Priprema plazmida ultrazvukom

Ultrazvuk je pouzdana tehnika za fragmentaciju plazmidne DNK. Precizno kontrolirana amplituda, način pulsiranja i kontrola temperature su najvažnije karakteristike ultrazvučnog aparata za neoštećujuću fragmentaciju plazmida. Osim toga, upotreba određenih agenasa pomaže u zaštiti od razgradnje plazmida. Hielscher Ultrasonics nudi različita rješenja za kontroliranu fragmentaciju plazmida iz pojedinačnih bočica, simultanu sonikaciju brojnih uzoraka kao i ploča s više jažica. Saznajte više o uspješnoj ultrazvučnoj fragmentaciji plazmida!

Smicanje plazmida pomoću ultrazvuka

Kada se uzorci DNK podvrgnu ultrazvučnim talasima, ultrazvučno generisane vibracije stvaraju akustičnu kavitaciju u tečnosti koja šiša ili razbija molekule DNK visoke molekularne težine putem mehaničkih sila. Obrada ultrazvukom je najrasprostranjenija metoda za masovne eksperimente smicanja DNK, uključujući aplikacije, kao što je Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), za koje su male veličine fragmenata apsolutno ključne za postizanje visoke rezolucije. (usp. Tseng et al., 2012.)
Plazmidna DNK (pDNA) je specifičan oblik DNK, karakteriziran svojim prstenastim oblikom i nalazi se u bakterijama i nekim eukariotima.
Supercoiled pDNA je željeni oblik plazmidne DNK jer pokazuje najbolje rezultate u nizvodnim procesima kao što su automatsko sekvenciranje i transfekcija. Ultrazvučna obrada je pogodna za uspješno fragmentiranje pDNK, uključujući supercoilled pDNK.
Thompson et al. (2008) su pokazali da je sonikacija plazmidom, za koju je poznato da fragmentira supernamotanu DNK, efikasan način da se poboljšaju dužine očitavanja sekvence phred20 do te mjere da se ne razlikuju značajno od Beckman Coulterovog kontrolnog šablona ili enzimski lineariziranih plazmida.

Upotreba plazmidnih vektora

Plazmidi se često koriste kao alati za kloniranje, prijenos i manipulaciju genima. Kada se plazmidi eksperimentalno koriste u ove svrhe, oni se nazivaju vektori. DNK fragmenti ili geni mogu se umetnuti u plazmidni vektor, stvarajući takozvani rekombinantni plazmid. Plazmidni vektori se koriste kao nosači za pokretanje rekombinantne DNK u ćeliju domaćina i ključna su komponenta molekularnog kloniranja.
“Nevirusni vektori se opsežno proučavaju za njihovu potencijalnu upotrebu u genskoj terapiji za liječenje različitih komplikovanih bolesti. Nevirusni vektori štite plazmidnu DNK od fizičke, hemijske i enzimske degradacije i isporučuju molekul DNK na ciljno mesto. Na primjer, kationski liposomi, hitozan i druge pozitivno nabijene nanočestice formiraju komplekse sa plazmidnom DNK putem elektrostatičkih interakcija. Međutim, lako formirani kationski liposomi/plazmidni DNK kompleksi su relativno veliki (tj. 300-400 nm) i heterogene prirode što ih čini teškim za upotrebu u farmaceutskim aplikacijama. Veliki i heterogeni plazmidni DNK/liposomi, plazmidni DNK/aerosoli i plazmidni DNK/peptidni kompleksi mogu se reducirati na manje i homogene čestice pomoću ultrazvučne obrade.” (Sarker et al., 2019.)
Istaknuti primjer za upotrebu plazmidnih vektora je CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 sistem se obično isporučuje ćelijama kao jedan veliki plazmid ili više manjih plazmida koji kodiraju ciljnu sekvencu, CRISPR vodič i Cas9.

Ultrazvučna priprema PLGA nanočestica napunjenih DNK nanoprecipitacijom

Jo et al. (2020) koristili su poli(mliječnu-ko-glikolnu kiselinu) (PLGA) kako bi formirali nosač nanočestica za isporuku modela CRISPR-Cas9 plazmida u primarne makrofage izvedene iz koštane srži. Za nanoprecipitaciju PLGA nanočestica, PLGA s dvije različite krajnje grupe (esterske i aminske grupe) korištene su s ciljem da pozitivno nabijene krajnje kapice amina povećaju efikasnost inkapsulacije i opterećenje zbog interakcije naboja između njega i negativno nabijene kičme DNK. U polipropilenskoj konusnoj centrifugalnoj epruveti od 50 mL, 100 mg Pluronic F127 je otopljeno u 20 mL autoklavirane DI vode vorteks miješanjem nakon čega je slijedilo 30 minuta nježne sonikacije pomoću ultrazvučne kupke (vidi CupHorn). Dodata je autoklavirana magnetna mešalica i rastvor je mešan na 600 RPM tokom 30 minuta dok su ostali rastvori napravljeni. Umjesto staklenog, korišteno je plastično laboratorijsko posuđe kako bi se svela na minimum nespecifična adsorpcija DNK. Odvojeno su napravljeni rastvori PLGA rastvorenog u DMF (44,48 mg/ml) i TIPS pentacena rastvorenog u THF (0,667 mg/ml). PLGA je ostavljen u mirnom stanju da se vlaži u DMF-u 30 minuta prije nego što je 30 minuta sonikiran. (za kompletan protokol vidi Jo et al., 2020.)

Zaštita plazmidne DNK tokom ultrazvučne obrade

DNK uključujući plazmide i supersmotane plazmide su vrlo osjetljive degradacije. Sve dostupne metode fragmentacije poznate su po određenim nedostacima. Ultrazvučna fragmentacija DNK jedna je od poželjnih metoda budući da kontrolirana sonikacija u kombinaciji sa zaštitnim mjerama omogućava smanjenje oštećenja lanaca DNK uzrokovana posmikom i toplinom.
Pored podešavanja niske amplitude, režima pulsiranja i kontrole temperature tokom ultrazvučnog smicanja DNK, upotreba određenih agenasa pokazala je značajan zaštitni efekat protiv degradacije DNK. Na primjer, različiti polimeri, peptidi i lipidi štite plazmidnu DNK tokom ultrazvučne obrade.

Stabilnost plazmidne DNK i nanokompleksa plazmidne DNK/IL na ultrazvučno smično naprezanje ispitana je elektroforezom u agaroznom gelu. I plazmidna DNK i plazmidna DNK/IL nanokompleksi su bili podvrgnuti ultrazvučnom smičnom naprezanju u različitim vremenskim tačkama. Plazmidna DNK je bila izložena ultrazvučnom smičnom naprezanju 0, 10, 20, 30 i 40 minuta. Međutim, nanokompleksi plazmida DNK/IL bili su izloženi ultrazvučnom smičnom naprezanju 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 minuta.
(studija i slika: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) su pokazali da kada su nanostrukture plazmidne DNK/jonske tekućine (pDNA/IL) bile podvrgnute ultrazvučnom smičnom naprezanju u trajanju od 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 minuta i kompleksirale sa komercijalno dostupnim kationskim genom agensa za isporuku lipofektamina, procenat fluorescentnih pozitivnih ćelija bio je 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% i 50%, respektivno (vidi grafikon ispod). Postotak fluorescentnih pozitivnih ćelija povećavao se kada su nanostrukture bile podvrgnute ultrazvučnom smičnom naprezanju u trajanju od 10 i 20 minuta, a nakon toga se polako smanjivao.

Utjecaj jonske tekućine [Bmim][PF6] na isporuku plazmidne DNK do COS7 stanica. Nanokompleksi plazmidne DNK/IL (jonske tečnosti) podvrgnuti su ultrazvučnom stresu smicanja do 120 minuta i kompleksirani sa LA prije nego što su isporučeni u ćelije COS7. Podaci pokazuju prosječan broj (%) GFP pozitivnih HeLa ćelija izbrojanih u 10 različitih mikroskopskih polja i eksperiment je izveden više puta u tri različita dana. (Studija i grafikon: ©Sarker et al., 2019.)

Ultrazvučna priprema lizata

Ultrasonic Cell Lysis Protocol
Počnite sa obogaćenim uzorkom ćelija koji je pripremljen metodom separacije ćelija (npr. imunomagnetsko odvajanje ćelija, fluorescentno aktivirano sortiranje ćelija (FACS), centrifugiranje u gradijentu gustine, izolacija ćelija imunogustine).
Uzorci ćelija moraju pokazati volumen pufera za lizu koji je prikladan za eksperimentalni cilj i ultrazvučni uređaj tipa sonde.
Poželjni su hipotonični puferi jer pojačavaju ultrazvučnu lizu ćelija. Važno je da se aditivi i koncentracija soli koriste na odgovarajući način.
Odaberite svoj ultrazvučni uređaj za lizu: Za indirektnu sonikaciju bočica preporučuje se VialTweeter ili CupHorn. Za ploče sa više jažica, UIP400MTP je idealan ultrasonikator. Najprikladniji su klasični ultrazvučni ultrazvučni uređaji tipa UP100H ili UP200Ht sa mikro vrhom.
Protokol za sonikaciju tipa sonde: Stavite sondu ultrazvučnog aparata u zapreminu uzorka u epruvetu za mikrocentrifugu i sonikirajte pribl. 10 sekundi. Ovisno o uzorku DNK, sonikacija se može ponoviti još jednom ili dva puta. Potreban unos ultrazvučne energije (Ws/mL) zavisi od viskoziteta uzorka i tipa DNK. Hlađenje preko ledene kupke i pulsiranja ultrazvučnog aparata pomaže u sprečavanju termičke degradacije uzorka.
Nakon ultrazvučne lize, uzorak se centrifugira kako bi se odvojili ostaci peleta (koji sadrže nelizirane stanice, jezgra i nelizirane organele)
Ako se uzorak ne obradi odmah dalje, može se čuvati na odgovarajućoj temperaturi kako bi se očuvala njegova održivost.

Ultrasonikatori za fragmentaciju DNK

Hielscher Ultrasonics nudi različite platforme zasnovane na ultrazvuku za fragmentaciju DNK, RNK i hromatina. Ove različite platforme uključuju ultrazvučne sonde (sonotrode), rješenja za indirektnu sonikaciju za istovremenu pripremu uzoraka više epruveta ili ploča sa više jažica (npr. ploče sa 96 jažica, mikrotitarske ploče), sonoreaktore i ultrazvučne čašice. Sve platforme za šišanje DNK pokreću se frekvencijski podešenim ultrazvučnim procesorima visokih performansi, koji se mogu precizno kontrolisati i daju ponovljive rezultate.

Ultrazvučni procesori za bilo koji broj i veličinu uzorka

Sa Hielscherovim ultrazvučnim aparatima za više uzoraka VialTweeter (za do 10 epruveta) i UIP400MTP (za mikroploče/ploče s više jažica) postaje lako moguće smanjiti vrijeme obrade uzorka zbog intenzivne i precizno kontrolirane ultrazvučne obrade dok se postiže željena distribucija veličine DNK fragmenta i prinos. . Ultrazvučna fragmentacija DNK čini korake pripreme plazmida efikasnim, pouzdanim i skalabilnim. Protokoli se mogu linearno skalirati od jednog do brojnih uzoraka primjenom konstantnih parametara ultrazvuka.
Ultrasonikatori sonde sa jednim do pet prstiju idealni su za pripremu manjeg broja uzoraka. Hielscherovi laboratorijski ultrasonikatori dostupni su s različitim razinama snage tako da možete odabrati idealan ultrazvučni disruptor za vašu primjenu vezanu za DNK.