Ultrazvučna fragmentacija DNK za sljedeće gensko sekvenciranje
Sekvenciranje naredne generacije (NGS) zahtijeva pouzdano sklanjanje i fragmentaciju genomske DNK kako bi se sekvencirale genomske DNK nit i stvorile biblioteke genoma. Kontrolirana fragmentacija DNK u fragmente DNK je bitan korak pripreme uzorka potreban prije sekvenciranja DNK. Ultrasonikacija se dokazuje kao efikasna i pouzdana tehnika za fragmentaciju DNK određene dužine. Ultrazvučni protokoli fragmentacije DNK postižu reprodukljive rezultate fragmentacije. Hielscherovi ultrasonikatori su sposobni proizvesti širok spektar genomske distribucije veličine fragmenta DNK, precizno kontrolisane preko operativnih parametara. Pošto su Hielscherovi ultrazvučni sistemi za šišanje DNK dostupni za jednostruke i više bočice kao i za mikroplate, priprema uzorka postaje vrlo efikasna.
Elektroforetske analize genomske DNA E. coli EDL933 podvrgnuti na 0 - 15 min ultrasonication. L označava DNA Ladder. (Basselet et al. 2008)
- ponoveni / reproducitivni rezultati
- precizno podesivo za dobijanje određene dužine fragmenta
- brza obrada
- dosljedni rezultati fragmentacije DNK
- uređaji za bilo koji volumen uzorka (npr. više bočica ili mikroplata)
- high throughput
- precizna kontrola temperature
- jednostavna, user-friendly operacija
Next-Gen Sequencing: Ultrasonic DNA Fragmentation for Library Preparation
Da bi se izvelo sekvenciranje sledeće generacije, moraju se obaviti tri osnovna koraka (1) priprema biblioteke, (2) sekvenciranje, i (3) analiza podataka. Tokom pripreme biblioteke, DNK je fragmentiran, zatim se delovi popravljaju (poliraju) dodavanjem jedne baze adenina i ciljni fragmenti se pretvaraju u dvostruko nasukanu DNK. Konačno, tako se prilagodnici vezuju ligacijom, PCR-om ili tagmentacijom tako da se konačni bibliotečan DNK proizvod može kvantitirati za sekvenciranje.
Fragmentacija DNK koristeći Sonication: Posebno kada kratko èitane tehnologije sekvenciranja kao što je Illumina, koje ne mogu èitati duæe fragmente DNK, DNK stabovi moraju biti fragmentiran do određene velièine koja se može pouzdano postiæi ultrazvukom.
Ultrasonication se može pouzdano koristiti za fragmentaciju DNK, RNK i hromatina.
Kako radi ultrazvučna fragmentacija DNK?
Sonication, poznat i kao akustična obrada uzoraka, je široko korištena metoda za fragmentiranje DNK. Za ultrazvučno šišanje DNK uzorci su izloženi ultrazvučnim talasima pod kontrolisanim stanjem. Radni princip ultrazvučne fragmentacije DNK se zasniva na vibracijama i kavitacijama koje stvaraju ultrazvučni talasi. Smicne sile koje su rezultat ultrazvučne (akustične) kavitacije lome molekule DNK visoke molekularne težine. Podešavanje sonikacije kao što su intenzivnost (amplitude, trajanje), pulsacioni način i temperatura omogućavaju preciznu fragmentaciju DNK do određene željene dužine fragmenata DNK. Dok se DNK često smanjuje na 100 do 600 bp pomoću ultrasonikacije, duži fragmenti DNK do 1300 bp mogu se dobiti kada se primene blaži ultrazvučni uslovi.
Ultrazvučno šišanje DNK tokom CHIP-a – hromatin Imuniprecipitaciona
Adapted from Jkwchui under CC-BY-SA.03
Kontrola temperature za sprečavanje degradacije DNK
Dvostruko nasukani molekularni oblik DNK je vrlo osjetljiv na povišene temperature tako da je tačan nadzor nad temperaturom tokom koraka pripreme uzoraka presudan faktor za pouzdane rezultate analize.
