Protokol za inaktivaciju virusa SARS-CoV-2 uz pomoć ultrazvuka

Hielscher VialTweeter je jedinstvena ultrazvučna jedinica za pripremu više uzoraka, koja se koristi za inaktivaciju koronavirusa SARS-COV-2. VialTweeter omogućava pripremu do 10 bočica sa uzorcima istovremeno i stoga je idealna jedinica za masovnu obradu uzoraka.

Inaktivacija SARS-CoV-2 Corona virusa VialTweeter-om

Nakon uklanjanja fiksatora, monoslojevi su tri puta isprani fiziološkim rastvorom puferiranim fosfatom (PBS) prije nego što su ćelije ostrugane u 1 mL MEM/5% FBS i obrađene sonikacijom (3 × 10 sekundi uključeno, 10 sekundi isključeno pri 100% snage i amplitude) koristeći Hielscher ultrazvučni procesor UP200St sa VialTweeterom prilog. Supernatanti su bistreni centrifugiranjem na 3000 × g tokom 10 minuta. Ovdje pročitajte cijeli protokol za inaktivaciju koronavirusa SARS-CoV-2 Welch et al. (2020) ispod:

Ćelije i virusi

Vero E6 ćelije (Vero C1008; ATCC CRL-1586) su uzgajane u modifikovanom Eagleovom minimalnom esencijalnom medijumu (MEM) sa dodatkom 10% (v/v) fetalnog telećeg seruma (FCS). Korišten je virus SARS-CoV-2 soj hCOV-19/Engleska/2/2020, izolovan od strane PHE iz prvog klastera pacijenata u UK 29.1.2020. Ovaj virus je dobijen na prolazu 1 i korišten za studije inaktivacije na prolazu 2 ili 3.
Za reagense i hemikalije koje se koriste za inaktivaciju SARS-CoV-2, kao i za uklanjanje citotoksičnosti reagensa, pogledajte naučni izvještaj Welcha et al. (2020).

Inaktivacija virusa deterdžentima – Protokol inaktivacije SARS-CoV-2 Coronavirusa Welch et al. 2020

Inaktivacija SARS-CoV-2

Za komercijalne proizvode, preparate virusa (tečnost kulture tkiva, titri u rasponu od 1 × 10⁶ do 1 × 10⁸ PFU/ml) tretirani su u tri primjerka reagensima u koncentracijama i za vrijeme kontakta preporučeno u uputama za upotrebu proizvođača, gdje su dostupne, ili za koncentracije i vremena koje su posebno zahtijevale laboratorije za ispitivanje. Kada je proizvođač dao raspon koncentracija, testiran je najniži omjer proizvoda prema uzorku (tj. najniža preporučena koncentracija ispitivanog proizvoda). Reagensi u epruveti za transport uzoraka testirani su korištenjem omjera jedne zapremine tečnosti kulture tkiva prema deset zapremina reagensa, osim ako proizvođač nije odredio zapreminski odnos tečnosti uzorka i reagensa. Deterdženti, fiksativi i otapala su testirani na naznačenim koncentracijama za naznačeno vrijeme. Svi koraci inaktivacije izvedeni su na sobnoj temperaturi (18 – 25°C). Za testiranje alternativnih tipova uzoraka, virus je ubačen u naznačenu matricu uzorka u omjeru 1:9, a zatim tretiran test reagensima kao što je gore navedeno. Svi eksperimenti uključivali su tri primjerka kontrolnih lažno tretiranih uzoraka s ekvivalentnom zapreminom PBS-a umjesto test reagensa. Odmah nakon potrebnog vremena kontakta, 1 mL tretiranog uzorka je obrađen pomoću odgovarajuće odabrane filtracijske matrice. Uklanjanje reagensa za testiranje inaktivacije izvedeno je u većem formatu centrifugiranja pomoću Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher), ili punjenjem praznih Pierce 10mL centrifugalnih kolona (Thermo Fisher) sa SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR ili Sephadex LH-20 za davanje 4mL upakovanih kuglica/smole. Za pročišćavanje pomoću Amicon filtera, 2 × 500 μl uzorka su pročišćena pomoću dva centrifugalna filtera prema prethodno opisanoj metodi, a zatim spojeni. Za formaldehid i formaldehid sa uklanjanjem glutaraldehida, korišćen je jedan filter sa zapreminom uzorka 1×500 μl, resuspendovan nakon obrade u 500 μl PBS i dodan u 400 ul MEM/5% FBS. Za inaktivaciju zaraženih jednoslojevi, 12,5 cm² tikvice Vero E6 ćelija (2,5 × 10⁶ ćelije/bocu u 2,5 mL MEM/5% FBS) inficirane su na MOI 0,001 i inkubirane na 37°C/5% CO₂ za 24 sata. Supernatant je uklonjen, a ćelije fiksirane upotrebom 5 mL formaldehida, ili formaldehida i glutaraldehida na sobnoj temperaturi 15 ili 60 minuta. Fiksativ je uklonjen, a monoslojevi su tri puta isprani PBS-om prije nego što su ćelije ostrugane u 1mL MEM/5% FBS-a i obrađene sonikacijom (3 × 10 sekundi uključeno, 10 sekundi isključeno pri 100% snage i amplitude) korištenjem UP200St sa VialTweeter nastavkom (Hielscher Ultrasound tehnologija). Supernatanti su bistreni centrifugiranjem na 3000 × g tokom 10 minuta.

Detalji reagensa koji se koristi za inaktivaciju koronavirusa SARS-CoV-2 ultrazvučnim VialTweeterom prema protokolu Welcha et al. 2020

Kompletan protokol uključujući upotrebu Hielscher VialTweeter-a možete pronaći ovdje:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Sofisticirani ultrazvučni dismembratori i disruptori ćelija

Ultrazvučni aparat za više uzoraka VialTweeter samo je jedno od mnogih ultrazvučnih rješenja za pripremu uzoraka u biološkim, biohemijskim i kliničkim laboratorijama. Hielscher Ultrasonics nudi idealan ultrazvučni dismembrator za vašu primjenu, npr. lizu stanica, ekstrakciju stanica, homogenizaciju tkiva, solubilizaciju lizata, otapanje, otplinjavanje uzoraka itd.
Javite nam koliko uzoraka morate obraditi po satu i danu, da li više volite direktnu ili indirektnu sonikaciju i koji je cilj obrade ultrazvučnog uzorka. Preporučićemo vam najprikladniju ultrazvučnu jedinicu za vašu svakodnevnu radnu rutinu!
Digitalni ultrazvučni procesori kompanije Hielscher Ultrasonics opremljeni su pametnim softverom, automatskim snimanjem podataka, jednostavnim opcijama za prethodno podešavanje za kontrolu temperature, trajanje ultrazvučne obrade, ciklus/pulsni način rada, kao i osvjetljenje uzorka i daljinsko upravljanje preglednikom. Trudimo se da naše ultrazvučne uređaje učinimo što pametnijima kako bi vaša istraživačka i radna rutina postala što praktičnija i uspješnija.
Kliknite ovdje, da pronađete više aplikacija uključujući protokole ultrazvučne pripreme uzoraka sa VialTweeter!