Ultrazvučna liza uzoraka Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster se u laboratorijama široko koristi kao model-organizam. Stoga se predanalitički koraci pripreme, kao što su liza, razgradnja ćelija, ekstrakcija proteina i smicanje DNK uzoraka Drosophila melanogaster, moraju često provoditi. Ultrazvučni dismembratori su pouzdani i efikasni te se mogu koristiti za obavljanje različitih zadataka, kao što su liza, ekstrakcija proteina ili fragmentacija DNK, s lakoćom, samo podešavanjem parametara ultrazvučnog procesa. Ultrazvučni homogenizatori su stoga fleksibilni alati širokog spektra primjene.

Ultrazvučna liza i ekstrakcija proteina

Liza, solubilizacija ćelija, homogenizacija tkiva i ekstrakcija proteina tipični su zadaci ultrazvučnih dismembratora u biološkim laboratorijama. Ultrazvučni dismembratori i razarači ćelija pogodni su za homogenizaciju životinjskih tkiva, insekata (npr. Drosophila melanogaster, C. elegans) ili biljnih uzoraka. Daljnje primjene ultrazvučne obrade su liza suspenzija ćelija i peleta te ekstrakcija intracelularnih proteina.
Ultrazvučna liza i ekstrakcija proteina vrlo su pouzdani i ponovljivi procesi, koji se mogu izvoditi na osnovu utvrđenih protokola. Budući da se intenzitet ultrazvučnog procesa može tačno podesiti putem parametara ultrazvučne obrade, kao što su amplituda, ciklički / pulsni način rada, temperatura i volumen uzorka, jednom provjereni protokoli mogu se iznova ponavljati s istim ishodom.

Ultrazvučna fragmentacija DNK i RNK

Nakon lize ćelija i ekstrakcije proteina, uobičajeni potrebni korak u pripremi uzoraka je smicanje i fragmentacija DNK, RNK i kromatina, npr. prije imunoprecipitacije kromatina (ChIP). Fragmentacija DNK i RNK može se pouzdano postići prekidanjem kovalentnih veza koje drže DNK na okupu fizičkim silama. Pri korištenju fizičkog smicanja, kao što je ultrazvučna obrada (sonikacija), najprije se prekidaju lanci DNK, a zatim se DNK fragmentira na manje dijelove.
Ultrazvučna fragmentacija DNK pouzdana je i efikasna u smicanju DNK na ciljanu dužinu, npr. 500bp (parova baza). Glavne prednosti ultrazvučne fragmentacije DNK uključuju preciznu kontrolu parametara i intenziteta ultrazvučnog procesa. Parametri ultrazvučnog procesa mogu se podešavati preciznim podešavanjem intenziteta ultrazvučne obrade, ciklusa i vremena. To omogućava stvaranje željenih veličina DNK, a ciljana dužina DNK može se pouzdano proizvesti, kao i reproducirati. Ultrazvučno smicanje DNK također je idealno za stvaranje fragmenata DNK velike molekularne mase.

Protokoli za ultrazvučnu lizu Drosophila melanogaster

U nastavku možete pronaći različite protokole za ultrazvučno potpomognutu lizu, ekstrakciju proteina te fragmentaciju DNK ili kromatina uzoraka Drosophila.

Ultrazvučna liza za test imunoprecipitacije umrežavanjem (CLIP)

CLIP test proveden je kao što je ranije prijavljeno, uz neke modifikacije. Približno 20 mg jajnika od 0- do 1-dan starih ženki divljeg tipa umreženo je UV zračenjem (3 × 2000 μJ/cm2), homogenizirano na ledu u 1 mL RCB pufera (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM saharoze, 1 mM DTT, 1× inhibitori proteaza Complete bez EDTA, 1 mM PMSF) uz dodatak 300 U RNAseOUT te stavljeno na led na 30 min. Homogenat je ultrazvučno obrađen na ledu, pri 80% snage, pet puta u impulsima od 20 s s pauzom od 60 s između njih, pomoću ultrazvučnog procesora Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) te centrifugiran (16.000 × g tokom 5 min na 4°C). Topivi ekstrakt prethodno je očišćen s 20 μl Protein-G dynabeads kuglica tokom 20 min na 4°C. Nakon uzimanja uzoraka za imunoblotting i kvantifikaciju ulazne RNK (1%), HP1 je imunoprecipitiran antitijelom anti-HP1 9A9 iz 450 μl prethodno očišćenog ekstrakta inkubacijom tokom 4 h s 50 μl Protein-G dynabeads kuglica. Imunoprecipitati su isprani 4 puta pomoću RCB. Za eluiranje imunoprecipitiranih RNK, peletirane kuglice kuhane su u 100 μL vode UltraPure tretirane DEPC-om tokom 5 min. U supernatant izdvojen za pripremu RNK dodano je 900 μL reagensa Qiazol. Pročišćena RNK korištena je kao šablon za sintezu cDNK pomoću oligo dT, nasumičnih heksamera i reverzne transkriptaze SuperScript III prema protokolu proizvođača.
(Cassale et al. 2019)

Ultrazvučna liza za test imunoprecipitacije kromatina

Imunoprecipitacija kromatina provedena je prema metodi koju je opisao Menet, uz manje modifikacije. Približno 20 mg jajnika od 0- do 1-dan starih ženki divljeg tipa homogenizirano je u 1 mL NEB pufera (10 mM HEPES-Na pri pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na pri pH 8, 0,5 mM EDTA-Na pri pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidin, 0,15 mM spermin, 1× inhibitori proteaza Complete bez EDTA) pomoću homogenizatora / uronjenog disperzera 1 min (pri 3000 rpm). Homogenat je prebačen u prethodno ohlađeni stakleni dounce homogenizator te je primijenjeno 15 punih poteza tijesnim tučkom. Slobodne jezgre zatim su centrifugirane pri 6000xg tokom 10 min na 4°C. Peleti koji sadrže jezgre resuspendirani su u 1 mL NEB i centrifugirani pri 20.000 × g tokom 20 min na gradijentu saharoze (0,65 mL 1,6 M saharoze u NEB, 0,35 mL 0,8 M saharoze u NEB). Pelet je resuspendiran u 1 mL NEB i formaldehida do konačne koncentracije od 1%. Jezgre su umrežavane 10 min na sobnoj temperaturi, a reakcija je zaustavljena dodavanjem 1/10 vol. 1,375 M glicina. Jezgre su prikupljene centrifugiranjem pri 6000 × g tokom 5 min. Jezgre su dvaput isprane u 1 mL NEB i resuspendirane u 1 mL pufera za lizu (15 mM HEPES-Na pri pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA pri pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na-deoksiholat, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroilsarkozin i 1× inhibitori proteaza Complete bez EDTA). Jezgre su ultrazvučno obrađene pomoću ultrazvučnog procesora Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) šest puta po 20 s uz uključen uređaj i po 1 min na ledu. Ultrazvučno obrađene jezgre centrifugirane su pri 13.000 × g tokom 4 min na 4°C. Većina ultrazvučno obrađenog kromatina bila je dužine od 500 do 1000 parova baza (bp). Za svaku imunoprecipitaciju, 15 μg kromatina inkubirano je u prisustvu 10 μg monoklonskog antitijela HP1 9A9 (3 h na 4°C u rotirajućem kotaču). Zatim je dodano 50 μl dynabeads kuglica s proteinom G te je inkubacija nastavljena preko noći na 4°C. Supernatanti su odbačeni, a uzorci su dvaput isprani u puferu za lizu (svako ispiranje 15 min na 4 °C) i dvaput u TE puferu (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl pri pH 8). Kromatin je eluiran s kuglica u dva koraka; najprije u 100 μl pufera za eluiranje 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl pri pH 8) na 65°C tokom 15 min, nakon čega su slijedili centrifugiranje i izdvajanje supernatanta. Materijal kuglica ponovo je ekstrahiran u 100 μl TE + 0,67% SDS. Spojeni eluat (200 μl) inkubiran je preko noći na 65°C radi poništavanja umreženja te tretiran s 50 μg/ml RNaseA tokom 15 min na 65°C i s 500 μg/ml proteinaze K tokom 3 h na 65°C. Uzorci su ekstrahirani fenol–hloroformom i precipitirani etanolom. DNK je resuspendirana u 25 μl vode. Radi maksimiziranja molekularnih analiza s imunoprecipitiranom DNK, geni kandidati amplificirani su u parovima optimiziranim duplex-PCR protokolom, korištenjem dva različita seta prajmera sličnih temperatura topljenja u jednoj reakciji.
(Casale et al. 2019)

Ultrazvučni razarači ćelija visokih performansi za biološke uzorke

Hielscher Ultrasonics vaš je dugogodišnji partner kada je riječ o ultrazvučnim uređajima visokih performansi za razgradnju ćelija, lizu, ekstrakciju proteina, fragmentaciju DNK, RNK i kromatina te druge predanalitičke korake pripreme uzoraka. Nudeći sveobuhvatan portfolio ultrazvučnih laboratorijskih homogenizatora i jedinica za pripremu uzoraka, Hielscher ima idealan ultrazvučni uređaj za vašu biološku primjenu i zahtjeve.
Klasični ultrazvučni uređaj sa sondom i mikrovrhom, kao što je UP200St (200W; vidi sliku lijevo) ili jedna od ultrazvučnih jedinica za pripremu uzoraka VialTweeter ili UP200ST_TD_CupHorn s VialHolderom omiljeni su modeli u istraživačkim i analitičkim laboratorijama. Klasična ultrazvučna sonda idealna je kada treba lizirati, ekstrahirati ili fragmentirati manji broj uzoraka. Jedinice za pripremu uzoraka VialTweeter i UP200St_TD_CupHorn omogućavaju istovremenu ultrazvučnu obradu do 10, odnosno 5 epruveta.
Ako se mora obraditi veliki broj uzoraka (npr. ploče sa 96 jažica, mikrotitarske ploče itd.), uređaj UIP400MTP idealna je postavka za ultrazvučnu obradu. UIP400MTP funkcionira poput većeg cuphorna, koji je napunjen vodom i ima dovoljno prostora za smještaj ploča s mikrojažicama. Pokretan ultrazvučnim procesorom snage 400 vati, UIP400MTP pruža vrlo ravnomjernu i intenzivnu ultrazvučnu obradu ploča s više jažica radi razgradnje ćelija, lize uzoraka, solubilizacije peleta, ekstrakcije proteina ili smicanja DNK.

Precizna kontrola putem pametnog softvera

Sva Hielscher rješenja za ultrazvučnu obradu od 200 vati naviše opremljena su digitalnim ekranom osjetljivim na dodir u boji i inteligentnim softverom. Putem pametnog protokoliranja podataka svi parametri ultrazvučnog procesa automatski se spremaju kao CSV datoteka na ugrađenu SD karticu čim se ultrazvučni uređaj pokrene. To istraživanje i protokoliranje čini mnogo praktičnijim. Nakon ispitivanja ultrazvučne obrade ili pripreme uzoraka jednostavno možete pregledati parametre ultrazvučne obrade svakog ciklusa obrade i uporediti ih.
Putem intuitivnog menija mnogi se parametri mogu unaprijed podesiti prije ultrazvučne obrade: na primjer, da bi se kontrolirala temperatura u uzorku i spriječila njegova termička degradacija, može se postaviti gornja granica temperature uzorka. Utični temperaturni senzor, koji se isporučuje uz ultrazvučnu jedinicu, daje ultrazvučnom procesoru povratnu informaciju o stvarnoj temperaturi tokom ultrazvučne obrade. Kada se dostigne gornja granica temperature, ultrazvučni uređaj pravi pauzu dok se ne dostigne donja granica postavljenog ∆T, a zatim automatski ponovo počinje s ultrazvučnom obradom.
Ako je potrebna ultrazvučna obrada s određenim unosom energije, možete unaprijed podesiti konačnu ultrazvučnu energiju ciklusa obrade. Naravno, ultrazvučna pulsacija i ciklički način rada također se mogu individualno podesiti.
Da biste ponovo koristili najuspješnije parametre ultrazvučne obrade, možete spremiti različite načine ultrazvučne obrade (npr. vrijeme obrade, intenzitet, ciklički način rada itd.) kao unaprijed postavljene načine, tako da se mogu lako i brzo ponovo pokrenuti.
Za veću operativnu praktičnost, sve digitalne ultrazvučne jedinice mogu se upravljati putem daljinskog upravljanja preko preglednika u bilo kojem uobičajenom pregledniku (npr. InternetExplorer, Safari, Chrome itd.). LAN veza je jednostavna plug-n-play postavka i ne zahtijeva dodatnu instalaciju softvera.
Mi u kompaniji Hielscher znamo da uspješna ultrazvučna obrada bioloških uzoraka zahtijeva preciznost i ponovljivost. Stoga smo svoje ultrazvučne uređaje osmislili kao pametne uređaje sa svim funkcijama koje omogućavaju efikasnu, pouzdanu, ponovljivu i praktičnu pripremu uzoraka.

Tabela u nastavku daje vam orijentaciju o približnom kapacitetu obrade naših ultrazvučnih sistema, od ultrazvučnih mikrovrhova i klasičnih ultrazvučnih homogenizatora do MultiSample ultrazvučnih uređaja za praktičnu, pouzdanu pripremu brojnih uzoraka: