Ultrazvučna ekstrakcija proteina iz tkiva i ćelijskih kultura
- Ekstrakcija proteina je ključni korak pripreme uzoraka u proteomici.
- Proteini se mogu ekstrahirati iz biljnog i životinjskog tkiva, kvasaca i mikroorganizama.
- Ultrazvučna obrada (sonikacija) je pouzdana, efikasna metoda ekstrakcije proteina koja daje visoke prinose proteina u kratkom vremenu ekstrakcije.
Ekstrakcija proteina iz tkiva i ćelija
Ekstrakcija proteina iz tkiva i kultiviranih ćelija ključni je korak pripreme uzoraka koji se provodi tokom mnogih biohemijskih i analitičkih tehnika, kao što su ELISA, PAGE, western blotting, masena spektrometrija ili prečišćavanje proteina. Ultrazvučna razgradnja ćelija, liza i ekstrakcija precizno su kontrolirana, netermička tehnika kojom se osiguravaju visoki prinosi proteina.
Ekstrakcija proteina iz ćelija pomoću ultrazvučne sonde UP200St
- Brzo
- Visoki prinosi
- Visoka efikasnost
- Precizna kontrola parametara
- Ponovljivi rezultati
- Linearna skalabilnost
Opće upute za ultrazvučnu lizu i ekstrakciju proteina
- Kontrola temperature: Da bi se osigurao visok prinos proteina bez termičke denaturacije, temperatura tokom ekstrakcije mora biti kontrolirana. Najsavremeniji ultrazvučni homogenizatori kompanije Hielscher – koji se nazivaju i ultrazvučni dezintegrator ili ultrasonifier – mogu se precizno kontrolirati. Opremljeni su priključivim temperaturnim senzorom. U postavkama ultrazvučnog homogenizatora može se podesiti maksimalna temperatura. Kada se ta maksimalna temperatura dostigne, ultrazvučni uređaj se automatski zaustavlja dok se uzorak ne ohladi.
- Pufer: Izbor odgovarajućeg pufera i odgovarajuće količine pufera razlikuje se od tkiva do tkiva i mora se utvrditi ispitivanjem metodom pokušaja i pogreške.
- Izolacija / prečišćavanje: Proteinski lizati mogu sadržavati višak biomolekula kao što su DNK ili ugljikohidrati, koji se mogu ukloniti precipitacijom proteina (deoksiholat-trihloroctena kiselina) ili zamjenom pufera.
Chittapalo i Noomhorm (2009) u svojoj su studiji izvijestili da se prinos proteina povećao primjenom ultrazvučne obrade (sonikacije) te da proces ultrazvučne homogenizacije i lize tkiva može značajno poboljšati postojeće procese ekstrakcije – što otvara nove komercijalne mogućnosti ekstrakcije.
Ultrazvučni CupHorn za istovremenu, vrlo efikasnu pripremu više uzoraka pod istim uvjetima radi izolacije proteina i fragmentacije DNK.
Ekstrakcija proteina iz životinjskog tkiva
Za pripremu tkiva u cjelini (npr. bubreg, srce, pluća, mišić itd.), tkivo treba izrezati na vrlo sitne komade čistim alatom, po mogućnosti na ledu i što je brže moguće, kako bi se spriječila razgradnja proteazama (npr. lizirajući pufer kao što je RIPA ili hipotonični lizirajući pufer koji sadrži koktel inhibitora proteaza i fosfataza). Nakon rezanja uzorak se uranja u tekući dušik radi brzog zamrzavanja. Uzorak se može pohraniti na -80°C za kasniju upotrebu ili držati na ledu za trenutnu homogenizaciju. Neposredno prije ultrazvučne ekstrakcije u epruvetu s uzorkom se brzo dodaje ledeno hladan lizirajući pufer (s inhibitorima proteaza DTT, leupeptin i aprotinin) (preporučuje se približno ~600 μL pufera na ~10 mg tkiva). Preporučuje se približno 20-60mg tkiva po epruveti za uzorak.
Ultrazvučna homogenizacija, liza i ekstrakcija provode se ultrazvučnim homogenizatorom kao što je UP100H ili UP200Ht, opremljenim mikrovrhom sonotrode. Trajanje ultrazvučne obrade je 60-90 s pri ultrazvučnom ciklusu od 15 s sonikacije i 10 s mirovanja. Uzorak se cijelo vrijeme treba držati na ledu.
Nakon ultrazvučne homogenizacije / ekstrakcije lizat se centrifugira pri 27.000g približno 20 min. Nakon toga se skuplja supernatant kako bi se koncentracija proteina mogla odrediti testom proteina, kao što je Pierce test proteina BCA.
Ekstrakcija proteina iz krvnog seruma
Radi homogene smjese seruma i fosfatnog pufera uzorak se prije ultrazvučne lize ćelija najprije vorteksira. Za ultrazvučnu lizu uzorak se ultrazvučno obrađuje ultrazvučnim laboratorijskim homogenizatorom kao što je UP100H u 8 ciklusa pri amplitudi od 20%, pri čemu svaki ciklus traje 5 sekundi uključeno i 15 sekundi isključeno. Ekstrakcija proteina provodi se ultrazvučnom obradom u ciklusima (pulsni način rada) i postavljanjem uzorka na led kako bi se izbjeglo pregrijavanje i termička razgradnja uzorka. Budući da serum sadrži veliku količinu proteina velike molekulske mase (kao što su albumin, α1-antitripsin, transferin, haptoglobulin, imunoglobulin G i imunoglobulin A), koji ometaju odvajanje proteina male molekulske mase tokom IEF-a, preporučuje se ukloniti ih iz seruma pomoću kolone za depleciju.
Ekstrakcija proteina iz biljnog tkiva
Svježe, meko biljno tkivo, npr. mahovina itd., može se lako razgraditi jednostavnim stavljanjem usitnjenog materijala uzorka u lizirajući pufer radi ultrazvučne obrade. Žilavo, drvenasto biljno tkivo, kao što su sjemenke, iglice jele itd., treba samljeti suho. Neki tvrdi, drvenasti biljni materijali moraju se prije ekstrakcije ultrazvukom smrznuti i samljeti u tekućem dušiku. Za suspenzije biljnih ćelijskih kultura obično je dovoljna ultrazvučna obrada u lizirajućem puferu u trajanju između 30 i 150 sekundi. Žilaviji materijali, kao što su sjemenke bundeve, zahtijevaju intenzivniju ultrazvučnu obradu, kako je opisano u nastavku.
Protokol za ultrazvučnu ekstrakciju albumina iz sjemenki bundeve
Za ultrazvučnu ekstrakciju proteina albumina iz fino samljevenog praha sjemenki bundeve, 10 g odmašćenog praha sjemenki bundeve i 100 mL deionizirane vode kao otapala dodaju se u čašu od 250mL. Ekstrakcija proteina sastoji se od dva koraka: Prvo se uzorak ultrazvučno obrađuje pomoću ultrazvučnog uređaja sondnog tipa UP400St (400W, 24kHz) opremljenog sonotrodom S24d7. Staklena čaša se tokom ultrazvučne homogenizacije stavlja u hladnu vodenu kupelj. Priključivi temperaturni senzor i postavke kontrole temperature ultrazvučnog uređaja UP400St osiguravaju da se temperatura uzorka uvijek održava ispod 30°C. Preciznom kontrolom temperature tokom ultrazvučne obrade izbjegava se denaturacija albumina. Zatim je ekstrakcija provedena miješalicom pri brzini od 200 rpm i na 30°C. Nakon toga se čaša prenosi u termostatsku tresilicu. Globulin se uklanja dijalizom destiliranom vodom. Nakon uklanjanja globulina proteinski ekstrakt može se uzorkovati radi određivanja profila albumina te se potom podešava na pI=3,0 pomoću 0,1 M HCl radi koagulacije albumina. Čvrsta faza se odvaja centrifugiranjem pri 5000g i 20°C te ponovno otapa u deioniziranoj vodi. Koagulacija albumina provodi se dvaput kako bi se povećao udio proteina u koncentratu albumina.
Ultrazvučna alkalna ekstrakcija proteina za pripremu proteinskog koncentrata iz mekinja riže pokazuje da ultrazvučna obrada daje veći prinos proteina u znatno kraćem vremenu ekstrakcije – u usporedbi s konvencionalnim metodama ekstrakcije.
Protokol pripreme uzoraka za funkcionalni enzim iNOS
Za dobivanje potpuno funkcionalnog enzima iNOS (npr. za probir lijekova) preporučuje se sljedeći protokol: Ćelijsku suspenziju treba staviti na led i ultrazvučno obrađivati uređajem UP100H pri amplitudi od 10µm u ciklusu od 5 s sonikacije i 25 s mirovanja na ledu. Postupak treba ponoviti približno 3 puta. Vrijeme mirovanja između ciklusa sonikacije smanjuje porast temperature i stoga smanjuje rizik od denaturacije.
Ultrazvučna solubilizacija proteina
Ultrazvučna obrada (sonikacija) može ubrzati proces solubilizacije proteina, koji obično traje nekoliko sati. Da se uzorak ne bi pregrijao te kako bi se spriječila razgradnja i modifikacije proteina u otopinama koje sadrže ureu, ultrazvučni impulsi ne bi trebali trajati duže od nekoliko sekundi.
Ultrazvučni uređaj UP200Ht s mikrovrhom S26d2 od 2mm za ultrazvučnu obradu malih uzoraka.
Ultrazvučna oprema za ekstrakciju proteina
Hielscher Ultrasonics nudi široku paletu ultrazvučnih homogenizatora za dezintegraciju ćelija, tkiva, bakterija, mikroorganizama, kvasaca i spora.
Laboratorijski ultrazvučni uređaji kompanije Hielscher snažni su i jednostavni za rukovanje. Izrađeni za rad 24/7, konstruirani su kao robusni i efikasni laboratorijski i stolni uređaji. Na svim uređajima se energetski izlaz i amplituda mogu precizno kontrolirati. Široka paleta pribora otvara dodatne mogućnosti postavki. Digitalni ultrazvučni uređaji kao što su VialTweeter, UP200Ht, UP200St i UP400St imaju integriranu kontrolu temperature i ugrađenu SD karticu za automatsko bilježenje podataka.
Za indirektnu ultrazvučnu obradu više uzoraka istovremeno, bez unakrsne kontaminacije, nudimo VialTweeter ili ultrazvučni CupHorn.
Tabela u nastavku daje pregled naših ultrazvučnih uređaja za pripremu uzoraka, razgradnju ćelija i ekstrakciju. Kliknite na vrstu uređaja da biste dobili više informacija o svakom ultrazvučnom homogenizatoru. Naše dobro obučeno tehničko osoblje s dugogodišnjim iskustvom rado će vam pomoći pri izboru najpogodnijeg ultrazvučnog uređaja za pripremu vaših uzoraka!
| Volumen šarže | Protok | Preporučeni uređaji |
|---|---|---|
| do 10 bočica ili epruveta | n.a. | VialTweeter |
| višejažične / mikrotitarske ploče | n.a. | UIP400MTP |
| više epruveta / posuda | n.a. | CupHorn |
| 1 do 500mL | 10 do 200mL/min | UP100H |
| 10 do 1000mL | 20 do 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 do 2000mL | 20 do 400mL/min | UP400St |
Ovisno o vašoj primjeni, materijalu i volumenu uzorka, preporučit ćemo vam najpogodniju konfiguraciju za pripremu vaših uzoraka. Kontaktirajte nas već danas!
Kontaktirajte nas! / Pitajte nas!
Digitalni ultrazvučni uređaji kompanije Hielscher imaju daljinsko upravljanje putem preglednika i automatsko protokoliranje podataka na integriranoj SD kartici.
VialTweeter za indirektnu ultrazvučnu obradu.
Vrijedno znanja
Proteomika
Proteomika je istraživačko područje koje proučava proteine i proteom. Proteini obavljaju široku paletu vitalnih funkcija unutar organizama. Proteom je cjelokupni skup proteina koje ekprimira genom, ćelija, tkivo ili organizam u određenom trenutku. Proteom se mijenja s vremenom i s različitim zahtjevima ili stresovima kojima je ćelija ili organizam izložen. Preciznije, to je skup eksprimiranih proteina u datoj vrsti ćelije ili organizma, u datom trenutku, pod definiranim uvjetima. Pojam je složenica od riječi proteini i genom. Proteomika je proučavanje proteoma.
