Priprema uzoraka ultrazvukom za ELISA testove

Testovi poput ELISA-e široko se koriste za in-vitro dijagnostiku, detekciju proteina povezanih s bolestima i kontrolu kvaliteta (npr. praćenje alergena u hrani). Priprema uzoraka ultrazvukom brza je, pouzdana i ponovljiva tehnika za lizu ćelija i izolaciju intracelularnih proteina, DNK, RNK i organela. Hielscher Ultrasonics nudi različita ultrazvučna rješenja za praktičnu pripremu pojedinačnih uzoraka, više epruveta, kao i za mikrotitarske ploče i ploče s 96 jažica.

ELISA – enzimski vezan imunosorbentni test (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

ELISA je skraćenica za enzimski vezan imunosorbentni test (enzyme-linked immunosorbent assay) i široko je korištena biohemijska analitička tehnika iz kategorije testova vezivanja liganda. U ELISA-i se tekući uzorak dodaje na stacionarnu čvrstu fazu posebnih svojstava vezivanja. Stacionarna čvrsta faza obično se nanosi kao premaz na ploču s jažicama ili ELISA ploču. Zatim se različiti tekući reagensi redom dodaju, inkubiraju i ispiru, tako da se na kraju u završnoj tekućini u jažici javi optička promjena (npr. razvoj boje djelovanjem produkta enzimske reakcije). Optička promjena omogućava mjerenje količine analita takozvanim kvantitativnim „očitavanjem“. Za kvantitativno očitavanje koristi se spektrofotometar, fluorometar ili luminometar za detekciju i mjerenje intenziteta propuštene svjetlosti. Na osjetljivost detekcije utječe pojačanje signala tokom analitičkih reakcija. Budući da su enzimske reakcije dobro istraženi i pouzdani procesi pojačanja, enzimi se koriste za stvaranje signala. Enzimi su vezani za reagense za detekciju u fiksnim omjerima kako bi se omogućila tačna kvantifikacija, što objašnjava i naziv „enzimski vezan“ imunosorbentni test.
Budući da se ELISA testovi izvode na mikrotitarskim pločama / pločama s 96 jažica, poznata je kao tehnika testiranja na pločama i koristi se npr. u kliničkoj in-vitro dijagnostici, istraživanju, razvoju lijekova itd. za detekciju i kvantifikaciju antitijela, peptida, proteina i hormona.
ELISA tehnika se često koristi kao dijagnostički alat u medicini, biotehnologiji i patologiji biljaka, a također je važno mjerenje kontrole kvaliteta u mnogim industrijama.

Ultrazvučna priprema uzoraka prije ELISA-e

Prije nego što se ELISA test može izvesti, uzorci zahtijevaju korake pripreme, poput lize ćelija i ekstrakcije intracelularnih proteina, DNK, RNK itd. Prednost ultrazvučne lize ćelija i izolacije proteina jesu njena visoka efikasnost, pouzdanost i ponovljivost. Svi ovi faktori važni su za dobivanje visokokvalitetnih dijagnostičkih i istraživačkih rezultata

Protokol za ultrazvučnu lizu ćelija prije ELISA-e

• Za ćelijske kulture: Prije ultrazvučne lize ćelija centrifugirajte ćelije 5 min pri 270 x g u mikrocentrifugi. Uklonite supernatant aspiracijom i resuspendirajte ćelije u 30 – 100 μL RIPA pufera. Zatim inkubirajte talog ćelija na ledu 30 min.
• Sada je uzorak ćelija spreman za ultrazvučnu lizu:
  Koristite ultrazvučni uređaj sa sondom (npr. UP200Ht sa sondom S26d2) ili ultrazvučni uređaj za više uzoraka (npr. VialTweeter za istovremenu ultrazvučnu obradu do 10 epruveta ili UIP400MPT za mikrotitarske ploče / ploče s 96 jažica), ovisno o broju uzoraka koje trebate pripremiti.
  Za ultrazvučnu obradu pojedinačnog uzorka sondom stavite ćelije u mikrocentrifugne epruvete od 1,5 mL.
• Unaprijed podesite trajanje ultrazvuka, ukupni unos energije, ciklični način rada i/ili temperaturna ograničenja u digitalnom meniju ultrazvučnog uređaja. Ovo osigurava vrlo pouzdanu ultrazvučnu obradu i ponovljivost.
• Umetnite sonotrodu i uključite ultrazvučni uređaj. Lagano pomjerajte mikrovrh ultrazvučne sonde kroz uzorak kako biste ga ravnomjerno ultrazvučno obradili.
  Kod većine ćelija ultrazvučna liza bit će završena nakon 2 -4 ciklusa ultrazvučne obrade od po 10 s.
• Nakon ultrazvučne obrade uklonite sonotrodu iz uzorka. Uzorke treba inkubirati na ledu 5 min. Zatim centrifugirajte pri 10.000 x g 20 min kako biste istaložili ostatke. Prebacite supernatante u novu mikrocentrifugnu epruvetu. Označite analite i pohranite na -20°C.
• Ultrazvučna sonotroda može se očistiti pažljivim brisanjem alkoholom ili ultrazvučnom obradom u čaši napunjenoj alkoholom, npr. 70% etanolom. Sve ultrazvučne sonde izrađene od titanija mogu se autoklavirati.

• Isperite tkivo ledeno hladnim PBS-om (0,01M, pH=7,4) kako biste temeljito uklonili višak hemolizirane krvi.
• Izvažite tkivo (bubreg, srce, pluća, slezenu itd.) i usitnite ga na male komade, koji se homogeniziraju u PBS-u. Potrebna zapremina PBS-a povezana je s težinom tkiva. Okvirno, 1g tkiva zahtijeva otprilike 9mL PBS-a. Preporučuje se dodati nešto inhibitora proteaza u PBS. (Alternativno se mogu koristiti RIPA ili hipotonični pufer za lizu koji sadrži koktel inhibitora proteaza i fosfataza.)
• Ovisno o veličini tkiva, kratka obrada vorteksiranjem (otprilike 1-2 min. u impulsima od 15 s) može pomoći pri prethodnoj obradi tkiva.
• Montirajte mikrovrh, npr. S26d2, na ultrazvučni uređaj. Stavite epruvetu s uzorkom i tkivom u ledenu kupelj.
• Ultrazvučno obradite uzorak svojim ultrazvučnim uređajem, npr. UP200St (80% amplitude) tokom 1 min. u impulsnom načinu rada (15 s uključeno, 15 s pauza). Držite uzorak u ledenoj kupelji.
• Homogenati se zatim centrifugiraju kako bi se dobile specifične frakcije (citosolna, nuklearna, mitohondrijska ili lizosomalna) radi obogaćivanja proteina za analizu. Centrifugiranjem uzorka 5 minuta pri 5000×g dobiva se supernatant.

Pouzdana kontrola temperature tokom ultrazvučne obrade

Temperatura je ključni faktor koji utječe na proces i posebno je važna pri obradi bioloških uzoraka, npr. radi sprječavanja termičke razgradnje proteina. Kao i sve mehaničke tehnike pripreme uzoraka, ultrazvučna obrada stvara toplinu. Međutim, temperatura uzoraka može se dobro kontrolisati pri korištenju uređaja Hielscher Ultrasonics. Predstavljamo vam različite opcije za praćenje i kontrolu temperature vaših uzoraka dok ih pripremate ultrazvučnim uređajem sa sondom ili uređajem VialTweeter prije analize.

1. Praćenje temperature uzorka: Svi digitalni ultrazvučni procesori Hielscher opremljeni su inteligentnim softverom i temperaturnim senzorom koji se može priključiti. Priključite temperaturni senzor na ultrazvučni uređaj (npr. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, ultrazvučni uređaj za ploče s više jažica UIP400MTP) i umetnite vrh temperaturnog senzora u jednu od epruveta s uzorkom. Putem digitalnog ekrana osjetljivog na dodir u boji možete u meniju ultrazvučnog procesora podesiti određeni temperaturni raspon za ultrazvučnu obradu uzorka. Ultrazvučni uređaj će se automatski zaustaviti kada se dostigne maksimalna temperatura i ostat će u pauzi dok temperatura uzorka ne padne na nižu vrijednost podešene temperature ∆. Zatim se ultrazvučna obrada automatski ponovo pokreće. Ova pametna funkcija sprječava razgradnju izazvanu toplinom.
2. Kod ultrazvučne jedinice za više uzoraka VialTweeter titanijski blok, koji drži epruvete s uzorcima, može se prethodno ohladiti. Stavljanje bloka VialTweeter (samo sonotrode bez pretvarača!) u frižider ili zamrzivač radi prethodnog hlađenja titanijskog bloka pomaže da se odgodi porast temperature u uzorku. Ako je moguće, i sam uzorak može se prethodno ohladiti.
3. Koristite ledenu kupelj ili suhi led za hlađenje tokom ultrazvučne obrade. Epruvete s uzorkom stavite tokom ultrazvučne obrade u ledenu kupelj. Za VialTweeter koristite plitku posudu napunjenu suhim ledom i postavite VialTweeter na suhi led kako bi se toplina mogla brzo odvoditi.

Kupci širom svijeta koriste Hielscher ultrazvučne uređaje sa sondom, kao i jedinice za ultrazvučnu obradu više uzoraka VialTweeter i UIP400MTP, za svakodnevnu pripremu uzoraka u biološkim, biohemijskim, medicinskim i kliničkim laboratorijima. Zahvaljujući inteligentnom softveru i kontroli temperature Hielscher procesora, temperatura se pouzdano kontroliše, a razgradnja uzoraka izazvana toplinom se izbjegava. Priprema uzoraka ultrazvukom pomoću Hielscher ultrazvučnih rješenja daje vrlo pouzdane i ponovljive rezultate!
Saznajte više o ultrazvučnoj obradi s visokom propusnošću uzoraka pomoću ultrazvučnog uređaja za ploče s više jažica UIP400MTP za testove!