Hajelscher ultrazvuk tehnologije

Ultrazvučni Lizis za zapadni Blotting

  • Zapadnom blot je analitički postupak za detekciju specifičnih proteina u uzorku homogenata tkiva ili ekstrakt ćelije.
  • Da biste pokrenuli Western blot ili za mjerenje aktivnosti enzima, mnogi testovi zahtijevaju pristup materijalima (npr proteini, DNA, subćelijskih fragmenti) zarobljeni u ćeliji.
  • Sonication je pouzdan i jednostavan za rukovanje metoda za kontrolisano poremećaja ćelija i lize.

Ultrazvučni Cell Prekid

ekstrakciju proteina iz tkiva i kulturan ćelija je prvi korak za mnoge biološke, biohemijske i analitičke tehnike (PAGE, Western blotting, ELISA, masene spektrometrije, itd) ili pročišćavanje proteina. Da biste dobili visok prinos proteina, materijal ćelija i tkiva moraju biti efikasno prekinut / lysed. Da li biljka ćeliju ili životinjsko tkivo, sonication je metoda za pripremu vaš mobilni lizat lako i brzo.

Prednosti sonication

  • brzo & efikasan
  • jednostavan rad
  • visok prinos proteina
  • ponovljive / ponovljive
  • precizno kontroliranom
  • skalabilan

Imuniprecipitaciona Protokol za zapadni imunoblottingu

A. Reagensi

Za pripremu rješenja, koristite pročišćena voda, kao što su Milli-Q.

  • 1X fosfata Buffered Saline (PBS)
  • 1X Cell Lizis Buffer: 20 mm Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM natrijev pirofosfat, 1 mM β-glicerofosfat, 1 mM Na3VO4, 1 g / ml Leupeptin
    Važno: Dodajte 1 mM PMSF neposredno prije upotrebe.
  • 15 μl Protein A + 15 μl Protein G je dovoljna za IP, ali to može ovisiti o svojoj primarnoj volumena antitijela i uzorak. Također možete koristiti gotov protein A / G agaroznom (npr Protein A za zec IgG sruši i Protein G za miš IgG padajućeg)
  • 3X SDS Sample Buffer: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 na 25 ° C), 6% w / v SDS-a, 30% glicerol, 150 mm DTT, 0.03% w / v bromfenol plava
Hielscher's VialTweeter is is´deal for the lysis of multiple samples

VialTweeter za ultrazvučno uzorak prep

Kontaktiraj nas! / Pitajte nas!





Molim vas, obratite se našem Politika privatnosti.


Sonication je važan korak u toku pripreme uzorka

UP200St sa mikro-vrhom za uzorak sonication

B. Priprema Cell lizatima

  • Žetve ćelije. Do žetve ćelije pod nondenaturing uvjetima, izvadite medije i isperite ćelije jednom sa ledenom PBS.
  • Uklonite PBS i dodajte 0,5 ml ledene 1X ćelije lizu tampon svakom ploča (10 cm) i inkubirajte ploče na ledu za 5 minuta.
  • Sastrugati ćelije sa ploča i prebaciti na Microcentrifuge cijevi. Držati na ledu.
  • Sonikacija dva puta za 10 sekundi u ledenom Imuniprecipitaciona buffer (IP tampon: 50 mm Tris-HCl [pH 7,4], 150 mm NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 i inhibitora proteaze mix). Za sonication je VialTweeter ili sonde ultrasonicator kao što je UP100H ili Uf200 ः t su najpogodnije.
  • Centrifugiranje lizatima na 15000 g 10 minuta na 4 ° C.
  • Prenesite supernatant na novu cijev. (Ako je potrebno, lizat se može čuvati na -80 ° C.)
  • Dodaj primarni antitela supernatant. Supernatant sa primarnim antitijela se inkubira za 1 h na 4 ° C pod svjetlo agitacija. Primarni antitijela se obično dodaje u iznosu 10x koncentriraniji nego se koristi za zapadne upijajući. (Možda početi sa 1μg po 100μL.)
  • Supernatant se zatim inkubira dalje sa mješavinom jednakih količina Protein A-agaroznom (Invitrogen) i protein G agaroznom za još 1 h.
  • Operite agaroznom peleta tri puta s IP tampon. Nakon toga, izvući vezan proteina sa SDS-PAGE pufera od grijanja na 95 ° C u trajanju od 5 minuta.