Bilo da koristite Hielscherove ultrasonikatore sonde, VialTweeter ili UIP400MTP – kontinuirano praćenje i kontrola temperature je osigurano zbog plugable temperaturnog senzora i softvera pametnog uređaja . Kako bi se održala temperatura unutar određenog raspona, možete postaviti gornje i donje ograničenje temperature. Prema tome, ultrasonikator će pauzirati čim se prekorači ova ograničenja temperature i automatski će se nastaviti sonikirati kada se temperatura spusti za postavljeni ∆T.
Sofisticirani softver Hielscher ultrasonicators osigurava pouzdano održavanje idealnih uslova liječenja uzorkom.
Masovna fragmentacija DNK uzorka sa UIP400MTP multi-Well Plate Ultrasonicatorom
Brojevi uzoraka u životnim naukama značajno su se povećali u posljednjih deset godina. To znači vrlo visok broj uzoraka (npr. 384, 1536 ili 3456 zveri po mikroplati) moraju biti obrađeni tokom pripreme uzoraka i analize pod dosljedno jednakim uvjetima kako bi se dobili usporediv i važeći rezultati. Sa UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics prati trend obrade masovnih uzoraka. UIP400MTP je ultrasonikator za pripremu uzoraka pomoću mikroplata. UIP400MTP može obraditi ploče sa 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 ili 3456 wells. Ovisno o tipu mikroplate, svaki dobrotlašci obično mogu držati uzorke volumena između desetine nanolitara do nekoliko mililitara. Široko se koristi u istraživanjima životne nauke, UIP400MTP se vrlo često koristi za pripremu uzoraka prije ispitivanja kao što su ELISA (enzimom povezani imunosorbent assay) ili PCR, Prije analitike proteina, kao i za pripremu hromatina prije CHiP-a i CHiP-seqa, identifikaciju modifikacije histona i druge analitičke tretmane (npr. gel elektroforezu, masenu spektrometriju).
VialTweeter za praparaciju uzoraka do 10 bočica
VialTweeter je široko korišteni laboratorijski ultrasonicator VialTweeter koji omogućava učinkovito i udobno sonication do 10 bočica istovremeno. Pošto se bočice i probne cijevi (npr. bočice Eppendorf, krio bočice, centrifuge cijevi) indirektno sonikuju, izbjegava se bilo koja unakrsna kontaminacija. Kako se isti intezitet ultrazvuka isporučuje svakom uzorku, svi rezultati sonikacije su homogeni i razmnožavajući. VialTweeter nudi sve pametne funkcije kao što su naši drugi digitalni uređaji (npr. pametni meni, programljive postavke, kontrola temperature, daljinski upravljač itd.) tako da je osiguran najviši korisnik-komfor.
Sonde sa više prstiju za Mikrovel ploče
Dostupno za ultrazvučne sonde homogenizatore UP200Ht i UP200St, sonde s više prstiju sa 4 ili 8 prstiju su udobna opcija za sonikirati više uzoraka u isto vrijeme pod istim uvjetima. Na primjer, sonotrode MTP-24-8-96 je sonda za osam prstiju, koja je idealna za integraciju u automatizirane sisteme ili efikasnu ručnu pripremu uzoraka zveri multi-well ploča. Sonotrode s više prstiju su idealne za automatizirane za laboratorije, gdje se obrađuju uglavnom pahuljasti i probne cijevi pomoću standardne ultrazvučne sonotrode. Višeprsti i standardne sonde mogu se brzo mijenjati u roku od nekoliko minuta pretvarajući ultrasonikator sa jednom sondom u višesonski ultrazvučni disruptor.
Hielscher Ultrasonicators za fragmentaciju DNK
Hielscher Ultrasonics nudi razne ultrazvučne platforme za DNK, RNK i fragmentaciju hromatina. Ove različite platforme uključuju ultrazvučne sonde (sonotrode), indirektna sonication rješenja za istovremenu pripremu uzoraka više cijevi ili multi-well ploča (npr. 96-dobro ploča, mikrotiter ploča), sonoreaktora, i ultrazvučnih cuphorns. Sve platforme za DNK šišanje su napajane frekvencijski podešenim, ultrazvučnim procesorima visokih performansi, koji su precizno kontrolisani i dostavljaju reprodukljive rezultate.
Ultrazvučni procesori za bilo koji broj uzorka i veličinu
Uz Hielscherove multi-uzorke ultrasonicators VialTweeter (za do 10 test cijevi) i UIP400MTP (za mikroplate/ multiwell ploče) postaje lako moguće smanjiti vrijeme obrade uzoraka zbog intenzivne i precizno kontrolirane ultrasonikacije uz dobivanje željene distribucije i prinosa veličine fragmenta DNK. Ultrazvučna fragmentacija DNK čini pripremu uzorka efikasnom, pouzdanom i skalablnom. Protokoli se mogu približno skalirati od jednog do brojnih uzoraka primjenom stalno kontroliranog ultrazvuka.
Ultrasonikatori sonde sa jednim do pet prstiju idealni su za pripremu manjih brojeva uzoraka. Hielscherovi laboratorijski ultrasonikatori dostupni su u raznim veličinama tako da vam možemo preporučiti idealan uređaj za vašu primjenu i zahtjeve.
preciznu kontrolu procesa
Precizno kontrolisane postavke sonikacije su presudne jer iscrpno sonifikacija može uništiti DNK, RNK i hromatin, ali neadekvatno ultrazvučno šišanje rezultira predugim fragmentima DNK i hromatina. Hielscherovi digitalni ultrasonicatori se lako mogu postaviti na precizan parametar sonication. Specifične postavke sonikacije se mogu sačuvati i kao programirana postavka za brzo ponavljanje istog postupka.
Sva sonication su automatski protokoliran i pohranjen kao CSV fajl na ugrađenoj SD-kartici. To omogućava preciznu dokumentaciju o izvršenim suđenjima i omogućava revizu sonication teče lako.
Preko daljinskog upravljača preglednika, svim digitalnim ultrasonikatorima se može upravljati i nadzirati putem bilo eg standardnog preglednika. Instalacija dodatnog softvera nije potrebna, pošto LAN veza omogućava vrlo jednostavno podešavanje plug-n-playa.
Najviši korisnik-friendliness in Ultrasonic Sample Preparation
Svi Hielscherovi ultrasonicatori su dizajnirani da isporuče ultrazvuk visokih performansi, dok su istovremeno uvijek vrlo korisni i laki za operirati. Sve postavke su dobro strukturirano u jasnom meniju, kojem se može lako pristupiti putem obojenih touch-displaya ili daljinskog upravljača preglednika. Pametni softver sa programiranim postavkama i automatskim snimanjem podataka osigurava optimalne postavke sonikacije za pouzdane i reprodukljive rezultate. Čist i jednostavan interfejs menija pretvara Hielscher ultrasonicators u korisnički i efikasne uređaje.
Tablica ispod vam daje naznaku o približnom kapacitetu obrade naših laboratorijskih ultrasonicatora, koji su idealni za zadatke pripreme uzoraka kao što su fragmentacija DNK i RNK, liza ćelija kao i ekstrakcija proteina:
| uređaj | Snaga [W] | tip | Volumen [ml] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP | 400 | za mikroplate | 6 – 3456 wells | VialTweeter | 200 | za do 10 bočica plus mogućnost stezanja | 0.5 – 1,5 |
| UP50H | 50 | Probe tipa | 0.01 – 250 |
| UP100H | 100 | Probe tipa | 0.01 – 500 |
| Uf200 ः t | 200 | Probe tipa | 0.1 – 1000 |
| UP200St | 200 | Probe tipa | 0.1 – 1000 |
| UP400St | 400 | Probe tipa | 5,0 – 2000 |
| Cufir | 200 | Cufir, sonoreglumac | 10 – 200 |
| GDmini2 | 200 | kontaminacija-slobodan protok ćeliju |
Kontaktiraj nas! / Pitajte nas!
Ultrazvučna jedinica za pripremu više uzoraka VialTweeter omogućava istovremeno sonikaciju do 10 bočica. Uz stezaljku uređaja VialPress, do 4 dodatne cijevi se mogu pritisnuti na prednju stranu za intenzivno sonication.
Sonotrode MTP-24-8-96 ima osam ultrazvučnih sondi za sonication wells of microtiter plates.
Književnost/reference
- Poptsova, M., Il’icheva, I., Nechipurenko, D. et al. (2014): Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing. Scientific Reports 4, 4532; 2014.
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample processing for DNA chip array-based analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts the Resistance to Doxorubicin in Human Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Characterization of the growth behavior of Leishmania tarentolae – a new expression system for recombinant proteins. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-wide tracking of unmethylated DNA Alu repeats in normal and cancer cells. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Protein Hint1 Triggers Apoptosis Independent of Its Enzymatic Activity. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.
Činjenice vredi znati
Šta je sekvenciranje sledeće generacije?
Sekvenciranje sljedeće generacije, također Sljedeće Gen Sequencing (NGS), visokoputno sekvenciranje ili sekvenciranje druge generacije, odnosi se na pristup masivnog paralelnog sekvenciranja, gdje su vrlo velike (masivne) količine DNK miliona fragmenata sekvencirani istovremeno paralelno po runu.
Da bi se izvelo sekvenciranje sledeće generacije, moraju se obaviti tri osnovna koraka (1) priprema biblioteke, (2) sekvenciranje, i (3) analiza podataka. Tokom pripreme biblioteke, DNK nit se mora rascjepkati u DNK fragmente određene dužine. Sonication je jedna od najpoћeljuжih tehnika fragmentacije DNK.
Tokom procesa sekvenciranja DNK, poredak nukleotida u DNK – poznat kao sekvenca nukleinih kiselina - određuje se. Sekvenca nukleinske kiseline se sačinjava iz četiri nukleotidne baze – adenina, cistozina, guanina, timina – koji kod za informacije.
Sekvenciranje sljedeće generacije je gonna istraživanja u životnoj nauci i personaliziranoj medicini budući da se SEKVENCIRANJE DNK i RNK umnogome koriste u genomskim istraživanjima, istraživanju raka, istraživanju rijetkih i složenih bolesti, mikrobijskim istraživanjima, agrigenomiji i mnogim drugim istraživačkim poljima.
Next Generation Sequencing vs Sanger Sequencing
Dok je sa Sekvencingom naredne generacije (NGS) moguće sekvencirati masivne brojeve genominih uzoraka, Sequencing Sanger (poznat i kao metoda prekida lanca ili First Generation Sequencing) ima samo mogućnost sekvenciranja malih brojeva uzoraka. Sekvenciranje Sengera sekvenciљe samo jedan fragment DNK u jednom trenutku i moћe se postiжi u jednom danu. Zbog svoje acccuracy, Sengerova sekvenca se također smatra tehnologijom zlatnog standarda, koja se koristi za verifikaciju rezultata dobivenih sekvencingom Sljedeće generacije.
Sekvenciranje sangera postiže dužine čitati od približno 800bp (tipično 500-600bp s neobogaćenom DNK). Duže dužine čitati u Sanger sekvencingu prikazuju značajne prednosti u odnosu na druge metode sekvenciranja posebno u smislu sekvenciranja repetitivnih regija genoma. Izazov kratko čitanih podataka sekvenci je posebno pitanje u sekvenciranju novih genoma (de novo) i u sekvenciranju visoko preuređenih genoma segmenata, obično onih viđenih kod genoma raka ili u regionima hromosoma koji pokazuju strukturnu varijaciju. [cp. Morozova i Marra, 2008]
Hielscher Ultrasonics proizvodi ultrazvučne homogenizatore visokih performansi od laboratorija u industrijske veličine.