Ultrazvučna liza za Western blotting

• Western blot je analitički postupak za detekciju specifičnih proteina u uzorku homogenata tkiva ili ekstrakta ćelija.
• Da bi se izvršio Western blot ili da se izmeri aktivnost enzima, mnogi testovi zahtevaju pristup materijalima (npr. proteini, DNK, subćelijski fragmenti) zarobljeni u ćeliji.
• Sonikacija je pouzdana i laka za rukovanje metoda za kontrolirano uništavanje i lizu stanica.

Ultrazvučni poremećaj ćelije

Ekstrakcija proteina iz tkiva i kultiviranih ćelija je prvi korak za mnoge biološke, biohemijske i analitičke tehnike (PAGE, Western blotting, ELISA, masena spektrometrija, itd.) ili prečišćavanje proteina. Da bi se dobio visok prinos proteina, ćelijski materijal i tkivo moraju biti efikasno poremećeni/lizirani. Bilo da se radi o biljnom ili životinjskom tkivu, ultrazvuk je metoda za laku i brzu pripremu vašeg ćelijskog lizata.

Prednosti sonikacije

• Brzo & efikasan
• jednostavan rad
• visok prinos proteina
• reproducibilno/ponovljivo
• precizno kontrolisan
• skalabilan

Immunoprecipitation Protocol for Western Immunoblotting

A. Reagensi

Za pripremu rastvora koristite prečišćenu vodu kao što je Milli-Q.

• 1X fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom (PBS)
• 1X pufer za lizu ćelija: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natrijum pirofosfat, 1 mM β/glicer 1 mM β/glicer 1 mM ml Leupeptin
  Važno: Dodajte 1 mM PMSF neposredno prije upotrebe.
• 15 μl Proteina A+15 μl Proteina G je dovoljno za IP, ali to može ovisiti o vašem primarnom antitelu i zapremini uzorka. Također možete koristiti prethodno pomiješanu proteinsku A/G agarozu (npr. Protein A za zečji IgG pull down i Protein G za mišji IgG pull down)
• 3X SDS pufer za uzorke: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 na 25°C), 6% w/v SDS, 30% glicerol, 150 mM DTT, 0,03% w/v bromofenol plavo

B. Priprema ćelijskih lizata

• Sakupite ćelije. Da biste sakupili ćelije u uslovima bez denaturacije, uklonite medij i jednom isperite ćelije ledeno hladnim PBS.
• Uklonite PBS i dodajte 0,5 ml ledeno hladnog 1X pufera za lizu ćelija u svaku ploču (10 cm) i inkubirajte ploče na ledu 5 minuta.
• Sastružite ćelije sa ploča i prebacite ih u epruvete za mikrocentrifugu. Držite se na ledu.
• Sonicirajte dvaput po 10 sekundi u ledeno hladnom puferu za imunoprecipitaciju (IP pufer: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 i mješavina inhibitora proteaze). Za sonikaciju, VialTweeter ili ultrasonikator sonde kao što je UP100H ili UP200Ht su najpogodniji.
• Centrifugirajte lizate na 15.000 g 10 minuta na 4°C.
• Prebacite supernatant u novu epruvetu. (Ako je potrebno, lizat se može čuvati na –80°C.)
• Dodajte primarno antitijelo u supernatant. Supernatant sa primarnim antitijelom se inkubira 1 h na 4°C uz lagano miješanje. Primarno antitijelo se obično dodaje u količini 10 puta većoj od one koja se koristi za western bloting. (Možete početi sa 1μg na 100μL.)
• Supernatant se zatim dalje inkubira sa mješavinom jednakih količina Protein A-agaroze (Invitrogen) i Protein G agaroze još 1 h.
• Operite pelete agaroze tri puta sa IP puferom. Nakon toga, ekstrahirajte vezane proteine sa SDS-PAGE puferom za punjenje zagrijavanjem na 95°C 5 minuta.

C. Imunoprecipitacija

• Uzmite 200 μl ćelijskog lizata i dodajte primarno antitijelo. Inkubirajte uz lagano ljuljanje preko noći na 4°C.
• Dodajte kuglice proteina A ili G agaroze (20 μl 50% kaše zrna). Inkubirajte uz lagano ljuljanje 1-3 sata na 4°C.
• Mikrocentrifugirajte 30 sekundi na 4°C. Operite pelet pet puta sa 500 µl 1X pufera za lizu ćelija. Držite na ledu tokom pranja.
• Resuspendirajte pelet sa 20 μl 3X SDS pufera za uzorke. Vortex, zatim mikrocentrifugirajte 30 sekundi.
• Zagrijte uzorak na 95-100°C 2-5 minuta i mikrocentrifugirajte 1 minut na 14.000 X g.
• Stavite uzorak (15–30 μl) na SDS-PAGE gel (12–15%).
• Analizirajte uzorak Western blottingom.

Western blot analiza sa Sonicatorom UP50H

U studiji Kriebisch et al. (2011):
Ukupni protein je izolovan iz ćelija MC3T3-E1 tretiranih sa 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) ili vozilo. Ćelije su lizirane puferom koji sadrži 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natrijum dodecil sulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) i 0,5% natrijum deoksiholat (Merck). Ćelijski lizat je sonikiran 2 × 10 s u ciklusu 1 i amplitudom 80 sa Ultrazvučni procesor UP50H (Hielscher, Ultrazvučna tehnologija, Teltow, Njemačka). Nakon toga je materijal centrifugiran 10 minuta na 14.000 rpm i supernatant je korišten za Western blot. Dvadeset pet μg proteina je prokuvano u puferu za uzorke i redukcionom sredstvu (Invitrogen) i potom odvojeno SDS-PAGE upotrebom 4-12% poliakrilamidnih gelova (Invitrogen) i prebačeno na nitroceluloznu membranu (GE health care). Membrana je blokirana 1 h sa TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) koji sadrži 1% kazeina (Sigma-Aldrich) i 1% Tris (1 M). Nakon blokiranja, membrana je inkubirana uz lagano mešanje preko noći na 4°C sa primarnim antitelom (zečji anti-humani CBS 1/500, razvijen u laboratoriji prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, SAD). Inkubacija sa sekundarnim antitijelom konjugiranim s peroksidazom hrena (HPR) (Dako) je izvedena 1 h na sobnoj temperaturi. Sve mrlje su razvijene poboljšanom hemiluminiscencijom (Perkin Elmer).
 

Kliknite ovdje da pročitate više o najboljim praksama za ultrazvučnu lizu i ekstrakciju ćelija, pripremu lizata i preporuke za poboljšanja procesa!
 
Tabela u nastavku daje vam indikaciju približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih aparata veličine laboratorija:

Literatura / Reference