Sinteza peptida u čvrstoj fazi – Efikasnije uz sonikardaciju

Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS) je uobičajena metoda za sintezu peptida. Ultrasonication je pouzdan alat za intenziviranje sinteze peptida u čvrstoj fazi što rezultira većim prinosima, poboljšanom čistoćom, bez racemizacije i značajno ubrzanom brzinom reakcije. Hielscher Ultrasonics nudi razna ultrazvučna rješenja za sintezu, cijepanje i otapanje peptida.

Ultrasonic Solid-Phase Peptide Synthesis

Ultrazvuk se već široko primjenjuje kao intenzivirajuća metoda u organskoj sintezi i dobro je poznat po svojim prednostima kao što su drastično skraćeno vrijeme reakcije, veći prinosi, manje nusproizvoda, iniciranje puteva koji se ne mogu postići na druge načine i/ili bolja selektivnost. Velike koristi se također mogu postići kada se ultrazvuk spoji s reakcijama sinteze peptida. Rezultati istraživanja su pokazali da se ultrazvučnom potpomognutom sintezom peptida postiže optimizirani prinos peptida visoke čistoće, bez racemizacije u kratkom vremenu reakcije.

Prednosti ultrazvučne sinteze peptida

Visoki prinosi peptida
Značajno brža sinteza
Veća čistoća peptida
Nema racemizacije
Paralelna sinteza različitih peptida
Scalable to any volume

Ultrazvučni cuphorn za jednoliku sonikaciju nekoliko reaktorskih posuda, npr. za poboljšanu sintezu peptida.

Ultrazvučni kuphorn za jednoliku sonikaciju nekoliko reaktorskih posuda za poboljšanu sintezu peptida.

Šematski prikaz Merrifieldove čvrste faze peptidne sinteze, koja se može intenzivirati ultrazvučnom obradom.

Graphic demonstrating the Merrifield solid phase peptide synthesis. Ultrasonication is used to promote and enhance the synthesis reaction as well as for cleavage of the synthesized peptides from the resin.
Grafika: ©Conejos-Sanchez et al., 2014.)

Study	Peptide(s) Studied	Reaction Time (Classical vs US-SPPS)	Crude Purity (Classical vs US-SPPS)	Racemization and Side Reactions	Key Takeaways
Wołczański et al. (2019)	Met-enkephalin, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-endorphin	600–1920 min → 48–284 min	24.2–71.3% → 60.6–89.9%	None observed for Cys/His, even at 70°C	~7–12x faster synthesis; major purity improvements, especially for aggregation-prone sequences like TAT.
Silva et al. (2021)	Pep1 (12-mer), Pep2 (9-mer), Pep3 (25-mer)	>3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (US only)	73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2)	Not tested; slight purity drop in Pep2 noted	14x time reduction for Pep1; crude yields significantly increased.
Merlino et al. (2019)	Model pentapeptides, peptides up to 44-mer, “teške sekvence” (Aβ 1-42, ACP 65-74)	60 min → 30 min (model)	84% → 93% (model); significantly higher than thermal heating (~45°C)	No significant increase for Cys/His enantiomers	Highly effective for difficult/aggregation-prone sequences; allows reduced reagent excess while maintaining high purity.

Sinteza peptida u čvrstoj fazi poboljšana ultrazvukom

Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS) je hemijska reakcija koja omogućava sklapanje peptidnog lanca kroz uzastopne reakcije derivata aminokiselina na nerastvorljivoj poroznoj podlozi. Međutim, tradicionalna sinteza peptida u čvrstoj fazi je relativno neefikasan i spor proces. Stoga je ultrazvučno intenziviranje sinteze peptida visoko cijenjeno sredstvo za efikasniju i bržu sintezu peptida.
Silva et al. (2021) upoređen “klasična” fluorenilmetoksikarbonil (Fmoc) sinteza peptida u čvrstoj fazi (SPPS) uz SPPS uz pomoć ultrazvuka (US) na bazi pripreme tri peptida, odnosno receptora faktora rasta za fibroblaste 3(FGFR3)-specifičnog peptida Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2) i PepEAp-NH2 peptida i novog peptida PepEAp-NH2. (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
SPPS uz pomoć US doveo je do 14 puta (Pep1) i 4 puta smanjenja vremena (Pep2) u sastavljanju peptida u poređenju sa “klasična” metoda. Zanimljivo je da je SPPS uz pomoć ultrazvuka dao Pep1 veće čistoće (82%) od “klasična” SPPS (73%). Značajno smanjenje vremena u kombinaciji sa postignutom visokom čistoćom sirovog peptida navelo je istraživački tim da primeni SPPS uz pomoć SAD na veliki peptid Pep3, koji pokazuje veliki broj hidrofobnih aminokiselina i homooligo sekvenci. Zanimljivo je da je sinteza ovog 25-mernog peptida postignuta za manje od 6 sati (347 min) umjerene čistoće (oko 49%).

Ultrazvučna sinteza peptida u čvrstoj fazi (US-SPPS) je efikasna tehnika za sintezu peptida koja sprečava racemizaciju.

Brža sinteza peptida putem sinteze peptida u čvrstoj fazi uz pomoć ultrazvučne agitacije.
(Studija i analiza: Wołczański et al., 2019.)

Merlino et al. (2019) također je proveo opsežnu studiju ultrazvučnih efekata na sintezu peptida u čvrstoj fazi na bazi Fmoc, što je omogućilo sintezu različitih biološki aktivnih peptida (do 44-mer), uz izuzetnu uštedu materijala i vremena reakcije. Pokazali su da ultrazvuk nije pogoršao glavne nuspojave i poboljšao sintezu peptida obdarenih “teške sekvence”, stavljajući ultrazvučno promoviranu sintezu peptida u čvrstoj fazi (US-SPPS) među trenutne visokoefikasne strategije sinteze peptida.

Dostupnost sistema visokih performansi za ultrazvučnu (zvučnu) sintezu peptida omogućava značajno poboljšane stope sinteze i povećanje čistoće sirovih proizvoda. (usp. Wołczański et al., 2019.)

Ultrazvučna sinteza peptida daje visoke prinose peptida visoke čistoće, dok je racemizacija spriječena.

Istraživanje racemizacije. Poređenje značajnih 1H NMR spektra modela peptida sintetiziranih ručno korištenjem klasičnog pristupa na sobnoj temperaturi u odnosu na ultrazvučnu metodu na povišenoj temperaturi. Hemijski pomaci His i Cys α-protona i metilenske grupe Acm (lijevi paneli), ɣ-metil protona Val (desni paneli) pokazuju da sonikacija na 70°C ne uzrokuje racemizaciju.
(Studija i analiza: Wołczański et al., 2019.)

Ultrazvučno cijepanje peptida

Nakon sinteze peptida u čvrstoj fazi (SPPS), sintetizirani peptidi se moraju odcijepiti od polimernih smola. Ovaj korak je također poznat kao uklanjanje zaštite. Kada se uporede uobičajeno mućkanje i ultrazvučno cijepanje peptida od smole, metoda protresanja zahtijeva pribl. 1 sat, dok se ultrazvučno cijepanje može postići za 15 do 20 min. Ultrazvučno cijepanje peptida može se primijeniti na cijepanje zaštićenih aminokiselina i peptida povezanih sa polistirenskim smolama preko benzil esterskih veza.

Ultrazvučno cijepanje je brza i pouzdana tehnika za odvajanje sintetiziranih peptida od polistirenske smole.

Ultrazvučno cijepanje peptida iz polistirenske smole daje visoke prinose peptida visoke čistoće, bez racemizacije, u brzoj proceduri.
(studija i grafika: ©Anuradha i Ravindranath, 1995.)

Reaktor s ultrazvučnim miješanjem za poboljšanu sintezu peptida.

Ultrazvučno agitirani reaktor za poboljšanu i ubrzanu sintezu peptida. Na slici je prikazano Ultrasonikator UP200St u staklenom reaktoru sa mešanjem.

Ultrasonikatori visokih performansi za sintezu peptida

Hielscher Ultrasonics nudi razna ultrazvučna rješenja za izravnu i indirektnu sonikaciju. Snažni i precizno kontrolirani ultrazvučni procesori isporučuju točno pravu količinu ultrazvučne energije u reakcionu posudu. Bilo da koristite špriceve, epruvete, ploče s više jažica ili staklene reaktore kao posude za sintezu, Hielscher Ultrasonics nudi najprikladniji ultrasonikator za vašu primjenu peptida.

Hielscher ultrazvučni sustavi su idealni za sintezu

prilagođeni peptidi
proizvodnja peptida velikih razmjera
peptidne biblioteke

Mnoge sinteze peptida se izvode u špricevima (npr. reaktori sa štrcaljkom). Hielscherova ultrazvučna miješalica za štrcaljku sonicira otopinu peptida spajajući ultrazvučne valove kroz zid šprica u tekućinu. Ultrazvučna mješalica za štrcaljku jedno je od najpopularnijih ultrazvučnih rješenja za ultrazvučno potpomognutu sintezu peptida.
Ultrazvučni cuphorn je prikladan alat za ultrazvučnu obradu do 5 reaktorskih posuda, dok VialTweeter može držati do deset reakcijskih cijevi plus dodatno pet većih posuda putem pribora za pričvršćivanje.
For other reactor types such as the Merrifield or Kamysz solid-phase reactor and other polypropylene or borosilicate vessels and reactors, Hielscher offers sonicators for indirect and direct sonication with customized clamp-on mounting or flange.

Naravno, veći stakleni reaktori s miješanjem, npr. za sintezu u fazi rastvora, može se lako opremiti ultrazvučnim sondama (poznatim kao sonotrode ili ultrazvučne rogove) bilo koje veličine.

Prednosti Hielscher ultrasonicatora za sintezu peptida

razne vrste ultrazvučnih aparata
direktna i indirektna sonikacija
precizna kontrola intenziteta
precizna kontrola temperature
kontinuirani ili pulsni ultrazvuk
pametne funkcije, programabilni uređaji
Dostupan za bilo koji volumen
linearnu skalabilnost

Za sintezu peptida u čvrstoj fazi u višeslojnim/mikrotiter pločama, UIP400MTP je idealan uređaj. Ultrazvučna kavitacija se indirektno i ravnomjerno prenosi u brojne uzorke u pločama za superioran transport mase i reakciju sinteze. Pogledajte video ispod da vidite mikroplatični sonikator UIP400MTP u akciji!

Ultrazvučni homogenizator UIP400MTP može sonicirati ploče sa više jažica i mikro-titarske ploče za lizu ćelija, fragmentaciju DNK, dispergovanje ili homogenizaciju.

Kontaktiraj nas! / Pitajte nas!

Ultrazvučni homogenizatori visokog smicanja koriste se u laboratorijskoj, stonoj, pilot i industrijskoj obradi.

Hielscher Ultrasonics proizvodi ultrazvučne homogenizatore visokih performansi za primjene miješanja, disperzije, emulgiranja i ekstrakcije u laboratorijskim, pilotskim i industrijskim razmjerima.

Povezane teme

Činjenice koje vrijedi znati o ultrazvučnoj sintezi peptida

Šta su peptidi?

Peptidi su spojevi u kojima je više aminokiselina povezano amidnim vezama, takozvanim peptidnim vezama. Kada se vežu u složene strukture – obično se sastoje od 50 ili više aminokiselina - ove velike peptidne strukture nazivaju se proteini. Peptidi su esencijalni gradivni element života i ispunjavaju brojne funkcije u tijelu.

Kako funkcioniše sinteza peptida?

U organskoj hemiji, molekularnoj biologiji i nauci o životu, sinteza peptida je proces proizvodnje peptida. Peptidi se hemijski sintetiziraju reakcijom kondenzacije karboksilne grupe jedne aminokiseline u amino grupu druge aminokiseline. Strategije zaštitnih grupa (također zaštitnih grupa) se obično koriste kako bi se izbjegle neželjene nuspojave s različitim bočnim lancima aminokiselina.
Hemijska (in-vitro) sinteza peptida najčešće počinje spajanjem karboksilne grupe dolazeće aminokiseline (C-terminus) na N-terminus rastućeg peptidnog lanca. Za razliku od ove C-to-N sinteze, prirodna proteinska biosinteza dugih peptida u živim organizmima odvija se u suprotnom smjeru. To znači da je u biosintezi, N-kraj dolazne aminokiseline vezan za C-kraj proteinskog lanca (N-do-C).
Većina istraživačkih i razvojnih protokola za sintezu peptida zasnovana je na metodama čvrste faze, dok se metode sinteze u fazi rastvora mogu naći u velikoj industrijskoj proizvodnji peptida.

Koje su trenutne najmodernije metode sinteze peptida?
SUS-SPPS (Održiva SPPS potpomognuta ultrazvukom) has been demonstrated to reduce the process to just two steps per cycle (combined coupling/capping/deprotection + single wash), significantly reducing solvent consumption and time. (cf. Mottola et al., 2025)
Ultrazvučno potpomognuti TAPS je novonastala kombinacija s dokazanom uspješnošću u ukupnim sintezama (npr. lipobaktin) i istražuju je CDMO-i za proizvodnju API-ja.
Otkrijte prednosti sinteze peptida sa ultrazvučno potpomognutim TAGGING-om!
Kontinuirana obrada istražuje se kao daljnje poboljšanje – opisane su platforme kontinuirane sinteze u jednom loncu s pomoćnim sililiranim tagovima.
Polje se kreće prema principima zelene hemije, pri čemu ultrazvuk i TAPS oboje doprinose smanjenju upotrebe rastvarača, manjoj potrošnji reagentima i poboljšanoj održivosti.

Literatura / Reference

Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.

High performance ultrasonics! Hielscher's product range covers the full spectrum from the compact lab ultrasonicator over bench-top units to full-industrial ultrasonic systems.

Hielscher Ultrasonics proizvodi ultrazvučne homogenizatore visokih performansi lab to industrijska veličina.