Ultrazvučna fragmentacija DNK za sekvenciranje nove generacije

Sekvenciranje nove generacije (NGS) zahtijeva pouzdano smicanje i fragmentaciju genomske DNK kako bi se sekvencirali lanci genomske DNK i kreirale genomske biblioteke. Kontrolirana fragmentacija DNK na DNK fragmente ključan je korak pripreme uzoraka koji je potreban prije sekvenciranja DNK. Ultrazvučna obrada dokazano je efikasna i pouzdana tehnika za fragmentaciju DNK na određenu dužinu. Protokoli ultrazvučne fragmentacije DNK postižu reproducibilne rezultate fragmentacije. Hielscher ultrazvučni uređaji mogu proizvesti širok raspon distribucija veličina fragmenata genomske DNK, koje se precizno kontroliraju putem radnih parametara. Budući da su Hielscher sistemi za ultrazvučno smicanje DNK dostupni za pojedinačne i višestruke bočice, kao i za mikroploče, priprema uzoraka postaje vrlo efikasna.

Sekvenciranje nove generacije: ultrazvučna fragmentacija DNK za pripremu biblioteka

Da bi se provelo sekvenciranje nove generacije, moraju se izvršiti tri osnovna koraka: (1) priprema biblioteke, (2) sekvenciranje i (3) analiza podataka. Tokom pripreme biblioteke DNK se fragmentira, zatim se krajevi fragmenata popravljaju (poliraju) dodavanjem jedne baze adenina, a ciljni fragmenti se pretvaraju u dvolančanu DNK. Na kraju se ligacijom, PCR-om ili tagmentacijom vezuju takozvani adapteri kako bi se konačni DNK produkt biblioteke mogao kvantificirati za sekvenciranje.
Fragmentacija DNK ultrazvučnom obradom: Posebno kod tehnologija sekvenciranja kratkih očitanja, kao što je Illumina, koje ne mogu lako očitavati duže DNK fragmente, lanci DNK moraju se fragmentirati na određenu veličinu, što se pouzdano može postići ultrazvučnom obradom.
Ultrazvučna obrada može se pouzdano koristiti za fragmentaciju DNK, RNK i kromatina.

Sekvenciranje nove generacije – priprema biblioteke

Ultrazvučna fragmentacija DNK uobičajeno se koristi u pripremi biblioteka za sekvenciranje DNK za platforme sekvenciranja nove generacije (NGS). Ova tehnika se koristi za razbijanje molekula DNK na manje fragmente željenog raspona veličina, što olakšava naredne korake u pripremi biblioteke. Ultrazvučna fragmentacija DNK obično je potrebna tokom koraka pripreme biblioteke u NGS radnim tokovima kako bi se genomska DNK fragmentirala na manje dijelove pogodne za daljnju obradu i sekvenciranje. Ona ima ključnu ulogu u osiguravanju uspjeha eksperimenta sekvenciranja jer stvara DNK fragmente odgovarajućeg raspona veličina za konkretnu platformu za sekvenciranje koja se koristi.

Sekvenciranje nove generacije – koraci procesa:

• Ultrazvučna fragmentacija DNK: Prije izrade biblioteke genomska DNK se fragmentira na manje, lakše savladive dijelove. Ultrazvučna fragmentacija podrazumijeva upotrebu zvučnih talasa visoke frekvencije za smicanje molekula DNK na fragmente željenog raspona veličina. Ovaj korak je ključan jer pomaže osigurati da očitanja sekvenciranja koja se kasnije generišu budu odgovarajuće dužine za platformu za sekvenciranje koja se koristi. Raspon veličina fragmenata može se podešavati prema specifičnim zahtjevima eksperimenta sekvenciranja.
• Klonalna amplifikacija PCR-om: Nakon ultrazvučne fragmentacije DNK fragmenti prolaze kroz popravak krajeva, ligaciju adaptera i PCR amplifikaciju kako bi se dobile konačne biblioteke za sekvenciranje DNK. Ovi koraci pripremaju fragmentirane molekule DNK za proces sekvenciranja dodavanjem sekvenci adaptera potrebnih za vezanje na platformu za sekvenciranje i za osiguravanje mjesta za početak sinteze (priming) pri PCR amplifikaciji.
• Sekvenciranje DNK sintezom: Kada su biblioteke za sekvenciranje pripremljene, počinje proces sekvenciranja DNK sintezom (SBS). Tokom SBS-a sekvenca DNK određuje se sekvencijalnim dodavanjem nukleotida na komplementarni lanac. Ovaj korak uključuje cikličke reakcije ugradnje nukleotida, snimanja i cijepanja, što omogućava određivanje sekvence DNK na osnovu fluorescentnih signala koje emituju ugrađeni nukleotidi.
• Masovno paralelno sekvenciranje: U završnom koraku prostorno odvojeni, amplificirani DNK šabloni sekvenciraju se istovremeno na masovno paralelan način. Ovaj pristup sekvenciranju visoke propusnosti omogućava generisanje miliona do milijardi očitanja sekvenciranja u jednom ciklusu sekvenciranja, što omogućava efikasno i brzo određivanje DNK sekvenci.

