Ultrazvučna obrada mikroploča u shotgun proteomici – aplikacijska bilješka

Shotgun proteomika zavisi od efikasne, ponovljive pripreme uzoraka kako bi se složen biološki materijal pretvorio u peptide spremne za LC-MS/MS. Ultrazvučni uređaj za mikroploče UIP400MTP podržava taj proces omogućavajući standardiziranu, paralelnu ultrazvučnu obradu uzoraka malog volumena, čime laboratorijama pomaže da poboljšaju razgradnju, ekstrakciju i resolubilizaciju u radnim tokovima zasnovanim na mikropločama. Ova aplikacijska bilješka opisuje kako se UIP400MTP može integrirati u pripremu uzoraka za proteomiku, na primjeru objavljenog radnog toka za ekstracelularne vezikule iz studija PLA2G12A/Th17, provjerenog u laboratoriju.

Ultrazvučna obrada mikroploča za ponovljiviju shotgun proteomiku

Za istraživače u proteomici ponovljiva priprema uzoraka presudna je za visokokvalitetne LC-MS/MS podatke. Ultrazvučni uređaj za mikroploče UIP400MTP podržava standardiziranu, paralelnu ultrazvučnu obradu u radnim tokovima zasnovanim na pločama te u radnim tokovima s malim volumenima i visokim protokom uzoraka.

Posebno je koristan za laboratorije koje rade sa:

• Velikim skupovima uzoraka koji zahtijevaju dosljednu obradu u mnogo jažica
• Materijalom ograničene količine, gdje se gubitak uzorka i varijabilnost moraju svesti na minimum
• Uzorcima bogatim lipidima, kao što su ekstracelularne vezikule
• Složenim biološkim preparatima koji zahtijevaju efikasnu razgradnju, ekstrakciju ili resolubilizaciju
• Komparativnom shotgun proteomikom, gdje je ponovljivost među uvjetima i replikatima ključna

Integriranjem ultrazvučne obrade mikroploča prije digestije istraživači mogu poboljšati spremnost uzorka za:

• Ekstrakciju i resolubilizaciju proteina
• Digestiju tripsinom/Lys-C
• Nano-LC/MS/MS akviziciju
• Kvantitativnu proteomsku analizu u narednim koracima

Ultrazvučna obrada mikroploča može koristiti:

• Proteomskim centralnim laboratorijima
• Laboratorijama za istraživanje EV
• Imunološkim i ćelijskobiološkim laboratorijama
• Translacijskim istraživačkim grupama
• Timovima iz oblasti prirodnih nauka koji prelaze s pripreme pojedinačnih uzoraka na radne tokove većeg protoka uzoraka

Priprema uzoraka visokog protoka za analizu proteoma ekstracelularnih vezikula

Šta je shotgun proteomika?

Shotgun proteomika postala je središnja analitička strategija za karakterizaciju složenih bioloških uzoraka, od lizata cijelih ćelija i tkivnih ekstrakata do pročišćenih organela, ekstracelularnih vezikula i kliničkih uzoraka s malom količinom materijala. Njena osnovna snaga leži u povezivanju digestije proteina, tekućinske hromatografije visoke rezolucije udružene s tandemskom masenom spektrometrijom i računalnog zaključivanja od peptida do proteina. Međutim, kvalitet konačnog proteomskog skupa podataka određen je mnogo prije nego što uzorak dospije do masenog spektrometra. Efikasna razgradnja uzorka, solubilizacija proteina, uklanjanje interferirajućih tvari, ponovljiva enzimska digestija i robustan oporavak peptida – sve su to odlučujući faktori za dubinu pokrivenosti i kvantitativnu pouzdanost.
Za istraživače u proteomici i laboratorije prirodnih nauka koje rade s ograničenim ili dragocjenim uzorcima priprema uzoraka često predstavlja usko grlo.

Izazov ekstracelularnih vezikula u proteomici

Ekstracelularne vezikule (EV) primjerice predstavljaju posebno zahtjevnu klasu uzoraka. To su nanočestice omeđene membranom, bogate lipidima, s relativno niskim prinosom proteina i velikim potencijalom za prijenos lipida, soli, deterdženata, serumskih proteina i drugih komponenti matriksa. Te osobine mogu ometati efikasnost digestije, hromatografske performanse, stabilnost elektrospreja i identifikaciju peptida. Radni tok pripreme za EV proteomiku stoga mora biti dovoljno snažan da razgradi strukture vezikula i solubilizira proteinski sadržaj, a da istovremeno ostane kompatibilan s enzimskom digestijom i LC-MS/MS analizom u narednim koracima.
U tom kontekstu ultrazvučna obrada kompatibilna s mikropločama nudi praktičan pristup ponovljivoj, paraleliziranoj obradi uzoraka. Hielscher ultrazvučni uređaji za mikroploče, modeli UIP400MTP (400 W) i UIP550MTP (550 W), namijenjeni su ultrazvučnoj obradi uzoraka u višejažičnim pločama i posudama malog volumena, te podržavaju radne tokove većeg protoka uzoraka od konvencionalnih ultrazvučnih uređaja s jednom sondom. Za proteomske laboratorije ovaj je format privlačan jer može smanjiti varijabilnost uzrokovanu ručnim radom, poboljšati paralelnu obradu više uzoraka i prirodnije se integrirati u procese pripreme uzoraka zasnovane na pločama.

Primjer radnog toka

Nedavni radni tok proteomike ekstracelularnih vezikula u biologiji Th17-ćelija pod utjecajem PLA2G12A pruža koristan, u laboratoriju provjeren primjer kako se ultrazvučni uređaj za mikroploče UIP400MTP može uključiti u pripremu uzoraka za shotgun proteomiku. U toj seriji studija EV uzorci su za analizu proteoma obrađeni tretmanom metanolom, ultrazvučnom obradom uređajem UIP400MTP, centrifugiranjem, sušenjem, digestijom tripsinom/Lys-C i nano-protočnom tekućinskom hromatografijom visoke rezolucije udruženom s tandemskom MS. Biološki rad objavili su 2026. godine Mochizuki-Ono i saradnici, a proteomska analiza pomogla je da se karakterizira kako PLA2G12A mijenja proteine EV sadržaja u kontekstu patogenih odgovora T-ćelija.

Ultrazvučni uređaj za višejažične ploče UIP400MTP

Zašto ultrazvučna obrada mikroploča?
UIP400MTP omogućava standardiziranu, paralelnu ultrazvučnu obradu uzoraka malog volumena. To je korisno kada su važne ponovljivost, mala količina uzorka na ulazu i protok više uzoraka.


Kontrolna lista za kontrolu kvaliteta

• Potvrdite jednak ulaz izražen kao ekvivalent EV proteina u svim uzorcima.
• Koristite randomizirane ili uravnotežene rasporede obrade uzoraka.
• Održavajte dosljednim volumen metanola, vrijeme ultrazvučne obrade, vrijeme sušenja i volumen digestije.
• Pratite prinos peptida i ukupan broj identificiranih proteina.
• Provjerite stopu propuštenih cijepanja i raspodjelu dužine peptida.
• Pregledajte oblik hromatografskih pikova i ponovljivost vremena zadržavanja.
• Uključite slijepe probe radi praćenja prijenosa uzorka (carryover).
• Koristite objedinjene QC uzorke za veće studije.
• Procijenite koeficijent varijacije replikata.
• Koristite PCA ili srodne metode za identifikaciju efekata serija ili odstupajućih uzoraka.

Preporuke za protokoliranje

Pri objavljivanju ili dokumentiranju ovog radnog toka navedite količinu EV ulaza, format ploče, volumen metanola, amplitudu i trajanje ultrazvučne obrade uređajem UIP400MTP, uvjete centrifugiranja, metodu sušenja, pufer za digestiju, koncentraciju enzima, trajanje digestije, uvjete zakiseljavanja, LC-MS/MS platformu, način akvizicije, verziju softvera, bazu podataka, FDR prag, metodu normalizacije i statistički radni tok.
Svi Hielscher ultrazvučni uređaji za mikroploče automatski bilježe važne procesne parametre, kao što su amplituda, trajanje ultrazvučne obrade i temperatura, s datumom i vremenskim žigom kao CVS datoteku na integriranoj SD kartici. Protokoliranje podataka radi ponovljivosti i kontrole kvaliteta nikada nije bilo lakše!

Studija u detalje: EV shotgun proteomika u studiji PLA2G12A

Studija PLA2G12A pruža konkretan primjer upotrebe UIP400MTP u radnom toku shotgun proteomike. Biološko pitanje bilo je kako izlučena fosfolipaza PLA2G12A mijenja ekstracelularne vezikule porijeklom iz Th17-ćelija i time utječe na diferencijaciju patogenih T-ćelija. Autori su pokazali da PLA2G12A djeluje na EV membrane stvarajući lizofosfolipide, uključujući 1-oleoil-lizofosfatidiletanolamin, te da nizvodna signalizacija lizofosfatidnom kiselinom preko LPA2 doprinosi diferencijaciji Th17. Osim signalizacije lipidima, studije su ispitivale i sadržaj EV, uključujući RNA i proteine, zbog čega je shotgun proteomika važna komponenta strategije karakterizacije.
U radnom toku pripreme EV, Th17 ćelije su uzgajane u mediju koji sadrži fetalni goveđi serum iz kojeg su uklonjeni egzosomi. Supernatanti kulture prvo su centrifugirani radi uklanjanja ćelija, filtrirani kroz filter od 0,22 µm, koncentrirani ultrafiltracijom/ultracentrifugiranjem, isprani, resuspendirani u PBS-u i kvantificirani BCA testom proteina. Ova prethodna priprema EV osigurala je da se definirana količina EV materijala izražena kao ekvivalent proteina može prenijeti u proteomski radni tok.
Za shotgun proteomsku analizu autori su koristili EV uzorke koji odgovaraju 5 µg ekvivalenta proteina. Ti uzorci su osušeni u PCR epruvetama i dodano je 25 µL metanola. Uzorci su zatim ultrazvučno obrađivani 3 minute pomoću ultrazvučnog uređaja za mikroploče UIP400MTP. Nakon ultrazvučne obrade uzorci su centrifugirani na 4°C tokom 20 minuta pri 19.000 × g. Nakon uklanjanja 20 µL supernatanta uzorci su centrifugirani do suha. Proteini su potom otopljeni ultrazvučnom obradom u 4 µL otopine tripsina/Lys-C koncentracije 100 ng/µL u 50 mM amonijevom bikarbonatu. Digestija je provedena 2 sata na 37°C uz protresanje od 300 rpm. Digest je zakiseljen s 1 µL 1,25% trifluoroctene kiseline i podvrgnut nano-protočnoj tekućinskoj hromatografiji udruženoj s tandemskom masenom spektrometrijom visoke rezolucije.
Ovaj radni tok ističe nekoliko korisnih principa za EV proteomiku s malom količinom materijala. Prvo, ulaz je normaliziran prema ekvivalentu proteina, što je važno pri poređenju EV iz različitih genotipova ili tretmana. Drugo, metanol je korišten prije ultrazvučne obrade, čime se podržavaju razgradnja i ekstrakcija, a izbjegavaju sistemi s deterdžentima koji mogu otežati LC-MS/MS. Treće, korak ultrazvučne obrade bio je kratak i standardiziran, što je kompatibilno s paralelnom obradom uzoraka. Četvrto, digestija tripsinom/Lys-C provedena je u vrlo malom volumenu, čime se smanjuje razrjeđenje i podržava oporavak peptida iz male količine materijala. Konačno, direktan prijelaz s digestije na zakiseljavanje i LC-MS/MS sveo je nepotrebne korake rukovanja na minimum.
LC-MS/MS metoda u narednim koracima koristila je nano-protočno razdvajanje s obrnutim fazama udruženo s Q-Exactive HF Orbitrap masenim spektrometrom. Uzorci su zadržani na C18 pretkoloni, a zatim razdvojeni na analitičkoj koloni unutrašnjeg promjera 50 µm pri 200 nL/min i 40°C. Gradijent je išao od niskog udjela organskog otapala do 35% otapala B tokom 60 minuta, nakon čega su slijedili ispiranje visokim udjelom organskog otapala i reekvilibracija. MS akvizicija je provedena u pozitivnom jonskom modu akvizicijom neovisnom o podacima uz kolizijsku disocijaciju višom energijom. Sirove DIA datoteke analizirane su pomoću DIA-NN 1.8 s in silico predviđenom spektralnom bibliotekom.