Hajelscher ultrazvuk tehnologije

Ultrazvučni proteina ekstrakcije iz tkiva i ćelija kulture

  • ekstrakcije proteina je bitan priprema uzorka korak u proteomika.
  • Proteini se može izdvojiti iz biljnog i životinjskog tkiva, kvasac i mikroorganizama.
  • Sonication je pouzdan, efikasan metodom ekstrakcije proteina daje visoko proteinska prinosa u kratkom vremenu ekstrakcije.

 

Vađenje proteina iz tkiva i ćelija

ekstrakciju proteina iz tkiva i kulturan ćelija je bitan priprema uzorka korak koji se obavlja tokom mnoge biohemijske i analitičke tehnike kao što su ELISA, STRANICA, zapadne upijajući, Masene spektrometrije, ili proteina pročišćavanje. ultrazvučni ćelije poremećaja, lizu i vađenje je precizno kontrolirati tehniku ​​kako bi se osiguralo visoke prinose proteina.

ekstrakciju proteina iz životinjskog tkiva

Za pripremu celokupnog tkiva (npr. Bubrega, srca, pluća, mišića itd.), Tkivo treba razdvojiti na vrlo male komade sa čistim alatom, na ledu po mogućstvu i što brže kako bi se sprečila degradacija proteazama (npr. lizni pufer kao što je RIPA ili hipotonski lizni pufer koji sadrži proteazu i koktel inhibitora fosfataze). Nakon disekcije, uzorak je uronjen u tečni azot za zamrzavanje. Uzorak se može čuvati na -80 ° C za kasniju upotrebu ili biti očišćen na ledu za neposrednu homogenizaciju. Neposredno pre ultrazvučne ekstrakcije, brzo dodati pufer za lizu leda (sa inhibitorima proteaza DTT, leupeptinom i aprotininom) u tubu uzorka (preporučuje se ~ 10 mg tkiva ~ 600 μL pufera). Pribl. Preporučuje se 20-60 mg tkiva po cijevi uzorka.
Ultrazvučni homogenizacije, lize i izvlačenje vrši se ultrazvučnim homogenizator, kao što je Uf200 ः t ili UP200St, Opremljen mikro-tip dihtovanje. trajanje sonication je 60-90 sekundi. na ultrazvučni režim ciklus od 15 sekundi. sonication i 10 sec. mirovanja vremena. Uzorak treba imati u ledu cijelo vrijeme.
Nakon ultrazvučnog homogenizacije / ekstrakcije je lizat se centrifugira na 27,000g za cca. 20 min. Nakon toga supernatent se prikupljaju, tako da se koncentracija proteina može se odrediti proteina testa, kao što su Pierce proteina testa BCA.

Proteinski sonicacija je važan metod za pripremu uzoraka

Ultrazvučno vađenje proteina iz ćelija sa UP200St

Informativni zahtev




Zabilježi naš Politika privatnosti.


ekstrakciju proteina iz seruma krvi

Za homogena mješavina seruma i fosfatni pufer, uzorak se vortexed prije nego ultrazvučno ćelije lize. Za ultrazvučnog lize, uzorak se sonicated sa ultrazvučnim laboratorija homogenizator, kao što su UP100H za 8 ciklusa na 20% amplitude, za ciklusi svakih 5 sekundi i 15 sekunde. Sonocation vrši sonicationg u ciklusima i postavljanjem uzorka na ledu, tako da je izbegao pregrijavanja i termalne degradacije uzorka. Od serum sadrži veliku količinu visoke proteina molekularne težine (kao što je albumin, α1-antitripsin, transferin, haptoglobulin, imunoglobulina G i imunoglobulina A), koja ometa odvajanje niske proteina molekularne težine tokom IEF, preporučuje se da ih osiromaši iz seruma koristeći iscrpljivanje koloni.

ekstrakciju proteina iz biljnog tkiva

Svježi, meki biljnih tkiva, npr mahovina, itd, može se lako poremećen jednostavnim postavljanjem sjeckani uzorak materijala u lizu tampon za sonication. Teška, ligenous biljnim tkivima, kao što su sjeme, jele igle itd, treba da se sastoji od suha. Neki tvrde, drvenaste biljnog materijala mora biti zamrznuta i tla u tečnim azotom prije nego iznuđena sonication. Za postrojenje staničnoj kulturi suspenzije, ultrazvučni tretman između 30 i 150 sekundi na lizu tampon je uglavnom dovoljno. Tvrđi materijal, kao što su sjemenke bundeve zahtijevaju intenzivniji sonication kao što je opisano u nastavku.

Protokol za ultrazvučno ekstrakciju albumin iz sjemena bundeve

Ultrazvučni tkivo homogenizator UP400St sa S24d40 - za ekstrakciju proteina iz biljnog i životinjskog tkiva (Kliknite za veću sliku!)Za ultrazvučne ekstrakcije proteina albumina iz fino brušene bučino u prahu, 10 g obezmašćenih bučino u prahu i 100 mL demi vode kao otapala se dodaju u 250ml čašu čašu. ekstrakcije proteina sastoji se u dva koraka: prvo, uzorak se sonicated sa sondom tipa ultrasonicator UP400St (400W, 24kHz) sa montiranim dihtovanje S24d7. Staklo posuda se stavlja u hladnu vodu za kupanje u toku ultrazvučnog homogenizacije. U postavci ultrasonicator UP400St sa senzorom za temperaturu uzorka koji se može priključiti, obezbeđuje da temperatura uzorka uvek bude ispod 30 ° C. Preciznom kontrolom temperature tokom sonifikacije izbjegava se denaturacija albumin. Drugo, ekstrakcija je izvršena sa mikserom pri brzini od 200 obrtaja u minuti i na 30 ° C. Nakon toga čaša se prebacuje u termostatski tresač. Globulin se uklanja putem dijalize pomoću destilovane vode. Nakon uklanjanja globulina, proteinski ekstrakt se može uzimati uzorkovanje za određivanje profila albumin i naknadno je podešen na pI = 3,0 koristeći 0,1 M HCl za koagulaciju albuminom. Čvrsta faza se odvaja centrifugiranjem na 5000 g, 20 ° C i ponovo se rastvori u deioniziranoj vodi. Albuminova koagulacija se vrši dva puta da poveća odnos proteina u koncentratu albumin.

Ultrazvučni ekstrakciju alkalne proteina za pripremu koncentrata proteina iz rižinih mekinja pokazuje da su rezultati ultrazvučne tretman u veći prinos proteina u znatno kraćem vremenu ekstrakcije – u odnosu na klasične metode ekstrakcije.

Ultrazvučni uređaj VialTweeter za ekstrakciju proteina iz uzoraka tkiva (Kliknite za veću sliku!)

VialTweeter za indirektno sonication.

prednosti

  • brz
  • visoki prinosi
  • vrlo učinkovit
  • Preciznu kontrolu nad parametrima
  • ponovljive rezultate
  • linearna skalabilnost

Priprema uzorka protokol za funkcionalnu iNOS enzima

Da biste dobili potpuno funkcionalan iNOS enzima (npr za droga), sljedeći protokol se preporučuje: Obustava ćelija treba staviti na led i sonikacija sa UP100H u 10μm amplitude u modu ciklusa od 5 sekundi. sonication i 25 sek. počivaju na ledu. Postupak treba ponavljati cca. 3 puta. Vremena odmarajući između sonication ciklusa smanjuje porast temperature i stoga će smanjiti rizik od denaturacije.

Ultrazvučni Protein topljenja i

Sonication može ubrzati proces topljenja i proteina, koja obično zahtijeva nekoliko sati. Kako se ne bi pregrijati uzorka i sprečavanje degradacije proteina i izmjene rješenja sadrže ureu, ultrazvučni rafali ne bi trebalo da traje duže od nekoliko sekundi.

Opće upute

Kontrola temperature: Kako bi se osigurao visok prinos proteina bez termo denaturacija, temperatura tijekom ekstrakcije mora biti pod kontrolom. Hielscher je state-of-art ultrazvučnog Homogenizatori – naziva ultrazvučno dezintegrator ili sonificator – su upravo kontrolirati. Oni dolaze sa senzorom plugable temperature. U opcijama podešavanja ultrazvučnog homogenizator, a maksimalna temperatura se može podesiti. Kada se dostigne ta temperatura max, na ultrasonicator automatski zaustavlja sve dok se uzorak ohladi.
buffer: Kod odabira odgovarajućeg tampon i pravo volumena pufera varira od tkiva do tkiva i mora biti shvatio-out ispitivanjem pokušaja i pogreške.
Izolacija / pročišćavanje: Protein lizatima može sadržavati višak biomolekula, kao što su DNA ili ugljikohidrata, koja se može ukloniti protein padavina (deoxycholate-trihlorsirćetnoj kiselina) ili buffer razmjene.

Chittapalo i Noomhorm (2009) prijavio da prinos proteina povećani koristeći sonication i da ultrazvučni proces homogenizacije tkiva i lize može znatno poboljšati postojeće procese ekstrakcije – osposobljavanje za nove mogućnosti komercijalne ekstrakcije.

Zaštita od buke s Hielscher je zvuk kućište SPB-L i ultrazvučnog uređaja UP200St. (Klikni za veću sliku!)

Ultrazvučni tkivo homogenizator UP200St za efikasnu ekstrakciju proteina

Preciznu kontrolu ultrazvučnog tretmana (Kliknite za veću sliku!)

kontrola preglednik za precizan rad i praćenje procesa sonication

Ultrazvučni Oprema za Protein Izdvajanje

Hielscher Ultrasonics nude širok raspon ultrazvučnog homogenizatora za raspad ćelija, tkiva, bakterija, mikroorganizama, kvasac, i spore.
Hielscher laboratoriju ultrasonicators su snažni i jednostavan za rukovanje. Napravljen za 24/7 rad, oni su dizajnirani kao robustan i efikasno laboratoriju i klupa-top uređajima. Za sve uređaje, izlaz energije i amplituda može precizno kontrolirati. Širokog spektra Dodaci otvara dodatne opcije za podešavanje. Digitalne uređaje kao što su VialTweeter, Uf200 ः t, UP200Sti UP400St je ugrađena kontrola temperature i ugrađeni SD karticu za automatsko snimanje podataka.
Za indirektan, cross-kontaminacije-free i istovremenog sonication višestrukih uzoraka, nudimo VialTweeter ili Ultrazvučni cuphorn.
U zavisnosti od aplikacije, materijala i volumena uzorka, mi ćemo vam preporučiti najpogodniji za podešavanje za svoj uzorak prep. Kontaktirajte nas još danas!

Kontaktiraj nas! / Pitajte nas!

Molimo koristite obrazac ispod, ako želite da zatražite dodatne informacije o ultrazvučnoj homogenizaciji. Biće nam drago da vam ponudimo ultrazvučni sistem koji odgovara vašim zahtevima.









Molim vas, obratite se našem Politika privatnosti.


Literatura / Reference

  • Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrazvučno pomogao alkalna ekstrakcija proteina iz obezmašćenih rižinih mekinja i svojstva koncentrata proteina. Int J Food Sci Technol 44: 1843-1849.
  • Simoes, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joan.; Nunes, Ana M.; Gomes, Sofija E.; Roberts, Peter M.; Lo, Adrian C.; D'Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen C.; Borralho Peter M.; Rodrigues, Cecilia M. P. (2013): Efikasno oporavak proteina iz više uzoraka izvora nakon Trizol ili Trizol LS ekstrakcije RNA i dugoročno skladištenje. BMC Genomics, 2013, 14: 181.


Činjenice vredi znati

proteomika

Proteomika je polje istraživanja koja istražuje proteina i proteom. Proteini ispunjavati širok spektar vitalnih funkcija unutar organizama. Proteom je čitav niz proteina izražava genom, ćelija, tkiva ili organizam u određenom trenutku. Proteom varira s vremenom i različite zahtjeve, ili naprezanja, da ćeliju ili organizam prolazi. Konkretnije, to je skup izrazio proteina u određeni tip ćelije ili organizma, u određenom trenutku, pod određenim uvjetima. Termin je mješavina proteina i genoma. Proteomika je proučavanje proteom.

protein

Proteini su velike biomolekule, tzv makromolekula – koji su sastavljeni od jednog ili više dugih lanaca amino kiselinskih ostataka. Proteini su prisutni u svim organizmima biljnog i životinjskog porijekla i oni su ključni za većinu bioloških funkcija. Pošto proteini sadrže mnogo bioloških informacija, oni se ekstrahuju za analitičku svrhu, npr. Za proteomska istraživanja. Najvažnija funkcija proteina uključuje katalizu metaboličkih reakcija, replikaciju DNK, odgovor na dražljaje i transport molekula sa jedne lokacije na drugu. Proteini se razlikuju jedni od drugih prvenstveno u njihovoj sekvenci aminokiselina, što je diktirano nukleotidnom sekvencom njihovih gena i koje obično rezultiraju u preklapanju proteina u specifičnu trodimenzionalnu strukturu koja određuje njegovu aktivnost. Proteini su – pored peptida – jedan od ključnih komponenti hrane. Stoga, proteomika je moćan alat u nauci o hrani za optimizaciju procesa, sigurnosti hrane i prehrambene procjene.

gel elektroforeza

Gel elektroforeza je glavna metoda za separaciju i analizu makromolekula kao što su DNK, RNK i proteina, kao i njihovi fragmenti, na osnovu njihove veličine i punjenja. Koristi se u kliničkoj hemije za razdvajanje proteina za punjenje i / ili veličine (IEF agaroznom, u suštini veličine nezavisni) i biokemije, molekularne biologije i proteomici da se odvoji mješovito stanovništvo DNK i RNK fragmenata po dužini, za procjenu veličine DNK i RNA fragmenata ili da se odvoji proteina punjenja.

kulture stanica

Cell kultura je pod kontrolom rastući proces u kojem se uzgajaju ćelije pod kontroliranim uvjetima. uslovi staničnoj kulturi varirati za svaki tip ćelija. U principu, okruženje kulture ćelija sastoji se od pogodnoj posudi (npr Petri jelo) sa supstratom ili medij koji opskrbljuje esencijalnih hranjivih tvari (aminokiselina, ugljikohidrata, vitamina, minerala), faktora rasta, hormoni, i gasova (CO2The2), A regulira fizio-kemijske okoliš (pH buffer, osmotski tlak, temperatura). Većina ćelija potreban površinu ili umjetnih podloge, dok su ostale kulture stanica može se uzgaja slobodno plutaju u kulturi srednje (suspenzija kulture, mobilni suspenzija).
Masovne kulture staničnim linijama životinja se koriste u industrijskoj proizvodnji virusnih vakcina i drugih biotehnološki proizvoda koji potiču. matične ćelije ljudske su kulturan da se proširi broj ćelija i diferenciraju ćelije u različite somatskih vrste stanica za potrebe transplantacije.

uzorke tkiva

Termin tkivo opisuje ćelijski srednji, gdje materijal ćelija na organizacionom nivou između ćelija i kompletan organa. U tkivu, slične ćelije, iz istog porekla koji zajedno obavljaju određenu funkciju, se montiraju. Do funkcionalne grupisanje više tkiva, kompleks struktura organi se formiraju.
Tkivo se uzorkuje za istraživanja u biologiji, histologiju / histopatologiji, parazitologiju, biohemije, imunohistohemijski kao i da gaje i izvući DNK. Može se razlikovati između životinja (podjela: sisara tkiva) i biljnih tkiva. Životinjska tkiva su svrstani u četiri osnovne vrste vezivnog, mišića, nervozan, i epitelnih tkiva. Biljka tkivo je podijeljena u sljedeće tri sistema tkiva: epidermis, tlo tkiva i vaskularnog tkiva.
uzorke tkiva se mogu pripremiti od životinjskih ili biljnih dijelova, npr kosti, mišića, lišće, itd

telesne tečnosti

Krv, serum, plazma, likvora, pljuvačka i sinovijalne tečnosti su telesne tečnosti, koji nude odličan izvor dijagnostički relevantne informacije. Stoga, sofisticirani priprema uzoraka tijelo tekućine za analizu je važno. Prva poteškoća je povezana sa širokim dinamičkim rasponom od komponenti prisutnih u tjelesnim tekućinama.

Određivanje koncentracije proteina

Bradford test, Lowry testa i bicinchoninic kiselina (BCA) test su zajedničke analize za određivanje koncentracije proteina. Goveđi serum albumin (BSA) je jedan od najčešće koristi protein standard.

lize Buffer

Lizu tampon mora biti izabran u skladu sa materijal ćelija ili tkiva (kultura tkiva, biljke, bakterije, gljivice, itd), i da li su ćelije u strukturi i vrsti strukture. Širok spektar lize baferuje za ekstrakciju proteina, membrane, i organele formulisana sa jednim ili više deterdžente. Deterdžent se obično bira preko testova pokušaja i pogreške ili – ako je dostupno – prema postojećem ekstrakcije proteina protokol. Deterdžent mora biti kompatibilan sa izvor tkiva i proteina. U principu, najblaže deterdžent koji radi za određeni tkiva / proteina, je izabran kako bi se održala maksimalna funkcionalnost ekstrakta. Osim toga, u slučaju vađenja membrane i organela, blagim deterdžentom drži membranu netaknuta. Obično se koristi deterdžente u lize odbojnika su uglavnom neionskih ili zwitterionic, npr Salom deoxycholate, Triton ™ X-100, NP40, i Tween 20.
Na primjer, tkiva kao što su mozak, jetra, crijeva, bubrega, slezena itd može jednostavno buffer s RIPA – Međutim, inhibitori proteaze i DTT (npr za gel elektroforeza) treba uključiti.
Lizu tampon za skeletnih mišića tkiva (ledena): 20 mm Tris (pH 7.8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (w / v) glicerol, 1 mM EDTA , 1 mM dithiothreitol dopunjeni proteaze i fosfataza inhibitor koktel
Tabela zajedničke rezerve i njihov opseg pH. U principu, ovi odbojnici se obično koristi u koncentracijama od 20-50 mm.

pufer pH raspon
Limunska kiselina – Nao 2,2 – 6,5
natrijev citrat – Limunska kiselina 3,0 – 6,2
natrijev acetat – sirćetna kiselina 3,6 – 5,6
Cacodylic kiselina natrijeva sol – HCl 5,0 – 7,4
MY – Nao 5,6 – 6,8
Natrij dihidrogen fosfat – dinatrijev hidrogen fosfat 5,8 – 8,0
imidazola – HCl 6,2 – 7,8
KRPE – Koh 6,6 – 7,8
Triethanolamine hidroklorid – Nao 6,8 – 8,8
Tris – HCl 7,0 – 9,0
HEPES – Nao 7,2 – 8,2
tricin – Nao 7,6 – 8,6
boraksa – borna kiselina 7,6 – 9,2
Bicine – Nao 7,7 – 8,9
glicin – Nao 8,6 – 10,6

Većina baferi pokazuju pH-ovisnost sa temperaturom. To se posebno odnosi na Tris odbojnika. Je pKa mijenja od 8.06 na 25 ° C do 8.85 na 0 ° C.
(PH i pKa tampon: pH mjeri koncentracija jona vodonika u vodenom rastvoru pKa (= kiselina konstanta disocijacije) je u vezi, ali konkretne mjere, po tome što pomaže da se predvidi kako će se molekula ponašati na određeni. pH vrijednosti.)

TRIzol

TRIzol je hemijski rješenje se koristi za izdvajanje RNA / DNA / proteina tokom ekstrakcije guanidinium tiocijanata-fenol-kloroform. Korištenje ultrazvučno pomoć TRIzol rezultati usisavanja u visokom DNK, RNK, a prinosi proteina iz istog uzorka i odlikuje time druge metode ekstrakcije.