Ultrazvučni uzorak Priprema za ELISA Assays

Elisa – Enzim-Povezani Imunosorbent Assay

ELISA se zalaže za imunosorbent koji je povezan sa enzimom i široko se koristi biohemijskim analizom tehnike kategorije ligand-vezanih analiza. U ELISA,tečni uzorak se dodaje u stacionarne čvrste faze sa posebnim svojstvima vezivanja. Normalno, stacionarna čvrsta faza se primjenjuje kao premaza na ploču sa dobrom ili ELISA ploču. Zatim, razni tekući reagenti se sekvencalno dodaju, inkubirali i oprali, tako da se konačno optička promjena (npr. razvoj boje produktom enzimske reakcije) dogodi u konačnoj tekućini u izvoru. Optička promjena omogućava mjerenje količine analita tako što se nazove kvantitativni “čitanje". Za kvantitativno očitavanje, spektrofotometar, fluorometar ili luminometar se koristi za otkrivanje i mjerenje jačine prenosive svjetlosti. Na osjetljivost detekcije utiče pojačanje signala tokom analitičke reakcije. Pošto su enzimske reakcije dobro istražene i pouzdani procesi pojačavanja, enzimi se koriste za stvaranje signala. Enzimi su povezani sa detekcionim reagentima u fiksnim proporcijama kako bi se omogućila tačna kvantifikacija, što objašnjava i naziv "enzimom povezan" imunosorbent-a.
Kako se ELISA-ina ispitivanja izvode u mikrotiterskim pločama / 96-dobro-pločama, poznata je kao tehnika ispitivanja na bazi ploča i koristi se npr. u kliničkoj in-vitro dijagnostici, istraživanju, razvoju lijekova itd. za otkrivanje i kvantifikovanje antitijela, peptida, proteina i hormona.
ELISA tehnika se često koristi kao dijagnostički alat u medicini, biotehnici, patologiji biljaka i također je važno mjerenje kontrole kvaliteta u više industrija.

Ultrazvučni uzorak Prep prije ELISA

Prije nego što se ELISA test može izvesti, uzorci zahtijevaju korake pripreme takve ćelijske lize i ekstrakcije intraćelijskih proteina, DNK, RNK itd. Prednost ultrazvučne lize ćelija i izolacije proteina je njegova visoka efikasnost, pouzdanost i reproducibilnost. Svi ovi faktori su važni kako bi se dobili visokokvalitetan dijagnostički i istraživački rezultati

Protokol za Pre-ELISA ultrazvučnu lizu ćelija

• Za Cell Cultures: Prije ultrazvučne lize ćelija, centrifuge ćelije 5 min na 270 x g u mikrocentrifugu. Ukloni supernatant aspiracijom i resuspend ćelijama u 30 – 100 μL RIPA bafera. Zatim, inkubira ćeliju kuglicu na ledu 30 min.
• Uzorak ćelije je spreman za ultrazvučnu lizu:
  Koristi ultrasonikator tipa sonde (npr. Uf200 ः t sa sondom S26d2) ili ultrazvučnim više uzorkom uređaja (npr. VialTweeter za istovremeno sonikaciju do 10 bočica ili UIP400MPT za mikrotiterske ploče / 96-dobro ploča) u zavisnosti od količine uzoraka koje trebate pripremiti.
  Za sonikaciju jednog uzorka tipa sonde, ćelije smestite u 1,5 mL mikrocentrifuge cevi.
• Pre-postavite svoje ultrazvučno trajanje, ukupan unos energije, režim ciklusa i/ili ograničenja temperature u digitalnom meniju ultrazvučnikatora. To osigurava vrlo pouzdano sonication i ponovenost.
• Uključi sonotrode i uključi ultrazvučni uređaj. Nježno pomaknite mikro vrh ultrazvučne sonde kroz uzorak kako bi se uzorak sonicirao u uniformi.
  Za većinu ćelija, ultrazvučna liza će biti završena nakon 2 -4 ciklusa sonikacije od 10 sek.
• Nakon sonikacije uklonite sonotrode iz uzorka. Uzorci bi trebali biti inkubirali na ledu 5 min. Zatim, centrifuga na 10.000 x g na 20 min da zalijeće krhotine. Prebaci natprirodne u novu mikrocentrifugnu cijev. Označite analiti i čuvajte na -20°C.
• Ultrazvučna sonotrode se može očistiti tako što se pravilno briše alkoholom ili sonikira u peklu ispunjenom alkoholom, npr. 70% etanola. Sve ultrazvučne sonde napravljene od titanija su autoklavi.

Za Tkivo Homogenates:

• Isperite tkivo ledeno hladnim PBS-om (0,01M, pH=7,4) kako bi se temeljito uklonila višak hemolize krvi.
• Vagati tkivo (bubreg, srce, pluća, slezena itd.) i macerat ga u male komadiće, koji su homogenizirani u PBS-u. Potreban volumen PBS-a je vezan za težinu maramice. Po pravilu palca, 1g tkivo zahtijeva cca. 9mL PBS. Preporučuje se dodati neki inhibitor proteaze u PBS. (RIPA ili hipotonični lizni bafer koji sadrži koktel proteaze i fosfataze može se koristiti alternativno.)
• U zavisnosti od veličine tkivo, kratki tretman vrtlogom (cca. 1-2 min. u 15 sec. pulsa) može biti od pomoći za pred-liječenje tkivo.
• Montiraj mikro-vrh, npr. S26d2, na svoj ultrasonikator. Cijev za uzorke s tkivom u ledeno kupatilo.
• Sonicirajte uzorak svojim ultrasonikatorom, npr. UP200St (80% amplitude) 1 min. u pulsnom modu (15sec on, 15sec pauza). Zadrži uzorak u ledenu kupku.
• Homogenati se zatim centrifugiraju kako bi se dobili specifični bazeni (cistosolni, nuklearni, mitohondrijski ili lizosomski) kako bi se obogatio protein za analizu. Centrifugom uzorka 5 minuta na 5000×g, supernatant se preuzme.

Pouzdana kontrola temperature tokom sonicationa

Temperatura je presudan faktor koji utječe na proces koji je posebno važan za liječenje bioloških uzoraka, npr. za sprečavanje toplinske degradacije proteina. Kao sve mehaničke tehnike pripreme uzoraka, sonication stvara toplotu. Međutim, temperatura uzoraka se može dobro kontrolirati kada se koriste Hielscher Ultrasonics uređaji. Predstavljamo vam razne opcije za praćenje i kontrolu temperature vaših uzoraka dok ih pripremate ultrasonikatorom tipa sonde ili VialTweeterom pre-analitički.

1. Praćenje temperature uzorka: Svi Hielscherovi digitalni ultrazvučni procesori opremljeni su inteligentnim softverom i plugable senzorom temperature. Uključite senzor temperature u ultrazvučni uređaj (npr. Uf200 ः t, UP200St, VialTweeter, UIP400MTP) i umetnite vrh senzora temperature u jednu od cijevi za uzorke. Preko digitalnog obojenog touch-displaya možete postaviti u meniju ultrazvučnog procesora specifičan temperaturni raspon za sonication vašeg uzorka. Ultrasonicator će se automatski zaustaviti kada se dostigne maksimalna temperatura i pauzirati dok temperatura uzorka ne padne na nižu vrijednost postavljene temperature ∆. Onda sonication počinje automatski ponovo. Ova pametna funkcija sprečava degradaciju izazvanu toplotom.
2. Što se tiče ultrazvučne multi-uzorka jedinice VialTweeter, titanijumski blok, koji drži cijevi za uzorke, može biti pre-hladjen. Stavite blok VialTweeter (samo sonotrode bez sonovoda!) u hladnjak ili zamrzivač kako bi se prethodno ohladio titanijski blok pomaže u odgodi porasta temperature u uzorku. Ako je moguće, i sam uzorak može biti pre-hladan.
3. Koristite ledeno kupatilo ili suhi led da se ohladite tokom sonikacije. Cijevi za uzorke tijekom sonikacije posjecite u ledeno kupatilo. Za VialTweeter koristite plitku tacnu napunjenu suhim ledom i vialTweeter posušite na suhi led tako da se toplina može brzo rasipati.

Kupci širom svijeta koriste Hielscher sonde-ultrasonicators kao i multi-uzorak sonication jedinice VialTweeter i UIP400MTP za njihov svakodnevni rad pripreme uzoraka u biološkim, biohemijskim, medicinskim i kliničkim laboratorijama. Inteligentni softver i kontrola temperature Hielscher procesora, temperatura je pouzdano kontrolisana i izbjegnuta degradacija uzorka izazvana toplotom. Ultrazvučna priprema uzorka uz Hielscher ultrazvučna rješenja isporučuje vrlo pouzdane i pomnožive rezultate!