Ultrazvučna liza za Western blotting
- Western blot je analitički postupak za detekciju specifičnih proteina u uzorku homogenata tkiva ili ekstrakta ćelija.
- Da bi se izvršio Western blot ili da se izmeri aktivnost enzima, mnogi testovi zahtevaju pristup materijalima (npr. proteini, DNK, subćelijski fragmenti) zarobljeni u ćeliji.
- Sonikacija je pouzdana i laka za rukovanje metoda za kontrolirano uništavanje i lizu stanica.
Ultrazvučni poremećaj ćelije
Ekstrakcija proteina iz tkiva i kultiviranih ćelija je prvi korak za mnoge biološke, biohemijske i analitičke tehnike (PAGE, Western blotting, ELISA, masena spektrometrija, itd.) ili prečišćavanje proteina. Da bi se dobio visok prinos proteina, ćelijski materijal i tkivo moraju biti efikasno poremećeni/lizirani. Bilo da se radi o biljnom ili životinjskom tkivu, ultrazvuk je metoda za laku i brzu pripremu vašeg ćelijskog lizata.
Prednosti sonikacije
- Brzo & efikasan
- jednostavan rad
- visok prinos proteina
- reproducibilno/ponovljivo
- precizno kontrolisan
- skalabilan

VialTweeter Sonicator za ultrazvučnu pripremu uzoraka kao što je razbijanje ćelija i izolacija proteina
Immunoprecipitation Protocol for Western Immunoblotting
A. Reagensi
Za pripremu rastvora koristite prečišćenu vodu kao što je Milli-Q.
- 1X fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom (PBS)
- 1X pufer za lizu ćelija: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natrijum pirofosfat, 1 mM β/glicer 1 mM β/glicer 1 mM ml Leupeptin
Važno: Dodajte 1 mM PMSF neposredno prije upotrebe. - 15 μl Proteina A+15 μl Proteina G je dovoljno za IP, ali to može ovisiti o vašem primarnom antitelu i zapremini uzorka. Također možete koristiti prethodno pomiješanu proteinsku A/G agarozu (npr. Protein A za zečji IgG pull down i Protein G za mišji IgG pull down)
- 3X SDS pufer za uzorke: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 na 25°C), 6% w/v SDS, 30% glicerol, 150 mM DTT, 0,03% w/v bromofenol plavo
B. Priprema ćelijskih lizata
- Sakupite ćelije. Da biste sakupili ćelije u uslovima bez denaturacije, uklonite medij i jednom isperite ćelije ledeno hladnim PBS.
- Uklonite PBS i dodajte 0,5 ml ledeno hladnog 1X pufera za lizu ćelija u svaku ploču (10 cm) i inkubirajte ploče na ledu 5 minuta.
- Sastružite ćelije sa ploča i prebacite ih u epruvete za mikrocentrifugu. Držite se na ledu.
- Sonicirajte dvaput po 10 sekundi u ledeno hladnom puferu za imunoprecipitaciju (IP pufer: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 i mješavina inhibitora proteaze). Za sonikaciju, VialTweeter ili ultrasonikator sonde kao što je UP100H ili UP200Ht su najpogodniji.
- Centrifugirajte lizate na 15.000 g 10 minuta na 4°C.
- Prebacite supernatant u novu epruvetu. (Ako je potrebno, lizat se može čuvati na –80°C.)
- Dodajte primarno antitijelo u supernatant. Supernatant sa primarnim antitijelom se inkubira 1 h na 4°C uz lagano miješanje. Primarno antitijelo se obično dodaje u količini 10 puta većoj od one koja se koristi za western bloting. (Možete početi sa 1μg na 100μL.)
- Supernatant se zatim dalje inkubira sa mješavinom jednakih količina Protein A-agaroze (Invitrogen) i Protein G agaroze još 1 h.
- Operite pelete agaroze tri puta sa IP puferom. Nakon toga, ekstrahirajte vezane proteine sa SDS-PAGE puferom za punjenje zagrijavanjem na 95°C 5 minuta.
C. Imunoprecipitacija
- Uzmite 200 μl ćelijskog lizata i dodajte primarno antitijelo. Inkubirajte uz lagano ljuljanje preko noći na 4°C.
- Dodajte kuglice proteina A ili G agaroze (20 μl 50% kaše zrna). Inkubirajte uz lagano ljuljanje 1-3 sata na 4°C.
- Mikrocentrifugirajte 30 sekundi na 4°C. Operite pelet pet puta sa 500 µl 1X pufera za lizu ćelija. Držite na ledu tokom pranja.
- Resuspendirajte pelet sa 20 μl 3X SDS pufera za uzorke. Vortex, zatim mikrocentrifugirajte 30 sekundi.
- Zagrijte uzorak na 95-100°C 2-5 minuta i mikrocentrifugirajte 1 minut na 14.000 X g.
- Stavite uzorak (15–30 μl) na SDS-PAGE gel (12–15%).
- Analizirajte uzorak Western blottingom.
Western blot analiza sa Sonicatorom UP50H
U studiji Kriebisch et al. (2011):
Ukupni protein je izolovan iz ćelija MC3T3-E1 tretiranih sa 1,25(OH)2D3 (10−8 M) ili vozilo. Ćelije su lizirane puferom koji sadrži 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natrijum dodecil sulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) i 0,5% natrijum deoksiholat (Merck). Ćelijski lizat je sonikiran 2 × 10 s u ciklusu 1 i amplitudom 80 sa Ultrazvučni procesor UP50H (Hielscher, Ultrazvučna tehnologija, Teltow, Njemačka). Nakon toga je materijal centrifugiran 10 minuta na 14.000 rpm i supernatant je korišten za Western blot. Dvadeset pet μg proteina je prokuvano u puferu za uzorke i redukcionom sredstvu (Invitrogen) i potom odvojeno SDS-PAGE upotrebom 4-12% poliakrilamidnih gelova (Invitrogen) i prebačeno na nitroceluloznu membranu (GE health care). Membrana je blokirana 1 h sa TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) koji sadrži 1% kazeina (Sigma-Aldrich) i 1% Tris (1 M). Nakon blokiranja, membrana je inkubirana uz lagano mešanje preko noći na 4°C sa primarnim antitelom (zečji anti-humani CBS 1/500, razvijen u laboratoriji prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, SAD). Inkubacija sa sekundarnim antitijelom konjugiranim s peroksidazom hrena (HPR) (Dako) je izvedena 1 h na sobnoj temperaturi. Sve mrlje su razvijene poboljšanom hemiluminiscencijom (Perkin Elmer).
Kliknite ovdje da pročitate više o najboljim praksama za ultrazvučnu lizu i ekstrakciju ćelija, pripremu lizata i preporuke za poboljšanja procesa!
Tabela u nastavku daje vam indikaciju približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih aparata veličine laboratorija:
Preporučeni uređaji | Batch Volume | Flow Rate |
---|---|---|
UIP400MTP 96-bunarski sonikator za ploče | mikrotitarske ploče sa više jažica | N / A |
Ultrazvučni kuphorn | CupHorn za bočice ili čašu | N / A |
GDmini2 | ultrazvučni mikroprotočni reaktor | N / A |
VialTweeter | 0.5 do 1.5 mL | N / A |
UP100H | 1 do 500 ml | 10 do 200 ml/min |
UP200Ht, UP200St | 10 do 1000 ml | 20 do 200 ml/min |
UP400St | 10 do 2000 ml | 20 do 400 ml/min |
Ultrazvučni sita Shaker | N / A | N / A |
Kontaktiraj nas! / Pitajte nas!

UIP400MTP Sonicator ploča za ultrazvučnu obradu ploča sa 96 jažica visoke propusnosti
O Western Blottingu
Blotovi su analitičke procedure u kojima se DNK, RNK i proteini prenose na nosač tako da se mogu razdvojiti.
Southern blot se koristi za detekciju DNK, Northern blot za RNK i Western blot za proteine.
Western blotting se također naziva proteinski imunobloting jer se antitijelo koristi za specifično otkrivanje njegovog antigena. Western blotting je jedna od najvažnijih metoda analize za otkrivanje specifičnih proteina u uzorku. U Western blot-u, proteini se imobiliziraju na membranama kako bi se otkrili pomoću monoklonskih ili poliklonskih antitijela.
Elektroforezom u SDS-poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE) nativni proteini se odvajaju 3-D strukturom ili denaturirani proteini po dužini polipeptida. Proteini se zatim prenose na membranu (obično nitrocelulozu ili PVDF), gdje su obojeni antitijelima specifičnim za ciljni protein. Korak gel elektroforeze uključen je u Western blot analizu kako bi se riješilo pitanje unakrsne reaktivnosti antitijela.
Nakon toga, odvojeni proteini se upijaju na matriks (uglavnom na nitroceluloznu ili PVDF membranu), gdje se boje antitijelima. Antitijela funkcionišu kao sonda i odabrana su specifično za ciljni protein. Analiza lokacije i intenziteta specifične reakcije otkriva detalje ekspresije ciljnih proteina u datom uzorku. Western blotting može otkriti ciljni protein koji je samo 1 ng zbog visoke rezolucije gel elektroforeze i jake specifičnosti i visoke osjetljivosti imunološkog testa. Western blot metoda se koristi u molekularnoj biologiji, biohemiji, imunogenetici i drugim poljima molekularnog istraživanja.
Ostale srodne tehnike uključuju dot blot analizu, imunohistohemiju i imunocitohemiju gdje se antitijela koriste za otkrivanje proteina u tkivima i stanicama imunološkim bojenjem i enzimski imunosorbentni test (ELISA).
Literatura / Reference
- Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
- Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
- Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.

VialTweeter Sonicator za istovremenu pripremu uzorka više bočica