Ultrazvučna liza uzoraka Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster se široko koristi u laboratorijama kao modelni organizam. Stoga se moraju često provoditi predanalitički pripremni koraci kao što su liza, razbijanje ćelija, ekstrakcija proteina i smicanje DNK uzoraka Drosophila melanogaster. Ultrazvučni dismembratori su pouzdani i efikasni i mogu se koristiti za obavljanje različitih zadataka kao što su liza, ekstrakcija proteina ili fragmentacija DNK samo podešavanjem parametara ultrazvučnog procesa. Ultrazvučni homogenizatori su stoga fleksibilni alati sa širokim spektrom primjena.

Ultrazvučna liza i ekstrakcija proteina

Liza, solubilizacija ćelija, homogenizacija tkiva i ekstrakcija proteina tipični su zadaci za ultrazvučne dismembratore u biološkim laboratorijama. Ultrazvučni dismembratori i ćelijski disruptori su pogodni za homogenizaciju životinjskih tkiva, insekata (npr. Drosophila melanogaster, C. elegans) ili biljnih uzoraka. Naknadne primjene ultrazvučne obrade su liza ćelijskih suspenzija i peleta, kao i ekstrakcija intracelularnih proteina.
Ultrazvučna liza i ekstrakcija proteina su visoko pouzdani i ponovljivi procesi, koji se mogu izvoditi na osnovu utvrđenih protokola. Budući da se intenzitet ultrazvučnog procesa može precizno podesiti putem parametara sonikacije kao što su amplituda, ciklus/pulsni režim, temperatura i zapremina uzorka, jednom dokazani protokoli mogu se ponavljati sa istim ishodom iznova i iznova.

Ultrazvučna fragmentacija DNK i RNK

Nakon ćelijske lize i ekstrakcije proteina, uobičajeni potrebni korak u pripremi uzorka je smicanje i fragmentacija DNK, RNK i hromatina, npr. prije imunoprecipitacije hromatina (ChIP). Fragmentacija DNK i RNK može se pouzdano postići razbijanjem kovalentnih veza koje drže DNK zajedno fizičkim silama. Koristeći fizičko smicanje kao što je sonikacija, prvo se lanci DNK lome, a zatim se DNK fragmentira na manje komade.
Ultrazvučna fragmentacija DNK je pouzdana i efikasna u smicanju DNK do ciljane dužine, npr. 500 bp (bazni parovi). Glavne prednosti ultrazvučne fragmentacije DNK uključuju preciznu kontrolu parametara i intenziteta ultrazvučnog procesa. Parametri ultrazvučnog procesa mogu se podesiti preciznim podešavanjem intenziteta ultrazvučne obrade, ciklusa i vremena. Ovo omogućava stvaranje željene veličine DNK, a ciljana dužina DNK može se pouzdano proizvesti i reprodukovati. Ultrazvučno smicanje DNK je također idealno za stvaranje fragmenata DNK visoke molekularne težine.

Protokoli za ultrazvučnu lizu Drosophila melanogaster

U nastavku možete pronaći različite protokole za ultrazvučno potpomognutu lizu, ekstrakciju proteina i fragmentaciju DNK ili kromatina uzoraka Drosophila.

Ultrazvučna liza za ispitivanje unakrsne imunoprecipitacije (CLIP).

CLIP test je izveden kao što je prethodno objavljeno uz neke modifikacije. Otprilike 20 mg jajnika ženki divljeg tipa starih od 0 do 1 dana je UV umreženo (3 × 2000 μJ/cm2), homogenizirano na ledu u 1 mL RCB pufera (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM saharoze, 1 mM DTT, 1 × potpuni inhibitori proteaze bez EDTA, 1 mM PMSF) dopunjen sa 300 U RNAseOUT i stavljen na led na 30 min. Homogenat je obrađen ultrazvukom na ledu, pri 80% snage, pet puta u rafalima od 20 s sa pauzom od 60 s između pomoću Hielscher ultrazvučnog procesora UP100H (100 W, 30 kHz) and centrifuged (16000 × g for 5 min at 4°C). Soluble extract was precleared with 20 μl Protein-G dynabeads for 20 min at 4°C. After removal of samples for immunoblotting and quantitation of RNA input (1%), HP1 was immunoprecipitated with anti-HP1 9A9 antibody from 450 μl precleared extract by incubation for 4 h with 50 μl Protein-G dynabeads. Immunoprecipitates were washed 4 times with RCB. To elute the immunoprecipitated RNAs, the pelleted beads were boiled in 100 μL of UltraPure DEPC-treated Water for 5 min. 900 μL Qiazol Reagent was added to the supernatant recovered for RNA preparation. The RNA purified was used as a template to synthesize cDNA using oligo dT, random hexamers and SuperScript reverse transcriptase III according to the manufacturer’s protocol.
(Cassale et al. 2019.)

Ultrazvučna liza za ispitivanje imunoprecipitacije hromatina

Imunoprecipitacija hromatinom izvedena je prema metodi koju je opisao Menet uz manje modifikacije. Približno 20 mg jajnika ženki divljeg tipa starih od 0 do 1 dana homogenizirano je u 1 mL NEB pufera (10 mM HEPES-Na pri pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na pri pH 8, 0,5 mM EDTA-Na pri pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidina, 0,15 mM spermina, 1× potpuni inhibitori proteaze bez EDTA) sa homogenizatorom? imerzionim disperzerom 1 min (na 3000 o/min). Homogenat je prebačen u prethodno ohlađenu staklenu posudu i naneseno je 15 punih poteza čvrstim tučkom. Slobodna jezgra su zatim centrifugirana na 6000xg 10 minuta na 4°C. Pelete koje sadrže jezgre su resuspendirane u 1 mL NEB i centrifugirane na 20000 × g 20 minuta na gradijentu saharoze (0,65 mL 1,6 M saharoze u NEB, 0,35 mL 0,8 M saharoze u NEB). Pelet je resuspendiran u 1 mL NEB i formaldehida do konačne koncentracije od 1%. Jezgra su umrežena 10 minuta na sobnoj temperaturi i ugašena dodavanjem 1/10 vol 1,375 M glicina. Jezgra su sakupljena centrifugiranjem na 6000 × g tokom 5 minuta. Jezgra su dva puta isprana u 1 mL NEB i resuspendirana u 1 mL pufera za lizu (15 mM HEPES-Na pri pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA pri pH 8, 1% Triton0 X-100. mM DTT, 0,1% Na deoksiholat, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroilsarkozin i 1x potpuni inhibitori proteaze bez EDTA). Nukleusi su ultrazvučni pomoću Hielscher ultrazvučnog procesora UP100H (100 W, 30 kHz) šest puta po 20 s i 1 min na ledu. Sonicirana jezgra su centrifugirana na 13000 × g 4 min na 4°C. Većina ultrazvučnog hromatina bila je dužine od 500 do 1000 parova baza (bp). Za svaku imunoprecipitaciju, 15 μg hromatina je inkubirano u prisustvu 10 μg HP1 9A9 monoklonskog antitela (3 h na 4°C u rotirajućem točku). Zatim je dodano 50 μl dynabeads proteina G i inkubacija je nastavljena preko noći na 4°C. Supernatanti su odbačeni i uzorci su dva puta isprani u puferu za lizu (svako pranje 15 minuta na 4 °C) i dva puta u TE puferu (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl pri pH 8). Hromatin je eluiran iz kuglica u dva koraka; prvo u 100 μl eluicionog pufera 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl pri pH 8) na 65°C tokom 15 minuta, nakon čega slijedi centrifugiranje i obnavljanje supernatanta. Materijal perli je ponovo ekstrahovan u 100 μl TE + 0,67% SDS. Kombinovani eluat (200 μl) je inkubiran preko noći na 65°C da bi se preokrenule poprečne veze i tretiran sa 50 μg/ml RNAseA tokom 15 minuta na 65°C i sa 500 μg/ml Proteinaze K tokom 3 h na 65°C. Uzorci su ekstrahovani fenol-hloroformom i istaloženi etanolom. DNK je resuspendirana u 25 μl vode. Da bi se maksimizirale molekularne analize sa imunoprecipitiranom DNK, geni kandidati su amplificirani u parovima kroz optimizirani dupleks-PCR protokol korištenjem dva različita seta prajmera koji imaju slične temperature topljenja u jednoj reakciji.
(Casale et al. 2019.)
 

Ultrazvučni disruptori ćelija visokih performansi za biološke uzorke

Hielscher Ultrasonics je vaš partner sa dugogodišnjim iskustvom kada su u pitanju ultrazvučni aparati visokih performansi za razbijanje ćelija, lizu, ekstrakciju proteina, DNK, RNK i fragmentaciju hromatina, kao i druge korake preanalitičke pripreme uzorka. Nudeći sveobuhvatan portfelj ultrazvučnih laboratorijskih homogenizatora i jedinica za pripremu uzoraka, Hielscher ima idealan ultrazvučni uređaj za vašu biološku primjenu i zahtjeve.
Klasični ultrasonikator tipa sonde sa mikro vrhom kao što je UP200St (200W; vidi sliku lijevo) ili jednu od jedinica za ultrazvučnu pripremu uzoraka VialTweeter ili UP200ST_TD_CupHorn sa VialHolderom su omiljeni modeli u istraživačkim i analitičkim laboratorijama. Klasična ultrazvučna sonda je idealna, kada se pripremi manje uzoraka mora biti lizirano, ekstrahirano ili fragmentirano. Jedinice za pripremu uzoraka VialTweeter i UP200St_TD_CupHorn omogućavaju istovremenu ultrazvučnu obradu do 10 ili 5 bočica, respektivno.
Ako se mora obraditi veliki broj uzoraka (npr. ploče sa 96 jažica, mikrotitarske ploče itd.), UIP400MTP je idealna postavka za sonikaciju. UIP400MTP funkcionira poput veće čaše, koja je napunjena vodom i ima dovoljno prostora za držanje mikro-bunarićnih ploča. Pokrenut snažnim ultrazvučnim procesorom od 400 vati, UIP400MTP isporučuje vrlo ujednačenu i intenzivnu ultrazvučnu obradu ploča s više jažica kako bi poremetila ćelije, lizirala uzorke, rastvorila pelete, ekstrahirala proteine ili smicala DNK.

Precizna kontrola putem Smart softvera

Sva rješenja Hielscher sonikacije od 200 vati naviše opremljena su digitalnim ekranom osjetljivim na dodir u boji i inteligentnim softverom. Putem pametnog protokola podataka svi parametri ultrazvučnog procesa se automatski spremaju kao CSV fajl na ugrađenu SD karticu čim se ultrazvučni aparat pokrene. Ovo čini istraživanje i protokoliranje mnogo praktičnijim. Nakon ispitivanja sonikacije ili pripreme uzorka, možete jednostavno pregledati parametre sonikacije svakog pokretanja sonikacije i usporediti ih.
Preko intuitivnog menija, brojni parametri se mogu unapred postaviti pre ultrazvuka: Na primer, da bi se kontrolisala temperatura u uzorku i da bi se sprečila njegova termička degradacija, može se postaviti gornja granica temperature uzorka. Senzor temperature koji se može priključiti, koji dolazi s ultrazvučnom jedinicom, daje ultrazvučnom procesoru povratnu informaciju o stvarnoj temperaturi ultrazvučne obrade. Kada se dostigne gornja granica temperature, ultrazvučni uređaj pauzira dok se ne dostigne donja granica skupa ∆T, a zatim počinje automatski ponovo sonikirati.
Ako je potrebna ultrazvučna obrada sa specifičnim energetskim unosom, možete unaprijed postaviti konačnu ultrazvučnu energiju za sonikaciju. Naravno, ultrazvučno pulsiranje i ciklusni režim se takođe mogu individualno podesiti.
Da biste ponovo koristili svoje najuspješnije parametre ultrazvuka, možete spremiti različite modove sonikacije (npr. vrijeme ultrazvuka, intenzitet, ciklusni režim itd.) kao unaprijed postavljene modove, tako da se mogu lako i brzo ponovo pokrenuti.
Za veću operativnu praktičnost, svim digitalnim ultrazvučnim jedinicama može se upravljati putem daljinskog upravljača pretraživača u bilo kojem uobičajenom pretraživaču (npr. InternetExplorer, Safari, Chrome itd.). LAN veza je jednostavno plug-n-play podešavanje i ne zahtijeva dodatnu instalaciju softvera.
Mi u Hielscheru znamo da uspješna sonikacija bioloških uzoraka zahtijeva preciznost i ponovljivost. Stoga smo dizajnirali naše ultrasonikatore kao pametne uređaje sa svim karakteristikama koje omogućavaju efikasnu, pouzdanu, ponovljivu i praktičnu pripremu uzorka.

Tabela ispod daje vam indikaciju približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih sistema od ultrazvučnih mikro-vrhova i klasičnih ultrazvučnih homogenizatora do MultiSample ultrasonikatora za praktičnu i pouzdanu pripremu brojnih uzoraka: