Ultrazvučni proteina ekstrakcije iz tkiva i ćelija kulture
- ekstrakcije proteina je bitan priprema uzorka korak u proteomika.
- Proteini se može izdvojiti iz biljnog i životinjskog tkiva, kvasac i mikroorganizama.
- Sonication je pouzdan, efikasan metodom ekstrakcije proteina daje visoko proteinska prinosa u kratkom vremenu ekstrakcije.
Vađenje proteina iz tkiva i ćelija
Ekstrakcija proteina iz tkiva i kultivisanih ćelija je suštinski korak pripreme uzorka koji se izvodi tokom mnogih biohemijskih i analitičkih tehnika kao što su ELISA, PAGE, Western blotting, masena spektrometrija ili prečišćavanje proteina. Poremećaj ultrazvučnih ćelija, liza i ekstrakcija je precizno kontrolisana, netermalna tehnika koja osigurava visok prinos proteina.
Ekstrakcija proteina iz ćelija ultrazvučna sonda UP200St
- brz
- visoki prinosi
- vrlo učinkovit
- Preciznu kontrolu nad parametrima
- ponovljive rezultate
- linearna skalabilnost
Opšte instrukcije za ultrazvučnu lizu i ekstrakciju proteina
- Kontrola temperature: Kako bi se osigurao visok prinos proteina bez termo denaturacija, temperatura tijekom ekstrakcije mora biti pod kontrolom. Hielscher je state-of-art ultrazvučnog Homogenizatori – Ultrazvučni disintegrator ili ultrasonifier – su upravo kontrolirati. Oni dolaze sa senzorom plugable temperature. U opcijama podešavanja ultrazvučnog homogenizator, a maksimalna temperatura se može podesiti. Kada se dostigne ta temperatura max, na ultrasonicator automatski zaustavlja sve dok se uzorak ohladi.
- buffer: Kod odabira odgovarajućeg tampon i pravo volumena pufera varira od tkiva do tkiva i mora biti shvatio-out ispitivanjem pokušaja i pogreške.
- Izolacija / pročišćavanje: Protein lizatima može sadržavati višak biomolekula, kao što su DNA ili ugljikohidrata, koja se može ukloniti protein padavina (deoxycholate-trihlorsirćetnoj kiselina) ili buffer razmjene.
Chittapalo i Noomhorm (2009) izvijestili su u svojoj studiji da se prinos proteina povećao pomoću sonifikacije i da proces homogenizacije i lize ultrazvučnog tkiva može značajno poboljšati postojeće procese ekstrakcije. – osposobljavanje za nove mogućnosti komercijalne ekstrakcije.
Ultrazvučni cuphorn za simultanu, visoko efikasnu pripremu uzorka više uzoraka pod istim uslovima za izolaciju proteina i fragmentaciju DNK.
ekstrakciju proteina iz životinjskog tkiva
Za pripremu celokupnog tkiva (npr. Bubrega, srca, pluća, mišića itd.), Tkivo treba razdvojiti na vrlo male komade sa čistim alatom, na ledu po mogućstvu i što brže kako bi se sprečila degradacija proteazama (npr. lizni pufer kao što je RIPA ili hipotonski lizni pufer koji sadrži proteazu i koktel inhibitora fosfataze). Nakon disekcije, uzorak je uronjen u tečni azot za zamrzavanje. Uzorak se može čuvati na -80 ° C za kasniju upotrebu ili biti očišćen na ledu za neposrednu homogenizaciju. Neposredno pre ultrazvučne ekstrakcije, brzo dodati pufer za lizu leda (sa inhibitorima proteaza DTT, leupeptinom i aprotininom) u tubu uzorka (preporučuje se ~ 10 mg tkiva ~ 600 μL pufera). Pribl. Preporučuje se 20-60 mg tkiva po cijevi uzorka.
Ultrazvučna homogenizacija, liza i ekstrakcija se izvode ultrazvučnim homogenizatorom kao što su UP100H ili UP200Ht, opremljeni ultrazvučnim sonotrodom. Trajanje sonifikacije je 60-90 sec. u režimu ultrazvučnog ciklusa od 15 sekundi. sonication i 10 sec. vrijeme odmora. Uzorak treba držati u ledu cijelo vrijeme.
Nakon ultrazvučnog homogenizacije / ekstrakcije je lizat se centrifugira na 27,000g za cca. 20 min. Nakon toga supernatent se prikupljaju, tako da se koncentracija proteina može se odrediti proteina testa, kao što su Pierce proteina testa BCA.
ekstrakciju proteina iz seruma krvi
Za homogenu mješavinu seruma i fosfatnog pufera, uzorak se prvo vrti prije ultrazvučne lize ćelija. Za ultrazvučnu lizu, uzorak se sonicira ultrazvučnim laboratorijskim homogenizatorom kao što je UP100H za 8 ciklusa na 20% amplitude, za cikluse od svakih 5 sekundi uključenih i 15 sekundi off. Ekstrakcija proteina se vrši soniciranjem u ciklusima (pulsacioni režim) i postavljanjem uzorka na led tako da se izbegne pregrevanje i termička degradacija uzorka. Pošto serum sadrži veliku količinu proteina visoke molekularne težine (kao što su albumin, α1-antitripsin, transferin, haptoglobulin, imunoglobulin G i imunoglobulin A), koji ometaju odvajanje proteina male molekularne težine tokom IEF-a, preporučuje se da ih iscrpite iz seruma pomoću kolone iscrpljivanja.
ekstrakciju proteina iz biljnog tkiva
Svježi, meki biljnih tkiva, npr mahovina, itd, može se lako poremećen jednostavnim postavljanjem sjeckani uzorak materijala u lizu tampon za sonication. Teška, ligenous biljnim tkivima, kao što su sjeme, jele igle itd, treba da se sastoji od suha. Neki tvrde, drvenaste biljnog materijala mora biti zamrznuta i tla u tečnim azotom prije nego iznuđena sonication. Za postrojenje staničnoj kulturi suspenzije, ultrazvučni tretman između 30 i 150 sekundi na lizu tampon je uglavnom dovoljno. Tvrđi materijal, kao što su sjemenke bundeve zahtijevaju intenzivniji sonication kao što je opisano u nastavku.
Protokol za ultrazvučno ekstrakciju albumin iz sjemena bundeve
Za ultrazvučnu proteinsku ekstrakciju albumina iz fino mljevenog praha bundeve, u staklenu čašu dodaju se 10 g demastiranog praha bundeve i 100 ml deionizirane vode kao rastvarač. Ekstrakcija proteina sastoji se u dva koraka: prvo, uzorak se sonicira sa Ultrazvučni sistem tipa sonde UP400St (400W, 24kHz) opremljen sonotrodom S24d7. Staklena čaša se stavlja u hladnu kupku tokom ultrazvučne homogenizacije. Senzor temperature i podešavanja kontrole temperature ultrazvučnika UP400St osiguravaju da se temperatura uzorka uvek drži ispod 30°C. Preciznom kontrolom temperature tokom sonicacije izbjegava se denaturacija albumina. Drugo, ekstrakcija je izvršena mikserom pri brzini od 200 o/min i na 30°C. Nakon toga, pehar se prenosi u termostatski šejker. Globulin se uklanja dijalizom destilovanom vodom. Nakon uklanjanja globulina, proteinski ekstrakt se može uzorkovati za određivanje profila albumina i naknadno se prilagođava na pI=3,0 koristeći 0,1 M HCl za koagulaciju albumina. Čvrsta faza se odvaja centrifugiranjem na 5000g, 20°C i rastvara u dejonizovanoj vodi. Koagulacija albumina se izvodi dva puta kako bi se povećao odnos proteina u koncentratu albumina.
Ultrazvučni ekstrakciju alkalne proteina za pripremu koncentrata proteina iz rižinih mekinja pokazuje da su rezultati ultrazvučne tretman u veći prinos proteina u znatno kraćem vremenu ekstrakcije – u odnosu na klasične metode ekstrakcije.
Priprema uzorka protokol za funkcionalnu iNOS enzima
Da bi se dobio potpuno funkcionalan iNOS enzim (npr. za skrining lekova), preporučuje se sledeći protokol: Ćelijsku suspenziju treba staviti na led i sonicirati sa UP100H na amplitudi od 10 μm u režimu ciklusa od 5 sekundi. sonikacije i 25 sekundi odmora na ledu. Proceduru treba ponoviti 3 puta. Vreme mirovanja između ciklusa sonicacije smanjuje porast temperature i samim tim smanjuje rizik od denaturacije.
Ultrazvučni Protein topljenja i
Sonication može ubrzati proces topljenja i proteina, koja obično zahtijeva nekoliko sati. Kako se ne bi pregrijati uzorka i sprečavanje degradacije proteina i izmjene rješenja sadrže ureu, ultrazvučni rafali ne bi trebalo da traje duže od nekoliko sekundi.
Ultrazvučni sistem UP200Ht sa 2mm mikrotipom S26d2 za sonicaciju malih uzoraka.
Ultrazvučni Oprema za Protein Izdvajanje
Hielscher Ultrasonics nude širok raspon ultrazvučnog homogenizatora za raspad ćelija, tkiva, bakterija, mikroorganizama, kvasac, i spore.
Hielscher laboratorijski ultrazvučnici su moćni i jednostavni za upotrebu. Napravljeni za 24/7 rad, dizajnirani su kao robusni i efikasni laboratorijski i bench-top uređaji. Za sve uređaje, izlazna energija i amplituda mogu se precizno kontrolisati. Široka paleta dodataka otvara dodatne opcije postavljanja. Digitalni ultrazvučnici kao što su VialTweeter, UP200Ht, UP200St, i UP400St imaju integrisanu kontrolu temperature i ugrađenu SD karticu za automatsko snimanje podataka.
Za indirektnu, unakrsnu i istovremenu sonikaciju više uzoraka nudimo VialTweeter ili ultrazvučni CupHorn.
Tabela ispod daje vam pregled naših ultrazvučnika za pripremu uzorka, poremećaj ćelija i ekstrakciju. Kliknite na tip uređaja da biste dobili više informacija o svakom ultrazvučnom homogenizatoru. Naše dobro obučeno i dugogodišnje tehničko osoblje biće vam drago da vam pomogne da izaberete najprikladniji ultrazvučni sistem za pripremu uzorka!
| Batch Volumen | protok | Preporučeni uređaji |
|---|---|---|
| Do 10 bočica ili cijevi | N / A. | VialTweeter |
| multiwell / microtiter ploce | N / A. | UIP400MTP |
| Višestruke cijevi / brodovi | N / A. | Cufir |
| 1 do 500ml | 10 do 200ml / min | UP100H |
| 10 do 1000mL | 20-200 ml/min | Uf200 ः t, UP200St |
| 10 do 2000mL | 20 do 400mL / min | UP400St |
U zavisnosti od aplikacije, materijala i volumena uzorka, mi ćemo vam preporučiti najpogodniji za podešavanje za svoj uzorak prep. Kontaktirajte nas još danas!
Kontaktiraj nas! / Pitajte nas!
Hielscher digitalni ultrazvučnici imaju daljinski upravljač preglednika i automatsko protokoliranje podataka na integriranoj SD-kartici.
VialTweeter za indirektno sonication.
Činjenice vredi znati
proteomika
Proteomika je polje istraživanja koja istražuje proteina i proteom. Proteini ispunjavati širok spektar vitalnih funkcija unutar organizama. Proteom je čitav niz proteina izražava genom, ćelija, tkiva ili organizam u određenom trenutku. Proteom varira s vremenom i različite zahtjeve, ili naprezanja, da ćeliju ili organizam prolazi. Konkretnije, to je skup izrazio proteina u određeni tip ćelije ili organizma, u određenom trenutku, pod određenim uvjetima. Termin je mješavina proteina i genoma. Proteomika je proučavanje proteom.
protein
Proteini su velike biomolekule, tzv makromolekula – koji su sastavljeni od jednog ili više dugih lanaca amino kiselinskih ostataka. Proteini su prisutni u svim organizmima biljnog i životinjskog porijekla i oni su ključni za većinu bioloških funkcija. Pošto proteini sadrže mnogo bioloških informacija, oni se ekstrahuju za analitičku svrhu, npr. Za proteomska istraživanja. Najvažnija funkcija proteina uključuje katalizu metaboličkih reakcija, replikaciju DNK, odgovor na dražljaje i transport molekula sa jedne lokacije na drugu. Proteini se razlikuju jedni od drugih prvenstveno u njihovoj sekvenci aminokiselina, što je diktirano nukleotidnom sekvencom njihovih gena i koje obično rezultiraju u preklapanju proteina u specifičnu trodimenzionalnu strukturu koja određuje njegovu aktivnost. Proteini su – pored peptida – jedan od ključnih komponenti hrane. Stoga, proteomika je moćan alat u nauci o hrani za optimizaciju procesa, sigurnosti hrane i prehrambene procjene.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction To je preanalitička procedura za razdvajanje i pre-koncetratne analize. U kombinaciji sa ultrazvučnošću, ekstrakcija tačke oblaka može se intenzivirati čineći proces efikasnijim, bržim i ekološki prihvatljivijim. Kod ultrazvučnosti, ekstrakcija tačke oblaka je znatno efikasnija metoda pripreme analita. Pročitajte više o ultrazvučno potpomognutom izvlačenju tačke oblaka!gel elektroforeza
Gel elektroforeza je glavna metoda za separaciju i analizu makromolekula kao što su DNK, RNK i proteina, kao i njihovi fragmenti, na osnovu njihove veličine i punjenja. Koristi se u kliničkoj hemije za razdvajanje proteina za punjenje i / ili veličine (IEF agaroznom, u suštini veličine nezavisni) i biokemije, molekularne biologije i proteomici da se odvoji mješovito stanovništvo DNK i RNK fragmenata po dužini, za procjenu veličine DNK i RNA fragmenata ili da se odvoji proteina punjenja.
kulture stanica
Cell kultura je pod kontrolom rastući proces u kojem se uzgajaju ćelije pod kontroliranim uvjetima. uslovi staničnoj kulturi varirati za svaki tip ćelija. U principu, okruženje kulture ćelija sastoji se od pogodnoj posudi (npr Petri jelo) sa supstratom ili medij koji opskrbljuje esencijalnih hranjivih tvari (aminokiselina, ugljikohidrata, vitamina, minerala), faktora rasta, hormoni, i gasova (CO2The2), A regulira fizio-kemijske okoliš (pH buffer, osmotski tlak, temperatura). Većina ćelija potreban površinu ili umjetnih podloge, dok su ostale kulture stanica može se uzgaja slobodno plutaju u kulturi srednje (suspenzija kulture, mobilni suspenzija).
Masovne kulture staničnim linijama životinja se koriste u industrijskoj proizvodnji virusnih vakcina i drugih biotehnološki proizvoda koji potiču. matične ćelije ljudske su kulturan da se proširi broj ćelija i diferenciraju ćelije u različite somatskih vrste stanica za potrebe transplantacije.
uzorke tkiva
Termin tkivo opisuje ćelijski srednji, gdje materijal ćelija na organizacionom nivou između ćelija i kompletan organa. U tkivu, slične ćelije, iz istog porekla koji zajedno obavljaju određenu funkciju, se montiraju. Do funkcionalne grupisanje više tkiva, kompleks struktura organi se formiraju.
Tkivo se uzorkuje za istraživanja u biologiji, histologiju / histopatologiji, parazitologiju, biohemije, imunohistohemijski kao i da gaje i izvući DNK. Može se razlikovati između životinja (podjela: sisara tkiva) i biljnih tkiva. Životinjska tkiva su svrstani u četiri osnovne vrste vezivnog, mišića, nervozan, i epitelnih tkiva. Biljka tkivo je podijeljena u sljedeće tri sistema tkiva: epidermis, tlo tkiva i vaskularnog tkiva.
uzorke tkiva se mogu pripremiti od životinjskih ili biljnih dijelova, npr kosti, mišića, lišće, itd
telesne tečnosti
Krv, serum, plazma, likvora, pljuvačka i sinovijalne tečnosti su telesne tečnosti, koji nude odličan izvor dijagnostički relevantne informacije. Stoga, sofisticirani priprema uzoraka tijelo tekućine za analizu je važno. Prva poteškoća je povezana sa širokim dinamičkim rasponom od komponenti prisutnih u tjelesnim tekućinama.
Određivanje koncentracije proteina
Bradford test, Lowry testa i bicinchoninic kiselina (BCA) test su zajedničke analize za određivanje koncentracije proteina. Goveđi serum albumin (BSA) je jedan od najčešće koristi protein standard.
lize Buffer
Lizu tampon mora biti izabran u skladu sa materijal ćelija ili tkiva (kultura tkiva, biljke, bakterije, gljivice, itd), i da li su ćelije u strukturi i vrsti strukture. Širok spektar lize baferuje za ekstrakciju proteina, membrane, i organele formulisana sa jednim ili više deterdžente. Deterdžent se obično bira preko testova pokušaja i pogreške ili – ako je dostupno – prema postojećem ekstrakcije proteina protokol. Deterdžent mora biti kompatibilan sa izvor tkiva i proteina. U principu, najblaže deterdžent koji radi za određeni tkiva / proteina, je izabran kako bi se održala maksimalna funkcionalnost ekstrakta. Osim toga, u slučaju vađenja membrane i organela, blagim deterdžentom drži membranu netaknuta. Obično se koristi deterdžente u lize odbojnika su uglavnom neionskih ili zwitterionic, npr Salom deoxycholate, Triton ™ X-100, NP40, i Tween 20.
Na primjer, tkiva kao što su mozak, jetra, crijeva, bubrega, slezena itd može jednostavno buffer s RIPA – Međutim, inhibitori proteaze i DTT (npr za gel elektroforeza) treba uključiti.
Lizu tampon za skeletnih mišića tkiva (ledena): 20 mm Tris (pH 7.8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (w / v) glicerol, 1 mM EDTA , 1 mM dithiothreitol dopunjeni proteaze i fosfataza inhibitor koktel
Tabela zajedničke rezerve i njihov opseg pH. U principu, ovi odbojnici se obično koristi u koncentracijama od 20-50 mm.
| pufer | pH raspon |
|---|---|
| Limunska kiselina – Nao | 2,2 – 6,5 |
| natrijev citrat – Limunska kiselina | 3,0 – 6,2 |
| natrijev acetat – sirćetna kiselina | 3,6 – 5,6 |
| Cacodylic kiselina natrijeva sol – HCl | 5,0 – 7,4 |
| MY – Nao | 5,6 – 6,8 |
| Natrij dihidrogen fosfat – dinatrijev hidrogen fosfat | 5,8 – 8,0 |
| imidazola – HCl | 6,2 – 7,8 |
| KRPE – Koh | 6,6 – 7,8 |
| Triethanolamine hidroklorid – Nao | 6,8 – 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – Nao | 7,2 – 8,2 |
| tricin – Nao | 7,6 – 8,6 |
| boraksa – borna kiselina | 7,6 – 9,2 |
| Bicine – Nao | 7,7 – 8,9 |
| glicin – Nao | 8,6 – 10,6 |
Većina baferi pokazuju pH-ovisnost sa temperaturom. To se posebno odnosi na Tris odbojnika. Je pKa mijenja od 8.06 na 25 ° C do 8.85 na 0 ° C.
(PH i pKa tampon: pH mjeri koncentracija jona vodonika u vodenom rastvoru pKa (= kiselina konstanta disocijacije) je u vezi, ali konkretne mjere, po tome što pomaže da se predvidi kako će se molekula ponašati na određeni. pH vrijednosti.)
TRIzol
TRIzol je hemijski rješenje se koristi za izdvajanje RNA / DNA / proteina tokom ekstrakcije guanidinium tiocijanata-fenol-kloroform. Korištenje ultrazvučno pomoć TRIzol rezultati usisavanja u visokom DNK, RNK, a prinosi proteina iz istog uzorka i odlikuje time druge metode ekstrakcije.
Literatura / Reference
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.