Kako funkcionira ultrazvučna fragmentacija DNK?

Sonikacija, poznata i kao akustična obrada uzoraka, široko je korištena metoda za fragmentaciju DNK. Za ultrazvučno smicanje DNK uzorci se izlažu ultrazvučnim talasima pod kontroliranim uvjetima. Princip rada ultrazvučne fragmentacije DNK zasniva se na vibracijama i kavitaciji koje generišu ultrazvučni talasi. Smične sile koje nastaju ultrazvučnom (akustičnom) kavitacijom razbijaju molekule DNK velike molekulske mase. Postavke sonikacije, kao što su intenzitet (amplituda, trajanje), pulsni način rada i temperatura, omogućavaju preciznu fragmentaciju DNK na određenu željenu dužinu DNK fragmenata. Iako se DNK ultrazvučnom obradom često svodi na 100 do 600 bp, duži DNK fragmenti do 1300 bp mogu se dobiti kada se primijene blaži ultrazvučni uvjeti.

Kontrola temperature radi sprječavanja degradacije DNK

Dvolančani molekularni oblik DNK vrlo je osjetljiv na povišene temperature, pa je tačna kontrola temperature tokom koraka pripreme uzoraka ključan faktor za pouzdane rezultate analize.
Bilo da koristite ultrazvučne uređaje sa sondom kompanije Hielscher, VialTweeter ili UIP400MTP – kontinuirano praćenje i kontrola temperature osigurani su zahvaljujući priključivom temperaturnom senzoru i softveru pametnog uređaja. Da biste održali temperaturu unutar određenog raspona, možete postaviti gornju i donju temperaturnu granicu. Shodno tome, ultrazvučni uređaj će se pauzirati čim se ta temperaturna granica premaši i automatski će nastaviti ultrazvučnu obradu kada se temperatura snizi za zadani ∆T.
Sofisticirani softver ultrazvučnih uređaja Hielscher osigurava pouzdano održavanje idealnih uvjeta obrade uzoraka.

Masovna fragmentacija DNK uzoraka pomoću ultrazvučnog uređaja za višejažične ploče UIP400MTP

Broj uzoraka u znanostima o životu značajno je porastao tokom posljednje decenije. To znači da se vrlo veliki broj uzoraka (npr. 384, 1536 ili 3456 jažica po mikroploči) mora obraditi tokom pripreme uzoraka i analize pod dosljedno jednakim uvjetima kako bi se dobili uporedivi i valjani rezultati. Sa UIP400MTP Hielscher Ultrasonics slijedi trend masovne obrade uzoraka. UIP400MTP je ultrazvučni uređaj za pripremu uzoraka pomoću mikroploča. UIP400MTP može obraditi ploče sa 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 ili 3456 jažica. Ovisno o vrsti mikroploče, svaka jažica obično može sadržavati volumene uzoraka od nekoliko desetina nanolitara do nekoliko mililitara. Široko korišten u istraživanjima u znanostima o životu, UIP400MTP vrlo se često koristi za pripremu uzoraka prije testova kao što su ELISA (enzimski imunosorbentni test) ili PCR, prije analitike proteina, kao i za pripremu kromatina prije CHiP i CHiP-seq, identifikacije modifikacija histona i drugih analitičkih tretmana (npr. gel elektroforeza, masena spektrometrija).
Saznajte više o visokopropusnoj obradi PCR ploča!

VialTweeter za pripremu uzoraka u do 10 bočica

VialTweeter je široko korišten laboratorijski ultrazvučni uređaj VialTweeter koji omogućava efikasnu i udobnu ultrazvučnu obradu do 10 bočica istovremeno. Budući da se bočice i epruvete (npr. Eppendorf bočice, kriobočice, centrifugalne epruvete) obrađuju ultrazvukom neizravno, izbjegava se svaka unakrsna kontaminacija. Kako se svakom uzorku isporučuje isti intenzitet ultrazvuka, svi rezultati ultrazvučne obrade su homogeni i reproducibilni. VialTweeter nudi sve pametne funkcije kao i naši drugi digitalni uređaji (npr. pametni meni, programabilne postavke, kontrola temperature, daljinsko upravljanje itd.), čime je osigurana najveća udobnost za korisnika.

Sonde sa više prstiju za mikroploče

Dostupne za ultrazvučne homogenizatore sa sondom UP200Ht i UP200St, sonde sa više prstiju sa 4 ili 8 prstiju praktična su opcija za istovremenu ultrazvučnu obradu više uzoraka pod istim uvjetima. Na primjer, sonotroda MTP-24-8-96 je sonda sa osam prstiju, koja je idealna za integraciju u automatizirane sisteme ili za efikasnu ručnu pripremu uzoraka u jažicama višejažičnih ploča. Sonotroda sa više prstiju idealna je za automatizaciju u laboratorijima, u kojima se uglavnom obrađuju čaše i epruvete pomoću standardne ultrazvučne sonotrode. Sonde sa više prstiju i standardne sonde mogu se brzo zamijeniti u roku od nekoliko minuta, čime se ultrazvučni uređaj sa jednom sondom pretvara u ultrazvučni dezintegrator sa više sondi.

Hielscher ultrazvučni uređaji za fragmentaciju DNK

Hielscher Ultrasonics nudi različite platforme zasnovane na ultrazvuku za fragmentaciju DNK, RNK i kromatina. Te različite platforme uključuju ultrazvučne sonde (sonotrode), rješenja za neizravnu ultrazvučnu obradu za istovremenu pripremu uzoraka u više epruveta ili višejažičnih ploča (npr. ploče sa 96 jažica, mikrotitarske ploče), sonoreaktore i ultrazvučne čaše (cuphorns). Sve platforme za smicanje DNK pokreću visokoučinkoviti ultrazvučni procesori sa podešenom frekvencijom, koji se mogu precizno kontrolirati i pružaju reproducibilne rezultate.

Ultrazvučni procesori za bilo koji broj i veličinu uzoraka

Pomoću ultrazvučnih uređaja za više uzoraka kompanije Hielscher, VialTweeter (za do 10 epruveta) i UIP400MTP (za mikroploče / višejažične ploče), omogućeno je skratiti vrijeme obrade uzoraka zahvaljujući intenzivnoj i precizno kontroliranoj ultrazvučnoj obradi, uz istovremeno postizanje željene distribucije veličina DNK fragmenata i prinosa. Ultrazvučna fragmentacija DNK čini pripremu uzoraka efikasnom, pouzdanom i skalabilnom. Protokoli se mogu linearno skalirati od jednog do brojnih uzoraka primjenom stalno kontroliranog ultrazvuka.
Ultrazvučni uređaji sa sondom s jednim do pet prstiju idealni su za pripremu manjeg broja uzoraka. Laboratorijski ultrazvučni uređaji kompanije Hielscher dostupni su u različitim veličinama, tako da vam možemo preporučiti idealan uređaj za vašu primjenu i zahtjeve.

Precizna kontrola procesa

Precizno kontrolirane postavke ultrazvučne obrade ključne su jer iscrpna sonikacija može uništiti DNK, RNK i kromatin, dok neadekvatno ultrazvučno smicanje rezultira predugim fragmentima DNK i kromatina. Digitalni ultrazvučni uređaji kompanije Hielscher mogu se lako podesiti na precizne parametre ultrazvučne obrade. Specifične postavke ultrazvučne obrade mogu se također pohraniti kao programirana postavka za brzo ponavljanje istog postupka.
Sve ultrazvučne obrade automatski se bilježe i pohranjuju kao CSV datoteka na ugrađenu SD karticu. To omogućava tačnu dokumentaciju izvedenih pokusa i olakšava pregled ciklusa ultrazvučne obrade.
Putem daljinskog upravljanja preko preglednika svim digitalnim ultrazvučnim uređajima može se upravljati i nadzirati ih putem bilo kojeg standardnog preglednika. Instalacija dodatnog softvera nije potrebna, jer LAN veza omogućava vrlo jednostavno plug-n-play podešavanje.


Najveća jednostavnost korištenja u ultrazvučnoj pripremi uzoraka

Svi Hielscher ultrazvučni uređaji dizajnirani su da isporučuju ultrazvuk visokih performansi, a istovremeno su uvijek vrlo prilagođeni korisniku i jednostavni za upravljanje. Sve postavke dobro su strukturirane u preglednom meniju, kojem se lako pristupa putem ekrana osjetljivog na dodir u boji ili daljinskog upravljanja preko preglednika. Pametni softver sa programabilnim postavkama i automatskim bilježenjem podataka osigurava optimalne postavke ultrazvučne obrade za pouzdane i reproducibilne rezultate. Čist i jednostavan meni čini Hielscher ultrazvučne uređaje prilagođenim korisniku i efikasnim uređajima.
Tabela u nastavku daje orijentaciju o približnom kapacitetu obrade naših laboratorijskih ultrazvučnih uređaja, koji su idealni za zadatke pripreme uzoraka kao što su fragmentacija DNK i RNK, liza ćelija i ekstrakcija proteina: