Ultrazvučna priprema uzorka za ELISA testove

Testovi kao što je ELISA se široko koriste za in-vitro dijagnostiku, detekciju proteina povezanih sa bolestima i kontrolu kvaliteta (npr. praćenje alergena u hrani). Ultrazvučna priprema uzoraka je brza, pouzdana i ponovljiva tehnika za lizu ćelija i izolaciju intracelularnih proteina, DNK, RNK i organela. Hielscher Ultrasonics nudi različita ultrazvučna rješenja za praktičnu pripremu pojedinačnih uzoraka, više bočica, kao i za mikrotitarske ploče i ploče sa 96 jažica.

ELISA – Enzimski imunosorbentni test

ELISA je skraćenica za enzimski imunosorbentni test i široko je korišćena tehnika biohemijske analize iz kategorije testova vezivanja liganda. U ELISA testu, tečni uzorak se dodaje na stacionarnu čvrstu fazu sa posebnim svojstvima vezivanja. Normalno, stacionarna čvrsta faza se nanosi kao premaz na ploču sa bunarima ili ELISA ploču. Zatim se razni tečni reagensi uzastopno dodaju, inkubiraju i ispiru, tako da konačno dolazi do optičke promjene (npr. razvoj boje produktom enzimske reakcije) u konačnoj tekućini u jažici. Optička promjena omogućava mjerenje količine analita pomoću kvantitativne tzv. “čitanje”. Za kvantitativno očitavanje koristi se spektrofotometar, fluorometar ili luminometar za detekciju i mjerenje intenziteta propuštene svjetlosti. Na osjetljivost detekcije utiče pojačanje signala tokom analitičkih reakcija. Pošto su enzimske reakcije dobro istražene i pouzdani procesi amplifikacije, enzimi se koriste za stvaranje signala. Enzimi su povezani sa reagensima za detekciju u fiksnim proporcijama kako bi se omogućila tačna kvantifikacija, što objašnjava i naziv imunosorbentnog testa „vezan za enzime“.
Kako se ELISA testovi izvode na mikrotitarskim pločama/pločama sa 96 jažica, poznat je kao tehnika analize na bazi ploča i koristi se npr. u kliničkoj in-vitro dijagnostici, istraživanju, razvoju lijekova itd. za otkrivanje i kvantificiranje antitijela, peptida, proteina, i hormoni.
ELISA tehnika se često koristi kao dijagnostički alat u medicini, biotehnologiji, biljnoj patologiji i također je važno mjerenje kontrole kvaliteta u više industrija.

Ultrazvučna priprema uzorka prije ELISA

Pre nego što se može izvesti ELISA test, uzorci zahtevaju korake pripreme kao što su liza ćelija i ekstrakcija intracelularnih proteina, DNK, RNK itd. Prednost ultrazvučne ćelijske lize i izolacije proteina je njena visoka efikasnost, pouzdanost i reproduktivnost. Svi ovi faktori važni su za dobijanje kvalitetne dijagnostike i rezultata istraživanja

Protokol za pre-ELISA ultrazvučnu ćelijsku lizu

• Za ćelijske kulture: Prije ultrazvučne lize ćelija, centrifugirajte ćelije 5 minuta na 270 xg u mikrocentrifugi. Uklonite supernatant aspiracijom i resuspendirajte ćelije u 30 – 100 μL RIPA pufera. Zatim inkubirajte ćelijsku peletu na ledu 30 minuta.
• Sada je uzorak ćelije spreman za ultrazvučnu lizu:
  Koristite ultrazvučni aparat tipa sonde (npr UP200Ht sa S26d2 sondom) ili ultrazvučni uređaj za više uzoraka (npr. VialTweeter za istovremenu sonikaciju do 10 bočica ili UIP400MPT za mikrotitarske ploče / ploče sa 96 jažica) ovisno o količini uzoraka koje trebate pripremiti.
  Za sonikaciju jednog uzorka sondom, stavite ćelije u epruvete za mikrocentrifugu od 1,5 mL.
• Unaprijed postavite svoje trajanje ultrazvuka, ukupni unos energije, režim ciklusa i/ili ograničenja temperature u digitalnom meniju ultrazvučnog aparata. Ovo osigurava visoko pouzdanu sonikaciju i ponovljivost.
• Umetnite sonotrodu i uključite ultrazvučni uređaj. Nježno pomjerite mikrovrh ultrazvučne sonde kroz uzorak kako biste uzorak sonikirali jednolično.
  Za većinu ćelija, ultrazvučna liza će biti završena nakon 2-4 ciklusa ultrazvučne obrade od 10 sekundi.
• Nakon sonikacije, uklonite sonotrodu iz uzorka. Uzorke treba inkubirati na ledu 5 minuta. Zatim centrifugirajte na 10.000 xg 20 minuta da se ostaci peletiraju. Prebacite supernatante u novu epruvetu za mikrocentrifugu. Označite analite i čuvajte na -20°C.
• Ultrazvučna sonotroda se može očistiti tako što se pravilno obriše alkoholom ili sonikatom u čaši napunjenoj alkoholom, npr. 70% etanolom. Sve ultrazvučne sonde napravljene od titanijuma mogu se autoklavirati.

