Ultrazvučna liza za western blot

• Western blot je analitička procedura za detekciju specifičnih proteina u uzorku tkivnog homogenata ili ćelijskog ekstrakta.
• Za izvođenje western bloat analize ili mjerenje enzimske aktivnosti mnogi testovi zahtijevaju pristup materijalima (npr. proteinima, DNK, subćelijskim fragmentima) zarobljenim u ćeliji.
• Ultrazvučna obrada (sonikacija) pouzdana je metoda, jednostavna za rukovanje, za kontrolisanu razgradnju i lizu ćelija.

Ultrazvučna razgradnja ćelija

Ekstrakcija proteina iz tkiva i kultiviranih ćelija prvi je korak za mnoge biološke, biohemijske i analitičke tehnike (PAGE, western blot, ELISA, masena spektrometrija itd.) ili za pročišćavanje proteina. Da bi se postigao visok prinos proteina, ćelijski materijal i tkivo moraju se efikasno razgraditi/ lizirati. Bilo da se radi o biljnoj ćeliji ili životinjskom tkivu, ultrazvučna obrada (sonikacija) je metoda kojom svoj ćelijski lizat možete pripremiti lako i brzo.

Prednosti ultrazvučne obrade (sonikacije)

• brza i efikasna
• jednostavan rad
• visok prinos proteina
• reproducibilna/ ponovljiva
• precizno kontrolisana
• skalabilna

Protokol imunoprecipitacije za western imunoblot

A. Reagensi

Za pripremu otopina koristite pročišćenu vodu, kao što je Milli-Q.

• 1X fosfatni puferirani fiziološki rastvor (PBS)
• 1X pufer za lizu ćelija: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natrijev pirofosfat, 1 mM β-glicerofosfat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptin
  Važno: Dodajte 1 mM PMSF neposredno prije upotrebe.
• 15 μl proteina A + 15 μl proteina G dovoljno je za IP, ali to može ovisiti o vašem primarnom antitijelu i volumenu uzorka. Možete koristiti i unaprijed pomiješanu agarozu s proteinima A/ G (npr. protein A za pull-down IgG zeca i protein G za pull-down IgG miša)
• 3X SDS pufer za uzorke: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 pri 25°C), 6% w/v SDS, 30% glicerol, 150 mM DTT, 0,03% w/v bromfenol plavo

B. Priprema ćelijskih lizata

• Prikupite ćelije. Da biste ćelije prikupili u nedenaturirajućim uvjetima, uklonite medij i jednom isperite ćelije ledeno hladnim PBS-om.
• Uklonite PBS i dodajte 0,5 ml ledeno hladnog 1X pufera za lizu ćelija u svaku ploču (10 cm) te inkubirajte ploče na ledu 5 minuta.
• Sastružite ćelije s ploča i prenesite ih u mikrocentrifugalne epruvete. Držite na ledu.
• Ultrazvučno obradite dvaput po 10 sekundi u ledeno hladnom puferu za imunoprecipitaciju (IP pufer: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 i smjesa inhibitora proteaza). Za ultrazvučnu obradu su VialTweeter ili ultrazvučni sonikator sa sondom, kao što su UP100H ili UP200Ht, najprikladniji.
• Centrifugirajte lizate pri 15.000 g tokom 10 minuta na 4°C.
• Prenesite supernatant u novu epruvetu. (Ako je potrebno, lizat se može čuvati na –80°C.)
• Dodajte primarno antitijelo supernatantu. Supernatant s primarnim antitijelom inkubira se 1 h na 4°C uz lagano miješanje. Primarno antitijelo se obično dodaje u količini koja je 10x koncentriranija od one koja se koristi za western blot. (Možete početi s 1μg na 100μL.)
• Supernatant se zatim dalje inkubira sa smjesom jednakih količina agaroze s proteinom A (Invitrogen) i agaroze s proteinom G još 1 h.
• Isperite agarozne pelete tri puta IP puferom. Nakon toga ekstrahirajte vezane proteine SDS-PAGE puferom za nanošenje zagrijavanjem na 95°C tokom 5 minuta.

C. Imunoprecipitacija

• Uzmite 200 μl ćelijskog lizata i dodajte primarno antitijelo. Inkubirajte uz nježno ljuljanje preko noći na 4°C.
• Dodajte kuglice agaroze s proteinom A ili G (20 μl 50% suspenzije kuglica). Inkubirajte uz nježno ljuljanje 1–3 sata na 4°C.
• Centrifugirajte u mikrocentrifugi 30 sekundi na 4°C. Isperite pelet pet puta sa 500 µl 1X pufera za lizu ćelija. Držite na ledu tokom ispiranja.
• Resuspendirajte pelet u 20 μl 3X SDS pufera za uzorke. Promiješajte na vortexu, zatim centrifugirajte u mikrocentrifugi 30 sekundi.
• Zagrijte uzorak na 95–100°C tokom 2–5 minuta i centrifugirajte u mikrocentrifugi 1 minutu pri 14.000 X g.
• Nanesite uzorak (15–30 μl) na SDS-PAGE gel (12–15%).
• Analizirajte uzorak western blotom.

Analiza western blotom sa sonikatorom UP50H

Sljedeći protokol sa sonikatorom sa sondom UP50H korišten je u studiji Kriebisch et al. (2011):
Ukupni protein izoliran je iz MC3T3-E1 ćelija tretiranih sa 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) ili nosačem (vehikulumom). Ćelije su lizirane puferom koji sadrži 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natrijev dodecil-sulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) i 0,5% natrijev deoksiholat (Merck). Ćelijski lizat je ultrazvučno obrađen 2 × 10 s pri ciklusu 1 i amplitudi 80 pomoću uređaja UP50H Ultrasonic Processor (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Njemačka). Nakon toga materijal je centrifugiran 10 min pri 14.000 o/min, a supernatant je korišten za western blot. Dvadeset pet μg proteina kuhano je u puferu za uzorke i redukcijskom sredstvu (Invitrogen), a zatim razdvojeno SDS-PAGE-om na 4–12% poliakrilamidnim gelovima (Invitrogen) i preneseno na nitroceluloznu membranu (GE health care). Membrana je blokirana 1 h pomoću TBS-a (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) koji sadrži 1% kazeina (Sigma-Aldrich) i 1% Tris-a (1 M). Nakon blokiranja membrana je inkubirana uz blago miješanje preko noći na 4°C s primarnim antitijelom (zečje anti-humano CBS 1/500, razvijeno u laboratoriju prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, SAD). Inkubacija sa sekundarnim antitijelom konjugiranim s peroksidazom hrena (HPR) (Dako) provedena je 1 h na sobnoj temperaturi. Svi blotovi su razvijeni pojačanom hemiluminiscencijom (Perkin Elmer).

Kliknite ovdje da biste saznali više o najboljim praksama za ultrazvučnu lizu i ekstrakciju ćelija, pripremu lizata i preporukama za poboljšanje procesa!

Tabela ispod daje vam orijentaciju o približnom kapacitetu obrade naših ultrazvučnih uređaja laboratorijske veličine:

Literatura / Reference

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.