Ultrazvučna fragmentacija DNK za sekvenciranje sljedeće generacije
Sekvencioniranje sljedeće generacije (NGS) zahtijeva pouzdano smicanje i fragmentaciju genomske DNK kako bi se sekvencionirali lanci genomske DNK i stvorile biblioteke genoma. Kontrolirana fragmentacija DNK u fragmente DNK je bitan korak pripreme uzorka koji je potreban prije sekvenciranja DNK. Ultrazvuk se dokazao kao efikasna i pouzdana tehnika za fragmentaciju DNK određene dužine. Ultrazvučni protokoli za fragmentaciju DNK postižu ponovljive rezultate fragmentacije. Hielscher ultrasonicatori su sposobni za proizvodnju širokog raspona distribucije veličine genomskih DNK fragmenata, precizno kontroliranih preko radnih parametara. Budući da su Hielscher ultrazvučni sistemi za smicanje DNK dostupni za pojedinačne i višestruke bočice, kao i za mikroploče, priprema uzorka postaje vrlo efikasna.
UIP400MTP sonikator ploča za pripremu uzoraka visoke propusnosti, ujednačeno obrađuje uzorke ultrazvukom u pločama s više jažica, mikrotitarskim pločama i pločama sa 96 jažica
- ponovljivi / ponovljivi rezultati
- precizno podesivo za postizanje određene dužine fragmenta
- brza obrada
- konzistentni rezultati fragmentacije DNK
- uređaji za bilo koju količinu uzoraka (npr. više bočica ili mikropločica)
- visoka propusnost
- precizna kontrola temperature
- jednostavno rukovanje prilagođeno korisniku
Sekvenciranje sljedeće generacije: ultrazvučna fragmentacija DNK za pripremu biblioteke
Da bi se izvršilo sekvenciranje sljedeće generacije, moraju se izvršiti tri osnovna koraka: (1) priprema biblioteke, (2) sekvenciranje i (3) analiza podataka. Tokom pripreme biblioteke, DNK se fragmentira, zatim se krajevi fragmenata popravljaju (poliraju) dodavanjem jedne baze adenina i ciljni fragmenti se pretvaraju u dvolančanu DNK. Konačno, takozvani adapteri se pričvršćuju ligacijom, PCR-om ili tagmentacijom tako da se konačni bibliotečki DNK proizvod može kvantificirati za sekvenciranje.
Fragmentacija DNK pomoću sonikacije: Naročito kada se radi o tehnologijama sekvencioniranja kratkog čitanja, kao što je Illumina, koja ne može lako čitati duže fragmente DNK, postolje DNK moraju biti fragmentirane do određene veličine koja se može pouzdano postići ultrazvučnom obradom.
Ultrazvuk se može pouzdano koristiti za fragmentaciju DNK, RNK i hromatina.
Next Gen Sequencing – Library Preparation
Ultrazvučna fragmentacija DNK se obično koristi u pripremi biblioteka za sekvenciranje DNK za platforme za sekvenciranje sljedeće generacije (NGS). Ova tehnika se koristi za razbijanje molekula DNK na manje fragmente željenog raspona veličina, što olakšava naredne korake u pripremi biblioteke. Ultrazvučna fragmentacija DNK obično je potrebna tokom koraka pripreme biblioteke NGS radnih tokova kako bi se fragmentirala genomska DNK na manje komade pogodne za daljnju obradu i sekvenciranje. On igra ključnu ulogu u osiguravanju uspjeha eksperimenta sekvenciranja generiranjem DNK fragmenata odgovarajuće veličine za određenu platformu sekvenciranja koja se koristi.
Elektroforetske analize genomske DNK E. coli EDL933 podvrgnute ultrazvuku u trajanju od 0 – 15 minuta. L označava DNK ljestve. (Baselet et al. 2008.)
Sekvencioniranje sljedeće generacije – Koraci procesa:
- Ultrazvučna fragmentacija DNK: Prije izgradnje biblioteke, genomska DNK se fragmentira na manje dijelove kojima se lakše upravlja. Ultrazvučna fragmentacija uključuje korištenje visokofrekventnih zvučnih valova za smicanje molekula DNK u fragmente željenog raspona veličina. Ovaj korak je ključan jer pomaže da se osigura da će čitanja sekvencioniranja koja su kasnije generirana biti odgovarajuće dužine za platformu sekvenciranja koja se koristi. Raspon veličine fragmenata može se podesiti na osnovu specifičnih zahtjeva eksperimenta sekvencioniranja.
- Klonalna amplifikacija pomoću PCR-a: Nakon ultrazvučne fragmentacije, DNK fragmenti se podvrgavaju krajnjoj popravci, vezivanju adaptera i PCR amplifikaciji kako bi se generirale konačne biblioteke DNK sekvenciranja. Ovi koraci pripremaju fragmentirane molekule DNK za proces sekvenciranja dodavanjem sekvenci adaptera neophodnih za vezivanje na platformu za sekvenciranje i obezbjeđivanjem početnih mjesta za PCR amplifikaciju.
- Sekvenciranje DNK sintezom: Nakon što se pripreme biblioteke sekvenciranja, počinje proces sekvenciranja DNK sintezom (SBS). Tokom SBS-a, sekvenca DNK je određena uzastopnim dodavanjem nukleotida komplementarnom lancu. Ovaj korak uključuje ciklične reakcije inkorporacije nukleotida, snimanja i cijepanja, omogućavajući određivanje sekvence DNK na osnovu fluorescentnih signala koje emituju ugrađeni nukleotidi.
- Masivno paralelno sekvenciranje: U završnom koraku, prostorno segregirani, amplificirani DNK šabloni se sekvenciraju istovremeno na masovno paralelan način. Ovaj pristup sekvencioniranja visoke propusnosti omogućava generiranje miliona do milijardi čitanja sekvenciranja u jednom ciklusu sekvenciranja, omogućavajući efikasno i brzo određivanje sekvenci DNK.
Kako radi ultrazvučna fragmentacija DNK?
Sonikacija, također poznata kao akustična obrada uzoraka, je široko korištena metoda za fragmentaciju DNK. Za ultrazvučno smicanje DNK, uzorci su izloženi ultrazvučnim talasima pod kontrolisanim uslovima. Princip rada ultrazvučne fragmentacije DNK zasniva se na vibracijama i kavitaciji koju stvaraju ultrazvučni talasi. Smične sile koje su rezultat ultrazvučne (akustične) kavitacije razbijaju molekule DNK visoke molekularne težine. Postavka sonikacije kao što su intenzitet (amplituda, trajanje), način pulsiranja i temperatura omogućavaju preciznu fragmentaciju DNK do određene željene dužine fragmenata DNK. Dok se DNK često smanjuje na 100 do 600 bp pomoću ultrazvučne obrade, duži fragmenti DNK do 1300 bp mogu se dobiti kada se primjenjuju blaži ultrazvučni uvjeti.
Ultrazvučno smicanje DNK tokom ChIP-a – hromatinska imunoprecipitacija
Adaptirano iz Jkwchui pod CC-BY-SA.03
Kontrola temperature kako bi se spriječila degradacija DNK
Dvolančani molekularni oblik DNK vrlo je osjetljiv na povišene temperature, tako da je precizna kontrola temperature tokom koraka pripreme uzorka ključni faktor za pouzdane rezultate analize.
Bilo da koristite Hielscherove ultrazvučne sonde, VialTweeter ili UIP400MTP – kontinuirano praćenje i kontrola temperature je osigurana zahvaljujući senzoru temperature koji se može priključiti i softveru pametnog uređaja. Da biste održali temperaturu unutar određenog raspona, možete postaviti gornju i donju temperaturnu granicu. Shodno tome, ultrasonikator će pauzirati čim se prekorači ovo ograničenje temperature i automatski će nastaviti sa sonikacijom kada se temperatura spusti za postavljeni ∆T.
Sofisticirani softver Hielscher ultrasonikatora osigurava pouzdano održavanje idealnih uvjeta obrade uzorka.
Fragmentacija masovnog uzorka DNK sa ultrasonikatorom za ploče UIP400MTP sa više jažica
Broj uzoraka u nauci o životu značajno se povećao u posljednjoj deceniji. To znači da se veoma veliki broj uzoraka (npr. 384, 1536 ili 3456 jažica po mikroploči) mora obraditi tokom pripreme uzorka i analize pod konstantno jednakim uslovima kako bi se dobili uporedivi i validni rezultati. Sa UIP400MTP, Hielscher Ultrasonics prati trend masovne obrade uzoraka. UIP400MTP je ultrazvučni aparat za pripremu uzoraka pomoću mikroploča. UIP400MTP može obraditi ploče sa 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 ili 3456 jažica. Ovisno o vrsti mikroploče, svaka jažica tipično može držati zapremine uzorka od desetina nanolitara do nekoliko mililitara. U širokoj upotrebi u istraživanjima nauke o životu, UIP400MTP se vrlo često koristi za pripremu uzoraka prije testova kao što su ELISA (enzimski imunosorbentni test) ili PCR, prije analize proteina, kao i za pripremu hromatina prije CHiP i CHiP-seq, modifikacije histona identifikaciju i druge analitičke tretmane (npr. gel elektroforeza, masena spektrometrija).
Pročitajte više o visokopropusnoj obradi PCR ploča!
VialTweeter za pripremu uzorka do 10 bočica
VialTweeter je široko korišćeni laboratorijski ultrasonikator VialTweeter koji omogućava efikasnu i udobnu sonikaciju do 10 bočica istovremeno. Budući da se bočice i epruvete (npr. Eppendorf bočice, krio bočice, epruvete za centrifugiranje) obrađuju indirektno ultrazvukom, izbjegava se svaka unakrsna kontaminacija. Kako se isti ultrazvučni intenzitet isporučuje svakom uzorku, svi rezultati sonikacije su homogeni i ponovljivi. VialTweeter nudi sve pametne funkcije kao što su naši drugi digitalni uređaji (npr. pametni meni, programabilna podešavanja, kontrola temperature, daljinsko upravljanje itd.) tako da je osigurana najveća udobnost za korisnika.
Sonde sa više prstiju za mikrojažinske ploče
Dostupne za ultrazvučne homogenizatore sonde UP200Ht i UP200St, sonde sa više prstiju sa 4 ili 8 prstiju su udobna opcija za ultrazvučnu obradu više uzoraka u isto vreme pod istim uslovima. Na primer, sonotroda MTP-24-8-96 je sonda sa osam prstiju, koja je idealna za integraciju u automatizovane sisteme ili efikasnu ručnu pripremu uzorka jažica ploča sa više jažica. Sonotroda s više prstiju idealna je za automatizirane laboratorije, gdje se uglavnom obrađuju čaše i epruvete koje koriste standardnu ultrazvučnu sonotrodu. Sonde sa više prstiju i standardne sonde mogu se brzo zameniti u roku od nekoliko minuta, pretvarajući ultrazvučni aparat sa jednom sondom u ultrazvučni disruptor sa više sondi.
Hielscher Ultrasonicatori za DNK fragmentaciju
Hielscher Ultrasonics nudi različite platforme zasnovane na ultrazvuku za fragmentaciju DNK, RNK i hromatina. Ove različite platforme uključuju ultrazvučne sonde (sonotrode), rješenja za indirektnu sonikaciju za istovremenu pripremu uzoraka više epruveta ili ploča sa više jažica (npr. ploče sa 96 jažica, mikrotitarske ploče), sonoreaktore i ultrazvučne čašice. Sve platforme za šišanje DNK pokreću se frekvencijski podešenim ultrazvučnim procesorima visokih performansi, koji se mogu precizno kontrolisati i daju ponovljive rezultate.
Ultrazvučni procesori za bilo koji broj i veličinu uzorka
Sa Hielscherovim ultrazvučnim aparatima za više uzoraka VialTweeter (za do 10 epruveta) i UIP400MTP (za mikroploče/ploče s više jažica) postaje lako moguće smanjiti vrijeme obrade uzorka zbog intenzivne i precizno kontrolirane ultrazvučne obrade dok se postiže željena distribucija veličine DNK fragmenta i prinos. . Ultrazvučna fragmentacija DNK čini pripremu uzorka efikasnom, pouzdanom i skalabilnom. Protokoli se mogu linearno skalirati od jednog do brojnih uzoraka primjenom konstantno kontroliranog ultrazvuka.
Ultrasonikatori sonde sa jednim do pet prstiju idealni su za pripremu manjeg broja uzoraka. Hielscherovi laboratorijski ultrasonikatori dostupni su u različitim veličinama tako da vam možemo preporučiti idealan uređaj za vašu primjenu i zahtjeve.
precizna kontrola procesa
Precizno kontrolirane postavke sonikacije su ključne jer iscrpna sonifikacija može uništiti DNK, RNK i kromatin, ali neadekvatno ultrazvučno smicanje rezultira predugačkim fragmentima DNK i kromatina. Hielscher-ovi digitalni ultrasonikatori mogu se lako postaviti na precizan parametar sonikacije. Specifične postavke sonikacije mogu se također sačuvati kao programirane postavke za brzo ponavljanje iste procedure.
Sva sonikacija se automatski protokolira i pohranjuje kao CSV datoteka na ugrađenoj SD kartici. Ovo omogućava preciznu dokumentaciju o izvedenim ispitivanjima i omogućava laku reviziju izvođenja sonikacije.
Preko daljinskog upravljača pretraživača, svim digitalnim ultrazvučnim aparatima se može upravljati i nadzirati putem bilo kojeg standardnog pretraživača. Instalacija dodatnog softvera nije potrebna, jer LAN veza omogućava vrlo jednostavno plug-n-play podešavanje.
Najveća jednostavnost za upotrebu u ultrazvučnoj pripremi uzoraka
Svi Hielscher ultrasonikatori su dizajnirani da isporuče ultrazvuk visokih performansi, dok su u isto vrijeme uvijek vrlo jednostavni za korištenje i laki za rukovanje. Sva podešavanja su dobro strukturirana u preglednom meniju, kojem se lako može pristupiti putem dodirnog ekrana u boji ili daljinskog upravljača za pretraživač. Pametni softver s programibilnim postavkama i automatskim snimanjem podataka osigurava optimalne postavke sonikacije za pouzdane i ponovljive rezultate. Čist i jednostavan za korištenje sučelje izbornika pretvara Hielscher ultrasonicatore u user-friendly i učinkovite uređaje.
Tabela ispod daje vam indikaciju približnog kapaciteta obrade naših laboratorijskih ultrazvučnih aparata, koji su idealni za zadatke pripreme uzoraka kao što su fragmentacija DNK i RNK, liza stanica kao i ekstrakcija proteina:
| Uređaj | Snaga [W] | Tip | Volumen [mL] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP | 400 | za mikroploče | 6 – 3456 bunara | VialTweeter | 200 | za do 10 bočica plus mogućnost pričvršćivanja | 0.5 – 1.5 |
| UP50H | 50 | tipa sonde | 0.01 – 250 |
| UP100H | 100 | tipa sonde | 0.01 – 500 |
| UP200Ht | 200 | tipa sonde | 0.1 – 1000 |
| UP200St | 200 | tipa sonde | 0.1 – 1000 |
| UP400St | 400 | tipa sonde | 5.0 – 2000 |
| CupHorn | 200 | CupHorn, sonoreaktor | 10 – 200 |
| GDmini2 | 200 | protočna ćelija bez kontaminacije |
Kontaktiraj nas! / Pitajte nas!
Ultrazvučna jedinica za pripremu više uzoraka VialTweeter omogućava istovremenu ultrazvučnu obradu do 10 bočica. Uz uređaj za pričvršćivanje VialPress, do 4 dodatne cijevi se mogu pritisnuti naprijed za intenzivnu sonikaciju.
Sonotroda MTP-24-8-96 ima osam ultrazvučnih sondi za ultrazvučnu obradu jažica mikrotitarskih ploča.
Literatura / Reference
- Poptsova, M., Il’icheva, I., Nechipurenko, D. et al. (2014): Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing. Scientific Reports 4, 4532; 2014.
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample processing for DNA chip array-based analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts the Resistance to Doxorubicin in Human Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Characterization of the growth behavior of Leishmania tarentolae – a new expression system for recombinant proteins. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-wide tracking of unmethylated DNA Alu repeats in normal and cancer cells. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Protein Hint1 Triggers Apoptosis Independent of Its Enzymatic Activity. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.
Činjenice koje vrijedi znati
Šta je sekvenciranje sljedeće generacije?
Sekvencioniranje sljedeće generacije, također sekvenciranje sljedeće generacije (NGS), sekvenciranje visoke propusnosti ili sekvenciranje druge generacije, odnosi se na pristup masovnog paralelnog sekvenciranja, gdje se vrlo velike (masovne) količine DNK od miliona fragmenata sekvenciraju istovremeno paralelno po trci.
Da bi se izvršilo sekvenciranje sljedeće generacije, tri osnovna koraka
- priprema biblioteke,
- sekvenciranje, i
- Analiza podataka
su obavezne.
Tokom pripreme biblioteke, lanci DNK moraju biti fragmentirani na fragmente DNK određene dužine. Sonikacija je jedna od poželjnih tehnika za fragmentaciju DNK.
Tokom procesa sekvenciranja DNK, redosled nukleotida u DNK – poznat kao sekvenca nukleinske kiseline – određuje se. Sekvenca nukleinske kiseline sastoji se od četiri nukleotidne baze – adenin, citozin, gvanin, timin – koji kod za informaciju.
Sekvencioniranje nove generacije pokreće istraživanja u nauci o životu i personaliziranoj medicini budući da se sekvenciranje DNK i RNK uvelike koristi u istraživanju genoma, istraživanju raka, istraživanju rijetkih i složenih bolesti, mikrobiološkim istraživanjima, agrigenomici i mnogim drugim istraživačkim poljima.
Next Generation Sequencing vs Sanger Sequencing
Dok je pomoću sekvenciranja sljedeće generacije (NGS) moguće sekvencirati ogroman broj genomskih uzoraka, Sanger sekvenciranje (također poznato kao metoda prekida lanca ili sekvenciranje prve generacije) ima samo sposobnost sekvenciranja malih brojeva uzoraka. Sanger sekvenciranje samo sekvencira jedan po jedan fragment DNK i može se postići u jednom danu. Zbog svoje tačnosti, Sanger sekvenciranje se također smatra tehnologijom zlatnih standarda, koja se koristi za provjeru rezultata dobivenih sekvenciranjem sljedeće generacije.
Sanger sekvenciranje postiže čitanje dužine od približno 800 bp (obično 500-600 bp sa neobogaćenom DNK). Duže dužine čitanja u Sangerovom sekvenciranju pokazuju značajne prednosti u odnosu na druge metode sekvenciranja, posebno u smislu sekvenciranja repetitivnih regija genoma. Izazov podataka o sekvenci kratkog čitanja posebno je problem u sekvenciranju novih genoma (de novo) i u sekvenciranju visoko preuređenih segmenata genoma, tipično onih koji se vide u genomima raka ili u regijama hromozoma koji pokazuju strukturne varijacije. [cp. Morozova i Marra, 2008]
DNK – Dezoksiribonukleinska kiselina – Njegovi oblici i funkcije
Svaki oblik DNK ima jedinstvene karakteristike i primjenu, doprinoseći širokom spektru istraživačkih polja, uključujući onkologiju, genetiku, forenzičku nauku i evolucijsku biologiju. Hielscher sonikatori su visoko učinkovito i pouzdano rješenje za izolaciju i fragmentaciju DNK i RNK za potrebe vaše analize. Na listi ispod, objašnjavamo vam specifične oblike DNK i kategoriziramo ih na osnovu njihovog biološkog konteksta i funkcija:
- Genomska DNK (gDNK)
Genomska DNK (gDNK): Kompletan skup DNK u organizmu, uključujući i kodirajuće (gene) i nekodirajuće regije. - Ekstracelularna DNK
Cirkulirajuća tumorska DNK (ctDNA): Fragmenti DNK koje tumorske ćelije puštaju u krvotok.
DNK bez ćelija (cfDNA): Fragmenti DNK koji slobodno kruže u krvotoku, potječu iz različitih tkiva. - Ekstrahromozomska kružna DNK (eccDNA): Kružne DNK molekule pronađene izvan hromozoma u eukariotskim ćelijama.
virusna DNK: DNK koja potiče od virusa, integrisana u genom domaćina ili kao epizomalna DNK. - Mitohondrijska DNK
Mitohondrijska DNK (mtDNA): DNK se nalazi u mitohondrijima, naslijeđena je od majke i uključena je u proizvodnju energije. - Plazmidna DNK
plazmidna DNK: Male, kružne molekule DNK koje se repliciraju nezavisno od hromozomske DNK, koje se obično nalaze u bakterijama i koriste se u genetskom inženjeringu. - Nuklearna DNK
Nuklearna DNK (nDNK): DNK sadržana u jezgru eukariotskih ćelija, koja čini većinu genetskog materijala u organizmu. - Jednoćelijska DNK
Jednoćelijska DNK (scDNA): DNK ekstrahovan iz jedne ćelije, koristi se za detaljnu genomsku analizu na nivou pojedinačne ćelije. - Rekombinantna DNK
Rekombinantna DNK (rDNK): Molekule DNK formirane laboratorijskim metodama genetske rekombinacije kako bi se spojio genetski materijal iz više izvora. - Specijalizovani obrasci
DNK okoline (eDNA): DNK prikupljena iz uzoraka okoliša (zemlja, vode) bez izolacije izvornih organizama
Drevna DNK (aDNK): DNK izvađen iz drevnih uzoraka, pružajući uvid u evolucijsku biologiju i drevne populacije. - Hromozomska DNK
hromozomska DNK: DNK koja čini hromozome unutar ćelijskog jezgra, obuhvatajući i kodirajuće i nekodirajuće regije. - Virusni i sintetički oblici
virusna DNK: DNK izvedena iz virusa, koji mogu biti integrirani u genome domaćina ili postojati kao nezavisni entiteti.
Sintetička DNK: Vještački sintetizovane sekvence DNK stvorene hemijskim procesima, često se koriste u istraživanju i biotehnologiji.
Hielscher Ultrasonics proizvodi ultrazvučne homogenizatore visokih performansi lab to industrijska veličina.