Drosophila melanogaster se u laboratorijama široko koristi kao model organizma. Stoga se moraju često provoditi preda analitički koraci pripreme kao što su liza, poremećaj ćelija, ekstrakcija proteina i snižavanje DNK uzoraka Drosophila melanogastera. Ultrazvučni dismembratori su pouzdani i efikasni i mogu se koristiti za obavljanje raznih zadataka kao što su liza, ekstrakcija proteina ili fragmentacija DNK na jednostavnost podešavanjem samo ultrazvučnih parametara procesa. Ultrazvučni homogenizatori su time fleksibilni alati sa širokim spektrom aplikacija.

Ultrazvučna liza i ekstrakcija proteina

Liza, rastvor ćelija, homogenizacija tkiva i ekstrakcija proteina su tipični zadaci za ultrazvučne dismembratore u biološkim laboratorijama. Ultrazvučni dismembratori i poremećaji ćelija su prikladni za homogenizaciju životinjskih tkiv, insekata (npr. Drosophila melanogaster, C. elegans) ili biljnih primjeraka. Naknadno primjena ultrasonication su liza ćelijskih suspenzija i peleta kao i ekstrakcija intraćelijskih proteina.
Ultrazvučna liza i ekstrakcija proteina su vrlo pouzdani i reproduktivni procesi, koji se mogu izvoditi na osnovu utvrđenih protokola. Pošto se ultrazvučni procesni intenzivitet može tačno podesiti preko parametara sonication kao što su amplitude, ciklus / pulsni mod, temperatura i volumen uzorka, nakon što se dokazani protokoli mogu ponavljati sa istim ishodom iznova i iznova.

Ultrazvučna DNK i rascjepkanost RNK

Nakon ćelijske lize i ekstrakcije proteina, čest potreban korak u pripremi uzorka je šaranje i fragmentacija DNK, RNK i hromatina, npr. prije imunoprecipitacije hromatina (ChIP). Fragmentacija DNK i RNK može se pouzdano postići razbijanjem kovalentnih veza koje drže DNK zajedno fizičkim silama. Koristeći fizičko sniženje kao što je sonication, u početku su DNK nit razbijena, onda se DNK fragmentira na manje komade.
Ultrazvučna fragmentacija DNK je pouzdana i efikasna u šiljanju DNK do ciljane dužine, npr. 500bp (bazni parovi). Glavne prednosti ultrazvučne fragmentacije DNK uključuju preciznu kontrolu ultrazvučnih parametara procesa i intenzivnosti. Parametri ultrazvučnog procesa mogu se podesiti podešavanjem jačine sonikacije, ciklusa i vremena precizno. Tako je moguće stvoriti željene veličine DNK i ciljana dužina DNK može biti pouzdano proizvedena kao i razmnožavana. Ultrazvučno šišanje DNK je idealno i za stvaranje fragmenata DNK visoke molekularne težine.

Protokoli za ultrazvučnu lizu drosophila melanogastera

U nastavku možete pronaći različite protokole za ultrazvučno potpomognutu lizu, ekstrakciju proteina, i DNK ili fragmentaciju hromatina uzoraka Drosophila.

Ultrazvučna liza za unakrsno povezivanje imunoprecipitacije (CLIP) Assay

CLIP assay je izveden kako je prethodno prijavljeno sa nekim izmjenama. Otprilike 20 mg jajnika od 0- do 1-dnevno stare ženke divljeg tipa bile su UV ukrštene (3 × 2000 μJ/cm2), homogenizirane na ledu u 1 mL RCB bafera (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM saharoze, 1 mM DTT, 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitori, 1 mM PMSF) dopunjeni sa 300 U RNAseOUT i stavljeni na led 30 min. Homogenat je bio soniciran na ledu, sa 80% snage, pet puta u 20 s puknuća sa 60 s odmora između korištenja Hielscher ultrazvučnog procesora UP100H (100 W, 30 kHz) i centrifugiran (16000 × g za 5 min na 4°C). Rastvorljiv ekstrakt je bio praćen sa 20 μl protein-G dinamida 20 min na 4°C. Nakon uklanjanja uzoraka za imunoblotiranje i kvantitacije ulaza RNK (1%), HP1 je imunoprecipitiran anti-HP1 9A9 antitijelom iz 450 μl precleared ekstrakta inkubacijom za 4 h sa 50 μl Protein-G dinamine. Imunoprecipitati su 4 puta oprani RCB-om. Da bi se eluirale imunoprecipitirane RNA- e, kuglice su kuhane u 100 μL UltraPure DEPC-tretirane vode 5 min. 900 μL Qiazol Reagent je dodano supernatantu koji se oporavio za pripremu RNK. RNK pročišćena je korištena kao predložak za sintezu cDNA koristeći oligo dT, slučajne heksameri i SuperScript reverznu transkriptazu III prema protokolu proizvođača.
(Cassale et al. 2019)

