Ultrazvučna liza bioinženjerskih ćelija u industrijskoj proizvodnji

Bioinženjerske vrste bakterija kao što je E. coli, kao i genetski modificirani tipovi stanica sisara i biljaka se široko koriste u biotehnologiji za ekspresiju molekula. Da bi se ovi sintetizirani biomolekuli oslobodili, potrebna je pouzdana tehnika razbijanja stanica. Ultrazvuk visokih performansi je dokazana metoda za efikasnu i pouzdanu ćelijsku lizu – lako skalabilno do velike propusnosti. Hielscher Ultrasonics vam nudi ultrazvučnu opremu visokih performansi za efikasnu lizu ćelija kako bi se proizvele velike količine visokokvalitetnih bio-molekula.

Ekstrakcija molekula iz tvornica ćelija

Za proizvodnju širokog spektra biomolekula, različiti konstruisani mikrobi i biljne ćelije mogu se koristiti kao tvornice mikrobnih ćelija, uključujući Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Piachiesia pasta, Sacchiachia pasta. Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana i alge, između mnogih drugih. Ove tvornice ćelija mogu proizvoditi proteine, lipide, biokemikalije, polimere, biogoriva i oleohemikalije, koje se koriste kao hrana ili sirovina za industrijsku primjenu. Ćelije koje se koriste kao tvornice ćelija uzgajaju se u zatvorenim bioreaktorima, gdje mogu postići visoku efikasnost, specifičnost i niske energetske zahtjeve.
Da bi se izolovali ciljni molekuli iz bioinženjerskih staničnih kultura, ćelije se moraju poremetiti kako bi se oslobodio intracelularni materijal. Ultrazvučni disruptori ćelija su dobro poznati kao visoko pouzdana i efikasna tehnika za dezintegraciju ćelija i oslobađanje jedinjenja.

Fabrike mikrobnih ćelija su metabolički konstruisane ćelije koje se koriste za sintezu različitih vrednih jedinjenja. Ultrazvučno uništavanje ćelija je efikasna i pouzdana metoda za oslobađanje vrednih jedinjenja iz unutrašnjosti ćelije.
studija i grafika: ©Villaverde, 2010.

Prednosti ultrazvučnih disruptora ćelija

Kao netermalna, blaga, ali vrlo efikasna tehnologija, ultrazvučni disruptori se koriste u laboratoriji i industriji za lizu ćelija i za proizvodnju visokokvalitetnih ekstrakata, npr. koriste se za izolaciju molekula iz tvornica ćelija.

Snažni ultrazvuk za efikasno uništavanje fabrika mikrobnih ćelija

Mehanizam i efekti ultrazvučnih disruptora ćelija:
Ultrazvučno uništavanje ćelija koristilo je snagu ultrazvučnih talasa. Ultrazvučni homogenizator / ćelijski disruptor je opremljen sondom (aka sonotroda) napravljenom od legure titana koja oscilira na visokoj frekvenciji od cca. 20 kHz. To znači da ultrazvučna sonda uparuje 20.000 vibracija u sekundi u soniciranoj tečnosti. Ultrazvučni talasi spojeni u tečnost karakterišu naizmenični ciklusi visokog/niskog pritiska. Tokom ciklusa niskog pritiska, tečnost se širi i nastaju sitni vakuumski mehurići. Ovi vrlo mali mjehurići rastu tokom nekoliko naizmjeničnih ciklusa pritiska sve dok ne mogu apsorbirati daljnju energiju. U ovom trenutku, kavitacijski mjehurići naglo implodiraju i lokalno stvaraju izuzetno energetski gusto okruženje. Ova pojava je poznata kao akustična kavitacija i karakteriziraju je lokalno vrlo visoke temperature, vrlo visoki pritisci i posmične sile. Ova posmična naprezanja efikasno razbijaju zidove ćelije i povećavaju prenos mase između unutrašnjosti ćelije i okolnog rastvarača. Kao čisto mehanička tehnika, ultrazvučno generirane posmične sile se široko koriste i preporučeni postupak za razbijanje bakterijskih stanica, kao i za izolaciju proteina. Kao jednostavna i brza metoda uništavanja ćelija, sonikacija je idealna za izolaciju malih, srednjih i velikih volumena. Hielscherovi digitalni ultrasonikatori opremljeni su jasnim izbornikom postavki za preciznu kontrolu ultrazvuka. Svi podaci ultrazvuka automatski se pohranjuju na ugrađenu SD karticu i jednostavno su dostupni. Sofisticirane opcije odvođenja toplote kao što su eksterno hlađenje, sonikacija u pulsnom režimu itd. tokom procesa ultrazvučne dezintegracije osiguravaju održavanje idealne temperature procesa, a time i netaknutost ekstrahovanih jedinjenja osetljivih na toplotu.

Istraživanje naglašava snagu ultrazvučnog razaranja i ekstrakcije ćelija

Prof. Chemat i dr. (2017) nastavlja u svojoj studiji da je „ekstrakcija uz pomoć ultrazvuka zelena i ekonomski isplativa alternativa konvencionalnim tehnikama za hranu i prirodne proizvode. Glavne prednosti su smanjenje vremena ekstrakcije i obrade, količine energije i rastvarača koji se koriste, rad jedinice i CO₂ emisije.”
Gabig-Ciminska i dr. (2014) koristili su homogenizator visokog pritiska i ultrazvučni ćelijski dsintegrator u svojoj studiji za lizu spora u cilju oslobađanja DNK. Upoređujući obje metode uništavanja ćelija, istraživački tim zaključuje da je u pogledu lize ćelije za DNK spora „analiza urađena korištenjem ćelijskih lizata iz homogenizacije pod visokim pritiskom. Poslije smo shvatili da ultrazvučno uništavanje ćelija ima izuzetne prednosti u tu svrhu. Prilično je brz i može se obraditi za male količine uzoraka.” (Gabig-Ciminska i dr., 2014.)

Biomolekule iz tvornica ćelija za proizvodnju hrane

Tvornice mikrobnih ćelija su održiva i efikasna proizvodna metodologija koja koristi mikrobne organizme za proizvodnju visokih prinosa nativnih i tuđih metabolita metaboličkim bioinženjeringom mikrobnih mikroorganizama kao što su bakterije, kvasci, gljive itd. Enzimi se na primjer proizvode pomoću mikroorganizama auch kao Aspergillus oryzae, gljivice i bakterije. Ti enzimi se koriste u proizvodnji hrane i pića, kao iu poljoprivredi, bioenergiji i njezi domaćinstva.
Određene bakterije kao što su Acetobacter xylinum i Gluconacetobacter xylinus proizvode celulozu tokom procesa fermentacije, gdje se nanovlakna sintetiziraju u procesu odozdo prema gore. Bakterijska celuloza (takođe poznata kao mikrobna celuloza) je hemijski ekvivalentna biljnoj celulozi, ali ima visok stepen kristalnosti i visoku čistoću (bez lignina, hemiceluloze, pektina i drugih biogenih komponenti) kao i jedinstvenu strukturu celuloznih nanovlakna. tkana trodimenzionalna (3D) mrežasta mreža. (usp. Zhong, 2020.) U poređenju sa celulozom biljnog porekla, bakterijska celuloza je održivija i proizvedena celuloza je čista i ne zahteva složene korake prečišćavanja. Ultrazvuk i ekstrakcija rastvaračem pomoću NaOH ili SDS (natrijum dodecil sulfat) su vrlo efikasni za izolaciju bakterijske celuloze iz bakterijskih ćelija.

Biomolekule iz tvornica ćelija za proizvodnju lijekova i vakcina

Jedan od najistaknutijih farmaceutskih proizvoda dobivenih iz tvornica stanica je humani inzulin. Za bioinženjersku proizvodnju inzulina koriste se pretežno E. coli i Saccharomyces cerevisiae. Budući da biosintetizirane molekule nano veličine nude visoku biokompatibilnost, biološke nanočestice kao što je feritin su korisne za brojne primjene u bioproizvodnji. Osim toga, proizvodnja metaboličkim inženjeringom mikroba često je znatno efikasnija u dobijenim prinosima. Na primjer, proizvodnja artemisinske kiseline, resveratrola i likopena povećana je deset puta do nekoliko stotina puta i već je uspostavljena ili je u razvoju za proizvodnju u industrijskoj mjeri. (usp. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017.)
Na primjer, biomolekule nano-veličine zasnovane na proteinima sa svojstvima samosastavljanja kao što su feritin i čestice slične virusu posebno su zanimljive za razvoj cjepiva jer oponašaju i veličinu i strukturu patogena i podložne su površinskoj konjugaciji antigena za promicanje interakcija sa imunim ćelijama. Takvi molekuli se eksprimiraju u takozvanim ćelijskim fabrikama (npr. projektovani sojevi E. coli), koje proizvode određeni ciljni molekul.

