Protokol za inaktivaciju koronavirusa SARS-CoV-2 pomoću ultrazvučne obrade (sonikacije)

Hielscher VialTweeter jedinstvena je ultrazvučna jedinica za istovremenu pripremu više uzoraka, koja se koristi za inaktivaciju koronavirusa SARS-COV-2. VialTweeter omogućava istovremenu pripremu do 10 bočica s uzorcima i stoga je idealna jedinica za masovnu obradu uzoraka.

Inaktivacija koronavirusa SARS-CoV-2 pomoću VialTweeter

Nakon uklanjanja fiksativa, monoslojevi su tri puta isprani fosfatnim puferiranim fiziološkim rastvorom (PBS), a zatim su ćelije sastrugane u 1mL MEM/5% FBS i podvrgnute ultrazvučnoj obradi (3 × 10 sekundi uključeno, 10 sekundi isključeno pri 100% snage i amplitude) pomoću Hielscher ultrazvučnog procesora UP200St sa VialTweeter nastavkom. Supernatanti su izbistreni centrifugiranjem pri 3000 × g tokom 10 min. Cjelokupni protokol za inaktivaciju koronavirusa SARS-CoV-2 autora Welch et al. (2020) pročitajte u nastavku:

Ćelije i virus

Ćelije Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) uzgajane su u modificiranom Eagleovom minimalnom esencijalnom mediju (MEM) uz dodatak 10% (v/v) fetalnog telećeg seruma (FCS). Korišten je soj virusa SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020, koji je PHE izolirao iz prve grupe povezanih slučajeva zaraze među pacijentima u Ujedinjenom Kraljevstvu dana 29/01/2020. Ovaj virus dobiven je u pasaži 1 i korišten za ispitivanja inaktivacije u pasaži 2 ili 3.
Za reagense i hemikalije koje se koriste za inaktivaciju SARS-CoV-2, kao i za uklanjanje citotoksičnosti reagensa, pogledajte naučni izvještaj Welcha et al. (2020).

Inaktivacija virusa deterdžentima – protokol za inaktivaciju koronavirusa SARS-CoV-2 prema Welch et al. 2020

Inaktivacija SARS-CoV-2


Za komercijalne proizvode, virusni preparati (tečnost tkivne kulture, titri u rasponu od 1 × 10⁶ do 1 × 10⁸ PFU/ml) tretirani su u triplikatu reagensima u koncentracijama i tokom vremena kontakta preporučenih u uputstvima proizvođača za upotrebu, gdje su bila dostupna, ili u koncentracijama i tokom vremena koje su izričito zatražile ispitne laboratorije. Kada je proizvođač naveo raspon koncentracija, ispitan je najniži omjer proizvoda i uzorka (tj. najniža preporučena koncentracija ispitivanog proizvoda). Reagensi iz epruveta za transport uzoraka ispitani su uz omjer jednog volumena tečnosti kulture tkiva prema deset volumena reagensa, osim ako je proizvođač naveo volumni omjer tečnosti uzorka i reagensa. Deterdženti, fiksativi i rastvarači ispitani su pri navedenim koncentracijama tokom navedenih vremena. Svi koraci inaktivacije provedeni su na sobnoj temperaturi (18 – 25°C). Za ispitivanje drugih vrsta uzoraka, virus je dodan u navedeni matriks uzorka u omjeru 1:9, a zatim je uzorak tretiran ispitivanim reagensima kako je prethodno opisano. Svi eksperimenti uključivali su kontrolne uzorke u triplikatu, podvrgnute istom postupku uz dodatak ekvivalentnog volumena PBS umjesto ispitivanog reagensa. Odmah nakon isteka potrebnog vremena kontakta, 1mL tretiranog uzorka obrađen je primjenom odgovarajuće odabranog filtracijskog matriksa. Uklanjanje reagensa za ispitivanje inaktivacije provedeno je u većim kolonama za centrifugiranje upotrebom proizvoda Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher) ili punjenjem praznih kolona za centrifugiranje Pierce kapaciteta 10mL (Thermo Fisher) materijalima SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR ili Sephadex LH-20 kako bi se dobilo 4mL sabijenih kuglica/smole. Za pročišćavanje pomoću filtera Amicon, uzorci 2 × 500μl pročišćeni su pomoću dva centrifugalna filtera prethodno opisanom metodom, a zatim objedinjeni. Za uklanjanje formaldehida i formaldehida s glutaraldehidom korišten je jedan filter s volumenom uzorka 1× 500μl, koji je nakon obrade resuspendiran u 500μl PBS i dodan u 400ul MEM/5% FBS. Za inaktivaciju inficiranih monolayers, 12,5 cm² flasks of Vero E6 cells (2,5 × 10⁶ cells/flask in 2,5mL MEM/5% FBS) were infected at MOI 0,001 and incubated at 37°C/5% CO₂ tokom 24 sata. Supernatant je uklonjen, a ćelije su fiksirane pomoću 5mL formaldehida ili formaldehida i glutaraldehida na sobnoj temperaturi tokom 15 ili 60 minuta. Fiksativ je uklonjen, a monoslojevi su isprani tri puta PBS-om prije nego što su ćelije struganjem prenesene u 1mL MEM/5% FBS i sonicirane (3 × 10 sekundi uključeno, 10 sekundi isključeno pri 100% snage i amplitude) pomoću uređaja UP200St s nastavkom VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Supernatanti su izbistreni centrifugiranjem pri 3000 × g tokom 10 minuta.


Detalji o reagensima korištenim za inaktivaciju koronavirusa SARS-CoV-2 pomoću ultrazvučnog VialTweeter prema protokolu autora Welch et al. 2020

Cjelokupni protokol, uključujući upotrebu Hielscher VialTweeter, možete pronaći ovdje:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Sofisticirani ultrazvučni dismembratori i razgrađivači ćelija

Višeuzorni ultrazvučni uređaj VialTweeter samo je jedno od mnogih ultrazvučnih rješenja za pripremu uzoraka u biološkim, biohemijskim i kliničkim laboratorijama. Hielscher Ultrasonics nudi idealan ultrazvučni dismembrator za vašu primjenu, npr. lizu ćelija, ekstrakciju iz ćelija, homogenizaciju tkiva, solubilizaciju lizata, otapanje, otplinjavanje uzoraka itd.
Recite nam koliko uzoraka trebate obraditi po satu i danu, preferirate li direktnu ili indirektnu ultrazvučnu obradu i koji je cilj ultrazvučnog tretmana uzoraka. Preporučit ćemo vam najprikladniju ultrazvučnu jedinicu za vašu svakodnevnu laboratorijsku rutinu!
Digitalni ultrazvučni procesori Hielscher Ultrasonics opremljeni su pametnim softverom, automatskim bilježenjem podataka, jednostavnim opcijama predpodešavanja za kontrolu temperature, trajanje ultrazvučne obrade, ciklički/pulsni način rada, kao i za osvjetljenje uzoraka i daljinsko upravljanje putem preglednika. Trudimo se da naši ultrazvučni uređaji budu što pametniji kako bi vaša istraživačka i radna rutina bila što praktičnija i uspješnija.
Kliknite ovdje da biste pronašli više primjena, uključujući protokole ultrazvučne pripreme uzoraka pomoću VialTweeter!