Ultrazvučna priprema uzoraka potpomognuta filtrom (FASP): unapređenje proteomskih radnih tokova naprednom ultrazvučnom obradom (sonikacijom)

Ultrazvučna priprema uzoraka potpomognuta filtrom (FASP) pojavljuje se kao vrlo efikasna i reproducibilna metoda u modernoj proteomici. Integracijom kontrolirane ultrazvučne obrade (sonikacije) u uhodane FASP radne tokove istraživači mogu znatno poboljšati ekstrakciju proteina, efikasnost digestije i ukupni kvalitet podataka. Zbog sve veće potražnje za visokopropusnom i reproducibilnom pripremom uzoraka fokusirani sonikatori, poput sonikatora za mikroploče UIP400MTP, dobivaju sve veći naučni i praktični značaj.

Naučni kontekst: zašto je FASP važan u proteomici

Priprema uzoraka potpomognuta filtrom (FASP) postala je zlatni standard u proteomici „odozdo prema gore“ (bottom-up) zbog mogućnosti uklanjanja deterdženata, soli i drugih kontaminanata uz istovremenu efikasnu enzimsku digestiju. Međutim, klasični FASP protokoli često imaju ograničenja povezana s nepotpunom lizom, nedosljednom digestijom i varijabilnošću uzoraka – naročito pri radu sa složenim ili otpornim biološkim ćelijama ili tkivima.
Upravo tu fokusirana ultrazvučna energija (sonikacija) pruža odlučujuću prednost. Uvođenjem mehaničkih smičnih sila i kavitacije, ultrazvučna obrada poboljšava više kritičnih koraka u FASP radnom toku bez narušavanja integriteta proteina.

Pozitivni učinci ultrazvučne obrade u ultrazvučnom FASP-u

Ultrazvučna obrada uvodi kontroliranu akustičnu kavitaciju – mikroskopsko stvaranje i kolaps mjehurića – koja generira lokalizirane smične sile i mikrostrujanje.
Ultrazvučna obrada poboljšava i korak alkilacije i korak digestije u ultrazvučnom FASP-u poboljšanjem prijenosa mase i ubrzavanjem reakcijske kinetike. Primjena ultrazvučne energije stvara kavitaciju, što dovodi do lokaliziranog mikrostrujanja i prolaznih smičnih sila koje potiču brzo miješanje i efikasno prodiranje reagensa u proteinski matriks ili okruženje filtra. Tokom alkilacije to rezultira ujednačenijom i bržom modifikacijom ostataka cisteina jodacetamidom. U koraku digestije ultrazvučna obrada povećava dostupnost proteolitičkih mjesta cijepanja i poboljšava interakcije enzima i supstrata, čime ubrzava aktivnost tripsina i povećava efikasnost digestije. Ukupno gledano, ultrazvučna obrada skraćuje vrijeme obrade uz održavanje ili poboljšanje potpunosti reakcije i reproducibilnosti.

U pripremi uzoraka za proteomiku, ultrazvučni FASP znači:

• Efikasniju razgradnju ćelija i ekstrakciju proteina, čak i kod žilavih tkiva ili mikrobnih uzoraka
• Poboljšanu solubilizaciju proteina
• Bolju dostupnost enzima tokom digestije
• Skraćeno vrijeme obrade i veću reproducibilnost

Za razliku od konvencionalnih mehaničkih ili hemijskih metoda lize, ultrazvučna obrada je vrlo kontrolirana i skalabilna, zbog čega je posebno pogodna za standardizirane proteomske radne tokove.

Prednosti ultrazvučnog FASP-a u odnosu na konvencionalne pristupe

Integracija ultrazvučne obrade u FASP protokole pruža mjerljive koristi koje direktno utječu na rezultate masene spektrometrije u nastavku procesa.
Ultrazvučni FASP omogućava potpuniji oporavak proteina, naročito iz zahtjevnih uzoraka poput vlaknastih tkiva ili biofilmova. Ujednačena raspodjela energije osigurava dosljednu obradu među replikatima i smanjuje varijabilnost – što je bitan zahtjev za kvantitativnu proteomiku.
Osim toga, ultrazvučna obrada ubrzava kinetiku digestije poboljšanjem interakcije enzima i supstrata. To često rezultira kraćim vremenom digestije i većim prinosom peptida uz očuvanje pokrivenosti sekvence.
Sa stajališta radnog toka, ultrazvučni sistemi smanjuju ručne intervencije i uklanjaju potrebu za agresivnim hemijskim tretmanima, čime se čuva integritet uzorka i pojednostavljuje standardizacija protokola.

Vennov dijagram koji prikazuje povećan broj identificiranih proteina ultrazvučnim FASP-om u poređenju s FASP-om preko noći
Slika i studija: ©Carvalho et al., 2020

Protokol: visokopropusni ultrazvučni FASP s UIP400MTP

Za laboratorije koje obrađuju velike kohorte uzoraka, sonikator za mikroploče UIP400MTP omogućava istovremenu ultrazvučnu obradu standardnih višejažičnih ploča (npr. ploča s 96 jažica), čime se znatno povećavaju propusnost i reproducibilnost.
U ovom formatu uzorci (obično 50–200 µL po jažici) pripremaju se direktno u mikroločama kompatibilnim s ultrafiltracijom ili daljnjom obradom. Puferi za lizu slični su onima koji se koriste u standardnim FASP protokolima.

UIP400MTP primjenjuje ujednačenu ultrazvučnu energiju na sve jažice. Ultrazvučna obrada obično se provodi pri amplitudi od 60–80% tokom 2–4 minute, ovisno o vrsti uzorka. Temperaturu pratite pomoću priključivog temperaturnog senzora. Koristite pulsnu ultrazvučnu obradu i, po želji, laboratorijski hladnjak.

Primjer protokola:

1. Za korak alkilacije uzorci se ultrazvučno obrađuju sonikatorom za mikroploče (UIP400MTP) pri amplitudi od 40% tokom 7 ciklusa (30 s ON, 15 s OFF; ukupno vrijeme ultrazvučne obrade: 5 min 45 s).
2. Nakon ultrazvučne obrade, otopina jodacetamida (IAA) uklanja se centrifugiranjem. Prije digestije tripsinom uzorci se moraju isprati kako bi se uklonila zaostala urea, jako haotropno sredstvo koje inhibira enzimsku aktivnost. Zbog toga se uzorci dvaput ispiru s 200 μL 25 mM amonijevog bikarbonata (AmBic).
3. Zatim se dodaje 100 μL otopine tripsina (omjer enzima i proteina 1:30) pripremljene u 12,5 mM amonijevog bikarbonata. Digestija proteina se potom provodi pomoću UIP400MTP pod istim uvjetima ultrazvučne obrade (amplituda 40%, 7 ciklusa, 30 s ON / 15 s OFF; ukupno vrijeme: 5 min 45 s).
4. Nakon ultrazvučne obrade uzorci se prenose na filterske ploče ili obrađuju pomoću FASP sistema zasnovanih na pločama. Koraci redukcije i alkilacije izvode se u ploči, čime se održava pojednostavljen radni tok.
5. Digestija tripsinom provodi se pod kontroliranim uvjetima (npr. 37°C, 4–16 sati), uz mogućnost kratke ultrazvučne stimulacije radi ubrzavanja enzimske aktivnosti i povećanja prinosa peptida.
6. Peptidi se oporavljaju centrifugiranjem i spremni su za LC-MS/MS analizu.

Ključna prednost ovog sistema je mogućnost osiguravanja identičnih uvjeta obrade u svim jažicama, čime se minimiziraju učinci serije i omogućavaju pouzdana kvantitativna poređenja u proteomskim studijama velikih razmjera.

Dizajn, proizvodnja i savjetovanje – kvalitet proizveden u Njemačkoj

Hielscher ultrazvučni uređaji poznati su po svom najvišem kvalitetu i standardima dizajna. Robusnost i jednostavno rukovanje omogućavaju nesmetanu integraciju naših ultrazvučnih uređaja u industrijska postrojenja. Hielscher ultrazvučni uređaji lako podnose teške uvjete i zahtjevna okruženja.

Hielscher Ultrasonics je ISO certificirana kompanija i posebno naglašava visokoučinkovite ultrazvučne uređaje s najsavremenijom tehnologijom i jednostavnošću korištenja. Naravno, Hielscher ultrazvučni uređaji su u skladu s CE oznakom i ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.

Literatura / reference

FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
• Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
• Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).