proizvodnja i pročišćavanje enzima pomoću ultrazvučne sonde

Za prekomjernu proizvodnju proteina označenih dekahistidinom (His10), E. coli BL21(DE3) transformisan je konstruktima pET19b. Prekonoćna prekultura sakupljena je centrifugiranjem, a 1% je korišteno za inokulaciju ekspresijske kulture. Ćelije koje nose pET19mgtB uzgajane su na 22°C do optičke gustine na 600 nm (OD600) od 0,7. Kultura je prenesena na 17°C i inducirana s 100 μM IPTG-a. Nakon 16 h kultura je sakupljena centrifugiranjem na 7.500 × g na 4°C. Ćelije su resuspendirane u 50 mM fosfatnom puferu sa fiziološkom otopinom (PBS) s 0,3 M NaCl pri pH 7,4 i razgrađene ultrazvučnom obradom pomoću S2 mikro-sonotrode na Hielscher ultrazvučnom uređaju UP200St pri ciklusu od 0,5 i amplitudi od 75%.
Prekomjerna proizvodnja GtfC označenog dekahistidinom inducirana je na 37°C pri OD₆₀₀ od 0,6 sa 100 μM IPTG-a. Ćelije su zatim inkubirane 4 h, sakupljene i lizirane kako je gore navedeno za MgtB.
Sirovi ćelijski ekstrakti centrifugirani su na 15.000 × g i 4°C radi sedimentacije ćelijskih ostataka. Bistri ekstrakti naneseni su na kolone HisTrap FF Crude od 1 ml pomoću sistema ÄKTAprime Plus. Enzimi su pročišćeni prema protokolu proizvođača za gradijentnu eluciju proteina označenih His-oznakom. Eluirane otopine proteina dijalizirane su dvaput naspram 1.000 volumena 50 mM PBS-a, pH 7,4, s 0,3 M NaCl na 4°C. Pročišćavanje je analizirano pomoću 12% SDS-PAGE. Koncentracija proteina određena je Bradfordovom metodom pomoću Roti-Quanta. (Rabausch et al. 2013)

Ultrazvučna ekstrakcija proteina iz bakterije E. coli
Protein mamac od interesa (u ovom slučaju MTV1 iz biljke Arabidopsis thaliana) fuzionira se s GST oznakom i eksprimira u ćelijama BL21 Escherichia coli (E. coli).

Uzmite jedan pelet GST-MTV1 i GST (što odgovara 50 ml bakterijske kulture) i svaki resuspendirajte u 2,5 mL ledeno hladnog pufera za ekstrakciju.
Koristite ultrazvučni uređaj UP100H (opremljen MS3 mikro-sonotrodom za male zapremine od oko 2-5mL) da razgradite bakterijske ćelije dok se ne liziraju, što se uočava po smanjenoj neprozirnosti i povećanoj viskoznosti. Ovo se mora provoditi na ledu, a preporučuje se ultrazvučna obrada u intervalima (npr. 10 s ultrazvučne obrade, zatim 10 s pauze na ledu i tako dalje). Treba paziti da se ne primjenjuje previsok intenzitet. Ako se uoči pjenjenje ili stvaranje bijelog taloga, intenzitet treba smanjiti.
Prenesite lizirani rastvor bakterija u mikrocentrifugalne epruvete od 1,5 mL i centrifugirajte na 4°C, 16.000 x g tokom 20 min.

Ultrazvučne sonde koriste sile akustične kavitacije za razgradnju ćelija i ekstrakciju molekula i DNK iz bakterije E.coli.

Ultrazvučni uređaji sa sondom poput UP400St koriste princip rada akustične kavitacije za efikasnu lizu bakterije E.coli.

Analiza ekspresije i pročišćavanje rekombinantnog proteina pomoću ultrazvučne obrade

Pelet E. coli ultrazvučno je obrađen Hielscher ultrazvučnim uređajem UP100H. U tu svrhu, pelet ćelija resuspendiran je u ohlađenom puferu za lizu (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) i hlađen na ledu 10 min. Zatim je suspenzija ćelija ultrazvučno obrađena s 10 kratkih impulsa od 10 s, nakon kojih je slijedio interval od 30 s za hlađenje. Na kraju su ćelijski ostaci uklonjeni ultracentrifugiranjem na 4°C tokom 15 min na 14.000 rpm. Radi potvrde ekspresije rPR, supernatant je nanesen na 12% poliakrilamidni gel i analiziran pomoću SDS-PAGE i Western blota. Pročišćavanje rPR provedeno je pomoću Ni2+-NTA smole (Invitrogen, USA) prema uputstvu proizvođača. U ovoj fazi korištena je nativna metoda pročišćavanja. Čistoća pročišćenog proteina procijenjena je elektroforezom na 12% poliakrilamidnom gelu i naknadnim bojenjem Coomassie plavom. Koncentracija pročišćenog proteina izmjerena je kompletom za test proteina Micro BCA (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)

Ovaj video prikazuje ultrazvučnu čašastu sonotrodu snage 200 vati za dispergiranje, homogeniziranje, ekstrakciju ili otplinjavanje laboratorijskih uzoraka.

Ultrazvučni homogenizatori za lizu bakterije E. coli

Hielscher Ultrasonics projektuje, proizvodi i isporučuje visokoučinkovite ultrazvučne homogenizatore za pouzdanu i efikasnu lizu bakterije E. coli i drugih vrsta ćelija, tkiva i ćelijskih kultura.
Široki portfolio ultrazvučnih sondi, kao i sistema za indirektnu ultrazvučnu obradu, omogućava nam da vam ponudimo idealan ultrazvučni homogenizator tkiva za vašu primjenu razgradnje ćelija i ekstrakcije.

Projektovanje, proizvodnja i savjetovanje – kvalitet proizveden u Njemačkoj

Hielscher ultrazvučni uređaji poznati su po najvišem kvalitetu i standardima dizajna. Pametni softver, intuitivni meni, programabilne postavke i automatsko protokoliranje podataka samo su neke od karakteristika Hielscher ultrazvučnih uređaja. Robusnost i jednostavan rad omogućavaju nesmetanu integraciju naših ultrazvučnih uređaja u istraživačke i biotehnološke objekte. Hielscher ultrazvučni uređaji lako se nose čak i s teškim uvjetima i zahtjevnim okruženjima.

Hielscher Ultrasonics je ISO certificirana kompanija i poseban naglasak stavlja na visokoučinkovite ultrazvučne uređaje koji odlikuju najsavremenijom tehnologijom i jednostavnošću korištenja. Naravno, Hielscher ultrazvučni uređaji su u skladu sa CE oznakom i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.

Tabela u nastavku daje okvirni pregled približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih uređaja:

Zapremina šarže	Protok	Preporučeni uređaji
višejažične / mikrotitarske ploče	n.a.	UIP400MTP
CupHorn za bočice ili čaše	n.a.	Ultrazvučni CupHorn
ultrazvučni mikroreaktor s protokom	n.a.	GDmini2
do 10 bočica od 0,5 do 1,5mL	n.a.	VialTweeter
0,5 do 1,5mL	n.a.	VialTweeter
1 do 500mL	10 do 200mL/min	UP100H
10 do 2000mL	20 do 400mL/min	UP200Ht, UP400St
0,1 do 20L	0,2 do 4L/min	UIP2000hdT
10 do 100L	2 do 10L/min	UIP4000
n.a.	10 do 100L/min	UIP16000
n.a.	veći	klaster uređaja UIP16000

Kontaktirajte nas! / Pitajte nas!

Video prikazuje sistem za ultrazvučnu pripremu uzoraka UIP400MTP, koji omogućava pouzdanu pripremu uzoraka u svim standardnim pločama s više jažica pomoću ultrazvuka visokog intenziteta. Tipične primjene uređaja UIP400MTP uključuju lizu ćelija, fragmentaciju DNA, RNA i hromatina te ekstrakciju proteina.

Dodatni protokoli za ultrazvučnu lizu bakterije E. coli

Proteini modificirani alicinom u bakteriji E. coli pomoću ultrazvučnog uređaja VialTweeter

Određivanje sadržaja sulfhidrilnih grupa testom s 5,5′-ditiobis(2-nitrobenzojevom kiselinom) (DTNB)
Prekonoćna kultura E. coli MG1655 korištena je za inokulaciju MOPS minimalnog medija (1:100). Kultura je uzgajana aerobno dok nije dostignut A600 od 0,4. Kultura je podijeljena na tri kulture od 15 ml za tretman stresom. Netretirana kultura služila je kao negativna kontrola. U jednu od preostale dvije kulture dodano je 0,79 mM alicina (128 μg ml-1), odnosno 1 mM diamida. Kulture su inkubirane 15 min. 5 ml svake kulture sakupljeno je centrifugiranjem (8.525 × g, 4°C, 10 min). Ćelije su dvaput isprane s 1 ml PBS-a (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, pohranjen anaerobno prije upotrebe) i centrifugirane (13.000 × g, 4°C, 10 min). Ćelije su resuspendirane u puferu za lizu (PBS sa 6 mM guanidinijum HCl, pH 7,4) prije razgradnje na 4°C ultrazvučnom obradom (VialTweeter ultrazvučni uređaj, Hielscher GmbH, Njemačka) (3 × 1 min). Ćelijski ostaci istaloženi su centrifugiranjem (13.000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatant je prenesen u QS-makro kivetu od 3,5 ml (10 mm) s magnetnom miješalicom i pomiješan s 1 ml pufera za lizu. Ekstinkcija uzoraka praćena je na 412 nm spektrofotometrom Jasco V-650 opremljenim držačem ćelije s kontrolom temperature PSC-718 na sobnoj temperaturi. Dodano je 100μl otopine 3 mM ditiobis(2-nitrobenzojeve kiseline). Ekstinkcija je praćena dok nije dostigla zasićenje. Koncentracija tiola izračunata je pomoću koeficijenta ekstinkcije ϵ₄₁₂ = 13.700 M^-1 cm^-1 za tio-2-nitrobenzojevu kiselinu (TNB). Ćelijske koncentracije tiola izračunate su na osnovu zapremine ćelija E. coli od 6,7 × 10^-15 litara i gustine ćelija od A600 = 0,5 (što odgovara 1 × 10⁸ ćelija ml^-1 kulture). (Müller et al. 2016)

Određivanje glutationa in vivo pomoću ultrazvučnog uređaja za razgradnju ćelija

E.coli MG1655 uzgajan je u MOPS minimalnom mediju u ukupnoj zapremini od 200ml dok nije dostignut A600 od 0,5. Kultura je podijeljena na kulture od 50 ml za tretman stresom. Nakon 15 min inkubacije s 0,79 mM alicina, 1 mM diamida ili dimetil sulfoksida (kontrola), ćelije su sakupljene na 4.000g na 4°C tokom 10 min. Ćelije su dvaput isprane KPE puferom prije resuspendiranja peleta u 700µl KPE pufera. Za deproteinaciju je dodano 300l 10% (w/v) sulfosalicilne kiseline prije razgradnje ćelija ultrazvučnom obradom (3 x 1 min; VialTweeter ultrazvučni uređaj). Supernatanti su sakupljeni nakon centrifugiranja (30 min, 13.000g, 4°C). Koncentracije sulfosalicilne kiseline smanjene su na 1% dodavanjem 3 volumena KPE pufera. Mjerenja ukupnog glutationa i GSSG provedena su kako je gore opisano. Ćelijske koncentracije glutationa izračunate su na osnovu zapremine ćelija E. coli od 6,7×10^-15 litara i gustine ćelija od A600 0,5 (što odgovara 1×10⁸ ćelija ml^-1 kulture). Koncentracije GSH izračunate su oduzimanjem 2[GSSG] od ukupnog glutationa. (Müller et al. 2016)

Ekspresija humane mAspAT u bakteriji E. coli pomoću ultrazvučnog homogenizatora

Pojedinačna kolonija E. coli BL21 (DE3) koja sadrži ekspresijski vektor stavljena je u 30 mL Luria-Bertani (LB) medija koji sadrži 100μg/mL ampicilina, a zatim uzgajana na 37ºC dok optička gustina (OD₆₀₀) nije dostigla 0,6. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem na 4.000 × g tokom 10 min i resuspendirane u 3L svježeg LB medija koji sadrži 100μg/mL ampicilina.
Zatim je ekspresija proteina inducirana s 1 mM izopropil β-ᴅ-1-tiogalaktopiranozidom (IPTG) tokom 20 h na 16ºC. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem na 8.000 × g tokom 15 min i isprane puferom A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Dobijeno je približno 45g (mokra masa) ćelija iz kulture od 3 L. Nakon centrifugiranja, peleti ćelija resuspendirani su u 40 mL (za kulturu od 1 L) ledeno hladnog pufera za ekstrakciju A i lizirani ultrazvučnom obradom na ledeno hladnoj temperaturi pomoću Hielscher ultrazvučnog uređaja za razgradnju ćelija UP400St. Lizat ćelija centrifugiran je na 12.000 rpm tokom 15 min radi odvajanja rastvorljive (supernatant) i istaložene (pelet) frakcije. (Jiang et al. 2015)

Povezane teme

Zanimljivosti koje vrijedi znati

E.coli

Escherichia coli (E. coli) je gram-negativna, fakultativno anaerobna, štapićasta, koliformna bakterija roda Escherichia koja se obično nalazi u donjem dijelu crijeva toplokrvnih organizama (endotermi). Postoji veliki broj sojeva (ili podtipova) bakterije E. coli s raznolikim karakteristikama. Većina sojeva E. coli je bezopasna za ljude, npr. sojevi B i K-12, koji se uobičajeno koriste za istraživačke primjene u laboratorijama. Međutim, neki sojevi su štetni i mogu uzrokovati ozbiljna oboljenja.
E. coli ima važnu ulogu u modernom biološkom inženjerstvu i industrijskoj mikrobiologiji jer se bakterijom lako manipuliše. Uobičajene laboratorijske primjene često uključuju upotrebu bakterije E. coli, npr. za stvaranje rekombinantne dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) ili kao model-organizma.
E. coli je vrlo svestran domaćin za proizvodnju heterolognih proteina, a dostupni su brojni sistemi ekspresije proteina za proizvodnju rekombinantnih proteina u bakteriji E. coli. Pomoću plazmida koji omogućavaju visoku ekspresiju proteina, geni se mogu uvesti u bakterije, što omogućava proizvodnju takvih proteina u velikim količinama u industrijskim procesima fermentacije.
E.coli se koristi kao ćelijska fabrika za proizvodnju inzulina. Daljnje primjene uključuju upotrebu modificiranih ćelija E. coli za razvoj i proizvodnju vakcina i imobiliziranih enzima, za proizvodnju biogoriva, kao i za bioremedijaciju.
Soj K-12 je mutantni oblik bakterije E. coli koji prekomjerno eksprimira enzim alkalnu fosfatazu (ALP). Ova mutacija nastaje zbog defekta u genu koji neprestano kodira za enzim. Ako gen proizvodi produkt bez ikakve inhibicije, to je poznato kao konstitutivna aktivnost. Ovaj specifični mutantni oblik koristi se za izolaciju i pročišćavanje enzima ALP.
Bakterije E. coli također se široko koriste kao ćelijske fabrike. Inženjerski modificirani mikrobi (npr. bakterije) i biljne ćelije mogu se koristiti kao tzv. ćelijske fabrike. Te genetski modificirane ćelije proizvode molekule, hemikalije, polimere, proteine i druge supstance, koje se koriste, na primjer, u farmaceutskoj, prehrambenoj i hemijskoj industriji. Da bi se molekule proizvedene u unutrašnjosti takvih bioinženjerski modificiranih ćelija oslobodile, ultrazvučna liza je uobičajena metoda za razgradnju ćelijskih zidova i prenošenje ciljnih supstanci u okolnu tečnost. Pročitajte više o lizi bioinženjerski modificiranih ćelija!

Ultrazvučna fragmentacija DNK

Ultrazvučne smične sile često su korištena metoda za oslobađanje molekula, organela i proteina iz unutrašnjosti ćelije, kao i za lomljenje lanaca DNK na komadiće. Akustična kavitacija razgrađuje ćelijske zidove i membrane radi ekstrakcije DNK iz ćelija i stvara fragmente dužine oko 600 – 800 bp, što je idealno za analizu.
Kliknite ovdje da saznate više o ultrazvučnim homogenizatorima za fragmentaciju DNK!

Literatura / reference

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

Visokoučinkovita ultrazvučna tehnologija! Hielscher asortiman pokriva cijeli spektar, od kompaktnih laboratorijskih ultrazvučnih uređaja preko stolnih jedinica do potpuno industrijskih ultrazvučnih sistema.

Hielscher Ultrasonics proizvodi visokoučinkovite ultrazvučne homogenizatore od laboratorijskih do industrijskih veličina.