C. Imunoprecipitacija

  • Uzmite 200 μl ćelija lizat i dodajte primarna antitijela. Inkubirati nježnim ljuljanje preko noći na 4 ° C.
  • Dodaj ili proteina A ili G agaroznom kuglice (20 μl 50% perla rastvoru). Inkubirati nježnim ljuljanje za 1-3 sata na 4 ° C.
  • Microcentrifuge za 30 sekundi na 4 ° C. Pranje pelet pet puta sa 500 μl od 1X ćelije pufera za lizu. Držati na ledu tijekom pranja.
  • Resuspendirajte talog s 20 μl 3X SDS uzorka tampon. Vortex, a zatim Microcentrifuge za 30 sekundi.
  • Zagrijte uzorak 95-100 ° C za 2-5 minuta i Microcentrifuge za 1 minutu na 14.000 X g.
  • Stavite uzorak (15-30 μl) na SDS-PAGE gel (12-15%).
  • Analizirati uzorak zapadne upijajući.

Kontaktirajte nas / Pitajte za više informacija

Razgovarajte s nama o vašim potrebama za obradu. Mi ćemo preporučiti najpogodniji za podešavanje i obrade parametara za svoj projekt.





Molim vas, obratite se našem Politika privatnosti.


Više sonication protokola

Western blot analiza s ultrasonicator UP50H

Slijedeći protokol je korišten u studiji Kriebisch et al. (2011):
Ukupnih proteina je izoliran od MC3T3-E1 ćelije tretirane 1,25 (OH)2D3 (10-8 M) ili vozila. Ćelije su lysed sa tampon sadrži 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mm NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natrij dodecil sulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) i 0,5% natrij deoxycholate (Merck). Je lizat ćelija je sonicated za 2 × 10 s pri ciklusu 1 i amplitude 80 s UP50H Ultrazvučni procesor (Hielscher, Ultrazvučna tehnologija, Teltow, Nemačka). Nakon toga se materijal centrifugirao 10 min na 14.000 obrtaja u minuti, a supernatant je korišćen za zapaljivanje. Dvadeset pet μg proteina je kuvano u puferu za uzorke i redukujućeg sredstva (Invitrogen), a zatim se odvaja SDS-PAGE pomoću 4-12% poliakrilamidnih gela (Invitrogen) i prenijeti na nitroceluloznu membranu (GE zdravstvena zaštita). Membrana je blokirana 1 sat sa TBS (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl) koji sadrži 1% kazeina (Sigma-Aldrich) i 1% Tris (1 M). Nakon blokiranja, membrana je inkubirana uz blago mešanje preko noći na 4 ° C sa primarnim antitelom (zec anti-human CBS 1/500, razvijen u laboratoriji prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). Inkubacija sa sekundarnim antitelom (Dako) konjugiranog peroksidaze (HPR) izvedena je tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Svi blotovi su razvijeni poboljšanim hemiluminiscencijom (Perkin Elmer).

Literatura / Reference



O Western Blotting

Mrlje su analitičke procedure na kojoj DNK, RNK i proteina se prenose na nosač tako da se mogu odvojiti.
The Southern blot se koristi za detekciju DNK, Northern blot za RNK i Western blot za proteine.
Zapadne upijajući se naziva proteina imunoblottingu jer antitijela se koriste za konkretno otkriti svoj antigen. Zapadni Blotting je jedan od najvažnijih metoda analize za detekciju specifičnih proteina u uzorku. U Western blot, proteini su imobilizovan na membrane da ih otkriti pomoću monoklonskih ili poliklonskih antitijela.
SDS-poliakrilamidnim gel elektroforezom (SDS-PAGE) prirodni proteini su odvojeni sa 3-D strukturom ili denaturiranim proteinama prema dužini polipeptida. Proteini se zatim prenose na membranu (obično nitroceluloza ili PVDF), gde su obojeni antitelima specifičnim za ciljni protein. Korak elektroforeze gela uključen je u analizu zapaljenog blata kako bi se riješilo pitanje unakrsne reaktivnosti antitela.
Nakon toga, odvojeni proteini se blotriju na matricu (uglavnom na nitrocelulozu ili PVDF membranu), gde su obojeni antitelima. Antitela funkcionišu kao sonda i odabrana su specifično za ciljni protein. Analiza lokacije i intenziteta specifične reakcije otkriva detalje ekspresije ciljanih proteina u datom uzorku. Zapadno blotovanje može otkriti ciljne proteine ​​koji su niži kao 1ng zbog visoke rezolucije gelske elektroforeze i jake specifičnosti i visoke osetljivosti imunoassaya. Metoda Western blot se koristi u molekularnoj biologiji, biohemiji, imunogenetici i drugim molekularnim istraživačkim poljima.
Ostale srodne tehnike uključuju dot analizu blot, imunohistokemijski i imunocitohemiju u kojima se koriste antitijela za detekciju proteina u tkiva i ćelija immunostaining, i imunoenzimske test (ELISA).