Bioinžinjerizovane vrste bakterija kao što su E. coli kao i genetički modifikovane vrste sisača i biljnih ćelija se u biotehnici široko koriste za izražavanje molekula. Da bi se oslobodile ove sintetizirane bio-molekule, potrebna je pouzdana tehnika poremećaja ćelija. Ultrasonikacija visokih performansi je dokazana metoda za efikasnu i pouzdanu lizu ćelija – lako skalablirati na velike ulaze. Hielscher Ultrasonics vam nudi ultrazvučnu opremu visokih performansi za učtivu lizu ćelija kako bi proizveli velike volumene visokokvalitetne bio-molekule.

Ekstrakcija molekula iz fabrika ćelija

Za proizvodnju širokog spektra biomolekula, razni inženjerski mikrobi i biljne ćelije mogu se koristiti kao mikrobne ćelijske tvornice, Uključujući Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana i alge, između mnogih drugih. Ove ćelijske tvornice mogu proizvoditi proteine, lipide, biohemije, polime, biološka mesa i oleohemije, koji se koriste kao hrana ili sirovina za industrijske primjene. Ćelije koje se koriste kao fabrike ćelija su kulturane u zatvorenim bioreaktorima, gdje mogu postići visoku efikasnost, specifičnost i niske energetske zahtjeve.
Da bi se izolirale ciljne molekule iz bioinžinjernih kultura ćelija, ćelije moraju biti poremećene tako da se oslobodi intraćelijski materijal. Ultrazvučni poremećaji ćelija su dobro uspostavljeni kao vrlo pouzdana i efikasna tehnika za dezintegraciju ćelija i oslobađanje spoja.

Mikrobne ćelijske tvornice su metabolički inžinjerizirane ćelije koje se koriste za sintezu različitih vrijednih spoja. Ultrazvučni poremećaj ćelija je efikasna i pouzdana metoda za oslobađanje vrijednih spoja iz unutrašnjosti ćelije.
studija i grafika: ©Villaverde, 2010.

Prednosti ultrazvučnih poremećaja ćelija

Kao ne-termalna, blaga, ali vrlo efikasna tehnologija, ultrazvučni disruptori se koriste u laboratoriji i industriji za lizaciju ćelija i za proizvodnju visokokvalitetnih ekstrakta, npr.

Power-Ultrasound for Efficient Disruption of Microbial Cell Factories

Mechanism and Effects of Ultrasonic Cell Disruptors:
Ultrazvučni poremećaj ćelije je koristio snagu ultrazvučnih talasa. Ultrazvučni homogenizator / cell disruptor je opremljen sondom (zvanom sonotrode) napravljenom od legure titana koja oscilira na visokoj frekvenciji od cca 20 kHz. To znači da ultrazvučna sonda parova 20.000 vibracija u sekundi u soniciranu tečnost. Ultrazvučni valovi zajedno u tečnost karakteriziraju naizmjenični ciklusi visokog tlaka / niskog tlaka. Tokom ciklusa niskog pritiska, tečnost se širi i nastaju minutni vakuumski mjehurići. Ovi vrlo mali mjehurići rastu preko nekoliko ciklusa naizmjeničnog pritiska dok ne mogu apsorbirati bilo kakvu dalju energiju. U ovom trenutku, mjehurići kavitacije impliraju nasilno i stvaraju lokalno izvanredno energetski gusto okruženje. Ovaj fenomen je poznat kao akustična kavitacija i karakteriziraju je lokalno vrlo visoke temperature, vrlo visoki pritisci i sile smicanja. Ovi smiceni stresovi lome efikasno ćelijske zidove i povećavaju prijenos mase između unutrašnjosti ćelije i okolnog otapa. Kao čisto mehanička tehnika, ultrazvučno generirane sile smicanja se široko koriste i preporučena procedura za poremećaj bakterijskih ćelija, kao i za izolaciju proteina. Kao jednostavna i brza metoda poremećaja ćelija, sonikacija je idealna za izolaciju malih, srednje i velikih volumena veličine. Hielscherovi digitalni ultrasonikatori opremljeni su jasnim jelovnikom postavki za preciznu kontrolu sonikacije. Svi podaci o sonikaciji se automatski pohrane na ugrađenoj SD-kartici i jednostavno su pristupačni. Sofisticirane opcije disipacije toplote kao što su vanjsko hlađenje, sonikacija u puls modu itd. tokom ultrazvučnog procesa dezintegracije osiguravaju održavanje idealne temperature procesa i time netaknutost ekstrahovanih spoja osjetljivih na toplinu.

Research Underlines the Strengths of Ultrasonic Cell Disruption and Extraction

Prof. Chemat et al. (2017) nastavlja u svojoj studiji da je "ekstrakcija uz pomoć ultrazvuka zelena i ekonomski održiva alternativa konvencionalnim tehnikama za hranu i prirodne proizvode. Glavne pogodnosti su snizenje vremena vađenja i obrade, količina korištene energije i otavara, operacije jedinice i CO₂ emisije."
Gabig-Ciminska et al. (2014) su koristili homogenizer visokog pritiska i ultrazvučni ćelijski dsintegrator u svojoj studiji za lizu spora kako bi oslobodili DNK. Uspoređujući obje metode poremećaja ćelija, istraživački tim zaključuje da je u vezi sa lizom ćelija za DNK spora,"analiza je urađena upošljavajući lizate ćelija iz homogenizacije visokog pritiska. Nakon toga, shvatili smo da ultrazvučni poremećaj ćelija ima izvanredne prednosti u tu svrhu. Prilično je brz i može se obraditi za male volumene uzoraka." (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolekule iz fabrika ćelija za proizvodnju hrane

Mikrobne ćelijske tvornice su održiva i efikasna metodologija proizvodnje koristeći mikrobne organizme za proizvodnju visokih prinosa materinjskih i nematerijskih metabolita metaboličkim bio-inženjeringom mikrobnih mikroorganizama kao što su bakterije, ovce, gljivice itd. Masovni enzimi se na primjer proizvode koristeći mikroorganizme auch kao Aspergillus oryzae, gljivice i bakterije. Ti masovni enzimi se koriste za proizvodnju hrane i napica, kao i u poljoprivredi, bioenerdžiji i nezi domaćinstava.
Određene bakterije kao što su Acetobacter xylinum i Gluconacetobacter xylinus proizvode celulozu tokom procesa fermentacije, gdje se nanofiberi sintetiziraju u procesu odonda na gore. Bakterijska celuloza (poznata i kao mikrobna celuloza) je hemijski ekvivalentna biljnoj celulozi, Ali ima visok stepen kristalnosti i visoke čistoće (bez lignina, hemiceluloze, pektina i drugih biogenih komponenti) kao i jedinstvenu strukturu celuloze nanofiber-tkane trodimenzionalne (3D) retikulirane mreže. (cf. Zhong, 2020) U poređenju sa biljnom celuloza, bakterijska celuloza je održivija i proizvedena celuloza je čista ne traži složene korake pročišćavanja. Ultrasonikacija i ekstrakcija otapila koristeći NaOH ili SDS (natrij dodecil sulfat) su vrlo efikasni za izolaciju bakterijske celuloze iz bakterijskih ćelija.

Biomolekule iz cell Factories for Pharmaceutical and Vaccine Production

Jedan od najiskusnijih farmaceutskih proizvoda izvedenih iz ćelijskih fabrika je humani inzulin. Za bioinžinjersku proizvodnju inzulina koriste se pretežno E. coli i Saccharomyces cerevisiae. Budući da bio-sintetizirane molekule nano veličine nude visoku biokompatibilnost, biološke nanočestice kao što je feričin su prednost za brojne primjene biomanufaktora. Osim toga, proizvodnja u metabolički inžinjeriranim mikrobovima je često znatno učtivija u dobivenim prinosima. Na primjer, proizvodnja artemisinske kiseline, resveratrola i likopena se desetostruko povećala na nekoliko stotina puta, i već je uspostavljena ili je u razvoju industrijskoj proizvodnji razmjera. (cf. Liu et al.; Mikrob. Činjenica o ćelijama. 2017)
Na primjer, biomolekule zasnovane na proteinima sa samosastavljajućim svojstvima kao što su ferimin i čestice slične virusima su posebno zanimljive za razvoj cjepiva jer oponašaju i veličinu i strukturu patogena i podložne su površinskom konjugaciji antigena kako bi promovirale interakciju s imunološkim ćelijama. Takve molekule su izražene u tako zvanim ćelijama (npr. inžinjeri E. coli soja), koje proizvode određenu ciljnu molekulu.

Protocol for Ultrasonic Lysis and of E. coli BL21 for Ferritin Release

Fericin je protein, koji je primarna funkcija skladištenje željeza. Ferritin pokazuje obećavajuće mogućnosti kao samosastavljajuće nanočestice u cjepivima, gdje se koristi kao vozilo za dostavu cjepiva (npr. SARS-Cov-2 spike proteini). Naučna istraživanja Sun i. al. (2016) pokazuje da se rekombinantni feritina može osloboditi kao rastvorljiv oblik iz Escherichia coli pri niskim NaCl koncentracijama (≤50 mmol/L). Kako bi se izrazio feritina u E. coli BL21 i da bi se ferrtin oslobodio, uspješno je primijenjen sljedeći protokol. Rekombinantni pET-28a/feritin plazmid je pretvoren u E coli BL21 (DE3) soj. Ćelije feritina E coli BL21 (DE3) su bile kulturane u LB medijima rasta sa 0,5% kanamicina na 37°C i inducirale su se u OD600 od 0,6 sa 0,4% izopropil-β-D-tiogalaktopiranoside 3 sata na 37°C. Konačna kultura je potom pobrana centrifugacijom na 8000g 10 minuta na 4°C, a kuglica je prikupljena. Zatim, kuglica je ponovo uložena u LB medijumu (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% ekstrakta ovce)/liznog bafera (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) i različite koncentracije NaCl otopine (0, 50, 100, 170, odnosno 300 mmol/L). Za lizu bakterijskih ćelija, sonikacija je primijenjena u modu pulsa: npr. ultrasonicator UP400St na 100% amplitude sa ciklusom dužnosti od 5 sekundi ON, 10 sekundi ISKLJUČENO, za 40 ciklusa) i zatim centrifugiran na 10 000g 15 minuta na 4°C. Supernatant i precipitat su analizirani natrijevim dodecyl sulfat poliaklilamid gel elektroforezom (SDS-PAGE). Svi natrijevi dodecil-sulfatni geli su skenirani skenerom visoke rezolucije. Gel slike su analizirane pomoću Magic Chemi 1D softvera. Za optimalnu jasnoću, proteinske trake su otkrivene podešavanjem parametara. Podaci za bendove su generirani iz tehničkih triplikata. (cf. Sun et al., 2016)

Ultrazvučni cell Disruptors for Industrial Lysis of Cell Factories

Ultrazvučna liza i ekstrakcija je pouzdana i udobna metoda za oslobađanje metabolita iz ćelijske tvornice i time pomaže u učtivoj proizvodnji ciljnih molekula. Ultrazvučni ćelijski disruptori su dostupni od laboratorije do industrijske veličine i procesi se mogu skalirati potpuno linearno.
Hielscher Ultrasonics je vaš kompetentni partner za ultrazvučne disruptore visokih performansi i ima dugoročno iskustvo u oblasti implantacije ultrazvučnih sistema u klupa-top i industrijske postavke.
Kada je riječ o sofisticiranom hardveru i softveru, Hielscher Ultrasonics sistemi poremećaja ćelija ispunjavaju sve zahtjeve za optimalnu kontrolu procesa, jednostavan rad i korisnik-prijateljnost. Korisnici i korisnik Hielscher ultrasonicators cijene korist koju Hielscher ultrazvučni ćelijski disruptori i ekstraktori omogućavaju precizno praćenje i kontrolu procesa – putem digitalnog touch-displaya i daljinskog upravljača preglednika. Svi važni podaci o sonikaciji (npr. neto energija, totalna energija, amplituda, trajanje, temperatura, pritisak) automatski se čuvaju kao CSV fajl na integrisanoj SD-kartici. To pomaže da se dobiju reproduktivni i ponove rezultati i olakšava standardizacija procesa kao i ispunjenje Dobrih proizvodnih praksi (cGMP).
Naravno, Hielscherovi ultrazvučni procesori su izgrađeni za 24/7 rad pod punim teretom i stoga se mogu pouzdano raditi u postavkama industrijske proizvodnje. Zbog velike robusnosti i niskog održavanja, prekidanje ultrazvučne opreme je zaista nisko. CIP (clean-in-place) i SIP (sterilize-in-place) osobine minimiziraju mukotrpno čišćenje, pogotovo jer su svi mokri dijelovi glatke metalne površine (bez skrivenih otvora ili mnoški).

Tabela u nastavku daje naznaku približan kapacitet prerade naših ultrasonicators: