Proteomski protokol: beskontaktna sonikacija poboljšava pripremu peptidnih uzoraka za MS

Proteomika „odozdo prema gore“ (bottom-up) postala je temelj modernog otkrivanja biomarkera, strukturne biologije i kliničke dijagnostike. Razgradnjom proteina na peptide prije analize masenom spektrometrijom (MS) istraživači mogu postići veću pokrivenost sekvence i pouzdaniju kvantifikaciju. Međutim, priprema bioloških uzoraka visoke kompleksnosti za MS i dalje je tehnički zahtjevna. Nedavni metodološki napreci pokazuju kako kontrolirana ultrazvučna obrada – posebno beskontaktnim višecijevnim sonikatorom VialTweeter Multi-Tube i mikroplatnim sonikatorom UIP400MTP Microplate – može znatno pojednostaviti ovaj tijek rada, poboljšati ponovljivost i spriječiti uobičajena uska grla instrumenata.
Pronađite detaljan protokol pripreme uzoraka za dobivanje peptida odgovarajuće veličine za analizu metodom MS.

Ko bi trebao koristiti beskontaktnu sonikaciju za pripremu peptidnih uzoraka?

• Laboratoriji za proteomiku „odozdo prema gore“ i otkrivanje: Istraživači koji pripremaju uzorke visoke kompleksnosti za LC-MS ili MALDI tijekove rada i zahtijevaju dosljedan, visok prinos peptida iz raznovrsnih bioloških matrica.
• Korisnici S-Trap™ i metode hvatanja u suspenziji: Timovi koji se oslanjaju na čišćenje u mikrokolonama i trebaju kontrolirano usitnjavanje DNK kako bi spriječili začepljenje kolone i osigurali nesmetano nanošenje uzorka i digestiju.
• Kliničke i translacijske istraživačke grupe: Laboratoriji koji obrađuju tkivo, ćelije, plazmu, serum ili cerebrospinalnu tečnost, gdje su ponovljivost od serije do serije i integritet uzorka od presudne važnosti.
• Timovi za kvantitativnu i ciljanu MS: Laboratoriji koji provode stroge komparativne studije u kojima sonikatori sa sondom unose rizik od unakrsne kontaminacije koja bi mogla ugroziti kvantifikaciju peptida niske zastupljenosti.
• Centralni laboratoriji i operacije visoke propusnosti: Grupe koje istovremeno obrađuju više bioloških replikata i koje imaju koristi od sonikacije u bloku sa zatvorenim epruvetama i više epruveta pomoću uređaja VialTweeter, što eliminira čišćenje sonde, smanjuje vrijeme ručnog rada i održava aseptične uvjete.
• Istraživači PTM-a i strukture proteina: Istraživači kojima je potrebna blaga obrada uz kontrolu temperature radi očuvanja labilnih modifikacija i maksimalne pokrivenosti sekvence tokom lize ćelija i homogenizacije.

Pregled protokola: od tkiva i ćelija do peptida spremnih za MS

Široko prihvaćen tijek rada proteomike „odozdo prema gore“ koji su opisali Wojtkiewicz i sur. pruža robusnu, skalabilnu metodu za pripremu peptidnih uzoraka iz raznovrsnih bioloških matrica. Polazeći od 50–100 mg brzo smrznutog tkiva ili 1–20 miliona ćelija, protokol integrira tehnologiju hvatanja u suspenziji (S-Trap™) radi efikasnog uklanjanja deterdženata, soli i kontaminanata prije enzimske digestije.
Nakon lize, kvantifikacije proteina, redukcije i alkilacije uzorak se zakiseli i nanese na S-Trap™ centrifugalnu kolonu, gdje se odvija digestija tripsinom/lysC. Dobiveni peptidi se eluiraju, suše i podvrgavaju LC-MS analizi. Kada se primijeni na 50 mg ljudskog srčanog tkiva, ovaj tijek rada dosljedno daje dovoljno peptida za 30–40 injekcija, uz identifikaciju više od 4.000 jedinstvenih proteina po analizi. Iako su hemija i čišćenje na koloni dobro definirani, uspjeh cijelog postupka u velikoj mjeri ovisi o početnim koracima fizičkog razaranja i upravljanja DNK.
Protokol preporučuje upotrebu višecijevnog sonikatora VialTweeter za sonikacijsku lizu ćelija i usitnjavanje DNK – oba koraka su ključna za analizu peptida.

Ultrazvučna liza ćelija i tkiva za ekstrakciju proteina

U tijeku rada proteomike „odozdo prema gore“ sonikacija je ključni korak u lizi uzoraka ćelija radi ekstrakcije proteina za naknadnu analizu masenom spektrometrijom. Nakon dodavanja SDS pufera za lizu ćelija u talog ćelija, uzorci se podvrgavaju ultrazvučnoj obradi pomoću višecijevnog sonikatora VialTweeter. Protokol koristi mikrocentrifugalne epruvete od 1,5 mL i propisuje rad sonikatora pri 30% snage, 10 sekundi uključeno i 10 sekundi isključeno, ponovljeno u 3 ciklusa. Nakon čekanja od 1 minute ciklus se ponovi još dva puta. Uzorci se neprekidno hlade ledom.
Ovaj proces ne samo da pomaže u razgradnji ćelija nego je posebno neophodan za usitnjavanje genomske DNK oslobođene tokom lize. Efikasno usitnjavanje DNK ključno je za smanjenje viskoznosti uzorka i sprječavanje začepljenja S-Trap™ kolona, čime se osiguravaju optimalan oporavak proteina i pouzdana naknadna digestija peptida.

Ključna uloga ultrazvučnog usitnjavanja DNK

Jedan od najčešćih kvarova u tijekovima rada zasnovanim na S-Trap™ jest začepljenje kolone, koje gotovo isključivo uzrokuje genomska DNK velike molekulske mase oslobođena tokom homogenizacije ćelija ili tkiva. Netaknuta DNK dramatično povećava viskoznost uzorka, zadržava peptide i blokira mikroporozni sorbentni sloj S-Trap™.
Ultrazvučna obrada rješava ovaj problem mehaničkom fragmentacijom DNK na male, topive fragmente. Primjenom kontrolirane akustične energije VialTweeter efikasno usitnjava nukleinske kiseline bez stvaranja prekomjerne toplote i unošenja stranih kontaminanata. Ovo smanjenje viskoznosti osigurava nesmetano nanošenje uzorka, ujednačene protoke kroz kolonu i neprekinutu kinetiku digestije.

Optimizirani parametri sonikacije uređajem VialTweeter

Protokol propisuje visoko ponovljiv režim sonikacije optimiziran za integritet bioloških uzoraka i naknadnu MS kompatibilnost. Za uzorke u mikrocentrifugalnim epruvetama od 1,5mL, uz upotrebu beskontaktnog blok sonikatora Hielscher VialTweeter, sljedeći parametri omogućuju lizu i optimalno usitnjavanje DNK uz očuvanje strukture proteina:

• Amplituda: 30% snage
• Obrazac ciklusa: 10 sekundi UKLJUČENO / 10 sekundi ISKLJUČENO
• Trajanje: 3 ciklusa (10 s UKLJ./10 s ISKLJ.) → 1 minuta odmora na ledu → ponoviti još 2 puta
• Upravljanje temperaturom: uzorci se tokom obrade stavljaju na led radi sprječavanja toplotne denaturacije i prerane enzimske aktivnosti

Ovaj pulsni pristup sonikaciji sprječava lokalizirano pregrijavanje, svodi oksidaciju peptida na najmanju mjeru i osigurava ujednačenu akustičnu izloženost u svim bočicama. Postavka sa zatvorenim epruvetama također eliminira potrebu za čišćenjem sonde između uzoraka, čime se drastično smanjuju vrijeme ručnog rada i varijabilnost operatera.

Ključne prednosti za moderne tijekove rada proteomike

Integracija uređaja VialTweeter u vaš tijek rada proteomike „odozdo prema gore“ nudi nekoliko operativnih i naučnih prednosti:

1. Dosljedna fragmentacija DNK: Ujednačena isporuka akustične energije u svim bočicama osigurava ponovljivo smanjenje viskoznosti i sprječava varijabilnost od serije do serije pri nanošenju na S-Trap™.
2. Očuvanje labilnih modifikacija: Obrada na niskoj temperaturi u ledenoj kupelji štiti posttranslacijske modifikacije (PTM) i sprječava agregaciju proteina uzrokovanu toplotom tokom lize ćelija.
3. Pojednostavljena naknadna obrada: Lizati obrađeni uređajem VialTweeter mogu se direktno izbistriti centrifugiranjem i kvantificirati bez dodatnih koraka čišćenja, što ubrzava put do S-Trap™ digestije.
4. Skalabilnost i fleksibilnost: Iste postavke sonikacije primjenjuju se i na visoko kompleksne uzorke tkiva i na suspenzije ćelija, što podržava proteomiku otkrivanja, ciljanu kvantifikaciju i tijekove rada glikoproteomike. Hielscher mikroplatni sonikatori omogućuju jednostavno povećanje razmjera na veliki broj uzoraka u višejažicnim pločama.

Literatura / reference

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
• Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
• Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.