Ultrazvučni Lizis za zapadni Blotting

• Zapadnom blot je analitički postupak za detekciju specifičnih proteina u uzorku homogenata tkiva ili ekstrakt ćelije.
• Da biste pokrenuli Western blot ili za mjerenje aktivnosti enzima, mnogi testovi zahtijevaju pristup materijalima (npr proteini, DNA, subćelijskih fragmenti) zarobljeni u ćeliji.
• Sonication je pouzdan i jednostavan za rukovanje metoda za kontrolisano poremećaja ćelija i lize.

Ultrazvučni Cell Prekid

ekstrakciju proteina iz tkiva i kulturan ćelija je prvi korak za mnoge biološke, biohemijske i analitičke tehnike (PAGE, Western blotting, ELISA, masene spektrometrije, itd) ili pročišćavanje proteina. Da biste dobili visok prinos proteina, materijal ćelija i tkiva moraju biti efikasno prekinut / lysed. Da li biljka ćeliju ili životinjsko tkivo, sonication je metoda za pripremu vaš mobilni lizat lako i brzo.

Prednosti sonication

• brzo & efikasan
• jednostavan rad
• visok prinos proteina
• ponovljive / ponovljive
• precizno kontroliranom
• skalabilan

Imuniprecipitaciona Protokol za zapadni imunoblottingu

A. Reagensi

Za pripremu rješenja, koristite pročišćena voda, kao što su Milli-Q.

• 1X fosfata Buffered Saline (PBS)
• 1X Cell Lizis Buffer: 20 mm Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM natrijev pirofosfat, 1 mM β-glicerofosfat, 1 mM Na3VO4, 1 g / ml Leupeptin
  Važno: Dodajte 1 mM PMSF neposredno prije upotrebe.
• 15 μl Protein A + 15 μl Protein G je dovoljna za IP, ali to može ovisiti o svojoj primarnoj volumena antitijela i uzorak. Također možete koristiti gotov protein A / G agaroznom (npr Protein A za zec IgG sruši i Protein G za miš IgG padajućeg)
• 3X SDS Sample Buffer: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 na 25 ° C), 6% w / v SDS-a, 30% glicerol, 150 mm DTT, 0.03% w / v bromfenol plava

B. Priprema Cell lizatima

• Žetve ćelije. Do žetve ćelije pod nondenaturing uvjetima, izvadite medije i isperite ćelije jednom sa ledenom PBS.
• Uklonite PBS i dodajte 0,5 ml ledene 1X ćelije lizu tampon svakom ploča (10 cm) i inkubirajte ploče na ledu za 5 minuta.
• Sastrugati ćelije sa ploča i prebaciti na Microcentrifuge cijevi. Držati na ledu.
• Sonikacija dva puta za 10 sekundi u ledenom Imuniprecipitaciona buffer (IP tampon: 50 mm Tris-HCl [pH 7,4], 150 mm NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 i inhibitora proteaze mix). Za sonication je VialTweeter ili sonde ultrasonicator kao što je UP100H ili Uf200 ः t su najpogodnije.
• Centrifugiranje lizatima na 15000 g 10 minuta na 4 ° C.
• Prenesite supernatant na novu cijev. (Ako je potrebno, lizat se može čuvati na -80 ° C.)
• Dodaj primarni antitela supernatant. Supernatant sa primarnim antitijela se inkubira za 1 h na 4 ° C pod svjetlo agitacija. Primarni antitijela se obično dodaje u iznosu 10x koncentriraniji nego se koristi za zapadne upijajući. (Možda početi sa 1μg po 100μL.)
• Supernatant se zatim inkubira dalje sa mješavinom jednakih količina Protein A-agaroznom (Invitrogen) i protein G agaroznom za još 1 h.
• Operite agaroznom peleta tri puta s IP tampon. Nakon toga, izvući vezan proteina sa SDS-PAGE pufera od grijanja na 95 ° C u trajanju od 5 minuta.

C. Imunoprecipitacija

• Uzmite 200 μl ćelija lizat i dodajte primarna antitijela. Inkubirati nježnim ljuljanje preko noći na 4 ° C.
• Dodaj ili proteina A ili G agaroznom kuglice (20 μl 50% perla rastvoru). Inkubirati nježnim ljuljanje za 1-3 sata na 4 ° C.
• Microcentrifuge za 30 sekundi na 4 ° C. Pranje pelet pet puta sa 500 μl od 1X ćelije pufera za lizu. Držati na ledu tijekom pranja.
• Resuspendirajte talog s 20 μl 3X SDS uzorka tampon. Vortex, a zatim Microcentrifuge za 30 sekundi.
• Zagrijte uzorak 95-100 ° C za 2-5 minuta i Microcentrifuge za 1 minutu na 14.000 X g.
• Stavite uzorak (15-30 μl) na SDS-PAGE gel (12-15%).
• Analizirati uzorak zapadne upijajući.

Western blot analiza s ultrasonicator UP50H

Slijedeći protokol je korišten u studiji Kriebisch et al. (2011):
Ukupnih proteina je izoliran od MC3T3-E1 ćelije tretirane 1,25 (OH)₂D₃ (10^-8 M) ili vozila. Ćelije su lysed sa tampon sadrži 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mm NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natrij dodecil sulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) i 0,5% natrij deoxycholate (Merck). Je lizat ćelija je sonicated za 2 × 10 s pri ciklusu 1 i amplitude 80 s UP50H Ultrazvučni procesor (Hielscher, Ultrazvučna tehnologija, Teltow, Nemačka). Nakon toga se materijal centrifugirao 10 min na 14.000 obrtaja u minuti, a supernatant je korišćen za zapaljivanje. Dvadeset pet μg proteina je kuvano u puferu za uzorke i redukujućeg sredstva (Invitrogen), a zatim se odvaja SDS-PAGE pomoću 4-12% poliakrilamidnih gela (Invitrogen) i prenijeti na nitroceluloznu membranu (GE zdravstvena zaštita). Membrana je blokirana 1 sat sa TBS (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl) koji sadrži 1% kazeina (Sigma-Aldrich) i 1% Tris (1 M). Nakon blokiranja, membrana je inkubirana uz blago mešanje preko noći na 4 ° C sa primarnim antitelom (zec anti-human CBS 1/500, razvijen u laboratoriji prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). Inkubacija sa sekundarnim antitelom (Dako) konjugiranog peroksidaze (HPR) izvedena je tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Svi blotovi su razvijeni poboljšanim hemiluminiscencijom (Perkin Elmer).

Književnost/reference