Protein
Proteini su velike biomolekule, takozvane makromolekule – koje se sastoje od jednog ili više dugih lanaca aminokiselinskih ostataka. Proteini su prisutni u svim organizmima, kako biljnog tako i životinjskog porijekla, i ključni su za većinu bioloških funkcija. Budući da proteini sadrže mnogo bioloških informacija, ekstrahiraju se u analitičke svrhe, npr. za proteomska istraživanja. Najvažnije funkcije koje obavljaju proteini uključuju katalizu metaboličkih reakcija, replikaciju DNK, odgovor na podražaje i transport molekula s jednog mjesta na drugo. Proteini se međusobno razlikuju prvenstveno po slijedu aminokiselina, koji je određen nukleotidnim slijedom njihovih gena i koji obično rezultira savijanjem proteina u specifičnu trodimenzionalnu strukturu koja određuje njegovu aktivnost. Proteini su – uz peptide – jedna od ključnih komponenti hrane. Stoga je proteomika moćan alat u nauci o hrani za optimizaciju procesa, sigurnost hrane i procjenu nutritivne vrijednosti.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction je preanalitički postupak za odvajanje i predkoncentriranje analita. U kombinaciji s ultrazvukom ekstrakcija točkom zamućenja može se intenzivirati, čime proces postaje efikasniji, brži i ekološki prihvatljiviji. Uz ultrazvuk je ekstrakcija točkom zamućenja znatno efikasnija metoda pripreme analita. Saznajte više o ultrazvučno potpomognutoj ekstrakciji točkom zamućenja!
Gel elektroforeza
Gel elektroforeza je glavna metoda za odvajanje i analizu makromolekula kao što su DNK, RNK i proteini, kao i njihovih fragmenata, na osnovu njihove veličine i naboja. Koristi se u kliničkoj hemiji za odvajanje proteina prema naboju i/ili veličini (IEF agaroza, u osnovi neovisno o veličini) te u biohemiji, molekularnoj biologiji i proteomici za odvajanje miješane populacije fragmenata DNK i RNK prema dužini, za procjenu veličine fragmenata DNK i RNK ili za odvajanje proteina prema naboju.
Ćelijske kulture
Ćelijska kultura je kontrolirani proces uzgoja u kojem se ćelije kultiviraju pod kontroliranim uvjetima. Uvjeti ćelijske kulture razlikuju se za svaku vrstu ćelija. Općenito, okruženje ćelijske kulture sastoji se od odgovarajuće posude (npr. Petrijeva zdjelica) sa supstratom ili medijem koji opskrbljuje esencijalnim hranjivim tvarima (aminokiseline, ugljikohidrati, vitamini, minerali), faktorima rasta, hormonima i plinovima (CO2, O2), te regulira fizikalno-hemijsko okruženje (pH pufer, osmotski tlak, temperatura). Većini ćelija potrebna je površina ili umjetni supstrat, dok se druge ćelijske kulture mogu uzgajati slobodno plutajući u mediju za kultivaciju (suspenzijska kultura, ćelijska suspenzija).
Masovne kulture životinjskih ćelijskih linija koriste se u industrijskoj proizvodnji virusnih vakcina i drugih biotehnološki dobivenih proizvoda. Humane matične ćelije kultiviraju se kako bi se povećao broj ćelija i kako bi se one diferencirale u različite tipove somatskih ćelija u svrhu transplantacije.
Uzorci tkiva
Pojam tkivo opisuje ćelijski međuoblik, u kojem se ćelijski materijal nalazi na organizacijskoj razini između ćelija i cjelovitog organa. U tkivu su okupljene slične ćelije istog porijekla koje zajedno obavljaju određenu funkciju. Funkcionalnim grupiranjem više tkiva nastaju složene strukture organa.
Tkivo se uzorkuje za istraživanja u biologiji, histologiji/histopatologiji, parazitologiji, biohemiji, imunohistohemiji, kao i za kultivaciju i ekstrakciju DNK. Može se razlikovati životinjsko (podjela: tkivo sisara) i biljno tkivo. Životinjska tkiva se grupiraju u četiri osnovna tipa: vezivno, mišićno, nervno i epitelno tkivo. Biljno tkivo dijeli se na sljedeća tri tkivna sistema: epidermis, osnovno tkivo i provodno tkivo.
Uzorci tkiva mogu se pripremiti iz životinjskih ili biljnih dijelova, npr. kosti, mišića, listova itd.
