Eluacija antitijela pomoću ultrazvučne obrade visoke propusnosti

Afinitetna hromatografija je moćna tehnika za pročišćavanje proteina, koja zahteva ultrazvučno potpomognuto nespecifično eluiranje je pouzdana tehnika pripreme uzorka za dobijanje antitela iz afinitetne hromatografije. Efikasno i reproducibilno eluiranje ciljnih antitijela vezanih za matrice afiniteta značajno je poboljšano ultrazvukom. Visokopropusni sonikator ploča UIP400MTP je optimalno prilagođen za eluiranje velikog broja uzoraka u pločama sa 96 jažica, mikrotitarskim i višejažičnim pločama i olakšava oporavak antitijela u afinitetnoj hromatografiji.

Kako sonikacija olakšava eluiranje?

Koristeći ultrazvučno intenzivirano nespecifično eluiranje, laboratorijski radnici i naučnici mogu efikasno povratiti pročišćena antitijela iz kolona afinitetne hromatografije. Ova pročišćena antitijela prolaze kroz nizvodne aplikacije u različitim poljima, kao što su imunologija, biotehnologija i medicinska dijagnostika.

Elucija je korak pripreme uzorka koji se obično koristi za afinitetnu hromatografiju: Afinitetna hromatografija koristi visoko specifične interakcije između ciljnog molekula (kao što je antitijelo) i liganda imobiliziranog na hromatografskoj matrici. Ovo omogućava selektivno pročišćavanje ciljnog molekula iz složene smjese koristeći specifični afinitet vezivanja molekula, npr. antitijela.
Specifično vezivanje antitela: Antitijela se često pročišćavaju afinitetnom hromatografijom, gdje se selektivno vezuju za ligand imobiliziran na hromatografskoj smoli. To može biti antigen, protein A/G ili bilo koji drugi molekul koji je u specifičnoj interakciji sa antitijelom od interesa.
elucija: Nakon vezivanja ciljnog antitijela na matriks, sljedeći korak uključuje eluiranje (ili ispiranje) vezanog antitijela iz smole. Ovaj korak eluiranja obično uključuje prekid specifičnog vezivanja između antitijela i liganda. Ovaj korak se može olakšati ultrazvukom.
Ultrazvučno potpomognuto nespecifično eluiranje: Za razliku od specifičnih metoda eluiranja koje remete samo interakciju antitijelo-ligand, nespecifične metode eluiranja remete sve interakcije na smoli, uključujući i one nespecifične. Ovo može biti korisno kada se radi sa jako vezanim zagađivačima koji mogu ometati proces pročišćavanja. Ovdje dolazi ultrazvuk u igru! Ultrazvučni talasi se koriste za stvaranje mjehurića kavitacije u puferu za eluiranje. Kada se ovi mjehurići kolabiraju u blizini matrice smole, oni proizvode intenzivne lokalizirane posmične sile i mikrostrujanje. Ovaj mehanički poremećaj pomaže u razbijanju nespecifičnih interakcija između antitijela i liganda, olakšavajući eluiranje vezanog antitijela iz matriksa.

Prednosti ultrazvučnog eluiranja pomoću ultrazvučne obrade

Ultrazvučno eluiranje nudi nekoliko prednosti, posebno u kontekstu tehnika pročišćavanja proteina kao što je afinitetna hromatografija.
Na primjer, ultrazvuk nadmašuje alternativne metode u smislu integriteta proteina, oporavka, čistoće, svestranosti i efikasnosti. Ove prednosti čine ultrazvučno eluiranje poželjnim izborom za procese pročišćavanja proteina, posebno u aplikacijama gdje je održavanje strukture i aktivnosti proteina od suštinskog značaja. Dodatno, ultrazvučno eluiranje ističe se svojom jednostavnošću, efikasnošću, svestranošću i kompatibilnošću sa širokim spektrom proteina i matrica afiniteta. Primjenjujući ultrazvučne valove da poremete interakcije proteina i matrice, ultrazvučno eluiranje nudi nježnu i brzu metodu za pročišćavanje proteina, osiguravajući visoke stope oporavka i očuvanje integriteta proteina za nizvodne primjene.

Blaže prema strukturi proteina: Eluiranje sa niskim pH uključuje upotrebu kiselih pufera da poremeti vezivanje između ciljnog proteina (npr. antitijela) i matrice afiniteta. Međutim, izlaganje niskom pH može denaturirati proteine, potencijalno kompromitujući njihovu strukturu i biološku aktivnost. Nasuprot tome, ultrazvučno eluiranje se prvenstveno oslanja na mehaničko oštećenje, a ne na hemijsku denaturaciju, što ga čini nježnijim za strukturu proteina. Ovo je posebno korisno kada se pročišćavaju osjetljivi proteini ili antitijela osjetljiva na promjene pH vrijednosti.

• Smanjeni rizik od agregacije: Ispiranje sa niskim pH može povećati rizik od agregacije proteina zbog odvijanja proteina i izlaganja hidrofobnih regija. Agregacija može dovesti do gubitka proteinske aktivnosti i poteškoća u daljem procesu obrade. Ultrazvučno eluiranje, za usporedbu, minimizira rizik od agregacije korištenjem mehaničkih sila da poremeti interakciju između proteina i matrice afiniteta bez značajnog mijenjanja prirodne konformacije proteina.
• Poboljšan oporavak i čistoća: Ultrazvučno eluiranje može postići veće stope oporavka i nivoe čistoće u poređenju sa alternativnim metodama eluiranja. Mehanički poremećaj koji se postiže ultrazvučnom obradom efikasno oslobađa vezane proteine iz matrice afiniteta, a minimizira nespecifične interakcije. Ovo rezultira poboljšanim obnavljanjem ciljnog proteina sa smanjenom kontaminacijom od nespecifično vezanih molekula, što doprinosi većoj čistoći eluirane frakcije.
• Visoka propusna obrada: Hielscher Ultrasonics nudi razne sonikatore za ultrazvučno potpomognuto pročišćavanje proteina, eluiranje i biopanning. Sonikator mikrotitarske ploče UIP400MTP omogućava masovnu obradu uzoraka u pločama sa 96 jažica i drugim pločama sa više jažica. VialTweeter je idealan za simultanu ultrazvučnu obradu do 10 epruveta kao što su Eppendorf bočice pod istim uvjetima. CupHorn je svestrani sonikator idealan za nekoliko epruveta, malih čaša i drugih posuda. I naravno, klasični sonikatori tipa sonde sa mikrovrhovima su dobro uspostavljen laboratorijski alat za pripremu uzoraka. Hielscher Ultrasonics asortiman proizvoda ima idealan sonikator za vašu postavku eksperimenta i veličinu uzorka.
• Svestranost i kompatibilnost: Ultrazvučno eluiranje je kompatibilno sa širokim spektrom proteina i matrica afiniteta, nudeći svestranost u aplikacijama za pročišćavanje. Nasuprot tome, eluiranje sa niskim pH možda neće biti prikladno za određene proteine koji su osjetljivi na kisele uvjete ili za afinitetne matrice koje su sklone razgradnji ili ispiranju pri niskom pH. Ultrazvučno eluiranje pruža nježnu i univerzalno primjenjivu alternativu koja se može prilagoditi specifičnim potrebama prečišćavanja bez ugrožavanja integriteta proteina ili stabilnosti matriksa.
• Vrijeme i efikasnost: Ultrazvučno eluiranje obično zahtijeva kraće vrijeme eluiranja u odnosu na druge metode eluiranja. Brzo i efikasno oslobađanje vezanih proteina olakšano ultrazvukom smanjuje vrijeme obrade i povećava ukupnu efikasnost prečišćavanja, što ga čini atraktivnom opcijom za aplikacije velike propusnosti ili kada su potrebni rezultati osjetljivi na vrijeme.

Biopaning uz pomoć ultrazvuka

Biopanning je kritična tehnika u prečišćavanju antitijela, posebno kada se moraju dobiti visoko specifična antitijela za istraživanje ili medicinsku dijagnostiku. Biopaning je proces u kojem se antitela izoluju iz mešavine antitela, takozvane biblioteke antitela.

Kako radi ultrazvučni biopanning?

Počinje sa bibliotekom antitijela, mješavinom raznih antitijela. Svako antitijelo karakterizira svoj jedinstveni oblik i specifičnost. Za analizu i terapiju, specifična antitijela koja prepoznaju određenu metu, kao što je virus ili stanica raka, moraju biti izolirana. Koristeći biopaning, ova specifična antitijela se mogu izolirati. Ultrazvuk pomaže da se olakša proces biopanninga, čineći pročišćavanje antitijela efikasnijim.

Počevši od biblioteke antitela, antitela se obično prikazuju na površini bakteriofaga, ćelije kvasca ili drugog sistema prikaza. Ova biblioteka predstavlja raznolik spektar antitijela.
U prvom koraku, ova biblioteka je izložena vašem ciljnom molekulu. Antitela koja se vezuju za metu će se zalepiti, dok će se druga isprati. Da bi se uklonila nevezana antitijela, uzorci se nekoliko puta isperu puferskom otopinom.

Sada imamo uzorke koji sadrže samo vezana antitijela. Međutim, to znači da su antitijela još uvijek vezana za svoj sistem prikaza. Da bi se oni oslobodili, interakcija antitijelo-ligand mora biti prekinuta. Ovaj korak je poznat kao elucija. Uzorci se mogu eluirati pomoću otopine koja narušava vezivanje, npr. korištenjem specifičnog pufera za eluiranje, haotropnog, snižavanja pH vrijednosti, primjene topline itd. Ove tehnike eluiranja uništavaju vezivanje antitijela-liganda, ali također mogu pogoršati sama antitijela. Zbog toga se ultrazvuk koristi kao alternativna tehnika za nježno uklanjanje antitijela sa njihove mete.

Nakon završetka koraka eluiranja, dobijamo pročišćena antitijela, spremna za upotrebu u istraživanju, dijagnostici ili terapiji.

Biopanning je moćna tehnika u prečišćavanju antitijela, a ultrazvučno eluiranje olakšava i intenzivira učinkovitost – što rezultira visoko pročišćenim, neoštećenim antitijelima. Ultrazvučni biopanning omogućava naučnicima da izoluju visoko specifična antitela iz složenih uzoraka, otvarajući vrata za širok spektar primena.

Sonikatori za pročišćavanje antitijela

Hielscher sonikatori su dobro uspostavljeni alati koji se koriste u najboljim istraživačkim ustanovama širom svijeta. Cijenjeni zbog svog vrhunskog dizajna i vrhunskih performansi, Hielscher sonikatori se smatraju nezamjenjivim laboratorijskim alatima u oblastima biotehnologije i molekularne biologije. Hielscher Ultrasonics nudi sonikatore za jedan uzorak, kao i pripremu uzoraka velike propusnosti, koji olakšavaju efikasno pročišćavanje antitijela i eluiranje molekula vezanih za cilj, te omogućavaju efikasno biopaning za izolaciju specifičnih antitijela s preciznošću i brzinom.
U kontekstu pročišćavanja antitijela, Hielscher sonikatori se ističu u olakšavanju koraka ispiranja i eluiranja efikasnim uklanjanjem nevezanih antitijela uz očuvanje integriteta kompleksa vezanih za cilj. Njihova precizna kontrola i skalabilnost omogućavaju prilagođene uslove obrade, osiguravajući optimalne rezultate prečišćavanja u širokom rasponu volumena uzoraka i složenosti.
Hielscher sonikatori predstavljaju tehnološku inovaciju u ultrazvučnoj obradi, nudeći neusporedive mogućnosti za pročišćavanje antitijela, eluiranje i biopaning. Svojom preciznošću, pouzdanošću i lakoćom rada, različiti ultrazvučni sistemi nude optimalnu efikasnost i svestranost za biofarmaceutska istraživanja, dijagnostiku i terapiju.
Kontaktirajte nas sada kako biste saznali više o Hielscher sonikatorima za pročišćavanje antitijela, eluciju i biopanning! Naše iskusno tehničko osoblje rado razgovara o vašoj aplikaciji vezanoj za antitijela!

Dizajn, proizvodnja i konsalting – Kvaliteta Made in Germany

Hielscher ultrasonicatori su poznati po najvišoj kvaliteti i standardima dizajna. Robusnost i jednostavan rad omogućavaju nesmetanu integraciju naših ultrazvučnih aparata u industrijske objekte. Hielscher ultrasonikatori lako se nose sa teškim uslovima i zahtevnim okruženjima.

Hielscher Ultrasonics je ISO sertifikovana kompanija i stavlja poseban naglasak na ultrazvučne aparate visokih performansi koji se odlikuju najsavremenijom tehnologijom i lakoćom korišćenja. Naravno, Hielscher ultrasonikatori su usklađeni sa CE i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoH.

Poređenje ultrazvučnog eluiranja u odnosu na tradicionalne tehnike eluiranja

1. Gradijentna elucija: Kod gradijentnog eluiranja, snaga vezivanja između ciljnog proteina i matrice afiniteta postepeno se smanjuje promjenom sastava pufera za eluiranje. To može uključivati promjenjive faktore kao što su pH, koncentracija soli ili koncentracija konkurentskih liganada. Gradijentno eluiranje omogućava fino podešavanje uslova eluiranja kako bi se selektivno oslobodio ciljni protein uz minimiziranje nespecifičnog vezivanja.
   Prednosti ultrazvučnog eluiranja: Ultrazvučno eluiranje nudi brže i ravnomjernije oslobađanje vezanih proteina u odnosu na gradijentno eluiranje. Dok gradijentno eluiranje zahtijeva pažljivu optimizaciju i praćenje uslova eluiranja, ultrazvučno eluiranje pruža jednostavniju i efikasniju metodu za oporavak proteina.
2. Konkurentska elucija: U kompetitivnom eluiranju, visoka koncentracija konkurentskog liganda se uvodi u pufer za eluiranje kako bi se poremetilo vezivanje između ciljnog proteina i matrice afiniteta. Konkurentni ligand se takmiči s ciljnim proteinom za mjesta vezivanja na matriksu, čime istiskuje protein i otpušta ga u eluat.
   Prednosti ultrazvučnog eluiranja: Ultrazvučno eluiranje nudi nježniju i svestraniju alternativu konkurentnom eluiranju. Kompetitivno eluiranje može zahtijevati upotrebu visokih koncentracija haotropnih agenasa (tj. ko-otopljene tvari koja remeti mrežu vodikovih veza između molekula vode i smanjuje stabilnost prirodnog stanja proteina slabljenjem hidrofobnog efekta) ili jakih kemikalija, koje mogu utjecati stabilnost i aktivnost proteina. Nasuprot tome, ultrazvučno eluiranje pruža mehaničko oštećenje bez potrebe za dodatnim hemijskim agensima, čuvajući integritet proteina i osiguravajući visoke stope oporavka.
3. Temperaturno inducirano eluiranje: Temperaturom izazvano eluiranje uključuje promjenu temperature pufera za eluiranje kako bi se poremetilo vezivanje između ciljnog proteina i matrice afiniteta. To se može postići povećanjem ili smanjenjem temperature, ovisno o specifičnoj interakciji protein-matriks.
   Prednosti ultrazvučnog eluiranja: Ultrazvučno eluiranje nudi bržu i kontrolisanu metodu za eluiranje proteina u poređenju sa metodama izazvanim temperaturom. Dok eluiranje izazvano temperaturom može zahtijevati preciznu kontrolu gradijenata temperature i duže vrijeme ekvilibracije, ultrazvučno eluiranje osigurava trenutni mehanički poremećaj, što rezultira kraćim vremenom eluiranja i poboljšanom efikasnošću.
4. Enzimska elucija: Enzimsko eluiranje koristi specifične enzime koji cijepaju veze između ciljnog proteina i matrice afiniteta, oslobađajući protein u eluat. Ova metoda je posebno korisna za proteine koji su čvrsto vezani za matriks ili za aplikacije koje zahtijevaju preciznu kontrolu nad uslovima eluiranja.
   Prednosti ultrazvučnog eluiranja: Ultrazvučno eluiranje nudi neenzimsku alternativu enzimskom eluiranju bez hemikalija. Dok enzimsko eluiranje može zahtijevati optimizaciju koncentracije enzima, vremena inkubacije i pH uslova, ultrazvučno eluiranje pruža jednostavnu i univerzalno primjenjivu metodu za oporavak proteina bez potrebe za dodatnim reagensima ili specijaliziranom opremom.