Protokol za ultrazvučnu lizu i E. coli BL21 za oslobađanje feritina

Feritin je protein čija je primarna funkcija skladištenje željeza. Feritin pokazuje obećavajuće sposobnosti kao samosastavljive nanočestice u vakcinama, gde se koristi kao sredstvo za isporuku vakcine (npr. SARS-Cov-2 spike proteini). Naučno istraživanje Sun et. al. (2016) pokazuju da se rekombinantni feritin može osloboditi kao rastvorljivi oblik iz Escherichia coli pri niskim koncentracijama NaCl (≤50 mmol/L). U cilju ekspresije feritina u E. coli BL21 i oslobađanja fertina, uspješno je primijenjen sljedeći protokol. Rekombinantni plazmid pET-28a/feritin transformisan je u soj E coli BL21 (DE3). Ćelije feritina E coli BL21 (DE3) su kultivisane u medijumu za rast LB sa 0,5% kanamicina na 37°C i indukovane na OD600 od 0,6 sa 0,4% izopropil-β-D-tiogalaktopiranozida tokom 3 sata na 37°C. Konačna kultura je zatim sakupljena centrifugiranjem na 8000 g tokom 10 minuta na 4°C, a pelet je sakupljen. Zatim je talog resuspendiran u LB mediju (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% ekstrakt kvasca)/pufer za lizu (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) i različito koncentracije rastvora NaCl (0, 50, 100, 170 i 300 mmol/L), respektivno. Za lizu bakterijskih ćelija, ultrazvuk je primenjen u pulsnom režimu: npr Ultrasonikator UP400St na 100% amplitude sa radnim ciklusom od 5 sekundi UKLJUČENO, 10 sekundi ISKLJUČENO, za 40 ciklusa) i zatim centrifugirano na 10 000g 15 minuta na 4°C. Supernatant i talog su analizirani elektroforezom na natrijum dodecil sulfatu u poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE). Svi gelovi obojeni natrijum dodecil sulfatom skenirani su skenerom visoke rezolucije. Slike gela su analizirane pomoću softvera Magic Chemi 1D. Za optimalnu jasnoću, proteinske trake su otkrivene podešavanjem parametara. Podaci za trake su generirani iz tehničkih trostrukih primjeraka. (usp. Sun et al., 2016.)

Ultrazvučni disruptori ćelija za industrijsku lizu tvornica ćelija

Ultrazvučna liza i ekstrakcija je pouzdana i udobna metoda za oslobađanje metabolita iz tvornica stanica čime se pomaže efikasna proizvodnja ciljnih molekula. Ultrazvučni disruptori ćelija dostupni su od laboratorijske do industrijske veličine i procesi se mogu skalirati potpuno linearno.
Hielscher Ultrasonics je vaš kompetentan partner za ultrazvučne disruptore visokih performansi i ima dugogodišnje iskustvo u polju implantacije ultrazvučnih sistema u stolnim i industrijskim okruženjima.
Kada je u pitanju sofisticirani hardver i softver, Hielscher Ultrasonics sistemi za disrupciju ćelija ispunjavaju sve zahtjeve za optimalnu kontrolu procesa, jednostavan rad i prilagođenost korisniku. Kupci i korisnici Hielscher ultrasonicatora cijene prednost koju Hielscher ultrazvučni disruptori i ekstraktori ćelija omogućuju precizno praćenje i kontrolu procesa – preko digitalnog ekrana osetljivog na dodir i daljinskog upravljača pretraživača. Svi važni podaci sonikacije (npr. neto energija, ukupna energija, amplituda, trajanje, temperatura, pritisak) se automatski pohranjuju kao CSV datoteka na integriranoj SD kartici. Ovo pomaže da se dobiju ponovljivi i ponovljivi rezultati i olakšava standardizaciju procesa, kao i ispunjavanje Dobre proizvodne prakse (cGMP).
Naravno, Hielscher ultrazvučni procesori su napravljeni za 24/7 rad pod punim opterećenjem i stoga mogu pouzdano raditi u postavkama industrijske proizvodnje. Zbog visoke robusnosti i niskog održavanja, vrijeme zastoja ultrazvučne opreme je zaista malo. Funkcije CIP (čišćenje na mjestu) i SIP (sterilizacija na mjestu) minimiziraju naporno čišćenje, posebno jer su svi mokri dijelovi glatke metalne površine (bez skrivenih otvora ili mlaznica).

Tabela ispod daje vam indikaciju približnih kapaciteta obrade naših ultrazvučnih aparata: