Ultrazvučna ekstrakcija proteina iz kultura tkiva i ćelija
- Ekstrakcija proteina je bitan korak pripreme uzorka u proteomici.
- Proteini se mogu ekstrahovati iz biljnog i životinjskog tkiva, kvasca i mikroorganizama.
- Sonikacija je pouzdana, efikasna metoda ekstrakcije proteina koja daje visoke prinose proteina u kratkom vremenu ekstrakcije.
Ekstrakcija proteina iz tkiva i ćelija
Ekstrakcija proteina iz tkiva i kultiviranih ćelija je bitan korak pripreme uzorka koji se izvodi tokom mnogih biohemijskih i analitičkih tehnika kao što su ELISA, PAGE, Western blotting, masena spektrometrija ili prečišćavanje proteina. Ultrazvučno uništavanje ćelija, liza i ekstrakcija je precizno kontrolisana, netermalna tehnika koja osigurava visoke prinose proteina.
Ekstrakcija proteina iz ćelija sa ultrazvučna sonda UP200St
- rapid
- visoki prinosi
- visoko efikasan
- Precizna kontrola parametara
- ponovljivi rezultati
- linearnu skalabilnost
Opća uputstva za ultrazvučnu lizu i ekstrakciju proteina
- Kontrola temperature: To ensure a high protein yield without thermal denaturation, temperature during extraction must be controlled. Hielscher’s state-of-art ultrasonic homogenizers – naziva se i ultrazvučni dezintegrator ili ultrasonifikator – se precizno kontrolišu. Dolaze sa senzorom temperature koji se može priključiti. U opcijama podešavanja ultrazvučnog homogenizatora može se podesiti maksimalna temperatura. Kada se dostigne ova maksimalna temperatura, ultrazvučni aparat se automatski zaustavlja dok se uzorak ne ohladi.
- tampon: Odabir odgovarajućeg pufera i odgovarajuće količine pufera varira od tkiva do tkiva i mora se utvrditi testiranjem pokušaja i greške.
- Izolacija/prečišćavanje: Proteinski lizati mogu sadržavati višak biomolekula kao što su DNK ili ugljikohidrati, koji se mogu ukloniti precipitacijom proteina (deoksiholat-trihloroctena kiselina) ili izmjenom pufera.
Chittapalo i Noomhorm (2009) su u svojoj studiji izvijestili da se prinos proteina povećava korištenjem ultrazvučne obrade i da ultrazvučna homogenizacija tkiva i proces lize mogu značajno poboljšati postojeće procese ekstrakcije. – omogućavajući nove komercijalne mogućnosti ekstrakcije.
Ultrazvučni kuphorn za istovremenu, visoko efikasnu pripremu uzoraka od više uzoraka pod istim uslovima za izolaciju proteina i fragmentaciju DNK.
Ekstrakcija proteina iz životinjskog tkiva
Za pripremu tkiva cijele veličine (npr. bubrega, srca, pluća, mišića itd.), tkivo treba secirati na vrlo male komade čistim alatima, po mogućnosti na ledu, i što je prije moguće kako bi se spriječila degradacija proteazama (npr. pufer za lizu kao što je RIPA ili hipotonični pufer za lizu koji sadrži koktel inhibitora proteaze i fosfataze). Nakon seciranja, uzorak se uranja u tečni dušik radi brzog zamrzavanja. Uzorak se može čuvati na -80°C za kasniju upotrebu ili se može držati na ledu radi trenutne homogenizacije. Neposredno prije ultrazvučne ekstrakcije, ledeno hladni pufer za lizu (sa inhibitorima proteaze DTT, leupeptinom i aprotininom) se brzo dodaje u epruvetu za uzorke (po ~10 mg tkiva se preporučuje oko ~600 μL pufera). Pribl. Preporučuje se 20-60 mg tkiva po epruveti za uzorke.
Ultrazvučna homogenizacija, liza i ekstrakcija se izvode ultrazvučnim homogenizatorom kao što je UP100H ili UP200Ht, opremljenim sonotrodom sa mikro vrhom. Trajanje sonikacije je 60-90 sekundi. u režimu ultrazvučnog ciklusa od 15 sek. sonikacija i 10 sek. vrijeme odmora. Uzorak treba stalno držati u ledu.
Nakon ultrazvučne homogenizacije/ekstrakcije, lizat se centrifugira na 27.000g cca. 20 min. Nakon toga se sakuplja supernatent, tako da se koncentracija proteina može odrediti proteinskim testom kao što je Pierce proteinski test BCA.
Ekstrakcija proteina iz krvnog seruma
Za homogenu mješavinu seruma i fosfatnog pufera, uzorak se prvo vorteksira prije ultrazvučne ćelijske lize. Za ultrazvučnu lizu, uzorak se obrađuje ultrazvučnim laboratorijskim homogenizatorom kao što je UP100H tokom 8 ciklusa pri 20% amplitude, za cikluse od svakih 5 sekundi uključenih i 15 sekundi isključenih. Ekstrakcija proteina se izvodi sonikacijom u ciklusima (način pulsiranja) i stavljanjem uzorka na led tako da se izbjegne pregrijavanje i termička degradacija uzorka. Budući da serum sadrži veliku količinu proteina visoke molekularne težine (kao što su albumin, α1-antitripsin, transferin, haptoglobulin, imunoglobulin G i imunoglobulin A), koji ometaju odvajanje proteina niske molekularne težine tokom IEF-a, preporučuje se njihovo iscrpljivanje. iz seruma pomoću kolone za iscrpljivanje.
Ekstrakcija proteina iz biljnog tkiva
Svježe, meko biljno tkivo, npr. mahovina itd., može se lako poremetiti jednostavnim stavljanjem usitnjenog uzorka materijala u pufer za lizu za sonikaciju. Čvrsta, ligasta biljna tkiva, kao što su sjemenke, iglice jele itd., treba suvo samljeti. Neki tvrdi, drvenasti biljni materijali moraju se zamrznuti i samljeti u tekućem dušiku prije ekstrakcije ultrazvučnom obradom. Za suspenzije biljnih ćelija, ultrazvučni tretman između 30 i 150 sekundi u puferu za lizu je uglavnom dovoljan. Čvršći materijal kao što su sjemenke bundeve zahtijevaju intenzivniju obradu sonikacijom kao što je opisano u nastavku.
Protokol za ultrazvučnu ekstrakciju albumina iz sjemenki bundeve
Za ultrazvučnu ekstrakciju proteina albumina iz fino mljevenog praha sjemenki bundeve, 10 g odmašćenog praha sjemenki bundeve i 100 mL dejonizirane vode kao rastvarača dodaju se u staklenu čašu od 250 mL. Ekstrakcija proteina se sastoji od dva koraka: Prvo, uzorak se obrađuje sonikacijom ultrasonikator tipa sonde UP400St (400W, 24kHz) opremljen sonotrodom S24d7. Staklena čaša se stavlja u kupatilo sa hladnom vodom tokom ultrazvučne homogenizacije. Uključivi temperaturni senzor i postavke kontrole temperature ultrasonikatora UP400St osiguravaju da se temperatura uzorka uvijek održava ispod 30°C. Preciznom kontrolom temperature tokom sonikacije izbjegava se denaturacija albumina. Drugo, ekstrakcija je izvedena mikserom pri brzini od 200 o/min i na 30°C. Nakon toga, čaša se prebacuje u termostatsku šejkeru. Globulin se uklanja dijalizom sa destilovanom vodom. Nakon uklanjanja globulina, ekstrakt proteina se može uzeti za određivanje profila albumina i zatim se podešava na pI=3,0 upotrebom 0,1 M HCl za koagulaciju albumina. Čvrsta faza se odvoji centrifugiranjem na 5000g, 20°C i ponovo rastvori u dejonizovanoj vodi. Koagulacija albumina se izvodi dva puta kako bi se povećao omjer proteina u albuminskom koncentratu.
Ultrazvučna alkalna ekstrakcija proteina za pripremu proteinskog koncentrata iz pirinčanih mekinja pokazuje da ultrazvučni tretman rezultira većim prinosom proteina u znatno kraćem vremenu ekstrakcije – u poređenju sa konvencionalnim metodama ekstrakcije.
Protokol za pripremu uzorka za funkcionalni iNOS enzim
Za dobijanje potpuno funkcionalnog iNOS enzima (npr. za skrining lekova), preporučuje se sledeći protokol: Suspenzija ćelija treba da se stavi na led i obradi ultrazvukom sa UP100H pri amplitudi 10 µm u režimu ciklusa od 5 sekundi. sonikacija i 25 sek. odmoriti na ledu. Postupak treba ponoviti cca. 3 puta. Vrijeme odmora između ciklusa sonikacije smanjuje porast temperature i stoga smanjuje rizik od denaturacije.
ultrazvučna solubilizacija proteina
Sonikacija može ubrzati proces solubilizacije proteina, koji obično zahtijeva nekoliko sati. Kako se uzorak ne bi pregrijao i spriječila degradacija proteina i modifikacije u otopinama koje sadrže ureu, ultrazvučni udari ne bi trebali trajati duže od nekoliko sekundi.
Ultrasonicator UP200Ht sa mikrovrhom od 2 mm S26d2 za ultrazvučnu obradu malih uzoraka.
Ultrazvučna oprema za ekstrakciju proteina
Hielscher Ultrasonics nudi širok spektar ultrazvučnih homogenizatora za dezintegraciju ćelija, tkiva, bakterija, mikroorganizama, kvasca i spora.
Hielscher laboratorijski ultrasonikatori su snažni i jednostavni za rukovanje. Napravljeni za rad 24/7, dizajnirani su kao robusni i efikasni laboratorijski i stoni uređaji. Za sve uređaje, izlaz energije i amplituda mogu se precizno kontrolisati. Širok raspon dodatne opreme otvara dodatne mogućnosti podešavanja. Digitalni ultrasonikatori kao što su VialTweeter, UP200Ht, UP200St i UP400St imaju integrisanu kontrolu temperature i ugrađenu SD karticu za automatsko snimanje podataka.
Za indirektnu, unakrsnu kontaminaciju i istovremenu sonikaciju više uzoraka, nudimo VialTweeter ili ultrazvučni CupHorn.
Tabela ispod daje vam pregled naših ultrazvučnih aparata za pripremu uzoraka, razbijanje ćelija i ekstrakciju. Kliknite na tip uređaja da biste dobili više informacija o svakom ultrazvučnom homogenizatoru. Naše dobro obučeno tehničko osoblje sa dugogodišnjim iskustvom rado će vam pomoći da odaberete najprikladniji ultrazvučni aparat za pripremu uzorka!
| Batch Volume | Flow Rate | Preporučeni uređaji |
|---|---|---|
| do 10 bočica ili epruveta | N? A | VialTweeter |
| multijažice? mikrotitarske ploče | N? A | UIP400MTP |
| više cijevi? posuda | N? A | CupHorn |
| 1 do 500 ml | 10 do 200 ml/min | UP100H |
| 10 do 1000 ml | 20 do 200 ml/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 do 2000 ml | 20 do 400 ml/min | UP400St |
Ovisno o vašoj primjeni, materijalu i zapremini uzorka, preporučit ćemo vam najprikladnije podešavanje za pripremu uzorka. Kontaktirajte nas danas!
Kontaktiraj nas!? Pitajte nas!
Hielscher digitalni ultrasonikatori imaju daljinski upravljač preglednika i automatsko protokoliranje podataka na integriranoj SD kartici.
VialTweeter za indirektnu sonikaciju.
Činjenice koje vrijedi znati
proteomika
Proteomika je polje istraživanja koje istražuje proteine i proteome. Proteini ispunjavaju široku lepezu vitalnih funkcija u organizmima. Proteom je čitav skup proteina izraženih od strane genoma, ćelije, tkiva ili organizma u određenom trenutku. Proteom varira s vremenom i različitim zahtjevima, ili stresovima, kojima ćelija ili organizam prolazi. Preciznije, to je skup eksprimiranih proteina u datom tipu ćelije ili organizma, u datom trenutku, pod definisanim uslovima. Termin je mješavina proteina i genoma. Proteomika je proučavanje proteoma.
proteina
Proteini su velike biomolekule, takozvane makromolekule – koji se sastoje od jednog ili više dugih lanaca aminokiselinskih ostataka. Proteini su prisutni u svim organizmima i biljnog i životinjskog porijekla i ključni su za većinu bioloških funkcija. Pošto proteini sadrže mnogo bioloških informacija, oni se ekstrahuju u analitičke svrhe, npr. za proteomska istraživanja. Najvažnija funkcija koju obavljaju proteini uključuje katalizu metaboličkih reakcija, replikaciju DNK, odgovor na podražaje i transport molekula s jedne lokacije na drugu. Proteini se međusobno razlikuju prvenstveno po svom slijedu aminokiselina, koji je diktiran nukleotidnom sekvencom njihovih gena, a koji obično rezultira savijanjem proteina u specifičnu trodimenzionalnu strukturu koja određuje njegovu aktivnost. Proteini su – pored peptida – jedna od ključnih komponenti hrane. Stoga je proteomika moćan alat u nauci o hrani za optimizaciju procesa, sigurnosti hrane i nutritivne procjene.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction je predanalitički postupak za odvajanje i prethodno koncentriranje analita. U kombinaciji sa ultrazvukom, ekstrakcija tačke zamućenja može se intenzivirati, čineći proces efikasnijim, bržim i ekološki prihvatljivijim. Uz ultrazvučnu obradu, ekstrakcija tačke zamućenja je znatno efikasnija metoda pripreme analita. Pročitajte više o ultrazvučnom potpomognutom ekstrakciji tačke oblaka!Gel elektroforeza
Gel elektroforeza je glavna metoda za odvajanje i analizu makromolekula kao što su DNK, RNK i proteini, kao i njihovih fragmenata, na osnovu njihove veličine i naboja. Koristi se u kliničkoj hemiji za odvajanje proteina prema naboju i/ili veličini (IEF agaroza, u suštini nezavisna od veličine) i u biohemiji, molekularnoj biologiji i proteomici za odvajanje mješovite populacije DNK i RNA fragmenata po dužini, za procjenu veličine DNK i RNA fragmente ili za odvajanje proteina nabojom.
ćelijske kulture
Ćelijska kultura je kontrolisani proces rasta kojim se ćelije uzgajaju u kontrolisanim uslovima. Uslovi kulture ćelija razlikuju se za svaki tip ćelije. Općenito, okruženje ćelijske kulture sastoji se od odgovarajuće posude (npr. Petrijeve posude) sa supstratom ili podlogom koji opskrbljuje esencijalne hranjive tvari (aminokiseline, ugljikohidrate, vitamine, minerale), faktore rasta, hormone i plinove (CO2, O2), i reguliše fizičko-hemijsko okruženje (pH pufer, osmotski pritisak, temperaturu). Većini ćelija je potreban površinski ili veštački supstrat, dok se druge ćelijske kulture mogu uzgajati slobodno lebdeći u medijumu za kulturu (suspenzijska kultura, ćelijska suspenzija).
Masovne kulture životinjskih ćelijskih linija koriste se u industrijskoj proizvodnji virusnih vakcina i drugih biotehnološki dobijenih proizvoda. Ljudske matične ćelije se uzgajaju kako bi se povećao broj ćelija i diferencirali ćelije u različite tipove somatskih ćelija za potrebe transplantacije.
Uzorci tkiva
Pojam tkivo opisuje ćelijski intermedijer, gdje je ćelijski materijal na organizacijskom nivou između ćelija i kompletnog organa. U tkivu se sklapaju slične ćelije istog porekla koje zajedno vrše određenu funkciju. Funkcionalnim grupiranjem više tkiva formiraju se složene strukture organa.
Tkivo se uzima za istraživanja u biologiji, histologiji/histopatologiji, parazitologiji, biohemiji, imunohistohemiji, kao i za kultivaciju i ekstrakciju DNK. Može se razlikovati između životinjskog (podpodjela: tkivo sisara) i biljnog tkiva. Životinjska tkiva su grupirana u četiri osnovna tipa vezivnog, mišićnog, nervnog i epitelnog tkiva. Biljno tkivo se dijeli na sljedeća tri tkiva: epidermis, prizemno tkivo i vaskularno tkivo.
Uzorci tkiva mogu se pripremiti od životinjskih ili biljnih dijelova, npr. kosti, mišića, listova itd.
Body Fluids
Krv, serum, plazma, cerebrospinalna tečnost, pljuvačka i sinovijalna tečnost su telesne tečnosti koje nude odličan izvor dijagnostički relevantnih informacija. Stoga je važna sofisticirana priprema uzoraka tjelesnih tekućina za analizu. Prva poteškoća je povezana sa širokim dinamičkim rasponom komponenti prisutnih u tjelesnim tekućinama.
Određivanje koncentracije proteina
Bradfordov test, Lowryjev test i test bicinhoninske kiseline (BCA) uobičajeni su testovi za određivanje koncentracije proteina. Goveđi serum albumin (BSA) je jedan od najčešće korištenih standarda proteina.
pufer za lizu
Pufer za lizu se mora odabrati u skladu sa ćelijskim materijalom ili tkivom (kultura tkiva, biljka, bakterije, gljive, itd.), te da li su ćelije u strukturi i tipu strukture. Širok raspon pufera za lizu za ekstrakciju proteina, membrana i organela je formulisan sa jednim ili više deterdženata. Deterdžent se obično bira putem testova pokušaja i grešaka ili – ako je dostupno – prema postojećem protokolu ekstrakcije proteina. Deterdžent mora biti kompatibilan sa izvorom tkiva i proteinima. Općenito, najblaži deterdžent koji djeluje na određeno tkivo/protein, bira se kako bi se održala maksimalna funkcionalnost ekstrakta. Nadalje, u slučaju ekstrakcije membrana i organela, blagi deterdžent održava membranu netaknutom. Često korišteni deterdženti u puferima za lizu su uglavnom nejonski ili cviterionski, npr. CHAPS, deoksiholat, Triton™ X-100, NP40 i Tween 20.
Na primjer, tkiva kao što su mozak, jetra, crijeva, bubrezi, slezena itd. mogu se jednostavno puferirati RIPA-om – međutim, inhibitore proteaze i DTT (npr. za gel elektroforezu) treba uključiti.
Pufer za lizu za tkivo skeletnih mišića (ledeno hladno): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glicerol, 1 mM EDTA , 1 mM ditiotreitola sa dodatkom koktela inhibitora proteaze i fosfataze
Tabela uobičajenih pufera i njihovog pH raspona. Općenito, ovi puferi se obično koriste u koncentracijama od 20-50 mM.
| tampon | pH opseg |
|---|---|
| Limunska kiselina – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Natrijum citrat – Limunska kiselina | 3.0 – 6.2 |
| Natrijum acetat – sirćetna kiselina | 3.6 – 5.6 |
| Natrijumova so kakodilne kiseline – HCl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Natrijum dihidrogen fosfat – dinatrijum hidrogen fosfat | 5.8 – 8.0 |
| Imidazole – HCl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Trietanolamin hidrohlorid – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – HCl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricine – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Natrijum tetraborat – borna kiselina | 7.6 – 9.2 |
| Bicine – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| glicin – NaOH | 8.6 – 10.6 |
Većina pufera pokazuje pH-ovisnost s temperaturom. Ovo posebno važi za Tris bafere. PKa se mijenja od 8,06 na 25°C do 8,85 na 0°C.
(pH i pKa pufera: pH mjeri koncentraciju vodikovih jona u vodenoj otopini. pKa (= konstanta disocijacije kiseline) je srodna, ali specifičnija mjera, jer pomaže da se predvidi kako će molekul djelovati na određenom pH vrijednost.)
TRIzol
TRIzol je hemijski rastvor koji se koristi za ekstrakciju RNK/DNK/proteina tokom ekstrakcije gvanidinijum tiocijanat-fenol-hloroform. Upotreba ultrazvučno potpomognute ekstrakcije TRIzola rezultira visokim prinosima DNK, RNK i proteina iz istog uzorka i time nadmašuje druge metode ekstrakcije.
Literatura/Reference
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.