Priprema plazmida pomoću ultrazvučne obrade

Ultrazvučna obrada pouzdana je tehnika za fragmentaciju plazmidne DNK. Precizno podesiva amplituda, pulsni način rada i kontrola temperature najvažnije su karakteristike ultrazvučnog uređaja za fragmentaciju plazmida bez oštećenja. Osim toga, upotreba određenih agenasa pomaže u zaštiti od degradacije plazmida. Hielscher Ultrasonics nudi različita rješenja za kontroliranu fragmentaciju plazmida iz pojedinačnih bočica, za istovremenu ultrazvučnu obradu većeg broja uzoraka te za ploče s više jažica. Saznajte više o uspješnoj ultrazvučnoj fragmentaciji plazmida!

Smicanje plazmida pomoću ultrazvučne obrade

Kada su uzorci DNK izloženi ultrazvučnim talasima, ultrazvučno generirane vibracije stvaraju akustičnu kavitaciju u tekućini, koja mehaničkim silama smiče ili lomi molekule DNK velike molekulske mase. Sonikacija je najšire korištena metoda za eksperimente masovnog smicanja DNK, uključujući primjene kao što je imunoprecipitacija kromatina (ChIP), za koju su mali fragmenti apsolutno ključni za postizanje visoke rezolucije. (usp. Tseng et al., 2012)
Plazmidna DNK (pDNA) je specifičan oblik DNK, karakteriziran prstenastim oblikom, a nalazi se u bakterijama i nekim eukariotima.
Superspiralizirana pDNA je poželjan oblik plazmidne DNK jer pokazuje najbolje rezultate u narednim procesima kao što su automatizirano sekvenciranje i transfekcija. Ultrazvučna obrada je pogodna za uspješnu fragmentaciju pDNA, uključujući superspiraliziranu pDNA.
Thompson et al. (2008) su pokazali da je sonikacija plazmida, za koju je poznato da fragmentira superspiraliziranu DNK, učinkovit način za poboljšanje dužina očitavanja sekvence phred20 do te mjere da se one značajno ne razlikuju od kontrolnog šablona kompanije Beckman Coulter ili enzimski linearizovanih plazmida.

Upotreba plazmidnih vektora

Plazmidi se često koriste kao alati za kloniranje, prijenos i manipulaciju genima. Kada se plazmidi eksperimentalno koriste u te svrhe, nazivaju se vektorima. Fragmenti DNK ili geni mogu se umetnuti u plazmidni vektor, čime nastaje takozvani rekombinantni plazmid. Plazmidni vektori koriste se kao nosači za unošenje rekombinantne DNK u ćeliju domaćina i ključna su komponenta molekularnog kloniranja.
“Nevirusni vektori se intenzivno proučavaju zbog njihove potencijalne upotrebe u genskoj terapiji za liječenje raznih složenih bolesti. Nevirusni vektori štite plazmidnu DNK od fizičke, kemijske i enzimske degradacije i isporučuju molekulu DNK na ciljno mjesto. Na primjer, kationski liposomi, hitozan i druge pozitivno nabijene nanočestice stvaraju komplekse s plazmidnom DNK putem elektrostatskih interakcija. Međutim, lako nastali kompleksi kationskih liposoma i plazmidne DNK relativno su veliki (tj. 300–400 nm) i heterogeni po prirodi, što otežava njihovu upotrebu u farmaceutskim primjenama. Veliki i heterogeni kompleksi plazmidne DNK/liposoma, plazmidne DNK/aerosola i plazmidne DNK/peptida mogu se pomoću ultrazvučne obrade smanjiti na manje i homogene čestice.” (Sarker et al., 2019)
Istaknut primjer upotrebe plazmidnih vektora je CRISPR–Cas9. Sistem CRISPR–Cas9 se u ćelije obično unosi kao jedan veliki plazmid ili više manjih plazmida koji kodiraju ciljnu sekvencu, CRISPR vodič i Cas9.

Ultrazvučna priprema nanočestica PLGA napunjenih DNK nanotaloženjem

Jo et al. (2020) koristili su poli(mliječnu-ko-glikolnu kiselinu) (PLGA) kako bi formirali nanočestični nosač za isporuku modelnog plazmida CRISPR–Cas9 u primarne makrofage porijeklom iz koštane srži. Za nanotaloženje nanočestica PLGA korišten je PLGA s dvije različite završne grupe (esterskom i aminskom) s ciljem da pozitivno nabijene aminske završne kape povećaju učinkovitost inkapsulacije i opterećenje zbog interakcija naboja između njih i negativno nabijene okosnice DNK. U konusnoj centrifugalnoj epruveti od polipropilena od 50 mL, 100 mg Pluronica F127 otopljeno je u 20 mL autoklavirane DI vode miješanjem na vorteksu, nakon čega je slijedila 30 min blage sonikacije u ultrazvučnoj kupelji (pogledajte CupHorn). Dodan je autoklavirani magnetni štapić za miješanje i otopina je miješana pri 600 RPM tokom 30 min dok su se pripremale ostale otopine. Plastični laboratorijski pribor korišten je umjesto staklenog u cijelom postupku kako bi se smanjila nespecifična adsorpcija DNK. Otopine PLGA u DMF-u (44,48 mg/ ml) i TIPS pentacena u THF-u (0,667 mg/ml) pripremljene su zasebno. PLGA je ostavljen da miruje i da se kvasi u DMF-u 30 min prije nego što je sonikiran 30 min. (za puni protokol vidi Jo et al., 2020)

Zaštita plazmidne DNK tokom sonikacije

DNK, uključujući plazmide i superspiralizirane plazmide, vrlo je osjetljiva na degradaciju. Za sve dostupne metode fragmentacije poznati su određeni nedostaci. Ultrazvučna fragmentacija DNK jedna je od preferiranih metoda jer kontrolirana sonikacija u kombinaciji sa zaštitnim mjerama omogućava smanjenje oštećenja lanaca DNK uzrokovanih smicanjem i toplinom.
Osim postavki niske amplitude, pulsnog načina rada i kontrole temperature tokom ultrazvučnog smicanja DNK, upotreba određenih agenasa pokazala je značajan zaštitni učinak protiv degradacije DNK. Na primjer, razni polimeri, peptidi i lipidi štite plazmidnu DNK tokom ultrazvučne obrade.

Stabilnost plazmidne DNK i nanokompleksa plazmidne DNK/IL na ultrazvučno smično naprezanje ispitana je testom agarozne gel elektroforeze. I plazmidna DNK i nanokompleksi plazmidne DNK/IL bili su izloženi ultrazvučnom smičnom naprezanju u različitim vremenskim tačkama. Plazmidna DNK bila je izložena ultrazvučnom smičnom naprezanju 0, 10, 20, 30 i 40 minuta. Nasuprot tome, nanokompleksi plazmidne DNK/IL bili su izloženi ultrazvučnom smičnom naprezanju 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 minuta.
(studija i slika: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) su pokazali da je, kada su nanostrukture plazmidne DNK / ionske tekućine (pDNA/IL) bile izložene ultrazvučnom smičnom naprezanju 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 min i kompleksirane s komercijalno dostupnim kationskim agensom za isporuku gena lipofektaminom, postotak fluorescentno pozitivnih ćelija iznosio 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% odnosno 50% (vidi grafikon ispod). Postotak fluorescentno pozitivnih ćelija povećao se kada su nanostrukture bile izložene ultrazvučnom smičnom naprezanju 10 i 20 min, a nakon toga je polako opadao.

Utjecaj ionske tekućine [Bmim][PF6] na isporuku plazmidne DNK u COS7 ćelije. Nanokompleksi plazmidne DNK/IL (ionska tekućina) bili su izloženi ultrazvučnom smičnom naprezanju do 120 minuta i kompleksirani s LA prije isporuke u COS7 ćelije. Podaci prikazuju prosječan broj (%) GFP pozitivnih HeLa ćelija prebrojanih u 10 različitih mikroskopskih polja, a eksperiment je izveden više puta tokom tri različita dana. (Studija i grafikon: ©Sarker et al., 2019)

Ultrazvučna priprema lizata

Protokol ultrazvučne lize ćelija
Počnite s obogaćenim uzorkom ćelija pripremljenim metodom razdvajanja ćelija (npr. imunomagnetno razdvajanje ćelija, fluorescentno aktivirano sortiranje ćelija (FACS), centrifugiranje u gradijentu gustoće, imunodenzitetska izolacija ćelija).
Uzorci ćelija moraju imati volumen pufera za lizu koji je prikladan za cilj eksperimenta i za ultrazvučni uređaj sa sondom.
Hipotonični puferi su poželjni jer pospješuju ultrazvučnu lizu ćelija. Važno je da se aditivi i koncentracija soli koriste na odgovarajući način.
Odaberite svoj uređaj za ultrazvučnu lizu: za indirektnu sonikaciju bočica preporučuju se VialTweeter ili CupHorn. Za ploče s više jažica UIP400MTP je idealan ultrazvučni uređaj. A za klasičnu sonikaciju sondom najprikladniji je ultrazvučni homogenizator kao što je UP100H ili UP200Ht s mikrovrhom.
Protokol za sonikaciju sondom: Postavite sondu ultrazvučnog uređaja u volumen uzorka u mikrocentrifugalnoj epruveti i sonikirajte približno 10 sekundi. Ovisno o uzorku DNK, sonikacija se može ponoviti još jednom ili dvaput. Potreban unos ultrazvučne energije (Ws/mL) ovisi o viskoznosti uzorka i vrsti DNK. Hlađenje ledenom kupkom i pulsni način rada ultrazvučnog uređaja pomažu da se spriječi termička degradacija uzorka.
Nakon ultrazvučne lize uzorak se centrifugira kako bi se odvojio talog ostataka (koji sadrži nelizirane ćelije, jezgre i nelizirane organele)
Ako se uzorak ne obrađuje odmah dalje, može se čuvati na odgovarajućoj temperaturi radi očuvanja njegove vitalnosti.

Ultrazvučni uređaji za fragmentaciju DNK

Hielscher Ultrasonics nudi različite platforme zasnovane na ultrazvuku za fragmentaciju DNK, RNK i kromatina. Te različite platforme uključuju ultrazvučne sonde (sonotrode), rješenja indirektne sonikacije za istovremenu pripremu uzoraka u više epruveta ili ploča s više jažica (npr. ploče s 96 jažica, mikrotitarske ploče), sonoreaktore i ultrazvučne cuphorne. Sve platforme za smicanje DNK pokreću ultrazvučni procesori visokih performansi s podešenom frekvencijom, koji su precizno kontrolirani i daju ponovljive rezultate.

Ultrazvučni procesori za bilo koji broj i veličinu uzoraka

S višeuzorkovnim ultrazvučnim uređajima kompanije Hielscher, VialTweeter (za do 10 epruveta) i UIP400MTP (za mikroploče/ploče s više jažica), lako je moguće skratiti vrijeme obrade uzoraka zahvaljujući intenzivnoj i precizno kontroliranoj ultrazvučnoj obradi uz postizanje željene raspodjele veličine fragmenata DNK i prinosa. Ultrazvučna fragmentacija DNK čini korake pripreme plazmida učinkovitim, pouzdanim i skalabilnim. Protokoli se mogu linearno skalirati s jednog na brojne uzorke primjenom konstantnih ultrazvučnih parametara.
Ultrazvučni uređaji sa sondom s jednim do pet prstiju idealni su za pripremu manjeg broja uzoraka. Laboratorijski ultrazvučni uređaji kompanije Hielscher dostupni su s različitim nivoima snage kako biste mogli odabrati idealni ultrazvučni dezintegrator za svoju primjenu vezanu uz DNK.