Ultrazvučna liza za hromatin imunoprecipitacija Assay

Imunoprecipitacija hromatina je izvedena prema metodi koju je Menet opisao s manjim izmjenama. Otprilike 20 mg jajnika od 0- do 1-dnevno stare ženke divljeg tipa homogenizirane su u 1 mL NEB bufera (10 mM HEPES-Na na pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na na pH 8, 0,5 mM EDTA-Na na pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidin, 0,15 mM Spermin, 1× EDTA- free Complete Protease Inhibitors) s homogenizatorom / uranjanje raspršivač 1 min (pri 3000 o/min). Homogenat je prebačen na pre-ohlađenu staklenu unce i 15 punih udaraca je naneseno uskim tučkom. Slobodni jedro je tada centrifugiran na 6000xg 10 min na 4°C. Kuglice koje sadrže jedro su resusped u 1 mL NEB i centrifugiran na 20000 × g za 20 min na sakroza gradijentu (0,65 mL od 1,6 M sakroza u NEB, 0,35 mL od 0,8 M sakroza u NEB). Kuglica je ponovo ubačana u 1 mL NEB i formaldehid do konačne koncentracije od 1%. Nuklei su bili unakrsno povezani 10 min na sonoj temperaturi i ugašeni dodavanjem 1/10 vol od 1.375 M glicina. Nuklei su prikupljeni centrifugacijom na 6000 × g 5 min. Nuklei su dva puta oprani u 1 mL NEB-a i ponovo su se ulili u 1 mL Lysis Buffera (15 mM HEPES-Na na pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA na pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Deoksiholat, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosine i 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors). Nuklei su sonicirane pomoću Hielscher ultrazvučnog procesora UP100H (100 W, 30 kHz) šest puta za 20 s na i 1 min na ledu. Sonicated nuclei su centrifugirani na 13000 × g 4 min na 4°C. Većina sonitiranog hromatina je bila 500 do 1000 baznih parova (bp) dužine. Za svaku imunoprecipitaciju inkubirao se 15 μg hromatina u prisustvu 10 μg monoklonskog protutijela HP1 9A9 (3 h na 4°C u rotirajućem kotaču). Zatim je dodano 50 μl dinamidnog proteina G, a inkubacija je nastavljena preko noći na 4°C. Natprirodni su odbačeni i uzorci su dva puta oprani u Lysis Bufferu (svako pranje 15 min na 4 °C) i dva puta u TE Bufferu (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl na pH 8). Hromatin je u dva koraka izdiran iz šmuka; prvi u 100 μl Eluition Buffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl na pH 8) na 65°C 15 min, nakon toga centrifugacija i oporavak supernatanta. Materijal je izvađen u 100 μl TE + 0,67% SDS- a. Kombinovani eluat (200 μl) inkubiran je preko noći na 65°C kako bi se obrnule unakrsne veze i tretirale sa 50 μg/ml RNaseA 15 min na 65°C i za 500 μg/ml Proteinaze K za 3 h na 65°C. Uzorci su ekstrahirani fenol-hloroform i etanol precipitiran. DNK je ponovo ubaиen u 25 μl vode. Za maksimiziranje molekularnih analiza sa imunoprecipitiranim DNK, geni kandidata su pojačani u parovima putem optimiziranog dupleks-PCR protokola koristeći dva različita seta primera koji imaju slične temperature topljenja u jednoj reakciji.
(Casale et al. 2019)
 

High-Performance Ultrasonic Cell Disruptors za biološke uzorke

Hielscher Ultrasonics je vaš dugo iskusni partner kada su u pitanju ultrasonikatori visokih performansi za poremećaj ćelije, lizu, ekstrakciju proteina, DNK, RNK, i fragmentaciju hromatina kao i druge predanalitičke korake pripreme uzoraka. Nudeći sveobuhvatan portfelj ultrazvučnih laboratorijskih homogenizatora i jedinica za pripremu uzoraka, Hielscher ima idealan ultrazvučni uređaj za vašu biološku primjenu i zahtjeve.
Klasični ultrasonikator tipa sonde s mikro vrhom kao što je UP200St (200W; vidi sliku lijevo) ili jednu od ultrazvučnih jedinica za pripremu uzoraka VialTweeter ili UP200ST_TD_CupHorn sa VialHolderom su omiljeni modeli u istraživačkim i analitičkim laboratorijama. Klasična ultrazvučna sonda je idealna, kada se pripremi manje uzoraka mora biti liziran, izvađen ili fragmentiran. Jedinice za pripremu uzoraka VialTweeter i UP200St_TD_CupHorn omogućavaju istovremeno sonikaciju do 10 ili 5 bočica, odnosno.
Ako se moraju obraditi visoki brojevi uzoraka (npr. ploče sa 96 dobrota, mikrotiterske ploče itd.) UIP400MTP je idealno podešavanje sonikacije. UIP400MTP funkcionira kao veći cuphorn, koji je ispunjen vodom i ima dovoljno prostora za držanje mikro-well ploča. Powered by a 400 watts powerful ultrasonic processor, UIP400MTP isporučuje vrlo jednoličan i intezivan sonication multi-well ploča kako bi poremetio ćelije, lyse uzorke, solubilize pelete, ekstrakt proteina ili smicne DNK.

Precizna kontrola putem smart softvera

Sva Hielscherova sonication rješenja od 200 vata prema gore opremljena su digitalnim ekranom osjetljivim na dodir u boji i inteligentnim softverom. Preko pametnog protokoliranja podataka svi parametri ultrazvučnog procesa se automatski čuvaju kao CSV fajl na ugrađenoj SD-kartici čim se počne sa ultrasonikatorom. Ovo istraživanje i protokoliranje čini mnogo zgodnim. Nakon ispitivanja sonication ili pripreme uzoraka, možete jednostavno pregledati parametre sonication svakog sonication pokrenuti i usporediti ih.
Preko intuitivnog menija, brojan parametar može biti postavljen prije sonicationa: Na primjer, da bi se kontrolirala temperatura u uzorku i kako bi se spriječila njegova toplinska degradacija, može se postaviti i gornje ograničenje temperature uzorka. Pluggable temperaturni senzor, koji dolazi sa ultrazvučnom jedinicom, daje ultrazvučnu povratnu vezu procesora o stvarnoj temperaturi sonikacije. Kada se dostigne gornje ograničenje temperature, ultrazvučni uređaj pauzira sve dok se ne postigne donja granica postavljenog ∆T i počne onda ponovo automatski sonicira.
Ako je potrebno sonication sa specifičnim unosom energije, možete predoceriti konačnu ultrazvučnu energiju sonication runa. Naravno, ultrazvučna pulsacija i režim ciklusa mogu biti pojedinačno postavljeni, previše.
Da bi ponovo koristili svoje najuspješnije parametre sonicationa, možete sačuvati razne načine sonication (npr. vrijeme sonication, intenzivitet, režim ciklusa itd.) kao pred-set modove, tako da mogu biti laki i brzo pokrenuti ponovo.
Za više operativnih pogodnosti, svim digitalnim ultrazvučnim jedinicama može se upravljati preko daljinskog upravljača preglednika u bilo koji zajednički preglednik (npr. InternetExplorer, Safari, Chrome itd.). LAN veza je jednostavna plug-n-play instalacija i ne zahtijeva dodatnu instalaciju softvera.
Mi u Hielscheru znamo da uspješno sonikacija bioloških uzoraka zahtijeva preciznost i ponovenost. Stoga smo naše ultrasonikatore dizajnirali kao pametne uređaje sa svim funkcijama koje omogućavaju efikasnu, pouzdanu, reprodukcijljivu i zgodnu pripremu uzoraka.

Tablica ispod vam daje naznaku o približnom kapacitetu obrade naših ultrazvučnih sistema od ultrazvučnih mikro-savjeta i klasičnih ultrazvučnih homogenizatora do MultiSample ultrasonicatora za pogodnu, pouzdanu pripremu brojnih uzoraka: