Protokol za SARS-CoV-2 Coronavirus Inactivation sa Sonication

Hielscher VialTweeter je jedinstvena ultrazvučna jedinica za pripremu više uzoraka, koja se koristi za inaktivaciju koronavirusa SARS-COV-2. VialTweeter omogućava istovremeno pripremu do 10 bočica za uzorke i time je idealna jedinica za obradu masovnih uzoraka.

Inaktivacija SARS-CoV-2 Coronavirusa sa VialTweeterom

Nakon uklanjanja fiksativnog, monolejeri su tri puta oprani fosfatom -baferiranim saline (PBS) prije struganja ćelija u 1mL MEM/5% FBS i soniciran (3 × 10 sekundi na, 10 sekundi isključen na 100% snage i amplitude) pomoću Hielscher ultrazvučnog procesora UP200St sa Vialtweeterom Prilog. Natprirodni su pojašnjeni centrifugom na 3000 × g 10 min. 

Pročitajte cijeli protokol ovdje za SARS-CoV-2 coronavirus inaktivaciju od strane Welch et al. (2020) u nastavku:

Ćelije i virus

Vero E6 ćelije (Vero C1008; ATCC CRL-1586) su bili kulturani u modificiranom Orlovom minimalnom esencijalnom mediju (MEM) dopunjenom sa 10% (v/v) serumom fetusnog teleta (FCS). Virus korišten je bio SARS-CoV-2 soj hCOV-19/England/2/2020, izoliran od strane PHE-a iz prvog klastera pacijenata u Velikoj Britaniji 29/01/2020. Ovaj virus je dobiven u prolazu 1 i korišten za ispitivanja inaktivacije na prolazu 2 ili 3.
Za reagente i hemikalije koje se koriste za inaktivaciju SARS-CoV-2 kao i uklanjanje reagentne cistotoksičnosti molimo vas da vidite naučni izvještaj Welch et al. (2020).

Inaktivacija virusa deterdžentima – SARS-CoV-2 Coronavirus Inactivation protocol by Welch et al. 2020

SARS-CoV-2 inaktivacija

Za komercijalne proizvode, preparati virusa (tekućina za kulturu tkiva, titeri u rasponu od 1 × 10⁶ do 1 × 10⁸ PFU/ml) su tretirani u triplikatu reagentima u koncentracijama i za kontaktna vremena preporučena u uputama proizvođača za upotrebu, gdje je to dostupno, ili za koncentracije i vremena koja su posebno zatražena od strane laboratorija za testiranje. Gdje je niz koncentracija dao proizvođač, testiran je najniži omjer proizvoda i uzorka (to je najniža preporučena koncentracija testnog proizvoda). Reagenti za transport uzoraka su testirani pomoću omjera jedne zapremine tekućine za kulturu tkiva i deset volumena reagenta, osim ako proizvođač nije naveo omjer volumena tekućine uzorka i reagenta. Deterdženti, fiksativi i otapao testirani su u naznačenim koncentracijama za naznačena vremena. Svi koraci inaktivacije su izvedeni na temperaturi ambijentalne sobe (18 – 25°C). Za testiranje alternativnih tipova uzoraka, virus je začinjen u naznačenu matricu uzorka u omjeru 1:9, zatim tretiran testnim reagentima kao gore. Svi eksperimenti su uključili trostruke kontrolne ismešane uzorke sa ekvivalentnim volumenom PBS-a na mjestu testnog reagenta. Odmah nakon potrebnog vremena kontakta obrađeno je 1mL obrađenog uzorka pomoću odgovarajuće odabrane filtracione matrice. Uklanjanje reagenta za ispitivanje inaktivacije je izvršeno u većem formatu spin kolone koristeći Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher), ili punjenje praznih Pierce 10mL centrifugnih stubova kapaciteta (Thermo Fisher) sa SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR ili Sephadex LH-20 da daju 4mL pakiranim kvascima/smoli. Za pročišćavanje pomoću Amicon filtera, 2 × uzoraka od 500μl su pročišćeni pomoću dva centrifugalna filtera metodom koja je prethodno opisana, a zatim udvojena zajedno. Za formaldehid i formaldehid sa uklanjanjem glutaraldehidrata, korišten je jedan filter sa volumenom uzorka od 1× 500μl, koji se ponovo koristi nakon obrade u 500μl PBS, i dodat na 400ul MEM/5% FBS. Za inaktivaciju zaraženih monoleji, 12,5 cm² flašice ćelija Vero E6 (2,5 × 10⁶ ćelije/pljoska u 2,5mL MEM/5% FBS) bile su zaražene kod MOI 0,001 i inkubirali na 37°C/5% CO₂ 24 sata. Supernatant je uklonjen, a ćelije fiksiran pomoću 5mL formaldehida, ili formaldehida i glutaraldehida na sobanoj temperaturi 15 ili 60 min. Fiksativno je uklonjeno, a monoleji su se tri puta prali PBS-om prije struganja ćelija u 1mL MEM/5% FBS i sonicated (3 × 10 second on, 10 seconds off at 100% power and amplitude) koristeći UP200St sa VialTweeter prilogom (Hielscher Ultrasound Technology). Natprirodni su pojašnjeni centrifugom na 3000 × g 10 min.

Detalji reagenta koji se koristi za sars-CoV-2 inaktivaciju koronavirusa sa ultrazvučnim VialTweeterom prema protokolu Welch et al. 2020

Potpuni protokol uključujući upotrebu Hielscher VialTweetera možete naći ovdje:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Sofisticirani ultrazvučni dismembratori i cell disruptors

Multi-uzorak ultrasonicator VialTweeter je samo jedno od mnogih ultrazvučnih rješenja za pripremu uzoraka u biološkim, biohemijskim i kliničkim laboratorijama. Hielscher Ultrasonics nudi idealan ultrazvučni dismembrator za vašu primjenu, npr. lizu ćelija, ekstrakciju ćelija, homogenizaciju tkiva, rastvaranje lisata, rastvaranje, degasiranje uzoraka itd.
Javite nam koliko uzoraka morate obraditi po satu i danu, ako više volite direktnu ili indirektnu sonikaciju i koja je meta ultrazvučnog tretmana uzorkom. Preporučit ćemo vam najpo odgovarajuću ultrazvučnu jedinicu za vašu dnevnu radnu rutinu!
Hielscher Ultrasonicsovi digitalni ultrazvučni procesori opremljeni su pametnim softverom, automatskim snimanjem podataka, lakim opcijama pre-podešavanja za kontrolu temperature, trajanjem sonikacije, ciklusom/pulsnim načinom rada kao i prozornim i daljinskim upravljačem preglednika. Trudimo se da naše ultrazvučne uređaje učinimo što pametnijima kako bi vaša rutina istraživanja i rada postala što zgodnija i uspješnija.
Kliknite ovdje, da pronađete više aplikacija uključujući protokole ultrazvučne pripreme uzoraka sa VialTweeterom!