• Isperite tkivo ledeno hladnim PBS-om (0,01M, pH=7,4) da biste temeljito uklonili višak krvi hemolize.
• Izvažite tkivo (bubreg, srce, pluća, slezena itd.) i macerirajte ga u male komadiće, koji se homogenizuju u PBS. Potrebna zapremina PBS-a je povezana sa težinom tkiva. U pravilu, 1 g tkiva zahtijeva cca. 9mL PBS. Preporučuje se dodavanje nekog inhibitora proteaze u PBS. (Alternativno se može koristiti RIPA ili hipotonični pufer za lizu koji sadrži koktel inhibitora proteaze i fosfataze.)
• Ovisno o veličini tkiva, kratki vorteks tretman (otprilike 1-2 min. u impulsima od 15 sekundi) može biti od pomoći za prethodnu obradu tkiva.
• Postavite mikro-vrh, npr. S26d2, na vaš ultrasonikator. Stavite epruvetu sa uzorkom sa maramicom u ledeno kupatilo.
• Sonicirajte uzorak sa svojim ultrasonikatorom, npr. UP200St (80% amplituda) 1 min. u pulsnom režimu (15 sekundi uključeno, 15 sekundi pauza). Držite uzorak u ledenoj kupki.
• Homogenati se zatim centrifugiraju kako bi se dobili specifični bazeni (citosolni, nuklearni, mitohondrijski ili lizozomalni) kako bi se obogatio protein za analizu. Centrifugiranjem uzorka u trajanju od 5 minuta na 5000×g, izvlači se supernatant.

Pouzdana kontrola temperature tokom sonikacije

Temperatura je ključni faktor koji utiče na proces koji je posebno važan za tretman bioloških uzoraka, npr. za sprečavanje termičke degradacije proteina. Kao i sve tehnike mehaničke pripreme uzoraka, sonikacija stvara toplinu. Međutim, temperatura uzoraka se može dobro kontrolirati kada se koriste uređaji Hielscher Ultrasonics. Predstavljamo vam različite opcije za praćenje i kontrolu temperature vaših uzoraka dok ih pripremate pomoću ultrasonikatora tipa sonde ili VialTweeter preanalitički.

1. Praćenje temperature uzorka: Svi Hielscher digitalni ultrazvučni procesori opremljeni su inteligentnim softverom i senzorom temperature koji se može priključiti. Uključite senzor temperature u ultrazvučni uređaj (npr. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, Sonikator ploča sa više jažica UIP400MTP) i umetnite vrh senzora temperature u jednu od epruveta za uzorke. Preko digitalnog ekrana osetljivog na dodir u boji, možete podesiti u meniju ultrazvučnog procesora određeni temperaturni opseg za vaš uzorak ultrazvučne obrade. Ultrasonikator će se automatski zaustaviti kada se dostigne maksimalna temperatura i pauzirati dok temperatura uzorka ne padne na nižu vrijednost podešene temperature ∆. Tada ultrazvuk počinje automatski ponovo. Ova pametna karakteristika sprečava degradaciju izazvanu toplotom.
2. Što se tiče ultrazvučne jedinice za više uzoraka VialTweeter, titanijumski blok, koji drži epruvete za uzorke, može se prethodno ohladiti. Stavite VialTweeter blok (samo sonotrodu bez sonde!) u frižider ili zamrzivač kako biste prethodno ohladili blok od titana koji pomaže da se odgodi porast temperature u uzorku. Ako je moguće, sam uzorak se također može prethodno ohladiti.
3. Koristite ledenu kupku ili suhi led za hlađenje tokom ultrazvučne obrade. Stavite epruvetu(e) za uzorke tokom ultrazvuka u ledenu kupku. Za VialTweeter koristite plitku posudu napunjenu suvim ledom i postavite VialTweeter na suvi led tako da se toplota može brzo raspršiti.

Kupci širom svijeta koriste ultrasonikatore tipa Hielscher sonde, kao i jedinice za sonikaciju sa više uzoraka VialTweeter i UIP400MTP za svoj svakodnevni rad na pripremi uzoraka u biološkim, biohemijskim, medicinskim i kliničkim laboratorijama. Inteligentni softver i kontrola temperature Hielscher procesora, temperatura je pouzdano kontrolirana i izbjegnuta degradacija uzorka izazvana toplinom. Ultrazvučna priprema uzorka s Hielscher ultrazvučnim rješenjima daje vrlo pouzdane i ponovljive rezultate!
Pročitajte više o ultrazvučnoj ultrazvuku visokog protoka pomoću ultrazvučnog aparata sa više jažica UIP400MTP za analize!