Ultrasonication je pouzdana tehnika za fragmentaciju plazmidna DNK. Precizno kontrolisana amplituda, način pulsacije i kontrola temperature su najvažnije osobine ultrasonikatora za neoštećenu fragmentaciju plazmida. Osim toga, upotreba određenih agenata pomaže u zaštiti od degradacije plazmida. Hielscher Ultrasonics nudi različita rješenja za kontroliranu fragmentaciju plazmida iz jednostrukih bočica, istovremeno sonikaciju brojnih uzoraka kao i višezložnih ploča. Saznajte više o uspješnoj ultrazvučnoj fragmentaciji plazme!

Plasmid Shearing koristeći Ultrasonication

Kada su uzorci DNK podvrgnuti ultrazvučnim talasima, ultrazvučno generirane vibracije stvaraju akustičnu kavitaciju u tečnosti koja makaze ili lome molekule DNK visoke molekularne težine putem mehaničkih sila. Sonication je najšire korištena metoda za eksperimente smicanje rasute DNK uključujući aplikacije, kao što je Hromatin Imunoprecipitacija (ChIP), za koje su male veličine fragmenta apsolutno presudne za dobijanje visoke rezolucije. (cf. Tseng et al., 2012)
Plazmidna DNK (pDNA) je specifičan oblik DNK, karakteriziran po obliku prstena i nađe se u bakterijama i nekim eukaryotima.
Superkoiled pDNA je željeni oblik plazmidne DNK jer pokazuje najbolje rezultate u procesima down-streama kao što su automatizirano sekvenciranje i transfekcija. Ultrasonication je pogodan za fragmentaciju PDNA, uključujući superkoiled pDNA, uspješno.
Thompson et al. (2008) je pokazao da je sonication plazmid, za koji je poznato da fragmentira supercoiled DNK, učinkovit način za poboljšanje sekvence phred20 dužine čitati do te točke da se ne razlikuju značajno od Beckman Coulter je kontrolni predložak ili enzimski linearno linearizirane plazmidi.

Upotreba Plasmid Vektora

Plazmidi se često koriste kao alati za kloniranje, prenos i manipulaciju genima. Kada se plazmidi koriste eksperimentalno u ove svrhe, oni se zovu vektori. DNK fragmenti ili geni mogu biti umetnuti u vektor plazmida, stvarajući tako zvani rekombinantni plazmid. Plazmidski vektori se koriste kao vozila za pogon rekombinantne DNK u ćeliju domaćina i ključna su komponenta molekularnog kloniranje.
“Neviralni vektori se intenzivno proučavaju za njihovu potencijalnu upotrebu u genskoj terapiji za liječenje raznih kompliciranih bolesti. Neviralni vektori štite plazmidnu DNK od fizičke, hemijske, i enzimatske degradacije i isporuče MOLEKULU DNK na ciljno mjesto. Na primjer, cationic liposomi, chitosan i druge pozitivno naelektrisane nanočestice formiraju komplekse sa plazmidnom DNK kroz elektrostatičke interakcije. Međutim, kompleksi PLAZMID-a su relativno veliki (300-400 nm) i heterogeni u prirodi, što ih otežava za korištenje u farmaceutskim primjenama. Veliki i heterogeni plazmidni DNK/liposomi, plazmidni DNK/aerosoli i plazmidni DNA/peptidni kompleksi mogu se smanjiti na manje, a homogene čestice pomoću ultrasonikacije.” (Sarker et al., 2019)
Istaknuti primjer za korištenje vektora plazmida je CRISPR–Cas9. CRISPR–Cas9 sistem se obično isporučuje ćelijama kao jedan veliki plazmid ili više manjih plazmida koji kodiraju ciljnu sekvencu, CRISPR vodič i Cas9.

Ultrazvučna priprema PLGA nanočestica natovarenih DNK nanoprecipitacijom

Jo et al. (2020) je koristio poli(laktičko-ko-glikolnu kiselinu) (PLGA) kako bi formirao nosač nanočesnika za isporuku modela CRISPR–Cas9 plazmid u primarnu koštanu srž izvedene makrofage. Za nanoprecipitaciju PLGA nanočestica, PLGA sa dvije različite end grupe (ester i amine grupe) su korišteni s ciljom da pozitivno naefriran amine end kape povećavaju efikasnost enkapsulacije i učitavanje zbog interakcija naboja između nje i negativno naboja okosnice DNK. U 50 mL polipropilenska konusna centrifuga cijev, 100 mg pluronske F127 je rastvorena u 20 mL autoklaviranoj DI vodi miješajući vrtlog nakon koje slijedi 30 min nježnog sonicationa pomoću ultrazvučne kupke (vidi CupHorn). Dodana je autoklavizirana magnetna traka za miješanje i otopina je pomiješana na 600 RPM 30 min dok su ostala rješenja napravljena. Plastični labware je korišten umjesto stakla u cijelom da bi se smanjila nespecificna adsorpcija DNK. Otopine PLGA rastvorenih u DMF (44,48 mg/ ml) i TIPS pentacenu rastvorenom u THF (0,667 mg/ml) su napravljene odvojeno. PLGA je ostavljena tiho da mokra u DMF-u 30 min prije nego što je sonicated 30 min. (za potpuni protokol vidi Jo et al., 2020)

Plazmidna DNK zaštita tokom Sonication

DNK uključujući plazmide i superkuhane plazmide su vrlo osjetljiva degradacija. Sve dostupne metode fragmentacije su poznate po određenim manama. Ultrazvučna rascjepkanost DNK je jedna od preferenciranih metoda pošto kontrolirana sonikacija u kombinaciji sa zaštitnim mjerama omogućava smanjenje smicanja i topline izazvanog oštećenja DNK nit.
Pored niskih postavki amplituda, načina pulsacije i kontrole temperature tokom ultrazvučnog DNA šišanja, upotreba određenih agenata pokazala je značajno zaštitno dejstvo protiv degradacije DNK. Na primjer, razni polimeri, peptidi i lipidi štite plazmidnu DNK tokom ultrasonifikacije.

Stabilnost plazmidnog DNK, i plazmidna DNK/IL nanokompleksi protiv ultrazvučnog smicnog stresa istražena je pomoću agaroze gela elektroforeze. I plazmidna DNK i plazmidna DNK/IL nanokompleksi bili su podvrgnuti ultrazvučnom smicnom stresu za različite tačke vremena. PLAZMIDNA je bila izložena ultrazvučnom smicnom stresu 0, 10, 20, 30, i 40 minuta. Međutim, plazmidna DNK/IL nanokompleksi su bili izloženi ultrazvučnom smicnom stresu 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 minuta.
(studija i slika: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) je pokazao da kada su plazmidna DNK / ionska tečnost (pDNA/IL) nanostrukturi podvrgnuti ultrazvučnom smicnom stresu za 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90, i 120 min i složeno sa komercijalno dostupnim kokacionim agensom za isporuku gena lipofectaminom, procenat fluorescentnih pozitivnih ćelija je bio 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65%, odnosno 50%(vidi grafikon ispod). Postotak fluorescentnih pozitivnih ćelija se povećao kada su nanostrukture bile podvrgnute ultrazvučnom smicajućem stresu 10, i 20 min, a nakon toga su se polako snižavale.

Utjecaj ionske tekućine [Bmim][PF6] na isporuku plazmidnog DNK u COS7 ćelije. Plazmidna DNK/IL (ionska tečnost) nanokompleksi bili su izloženi ultrazvučnom smicnom stresu do 120 minuta i složeni sa LA prije isporuke u COS7 ćelije. Podaci pokazuju prosječan broj (%) GFP pozitivnih HeLa ćelija izbrojanih u 10 različitih mikroskopskih polja i eksperiment je izveden više puta u tri različita dana. (Studija i grafikon: ©Sarker et al., 2019)

Ultrazvučna priprema lisata

Protokol za ultrazvučnu lizu ćelija
Počnite sa obogaćenim uzorkom ćelija koji je pripremljen putem metode razdvajanja ćelija (npr. odvajanje imunomagnetskih ćelija, sortiranje ćelija aktiviranih fluorescencijom (FACS), centrifugacija gradijenta densiteta, izolacija ćelija imunodenscencije).
Uzorci ćelija moraju pokazati volumen liznog bafera koji je primjeren eksperimentalnom cilju i ultrasonikatoru tipa sonde.
Hipotonični baferi su preferentni jer pojačavaju ultrazvučnu lizu ćelija. Važno je da se dodaci i koncentracija soli koriste na odgovarajući način.
Odaberite svoj ultrazvučni uređaj za lizu: Za indirektno sonikaciju bočica preporučuje se VialTweeter ili CupHorn. Za multiwell-ploče, UIP400MTP je idealan ultrasonicator. I klasična sonda tipa sonde, ultrazvučni homogenizer kao UP100H ili UP200Ht sa mikro vrhom su najpostojaniji.
Protokol za sondi tipa sonication: Stavi ultrasonikatornu sondu u volumen uzorka u mikrocentrifugnu cijev i soniciraj cca 10 sekundi. U zavisnosti od UZORKA DNK, sonikacija se može ponoviti još jedan ili dva puta. Potreban ultrazvučni ulaz energije (Ws/mL) zavisi od viskoznosti uzorka i tipa DNK. Hlađenje putem ledene kupke i načina pulsacije ultrasonikatora pomaže u sprečavanju da se uzorak termički degradira.
Nakon ultrazvučne lize, uzorak se centrifugirao da odvoji ostatke peleta (koji sadrže nelysed ćelije, jedro, i nelysed organelles)
Ako uzorak nije odmah obrađen dalje, može se čuvati na odgovarajućoj temperaturi kako bi se sačuvala njegova održivost.

Ultrasonikatori za fragmentaciju DNK

Hielscher Ultrasonics nudi razne ultrazvučne platforme za DNK, RNK i fragmentaciju hromatina. Ove različite platforme uključuju ultrazvučne sonde (sonotrode), indirektna sonication rješenja za istovremenu pripremu uzoraka više cijevi ili multi-well ploča (npr. 96-dobro ploča, mikrotiter ploča), sonoreaktora, i ultrazvučnih cuphorns. Sve platforme za DNK šišanje su napajane frekvencijski podešenim, ultrazvučnim procesorima visokih performansi, koji su precizno kontrolisani i dostavljaju reprodukljive rezultate.

Ultrazvučni procesori za bilo koji broj uzorka i veličinu

Uz Hielscherove multi-uzorke ultrasonicators VialTweeter (za do 10 test cijevi) i UIP400MTP (za mikroplate/ multiwell ploče) postaje lako moguće smanjiti vrijeme obrade uzoraka zbog intenzivne i precizno kontrolirane ultrasonikacije uz dobivanje željene distribucije i prinosa veličine fragmenta DNK. Ultrazvučna fragmentacija DNK čini korake pripreme plazmida efikasnim, pouzdanim i skalablnim. Protokoli se mogu približno skalirati od jednog do brojnih uzoraka primjenom stalnih ultrazvučkih parametara.
Ultrasonikatori sonde sa jednim do pet prstiju idealni su za pripremu manjih brojeva uzoraka. Hielscherovi ultrasonikatori su dostupni sa različitim nivoima snage tako da možete odabrati idealan ultrazvučni disruptor za vašu primjenu vezanu uz DNK.