Biosintetička proizvodnja oligosaharida humanog mlijeka

Biosinteza oligosaharida humanog mlijeka (HMO) putem fermentacije ili enzimskih reakcija složen je proces koji zahtijeva mnogo resursa i često daje nizak prinos. Ultrazvučna obrada povećava prijenos mase između supstrata i ćelijskih fabrika te stimuliše rast i metabolizam ćelija. Time sonikacija intenzivira fermentaciju i biohemijske procese, što rezultira bržom i efikasnijom proizvodnjom HMO-a.

Oligosaharidi humanog mlijeka

Oligosaharidi humanog mlijeka (HMO), poznati i kao glikani humanog mlijeka, jesu molekule šećera koje pripadaju grupi oligosaharida. Istaknuti primjeri HMO-a su 2’-fukosillaktoza (2’-FL), lakto-N-neotetraoza (LNnT), 3’-galaktosillaktoza (3’-GL) i difukosillaktoza (DFL).
Iako se majčino mlijeko sastoji od više od 150 različitih HMO struktura, trenutno se u komercijalnim razmjerima proizvode samo 2′-fukosillaktoza (2′-FL) i lakto-N-neotetraoza (LNnT), koje se koriste kao nutritivni aditivi u dječjoj hrani za dojenčad.
Oligosaharidi humanog mlijeka (HMO) poznati su po svom značaju u ishrani beba. Oligosaharidi humanog mlijeka jedinstvena su vrsta nutrijenata koji unutar crijeva dojenčeta djeluju kao prebiotici, antiadhezivni antimikrobni agensi i imunomodulatori te značajno doprinose razvoju mozga. HMO se isključivo nalaze u majčinom mlijeku; druga mlijeka sisara ( npr. kravlje, kozje, ovčije, devino itd.) nemaju ove specifične oblike oligosaharida.
Oligosaharidi humanog mlijeka treća su najzastupljenija čvrsta komponenta humanog mlijeka, koja može biti prisutna u otopljenom, emulgiranom ili suspendovanom obliku u vodi. Laktoza i masne kiseline najzastupljenije su čvrste tvari u humanom mlijeku. HMO su prisutni u koncentraciji od 0,35–0,88 unci (9,9–24,9 g)/ L. Poznato je približno 200 strukturno različitih oligosaharida humanog mlijeka. Dominantni oligosaharid kod 80% svih žena je 2’-fukosillaktoza, koja je u majčinom mlijeku prisutna u koncentraciji od približno 2,5 g/ L.
Budući da se HMO ne probavljaju, ne doprinose ishrani kalorijama. Kao neprobavljivi ugljikohidrati djeluju kao prebiotici, a poželjna crijevna mikroflora, posebno bifidobakterije, selektivno ih fermentira.

Biosinteza oligosaharida humanog mlijeka

Ćelijske fabrike i enzimski / hemoenzimski sistemi trenutne su tehnologije koje se koriste za sintezu HMO-a. Za proizvodnju HMO-a u industrijskim razmjerima, fermentacija mikrobnih ćelijskih fabrika, biohemijska sinteza i različite enzimske reakcije izvedivi su načini biološke proizvodnje HMO-a. Zbog ekonomskih razloga, biosinteza pomoću mikrobnih ćelijskih fabrika trenutno je jedina tehnika koja se koristi na nivou industrijske proizvodnje HMO-a.

Fermentacija HMO-a pomoću mikrobnih ćelijskih fabrika

E.coli, Saccharomyces cerevisiae i Lactococcus lactis uobičajeno su korištene ćelijske fabrike za biološku proizvodnju bioloških molekula poput HMO-a. Fermentacija je biohemijski proces u kojem mikroorganizmi pretvaraju supstrat u ciljane biološke molekule. Mikrobne ćelijske fabrike koriste jednostavne šećere kao supstrat, koje pretvaraju u HMO. Budući da su jednostavni šećeri (npr. laktoza) obilan i jeftin supstrat, proces biosinteze ostaje ekonomičan.
Na rast i brzinu biokonverzije uglavnom utiče prijenos mase nutrijenata (supstrata) do mikroorganizama. Brzina prijenosa mase glavni je faktor koji utiče na sintezu proizvoda tokom fermentacije. Poznato je da ultrazvučna obrada potiče prijenos mase.
Tokom fermentacije uslovi u bioreaktoru moraju se stalno pratiti i regulisati kako bi ćelije mogle rasti što brže i potom proizvoditi ciljane biomolekule (npr. oligosaharide poput HMO-a; inzulin; rekombinantne proteine). Teoretski, stvaranje proizvoda počinje čim ćelijska kultura počne rasti. Međutim, naročito kod genetski modificiranih ćelija, poput inženjerski prilagođenih mikroorganizama, ono se obično inducira naknadno dodavanjem hemijske supstance u supstrat, koja pojačava ekspresiju ciljanog biomolekula. Ultrazvučni bioreaktori (sono-bioreaktori) mogu se precizno kontrolisati i omogućavaju ciljanu stimulaciju mikroba. To rezultira bržom biosintezom i većim prinosima.
Ultrazvučna liza i ekstrakcija: Fermentacija složenih HMO-a može biti ograničena niskim titrima fermentacije i time što proizvodi ostaju unutarćelijski. Ultrazvučna liza i ekstrakcija koriste se za oslobađanje unutarćelijskog materijala prije prečišćavanja i naknadnih procesa.

Ultrazvučno potaknuta fermentacija

Brzina rasta mikroba poput Escherichia coli, inženjerski prilagođene E.coli, Saccharomyces cerevisiae i Lactococcus lactis može se ubrzati povećanjem brzine prijenosa mase i propusnosti ćelijskog zida primjenom kontrolisane niskofrekventne ultrazvučne obrade. Kao blaga, netermička tehnika obrade, ultrazvučna obrada unosi u fermentacijsku masu isključivo mehaničke sile.
Akustična kavitacija: Princip rada sonikacije zasniva se na akustičnoj kavitaciji. Ultrazvučna sonda (sonotroda) unosi niskofrekventne ultrazvučne talase u medij. Ultrazvučni talasi putuju kroz tečnost stvarajući naizmjenične cikluse visokog pritiska (kompresija) / niskog pritiska (razrjeđenje). Naizmjeničnim sabijanjem i istezanjem tečnosti nastaju sitni vakuumski mjehurići. Ti mali vakuumski mjehurići rastu tokom nekoliko ciklusa dok ne dosegnu veličinu pri kojoj ne mogu apsorbovati dodatnu energiju. U toj tački maksimalnog rasta vakuumski mjehur burno imploidira i stvara lokalno ekstremne uslove, poznate kao fenomen kavitacije. U kavitacijskoj „vrućoj tački” mogu se uočiti visoki pritisci i temperaturne razlike te intenzivne smične sile s mlazovima tečnosti brzine do 280m/sec. Ovim kavitacijskim efektima postiže se temeljit prijenos mase i sonoporacija (perforacija ćelijskih zidova i ćelijskih membrana). Nutrijenti iz supstrata dopremaju se do živih cjelovitih ćelija i u njih, tako da su ćelijske fabrike optimalno ishranjene, a rast i brzine konverzije ubrzani. Ultrazvučni bioreaktori jednostavna su, a ipak vrlo efikasna strategija za obradu biomase u jednolončanom procesu biosinteze.
Poznato je da precizno kontrolisana, blaga sonikacija intenzivira fermentacijske procese.
Sonikacija poboljšava „produktivnost mnogih bioprocesa koji uključuju žive ćelije putem pojačanog unosa supstrata, pojačane proizvodnje ili rasta povećanjem poroznosti ćelija i potencijalno pojačanog oslobađanja ćelijskih komponenti.” (Naveena et al. 2015)
Saznajte više o ultrazvučno potpomognutoj fermentaciji!

Naveena et al. (2015) su ustanovili da ultrazvučna intenzifikacija nudi nekoliko prednosti tokom bioprocesiranja, uključujući niske operativne troškove u poređenju s drugim opcijama pojačavajućeg tretmana, jednostavnost rada i skromne zahtjeve za snagom.

Visokoučinkoviti ultrazvučni fermentacijski reaktori

Fermentacijski procesi uključuju žive mikroorganizme poput bakterija ili kvasca, koji funkcionišu kao ćelijske fabrike. Iako se sonikacija primjenjuje radi poticanja prijenosa mase i povećanja brzine rasta i konverzije mikroorganizama, ključno je precizno kontrolisati ultrazvučni intenzitet kako bi se izbjeglo uništavanje ćelijskih fabrika.
Hielscher Ultrasonics je specijalist za dizajn, proizvodnju i distribuciju visokoučinkovitih ultrazvučnih uređaja, koji se mogu precizno kontrolisati i nadzirati kako bi se osigurali superiorni prinosi fermentacije.

Kontrola procesa nije samo ključna za visoke prinose i vrhunski kvalitet, nego omogućava i ponavljanje i reprodukciju rezultata. Naročito kada je riječ o stimulaciji ćelijskih fabrika, prilagođavanje parametara sonikacije specifičnim ćelijama ključno je za postizanje visokih prinosa i sprječavanje razgradnje ćelija. Stoga su svi digitalni modeli Hielscher ultrazvučnih uređaja opremljeni inteligentnim softverom koji vam omogućava da podešavate, nadzirete i revidirate parametre sonikacije. Parametri ultrazvučnog procesa, kao što su amplituda, temperatura, pritisak, trajanje sonikacije, radni ciklusi i unos energije, ključni su za poticanje proizvodnje HMO-a putem fermentacije.
Pametni softver Hielscher ultrazvučnih uređaja automatski bilježi sve važne parametre procesa na integriranu SD karticu. Automatsko bilježenje podataka o procesu sonikacije osnova je za standardizaciju procesa i reproducibilnost / ponovljivost, koje su potrebne za Dobru proizvođačku praksu (GMP).

Ultrazvučni reaktori za fermentaciju

Hielscher nudi ultrazvučne sonde različitih veličina, dužina i geometrija, koje se mogu koristiti za šaržne, kao i za kontinuirane protočne tretmane. Ultrazvučni reaktori, poznati i kao sono-bioreaktori, dostupni su za bilo koju zapreminu, pokrivajući ultrazvučno bioprocesiranje od malih laboratorijskih uzoraka do pilot nivoa i potpuno komercijalne proizvodnje.
Poznato je da položaj ultrazvučne sonotrode u reakcijskoj posudi utiče na raspodjelu kavitacije i mikrostrujanja unutar medija. Sonotroda i ultrazvučni reaktor trebaju se odabrati u skladu sa zapreminom ćelijskog bujona koji se obrađuje. Iako se sonikacija može provoditi i u šaržnom i u kontinuiranom načinu rada, za velike proizvodne zapremine preporučuje se upotreba kontinuirane protočne instalacije. Prolaskom kroz ultrazvučnu protočnu ćeliju sav ćelijski medij dobija potpuno jednaku izloženost sonikaciji, čime se osigurava najefikasniji tretman. Širok asortiman Hielscher Ultrasonics ultrazvučnih sondi i protočnih ćelijskih reaktora omogućava sastavljanje idealne postavke za ultrazvučno bioprocesiranje.

Hielscher Ultrasonics – od laboratorija preko pilot postrojenja do proizvodnje

Hielscher Ultrasonics pokriva cijeli spektar ultrazvučne opreme, od kompaktnih ručnih ultrazvučnih homogenizatora za pripremu uzoraka do stolnih i pilot sistema, kao i snažnih industrijskih ultrazvučnih jedinica koje bez problema obrađuju količine od više kamiona po satu. Zahvaljujući svestranosti i fleksibilnosti opcija instalacije i montaže, Hielscher ultrazvučni uređaji mogu se lako integrisati u sve vrste šaržnih reaktora, reaktora s dohranjivanjem ili kontinuiranih protočnih postavki.
Različita dodatna oprema i prilagođeni dijelovi omogućavaju idealno prilagođavanje vaše ultrazvučne postavke zahtjevima vašeg procesa.
Hielscher ultrazvučni procesori izrađeni su za rad 24/7 pod punim opterećenjem i u zahtjevnim uslovima, pouzdani su i zahtijevaju samo nisko održavanje.
Tabela u nastavku daje vam okvirnu orijentaciju o približnom kapacitetu obrade naših ultrazvučnih uređaja: