Ultrazvučna liza bioinženjeriranih ćelija u industrijskoj proizvodnji

Bioinženjerirane bakterijske vrste poput E. coli, kao i genetski modificirane ćelije sisara i biljaka, naširoko se koriste u biotehnologiji za ekspresiju molekula. Da bi se oslobodile ove sintetizirane biomolekule, potrebna je pouzdana tehnika razgradnje ćelija. Visokoučinkovita ultrazvučna obrada dokazana je metoda za efikasnu i pouzdanu lizu ćelija – lako skalabilna na velike kapacitete obrade. Hielscher Ultrasonics nudi vam visokoučinkovitu ultrazvučnu opremu za efikasnu lizu ćelija radi proizvodnje velikih količina visokokvalitetnih biomolekula.

Ekstrakcija molekula iz ćelijskih tvornica

Za proizvodnju širokog spektra biomolekula kao mikrobne ćelijske tvornice mogu se koristiti različiti inženjerirani mikrobi i biljne ćelije, uključujući Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, cijanobakterije, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana i alge, među mnogim drugim. Ove ćelijske tvornice mogu proizvoditi proteine, lipide, biohemikalije, polimere, biogoriva i oleohemikalije, koji se koriste kao hrana ili sirovina za industrijske primjene. Ćelije koje se koriste kao ćelijske tvornice uzgajaju se u zatvorenim bioreaktorima, u kojima mogu postići visoku efikasnost, specifičnost i niske energetske zahtjeve.
Da bi se ciljni molekuli izolirali iz kultura bioinženjeriranih ćelija, ćelije se moraju razgraditi kako bi se oslobodio intracelularni materijal. Ultrazvučni disruptori ćelija dobro su etablirani kao veoma pouzdana i efikasna tehnika za dezintegraciju ćelija i oslobađanje spojeva.

Mikrobne ćelijske tvornice su metabolički inženjerirane ćelije koje se koriste za sintezu različitih vrijednih spojeva. Ultrazvučna razgradnja ćelija efikasna je i pouzdana metoda za oslobađanje vrijednih spojeva iz unutrašnjosti ćelije.
studija i grafika: ©Villaverde, 2010.

Prednosti ultrazvučnih disruptora ćelija

Kao netermička, blaga, a ipak veoma efikasna tehnologija, ultrazvučni disruptori koriste se u laboratorijama i industriji za lizu ćelija i za proizvodnju visokokvalitetnih ekstrakata, npr. za izolaciju molekula iz ćelijskih tvornica.

Snažni ultrazvuk za efikasnu razgradnju mikrobnih ćelijskih tvornica

Mehanizam i učinci ultrazvučnih disruptora ćelija:
Ultrazvučna razgradnja ćelija koristi snagu ultrazvučnih talasa. Ultrazvučni homogenizator / disruptor ćelija opremljen je sondom (tzv. sonotrodom) od legure titanija koja oscilira visokom frekvencijom od oko 20 kHz. To znači da ultrazvučna sonda unosi 20.000 vibracija u sekundi u tekućinu koja se podvrgava ultrazvučnoj obradi. Ultrazvučni talasi unijeti u tekućinu karakterišu se naizmjeničnim ciklusima visokog / niskog pritiska. Tokom ciklusa niskog pritiska tekućina se širi i nastaju sitni vakuumski mjehurići. Ovi veoma mali mjehurići rastu kroz nekoliko naizmjeničnih ciklusa pritiska sve dok ne mogu apsorbirati dodatnu energiju. U toj tački kavitacijski mjehurići snažno implodiraju i lokalno stvaraju izuzetno energetski gustu sredinu. Ova pojava poznata je kao akustična kavitacija, a karakterišu je lokalno veoma visoke temperature, veoma visoki pritisci i smične sile. Ova smična naprezanja efikasno razaraju ćelijske zidove i povećavaju prijenos mase između unutrašnjosti ćelije i okolnog otapala. Kao čisto mehanička tehnika, ultrazvučno generirane smične sile naširoko se koriste i preporučeni su postupak za razgradnju bakterijskih ćelija, kao i za izolaciju proteina. Kao jednostavna i brza metoda razgradnje ćelija, sonikacija je idealna za izolaciju malih, srednjih i velikih volumena. Digitalni ultrazvučni uređaji Hielscher opremljeni su preglednim izbornikom postavki za preciznu kontrolu ultrazvučne obrade. Svi podaci o sonikaciji automatski se pohranjuju na ugrađenu SD-card karticu i jednostavno su dostupni. Sofisticirane opcije odvođenja topline, poput vanjskog hlađenja, sonikacije u puls modu itd., tokom procesa ultrazvučne dezintegracije osiguravaju održavanje idealne temperature procesa i time očuvanost izdvojenih spojeva osjetljivih na toplinu.

Istraživanja ističu snage ultrazvučne razgradnje ćelija i ekstrakcije

Prof. Chemat i sur. (2017) u svojoj studiji rezimiraju da je „ekstrakcija potpomognuta ultrazvukom zelena i ekonomski isplativa alternativa konvencionalnim tehnikama za hranu i prirodne proizvode. Glavne prednosti su smanjenje vremena ekstrakcije i obrade, količine korištene energije i otapala, jediničnih operacija te CO₂ emisija.“
Gabig-Ciminska i sur. (2014) u svojoj su studiji koristili homogenizator visokog pritiska i ultrazvučni dezintegrator ćelija za lizu spora radi oslobađanja DNK. Poredeći obje metode razgradnje ćelija, istraživački tim zaključuje da je u pogledu lize ćelija za DNK spora „analiza provedena korištenjem ćelijskih lizata dobivenih homogenizacijom pod visokim pritiskom. Nakon toga smo uvidjeli da ultrazvučna razgradnja ćelija ima izuzetne prednosti u tu svrhu. Prilično je brza i može se provoditi za male volumene uzoraka.“ (Gabig-Ciminska i sur., 2014)

Biomolekule iz ćelijskih tvornica za proizvodnju hrane

Mikrobne ćelijske tvornice održiva su i efikasna proizvodna metodologija koja koristi mikrobne organizme za dobivanje visokih prinosa nativnih i nenativnih metabolita metaboličkim bioinženjeringom mikrobnih mikroorganizama poput bakterija, kvasaca, gljivica itd. Industrijski enzimi se, na primjer, proizvode korištenjem mikroorganizama kao što su Aspergillus oryzae, gljivice i bakterije. Ti se industrijski enzimi koriste u proizvodnji hrane i pića, kao i u poljoprivredi, bioenergiji i njezi domaćinstva.
Određene bakterije, poput Acetobacter xylinum i Gluconacetobacter xylinus, tokom procesa fermentacije proizvode celulozu, pri čemu se nanovlakna sintetiziraju u procesu odozdo prema gore. Bakterijska celuloza (poznata i kao mikrobna celuloza) hemijski je ekvivalentna biljnoj celulozi, ali ima visok stepen kristalnosti i visoku čistoću (bez lignina, hemiceluloze, pektina i drugih biogenih komponenti), kao i jedinstvenu strukturu trodimenzionalne (3D) umrežene mreže satkane od celuloznih nanovlakana. (usp. Zhong, 2020) U poređenju s celulozom biljnog porijekla, bakterijska celuloza je održivija, a proizvedena celuloza je čista i ne zahtijeva složene korake pročišćavanja. Ultrazvučna obrada i ekstrakcija otapalom pomoću NaOH ili SDS-a (natrijev dodecil-sulfat) veoma su efikasne za izolaciju bakterijske celuloze iz bakterijskih ćelija.

Biomolekule iz ćelijskih tvornica za proizvodnju farmaceutskih proizvoda i vakcina

Jedan od najistaknutijih farmaceutskih proizvoda dobivenih iz ćelijskih tvornica je humani inzulin. Za proizvodnju bioinženjeriranog inzulina pretežno se koriste E. coli i Saccharomyces cerevisiae. Budući da biosintetizirane molekule nanoveličine nude visoku biokompatibilnost, biološke nanočestice poput feritina povoljne su za brojne primjene u biproizvodnji. Osim toga, proizvodnja u metabolički inženjeriranim mikrobima često je znatno efikasnija u pogledu dobivenih prinosa. Na primjer, proizvodnja artemisinske kiseline, resveratrola i likopena povećana je deset do nekoliko stotina puta i već je uspostavljena ili je u razvoju za proizvodnju industrijskog obima. (usp. Liu i sur.; Microb. Cell Fact. 2017)
Na primjer, biomolekule nanoveličine na bazi proteina sa svojstvima samosastavljanja, poput feritina i čestica nalik virusima, posebno su zanimljive za razvoj vakcina jer oponašaju i veličinu i strukturu patogena te su pogodne za površinsku konjugaciju antigena radi promoviranja interakcije s imunim ćelijama. Takve se molekule eksprimiraju u takozvanim ćelijskim tvornicama (npr. inženjerirani sojevi E. coli), koje proizvode određenu ciljnu molekulu.

Protokol za ultrazvučnu lizu E. coli BL21 radi oslobađanja feritina

Feritin je protein čija je primarna funkcija pohranjivanje željeza. Feritin pokazuje obećavajuće sposobnosti kao nanočestice koje se samosastavljaju u vakcinama, gdje se koristi kao nosač vakcine (npr. spike proteini SARS-Cov-2). Naučno istraživanje Sun et. al. (2016) pokazuje da se rekombinantni feritin može osloboditi u topljivom obliku iz Escherichia coli pri niskim koncentracijama NaCl (≤50 mmol/L). Radi ekspresije feritina u E. coli BL21 i oslobađanja feritina uspješno je primijenjen sljedeći protokol. Rekombinantni plazmid pET-28a/ferritin transformiran je u soj E coli BL21 (DE3). Ćelije ferritin E coli BL21 (DE3) uzgajane su u LB hranjivoj podlozi s 0,5% kanamicina na 37°C i inducirane pri OD600 od 0,6 s 0,4% izopropil-β-D-tiogalaktopiranozida tokom 3 sata na 37°C. Konačna kultura zatim je prikupljena centrifugiranjem pri 8000g tokom 10 minuta na 4°C, a talog je sakupljen. Nakon toga talog je resuspendiran u LB mediju (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% ekstrakta kvasca)/puferu za lizu (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) i različitim koncentracijama otopine NaCl (0, 50, 100, 170 i 300 mmol/L), respektivno. Za lizu bakterijskih ćelija primijenjena je sonikacija u pulsnom režimu: npr. korištenjem ultrazvučnog uređaja UP400St pri amplitudi od 100% s radnim ciklusom od 5 sekundi UKLJUČENO, 10 sekundi ISKLJUČENO, tokom 40 ciklusa), a zatim centrifugirano pri 10 000g tokom 15 minuta na 4°C. Supernatant i talog analizirani su elektroforezom na poliakrilamidnom gelu s natrijevim dodecil-sulfatom (SDS-PAGE). Svi gelovi obojeni natrijevim dodecil-sulfatom skenirani su skenerom visoke rezolucije. Slike gelova analizirane su softverom Magic Chemi 1D. Radi optimalne jasnoće trake proteina detektirane su podešavanjem parametara. Podaci za trake generirani su iz tehničkih triplikata. (usp. Sun et al., 2016)

Ultrazvučni disruptori ćelija za industrijsku lizu ćelijskih tvornica

Ultrazvučna liza i ekstrakcija pouzdana je i praktična metoda za oslobađanje metabolita iz ćelijskih tvornica, čime se pomaže efikasna proizvodnja ciljnih molekula. Ultrazvučni disruptori ćelija dostupni su od laboratorijske do industrijske veličine, a procesi se mogu skalirati potpuno linearno.
Hielscher Ultrasonics je vaš kompetentni partner za visokoučinkovite ultrazvučne disruptore i ima dugogodišnje iskustvo u području ugradnje ultrazvučnih sistema u laboratorijskim i industrijskim okruženjima.
Kada je riječ o sofisticiranom hardveru i softveru, Hielscher Ultrasonics sistemi za razgradnju ćelija ispunjavaju sve zahtjeve za optimalnu kontrolu procesa, jednostavno rukovanje i prilagođenost korisniku. Kupci i korisnici Hielscher ultrazvučnih uređaja cijene prednost koju Hielscher ultrazvučni disruptori i ekstraktori ćelija pružaju u vidu precizne kontrole i praćenja procesa – putem digitalnog ekrana osjetljivog na dodir i daljinskog upravljanja preko preglednika. Svi važni podaci o sonikaciji (npr. neto energija, ukupna energija, amplituda, trajanje, temperatura, pritisak) automatski se pohranjuju kao CSV datoteka na integriranu SD karticu. To pomaže u dobivanju reproduktivnih rezultata koji se mogu ponoviti te olakšava standardizaciju procesa kao i ispunjavanje zahtjeva Dobre proizvođačke prakse (cGMP).
Naravno, Hielscher ultrazvučni procesori izrađeni su za rad 24/7 pod punim opterećenjem pa se stoga mogu pouzdano koristiti u industrijskim proizvodnim okruženjima. Zahvaljujući visokoj robusnosti i niskom održavanju, zastoj ultrazvučne opreme zaista je mali. Funkcije CIP (čišćenje na mjestu) i SIP (sterilizacija na mjestu) svode naporno čišćenje na minimum, pogotovo jer su svi dijelovi u kontaktu s medijem glatke metalne površine (bez skrivenih otvora ili mlaznica).

Tabela u nastavku daje vam orijentaciju o približnom procesnom kapacitetu naših ultrazvučnih uređaja: