Sinteza peptida na čvrstoj fazi – efikasnija uz sonikaciju
Sinteza peptida na čvrstoj fazi (SPPS) uobičajena je metoda za sintezu peptida. Ultrazvučna obrada pouzdan je alat za intenziviranje sinteze peptida na čvrstoj fazi, što rezultira višim prinosima, boljom čistoćom, izostankom racemizacije i znatno ubrzanom brzinom reakcije. Hielscher Ultrasonics nudi različita ultrazvučna rješenja za sintezu, cijepanje i otapanje peptida.
Ultrazvučna sinteza peptida na čvrstoj fazi
Ultrazvučna obrada se već široko primjenjuje kao metoda intenziviranja u organskoj sintezi i poznata je po svojim prednostima, kao što su drastično skraćeno vrijeme reakcije, viši prinosi, manje nusproizvoda, pokretanje reakcijskih puteva koji se na druge načine ne bi mogli ostvariti i/ili bolja selektivnost. Velike koristi mogu se postići i kada se sonikacija uvede u reakcije sinteze peptida. Rezultati istraživanja pokazali su da sinteza peptida potpomognuta ultrazvukom postiže optimiziran prinos peptida visoke čistoće, bez racemizacije, u kratkom reakcijskom vremenu.
- Visoki prinosi peptida
- Znatno brža sinteza
- Veća čistoća peptida
- Bez racemizacije
- Paralelna sinteza različitih peptida
- Skalabilno na bilo koji volumen
Ultrazvučni cuphorn za ujednačenu sonikaciju više reakcijskih posuda radi poboljšane sinteze peptida.
Grafički prikaz Merrifieldove sinteze peptida na čvrstoj fazi. Ultrazvučna obrada koristi se za poticanje i pojačavanje reakcije sinteze, kao i za cijepanje sintetiziranih peptida sa smole.
Grafika: ©Conejos-Sanchez i sar., 2014)
| Studija | Proučavani peptid(i) | Reakcijsko vrijeme (klasična SPPS vs US-SPPS) | Sirova čistoća (klasična SPPS vs US-SPPS) | Racemizacija i sporedne reakcije | Ključni zaključci |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański i sar. (2019) | Met-enkephalin, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-endorphin | 600–1920 min → 48–284 min | 24,2–71,3% → 60,6–89,9% | Nije uočena za Cys/His, čak ni pri 70°C | ~7–12x brža sinteza; velika poboljšanja čistoće, posebno za sekvence sklone agregaciji poput TAT. |
| Silva i sar. (2021) | Pep1 (12-mer), Pep2 (9-mer), Pep3 (25-mer) | >3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (samo US) | 73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2) | Nije testirano; primijećen blagi pad čistoće kod Pep2 | 14x kraće vrijeme za Pep1; sirovi prinosi znatno povećani. |
| Merlino i sar. (2019) | Modelni pentapeptidi, peptidi do 44-mera, „teške sekvence“ (Aβ 1-42, ACP 65-74) | 60 min → 30 min (model) | 84% → 93% (model); znatno više nego kod termičkog zagrijavanja (~45°C) | Nema značajnog povećanja za enantiomere Cys/His | Vrlo djelotvorno za teške sekvence/sekvence sklone agregaciji; omogućava smanjen višak reagensa uz zadržavanje visoke čistoće. |
Sinteza peptida na čvrstoj fazi poboljšana ultrazvukom
Sinteza peptida na čvrstoj fazi (SPPS) je hemijska reakcija koja omogućava sastavljanje peptidnog lanca putem uzastopnih reakcija derivata aminokiselina na nerastvorljivom poroznom nosaču. Međutim, tradicionalna sinteza peptida na čvrstoj fazi relativno je neefikasan i spor proces. Stoga je ultrazvučno intenziviranje sinteze peptida visoko cijenjen alat za djelotvorniju i bržu sintezu peptida.
Silva i sar. (2021) uporedili su „klasičnu“ sintezu peptida na čvrstoj fazi (SPPS) s fluorenilmetoksikarbonilom (Fmoc) sa SPPS potpomognutom ultrazvukom (US) na osnovu pripreme tri peptida, i to peptida Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2) specifičnog za receptor 3 fibroblastnog faktora rasta (FGFR3) te novih peptida Pep2 (RQMATADEA-NH2) i Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
SPPS potpomognuta ultrazvukom dovela je do 14 puta (Pep1) odnosno 4 puta kraćeg vremena (Pep2) sastavljanja peptida u poređenju s „klasičnom“ metodom. Zanimljivo je da je SPPS potpomognuta ultrazvukom dala Pep1 veće čistoće (82%) nego „klasična“ SPPS (73%). Znatno skraćeno vrijeme u kombinaciji s postignutom visokom čistoćom sirovog peptida navelo je istraživački tim da US-SPPS primijeni na veliki peptid Pep3, koji ima velik broj hidrofobnih aminokiselina i homooligomernih sekvenci. Zanimljivo je da je sinteza ovog 25-mernog peptida postignuta za manje od 6 sati (347 min) uz umjerenu čistoću (oko 49%).
Brža sinteza peptida na čvrstoj fazi primjenom ultrazvučnog miješanja.
(Studija i analiza: Wołczański i sar., 2019)
Merlino i sar. (2019) također su proveli opsežnu studiju ultrazvučnih učinaka na sintezu peptida na čvrstoj fazi zasnovanu na Fmoc-u, koja je omogućila sintezu različitih biološki aktivnih peptida (do 44-mera) uz izuzetnu uštedu materijala i reakcijskog vremena. Pokazali su da ultrazvučna obrada nije pogoršala glavne sporedne reakcije te da je poboljšala sintezu peptida s „teškim sekvencama“, čime se sinteza peptida na čvrstoj fazi potpomognuta ultrazvukom (US-SPPS) svrstava među aktuelne visokoefikasne strategije sinteze peptida.
Dostupnost visokoučinkovitih sistema za ultrazvučnu (sonikacijsku) sintezu peptida omogućava znatno poboljšane brzine sinteze i povećanje čistoće sirovih proizvoda. (usp. Wołczański i sar., 2019)
Ispitivanje racemizacije. Poređenje značajnih 1H NMR spektara modelnih peptida sintetiziranih ručno klasičnim pristupom na sobnoj temperaturi naspram ultrazvučne metode na povišenoj temperaturi. Hemijski pomaci α-protona His i Cys te metilenske grupe Acm (lijevi paneli), ɣ-metilnih protona Val (desni paneli) pokazuju da sonikacija pri 70°C ne uzrokuje racemizaciju.
(Studija i analiza: Wołczański i sar., 2019)
Ultrazvučno cijepanje peptida
Nakon sinteze peptida na čvrstoj fazi (SPPS), sintetizirani peptidi moraju se odcijepiti od polimernih smola. Ovaj korak poznat je i kao deprotekcija. Kada se uporede uobičajeno mućkanje i ultrazvučna obrada za cijepanje peptida sa smole, metoda mućkanja zahtijeva oko 1 sat, dok se ultrazvučno cijepanje može provesti za 15 do 20 min. Ultrazvučno cijepanje peptida može se primijeniti za cijepanje zaštićenih aminokiselina i peptida vezanih za polistirenske smole putem benzilnih esterskih veza.
Ultrazvučno cijepanje peptida sa polistirenske smole daje visoke prinose peptida visoke čistoće, bez racemizacije, brzim postupkom.
(studija i grafika: ©Anuradha i Ravindranath, 1995)
Ultrazvučno miješani reaktor za poboljšanu i ubrzanu sintezu peptida. Slika prikazuje ultrazvučni uređaj UP200St u miješanom staklenom reaktoru.
Visokoučinkoviti ultrazvučni uređaji za sintezu peptida
Hielscher Ultrasonics nudi različita ultrazvučna rješenja za direktnu i indirektnu sonikaciju. Snažni i precizno podesivi ultrazvučni procesori isporučuju tačno odgovarajuću količinu ultrazvučne energije u reakcijsku posudu. Bez obzira na to koristite li štrcaljke, epruvete, višejamične ploče ili staklene reaktore kao posudu za sintezu, Hielscher Ultrasonics nudi najprikladniji ultrazvučni uređaj za vašu primjenu u sintezi peptida.
- peptida po narudžbi
- peptida u velikim razmjerima
- peptidnih biblioteka
Mnoge sinteze peptida izvode se u štrcaljkama (npr. reaktori od štrcaljki s fritom). Ultrazvučni mikser za štrcaljke kompanije Hielscher sonicira otopinu peptida tako što ultrazvučne valove kroz stijenku štrcaljke uvodi u tečnost. Ultrazvučni mikser za štrcaljke jedno je od najpopularnijih ultrazvučnih rješenja za sintezu peptida potpomognutu ultrazvukom.
Ultrazvučni cuphorn prikladan je alat za sonikaciju do 5 reakcijskih posuda, dok VialTweeter može primiti do deset reakcijskih epruveta te dodatno pet većih posuda putem pribora s hvataljkom.
Za druge vrste reaktora, kao što su reaktor za čvrstu fazu tipa Merrifield ili Kamysz te druge posude i reaktore od polipropilena ili borosilikata, Hielscher nudi sonikatore za indirektnu i direktnu sonikaciju s prilagođenom montažom s hvataljkom ili prirubnicom.
Naravno, veći miješani stakleni reaktori, npr. za sintezu u otopini, mogu se jednostavno opremiti ultrazvučnim sondama (poznatim i kao sonotrode ili ultrazvučni rogovi) bilo koje veličine.
- različiti tipovi ultrazvučnih uređaja
- direktna i indirektna sonikacija
- precizna kontrola intenziteta
- precizna kontrola temperature
- kontinuirani ili pulsirajući ultrazvuk
- pametne funkcije, programabilni uređaji
- dostupno za bilo koji volumen
- linearna skalabilnost
Za sintezu peptida na čvrstoj fazi u višejamičnim/mikrotitarskim pločama UIP400MTP je idealan uređaj. Ultrazvučna kavitacija se indirektno i ravnomjerno unosi u brojne jamice za uzorke radi vrhunskog prijenosa mase i reakcije sinteze. Pogledajte video u nastavku da vidite sonikator za mikroploče UIP400MTP na djelu!
Kontaktirajte nas! / Pitajte nas!
Hielscher Ultrasonics proizvodi visokoučinkovite ultrazvučne homogenizatore za primjene miješanja, disperzije, emulgiranja i ekstrakcije u laboratorijskom, pilot i industrijskom razmjeru.
Činjenice vrijedne znanja o ultrazvučnoj sintezi peptida
Šta su peptidi?
Peptidi su spojevi u kojima je više aminokiselina povezano amidnim vezama, takozvanim peptidnim vezama. Kada su vezani u složene strukture – koje se obično sastoje od 50 ili više aminokiselina – te velike peptidne strukture nazivaju se proteinima. Peptidi su bitan građevni element života i obavljaju brojne funkcije u tijelu.
Kako funkcioniše sinteza peptida?
U organskoj hemiji, molekularnoj biologiji i prirodnim naukama sinteza peptida je proces proizvodnje peptida. Peptidi se hemijski sintetiziraju kondenzacijskom reakcijom karboksilne grupe jedne aminokiseline s amino grupom druge aminokiseline. Strategije zaštitnih grupa (također zaštitnih skupina) obično se koriste kako bi se izbjegle neželjene sporedne reakcije s različitim bočnim lancima aminokiselina.
Hemijska (in-vitro) sinteza peptida najčešće počinje vezivanjem karboksilne grupe aminokiseline koja pristiže (C-terminus) za N-terminus peptidnog lanca u rastu. Za razliku od ove C-do-N sinteze, prirodna biosinteza proteina dugih peptida u živim organizmima odvija se u suprotnom smjeru. To znači da je u biosintezi N-terminus aminokiseline koja pristiže povezan s C-terminusom proteinskog lanca (N-do-C).
Većina istraživačkih i razvojnih protokola za sintezu peptida zasniva se na metodama na čvrstoj fazi, dok se metode sinteze u otopini mogu naći u industrijskoj proizvodnji peptida velikih razmjera.
Kakvo je trenutno stanje tehnike u sintezi peptida?
SUS-SPPS (održiva SPPS potpomognuta ultrazvukom) pokazalo se da skraćuje proces na samo dva koraka po ciklusu (kombinirano sprezanje/blokiranje/deprotekcija + jedno ispiranje), čime se znatno smanjuju potrošnja otapala i vrijeme. (usp. Mottola i sar., 2025)
TAPS potpomognut ultrazvukom je kombinacija u nastajanju s dokazanim uspjehom u totalnim sintezama (npr. lipobaktin), a CDMO organizacije je istražuju za proizvodnju API-ja.
Otkrijte prednosti ultrazvučno potpomognute sinteze peptida TAGGING metodom!
Kontinuirana obrada istražuje se kao daljnje poboljšanje – opisane su platforme za kontinuiranu sintezu u jednoj posudi potpomognutu silil-oznakom.
Oblast se kreće prema principima zelene hemije, pri čemu ultrazvuk i TAPS doprinose smanjenoj upotrebi otapala, manjem opterećenju reagensima i poboljšanoj održivosti.
Literatura / reference
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonics proizvodi visokoučinkovite ultrazvučne homogenizatore od laboratorijske do industrijske veličine.