Sonikacija u mikropločama u shotgun proteomici – Bilješka o primjeni

Shotgun proteomika zavisi od efikasne, ponovljive pripreme uzorka za pretvaranje složenog biološkog materijala u peptide spremne za LC-MS/MS. UIP400MTP mikropločasti sonikator podržava ovaj proces omogućavajući standardiziranu, paralelnu sonifikaciju uzoraka malih volumena, pomažući laboratorijama da poboljšaju disruptivnost, ekstrakciju i resolubilizaciju u mikropločastim radnim tokovima. Ova primjena bilješka opisuje kako se UIP400MTP može integrisati u pripremu proteomskih uzoraka, koristeći objavljeni radni tok za ekstracelularne vezikule iz studija PLA2G12A/Th17 kao laboratorijski testirani primjer.

Microplate Sonication for More Reproducible Shotgun Proteomics

Za istraživače proteomike, ponovljivo pripremanje uzoraka je ključno za visokokvalitetne LC-MS/MS podatke. UIP400MTP mikrotalasni sonikator podržava standardizovanu, paralelnu sonikaciju u protokolu zasnovanom na pločama i u protokolu sa malim volumenom/visokim protokom.

Posebno je koristan za laboratorije koje rade sa:

• Velikim skupovima uzoraka koji zahtijevaju konzistentnu obradu kroz mnoge bušotine (wells)
• Materijalom s ograničenim ulazom, gdje gubitak uzoraka i varijabilnost moraju biti minimizirani
• Uzorci bogati lipidima, poput ekstracelularnih vezikula
• Kompleksne biološke pripreme koje zahtijevaju efikasno razdvajanje, ekstrakciju ili ponovno rastvaranje
• Komparativna shotgun proteomika, gdje je ponovljivost između uslova i replikata presudna

Integrisanjem mikrotalasne sonikacije prije digestije, istraživači mogu poboljšati spremnost uzoraka za:

• Ekstrakciju proteina i ponovno rastvaranje
• Trypsinska/Liz-C digestija
• Nano-LC/MS/MS akvizicija
• Kvantitativna dalja analiza proteomike

 

Skalirajte pripremu svojih proteomskih uzoraka sa sigurnošću!
Naučite kako mikropločasta sonikacija pomaže smanjiti manuelnu varijabilnost, poboljšati disruptivnost uzoraka i pripremiti kompleksne biološke uzorke za pouzdanu LC-MS/MS analizu.

Zahtjev za informacijama


Email adresa (obavezno)


Proizvod ili područje od interesa



Slažem se sa Politikom privatnosti









Zatražite informacije

Mikropločasta sonikacija može koristiti:

• Proteomske centralne laboratorije
• Laboratoriji za istraživanje EV
• Imunološki i ćelijsko-biološki laboratoriji
• Grupi za translacijsko istraživanje
• Timovi iz oblasti bioloških nauka koji prelaze sa pripreme jednog uzorka na tokove rada sa višom propusnošću

Priprema uzorka visokog protoka za analizu proteoma ekstracelularnih vezikula

Šta je shotgun proteomika?

Shotgun proteomics has become a central analytical strategy for characterizing complex biological samples, from whole-cell lysates and tissue extracts to purified organelles, extracellular vesicles, and low-input clinical specimens. Its core strength lies in the coupling of protein digestion, high-resolution liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and computational peptide-to-protein inference. However, the quality of the final proteome dataset is determined long before the sample reaches the mass spectrometer. Efficient sample disruption, protein solubilization, removal of interfering substances, reproducible enzymatic digestion, and robust peptide recovery are all decisive for depth of coverage and quantitative reliability.
Za istraživače iz oblasti proteomike i laboratorije za životne nauke koje rade s ograničenim ili vrijednim uzorcima, priprema uzorka je često usko grlo.

Izazov ekstracelularnih vezikula u proteomici

Extracellular vesicles (EVs), for example, represent a particularly demanding sample class. They are membrane-bound, lipid-rich, nanoscale particles with relatively low protein yield and a high potential for carry-over of lipids, salts, detergents, serum proteins, and other matrix components. These features can interfere with digestion efficiency, chromatographic performance, electrospray stability, and peptide identification. A preparation workflow for EV proteomics must therefore be strong enough to disrupt vesicle structures and solubilize protein cargo, while remaining compatible with downstream enzymatic digestion and LC-MS/MS analysis.
U ovom kontekstu, ultrazvučna obrada kompatibilna s mikropločama nudi praktičan pristup za ponovljivo, paralelizirano procesiranje uzoraka. Hielscher modeli mikrosonicatora za mikroploče UIP400MTP (400 W) i UIP550MTP (550 W) dizajnirani su za sonikaciju uzoraka u pločama s više jama i posudama malog volumena, podržavajući radne tokove većeg protoka od konvencionalnih sonikatora s jednom sondom. Za proteomiku laboratorije, ovaj format je atraktivan jer može smanjiti varijabilnost koja zavisi od ruku, poboljšati paralelnu obradu više uzoraka i prirodnije se integrirati u pripremne tokove uzoraka zasnovane na pločama.

Primjer radnog toka

Nedavni protokol proteomike ekstracelularnih vezikula (EV) u biologiji Th17-ćelija vođenoj PLA2G12A pruža koristan, laboratorijski testiran primjer kako se sonikator za mikroploče UIP400MTP može uključiti u pripremu uzoraka za shotgun proteomiku. U toj seriji studija, EV uzorci su obrađeni za analizu proteoma korištenjem tretmana metanolom, sonikacije UIP400MTP, centrifugiranja, sušenja, digestije trypsinom/Lys-C i nano-flow LC-visokorezolucijske tandem MS. Ista biološka istraživanja su prvo prijavljena kao bioRxiv preprint, da bi potom bila objavljena u časopisu Cell Reports, gdje je proteomička analiza pomogla karakterizirati kako PLA2G12A mijenja proteine tereta EV u kontekstu patogenih T-ćelijskih odgovora.

Sonikator ploča sa više jažica UIP400MTP

Zašto mikropločasta sonikacija?
The UIP400MTP enables standardized, parallel sonication of small-volume samples. This is useful when reproducibility, low sample input, and multi-sample throughput are important.


Kontrolna lista kvaliteta

• Potvrdi jednaki unos proteina EV ekvivalenata u svim uzorcima.
• Koristi nasumične ili uravnotežene rasporede obrade uzoraka.
• Održavaj konzistentan volumen metanola, vrijeme sonikacije, vrijeme sušenja i volumen digestije.
• Prati prinos peptida i ukupnu identifikaciju proteina.
• Provjeri stopu propuštenih rezanja i distribuciju dužine peptida.
• Ispitaj oblik hromatografskog vrha i reproduktivnost vremena zadržavanja.
• Uključi prazne uzorke za praćenje prenosa.
• Koristi objedinjene QC uzorke za veće studije.
• Procijeni koeficijent varijacije replika.
• Koristi PCA ili slične metode za identifikaciju uticaja serija ili odstupajućih uzoraka.

Preporuke za protokol

Prilikom objavljivanja ili dokumentiranja ovog radnog toka, navedite količinu EV unosa, format ploče, zapreminu metanola, amplitudu i vrijeme sonikacije UIP400MTP, uslove centrifugiranja, metodu sušenja, pufer za digestiju, koncentraciju enzima, vrijeme digestije, uslove acidifikacije, LC-MS/MS platformu, način akvizicije, verziju softvera, bazu podataka, FDR prag, metodu normalizacije i statistički radni tok.
Svi Hielscher mikroplejt sonikatori automatski bilježe važne parametre procesa poput amplitude, trajanja sonikacije i temperature sa datumom i vremenom u CVS fajl na integrisanoj SD kartici. Protokoliranje podataka za reproduktivnost i kontrolu kvaliteta nikada nije bilo jednostavnije!

Studija u detalje: EV Shotgun proteomika u PLA2G12A studiji

The PLA2G12A study provides a concrete example of UIP400MTP use in a shotgun proteomics workflow. The biological question was how the secreted phospholipase PLA2G12A modifies Th17-cell-derived extracellular vesicles and thereby influences pathogenic T-cell differentiation. The authors showed that PLA2G12A acts on EV membranes to produce lysophospholipids, including 1-oleoyl-lysophosphatidylethanolamine, and that downstream lysophosphatidic acid signaling via LPA2 contributes to Th17 differentiation. Beyond lipid signaling, the studies also examined EV cargo, including RNA and protein content, making shotgun proteomics an important component of the characterization strategy.
In the EV preparation workflow, Th17 cells were cultured in medium containing exosome-depleted fetal bovine serum. Culture supernatants were first centrifuged to remove cells, filtered through a 0.22 µm filter, concentrated by ultrafiltration/ultracentrifugation, washed, resuspended in PBS, and quantified by BCA protein assay. This upstream EV preparation ensured that a defined protein-equivalent amount of EV material could be carried into the proteomics workflow.
For shotgun proteomic analysis, the authors used EV samples corresponding to 5 µg protein equivalents. These samples were dried in PCR tubes, and 25 µL methanol was added. The samples were then sonicated for 3 minutes using the UIP400MTP microplate sonicator. Following sonication, the samples were centrifuged at 4°C for 20 minutes at 19,000 × g. After removal of 20 µL supernatant, the samples were centrifuged to dryness. Proteins were then dissolved by sonication in 4 µL trypsin/Lys-C solution at 100 ng/µL in 50 mM ammonium bicarbonate. Digestion was performed for 2 hours at 37°C with shaking at 300 rpm. The digest was acidified with 1 µL of 1.25% trifluoroacetic acid and submitted to nano-flow LC-high-resolution tandem mass spectrometry.
This workflow highlights several useful principles for low-input EV proteomics. First, the input was normalized by protein equivalent, which is important when comparing EVs from different genotypes or treatments. Second, methanol was used before sonication, supporting disruption and extraction while avoiding detergent systems that may complicate LC-MS/MS. Third, the sonication step was short and standardized, which is compatible with parallel sample processing. Fourth, trypsin/Lys-C digestion was performed in a very small volume, reducing dilution and supporting low-input peptide recovery. Finally, direct transition from digestion to acidification and LC-MS/MS minimized unnecessary handling steps.
Downstream LC-MS/MS metoda koristila je nano-protok reverzno-faznu separaciju povezanu sa Q-Exactive HF Orbitrap masenim spektrometrom. Uzorci su bili zadržani na C18 prekoloni, a zatim razdvojeni na analitičkoj koloni unutarnjeg prečnika 50 µm pri 200 nL/min i 40°C. Gradient je tekao od niskog sadržaja organskog rastvarača do 35% rastvarača B tokom 60 minuta, a zatim su uslijedile visoko-organske ispiranje i ponovno izjednačavanje. MS akvizicija je izvedena u pozitivnom ionskom modu koristeći neovisno prikupljanje podataka sa višim energetskim sudarnim disocijacijama. DIA sirovi fajlovi su analizirani koristeći DIA-NN 1.8 sa in silico predviđenom spektralnom bibliotekom.