Tjelesne tečnosti
Krv, serum, plazma, cerebrospinalna tečnost, pljuvačka i sinovijalna tečnost su tjelesne tečnosti koje predstavljaju bogat izvor dijagnostički relevantnih informacija. Stoga je važna sofisticirana priprema uzoraka tjelesnih tečnosti za analizu. Prva poteškoća povezana je sa širokim dinamičkim rasponom komponenti prisutnih u tjelesnim tečnostima.
Određivanje koncentracije proteina
Bradfordov test, Lowryjev test i test s bicinhoninskom kiselinom (BCA) uobičajeni su testovi za određivanje koncentracije proteina. Goveđi serumski albumin (BSA) jedan je od najčešće korištenih proteinskih standarda.
Lizirajući pufer
Lizirajući pufer mora se odabrati u skladu s ćelijskim materijalom ili tkivom (tkivna kultura, biljka, bakterije, gljive itd.) te prema tome jesu li ćelije u nekoj strukturi i o kakvoj se strukturi radi. Široka paleta lizirajućih pufera za ekstrakciju proteina, membrana i organela formulira se s jednim ili više deterdženata. Deterdžent se obično bira metodom pokušaja i pogreške ili – ako postoji – prema postojećem protokolu za ekstrakciju proteina. Deterdžent mora biti kompatibilan s izvorom tkiva i proteinima. Općenito se bira najblaži deterdžent koji djeluje za određeno tkivo / protein kako bi se očuvala maksimalna funkcionalnost ekstrakta. Nadalje, u slučaju ekstrakcije membrana i organela, blagi deterdžent održava membranu netaknutom. Deterdženti koji se najčešće koriste u lizirajućim puferima uglavnom su neionski ili cviterionski, npr. CHAPS, deoksiholat, Triton™ X-100, NP40 i Tween 20.
Na primjer, tkiva kao što su mozak, jetra, crijevo, bubreg, slezena itd. mogu se jednostavno puferirati pomoću RIPA – međutim, treba uključiti inhibitore proteaza i DTT (npr. za gel elektroforezu).
Lizirajući pufer za skeletno mišićno tkivo (ledeno hladan): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glicerol, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol uz dodatak koktela inhibitora proteaza i fosfataza
Tabela uobičajenih pufera i njihovog pH raspona. Općenito se ovi puferi obično koriste u koncentracijama od 20-50 mM.
| Pufer | pH raspon |
|---|---|
| Limunska kiselina – NaOH | 2,2 – 6,5 |
| Natrijum citrat – limunska kiselina | 3,0 – 6,2 |
| Natrijum acetat – octena kiselina | 3,6 – 5,6 |
| Natrijeva sol kakodilne kiseline – HCl | 5,0 – 7,4 |
| MES – NaOH | 5,6 – 6,8 |
| Natrijum dihidrogenfosfat – dinatrijum hidrogenfosfat | 5,8 – 8,0 |
| Imidazol – HCl | 6,2 – 7,8 |
| MOPS – KOH | 6,6 – 7,8 |
| Trietanolamin hidroklorid – NaOH | 6,8 – 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7,2 – 8,2 |
| Tricin – NaOH | 7,6 – 8,6 |
| Natrijum tetraborat – borna kiselina | 7,6 – 9,2 |
| Bicin – NaOH | 7,7 – 8,9 |
| Glicin – NaOH | 8,6 – 10,6 |
Većina pufera pokazuje ovisnost pH vrijednosti o temperaturi. To posebno vrijedi za Tris pufere. pKa se mijenja sa 8,06 na 25°C na 8,85 na 0°C.
(pH i pKa pufera: pH mjeri koncentraciju vodikovih iona u vodenoj otopini. pKa (= konstanta disocijacije kiseline) srodna je, ali specifičnija mjera, jer pomaže predvidjeti kako će se molekula ponašati pri određenoj pH vrijednosti.)
TRIzol
TRIzol je hemijska otopina koja se koristi za ekstrakciju RNK/DNK/proteina tokom ekstrakcije gvanidinijum tiocijanat-fenol-hloroformom. Primjena ultrazvučno potpomognute ekstrakcije TRIzolom daje visoke prinose DNK, RNK i proteina iz istog uzorka te time nadmašuje druge metode ekstrakcije.
Literatura/reference
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D'Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.