Proteomski radni tokovi s visokom brzinom varenja proteina

Proteomika je suštinsko polje za razumevanje bioloških procesa i sistema, pri čemu varenje proteina predstavlja kritičan korak u njenom toku rada. Tradicionalno, probava proteina se provodi u otopini pomoću proteolitičkih enzima poput tripsina, koji specifično hidrolizira peptidne veze na ostacima lizina i arginina. Ovaj proces stvara peptide koji su pogodni za jonizaciju i fragmentaciju u aplikacijama masene spektrometrije (MS). Međutim, konvencionalne metode varenja zahtijevaju 12-24 sata da bi se postigla završetak, stvarajući značajna uska grla u proteomskim radnim tokovima.
Ultrasonication nudi moćnu alternativu, dramatično skraćujući vrijeme probave sa sati na samo nekoliko minuta. U kombinaciji sa naprednim sonikatorima za više uzoraka kao što su Hielscher CupHorn, VialTweeter i sonikator ploča sa 96 jažica UIP400MTP, ultrazvučna obrada omogućava ubrzanu proteomiku visokog protoka. Ove tehnologije pojednostavljuju radni proces, smanjujući vrijeme pripreme uzoraka i povećavajući efikasnost bez ugrožavanja ponovljivosti ili kvaliteta podataka.

Uloga ultrazvučne energije u probavi proteina

Ultrasonication koristi fokusirane ultrazvučne talase za stvaranje kavitacije – lokalizovanih mikromehurića koji se kolabiraju i stvaraju intenzivne sile smicanja. Ovaj fenomen pojačava prijenos mase, potiče miješanje enzima sa supstratima i razvija proteinske strukture, izlažući mjesta cijepanja proteolitičkim enzimima poput tripsina.
Rezultat? Značajno smanjenje vremena probave bez ugrožavanja efikasnosti ili ponovljivosti.

Ultrazvučno poboljšana proteolitička probava: metodologija i rezultati

Protokol za ubrzanu probavu

Varenje potpomognuto ultrazvukom kombinuje proteolitičke enzime i ultrazvučnu energiju kako bi se ubrzao radni proces. Na primjer, korištenjem Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), proces digestije se odvija na sljedeći način:

1. Redukcija: Uzorci proteina (0,5 mg/mL, 20 µL) se tretiraju sa DTT (2 µL, 110 mM) u amonijum bikarbonatnom puferu (12,5 mM). Sonikacija se primjenjuje pri 50% amplitude tokom 5 minuta.
2. Alkilacija: Nakon dodavanja IAA (2 µL, 400 mM), sonikacija se ponavlja pod istim uslovima.
3. Digestija: Uzorci se razblažuju i inkubiraju sa imobilisanim nanočesticama tripsina. Posljednji krug ultrazvuka (5 minuta) dovršava probavu. Peptidi se odvajaju, suše i čuvaju za MS analizu.

Ova ultrazvučna metoda smanjuje ukupno vrijeme pripreme sa 12 sati na manje od 30 minuta. Uprkos ubrzanom procesu, prinos i kvalitet peptida ostaju dosljedni tradicionalnim metodama preko noći.

Efikasnost ultrazvučne probave proteina

U uporednim studijama koje koriste proteome E. coli:

• Identifikacija proteina: Ultrazvučno digestirani uzorci identifikovali su 777 proteina za 5 minuta, u poređenju sa 817 za 12 sati. Zajedničke identifikacije proteina premašile su 70%.
• Reproducibilnost: Ponovljene analize su pokazale vrijednosti korelacije iznad 98% unutar svake metode, pokazujući pouzdanost.
• selektivnost: Određeni proteini su preferencijalno digestirani svakom metodom, pri čemu je ultrazvučna digestija favorizirala 65 proteina i digestija preko noći 54 proteina. Takve nijansirane razlike naglašavaju jedinstveni potencijal ultrazvučne obrade za specifične primjene.

Rezultati kvantifikacije proteina bez oznaka za sedam proteina u E. coli
uzorak. Sljedeći proteini su dodani na dva različita nivoa kao što je navedeno u koloni
nazvan "Theo Ratio". Theo Ratio je teoretski omjer između dva nivoa koja se koriste u ovome
eksperiment. Goveđi serumski albumin (ALBU), β-laktoglobulin (LACB), α-S1 kazein (CASA1),
α-S2 kazein (CASA2), citokrom c (CYC), ovalbumin (OVAL) i karboanhidraza 2
(CAH2). Omjeri su izračunati korištenjem intenziteta LFQ proteina dobivenih od MaxQuant-a
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Studija i grafika: © Martins et al., 2019)

Tripsin imobiliziran nanočesticama

Integracija imobiliziranih nanočestica tripsina (npr. T-FMNP) sa ultrazvučnom obradom dodatno poboljšava radni proces proteomike. Ove nanočestice pružaju veliku površinu za interakcije enzima i supstrata, povećavajući efikasnost. Kada se primeni na složene proteome, kao što je E. coli, kombinovana metoda postiže:

• brzina: Kompletna probava u roku od 5 minuta.
• tačnost: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Skalabilnost: Adaptacija na platforme sa više bunara kao što je UIP400MTP omogućava obradu visokog protoka.

Kliknite ovdje za detaljan protokol s uputama korak po korak!
(usp. Martins et al., 2019.)

Proteolitička probava velikom brzinom i velikom propusnošću s Hielscher sonikatorima

Najbolji modeli sonikatora za proteomiku

Hielscher Ultrasonics nudi različite modele sonikatora za istovremenu pripremu više uzoraka koji olakšavaju radni proces velike propusnosti. Bilo da radite s bočicama, epruvetama, pločama s više jažica (npr. pločama sa 6, 24, 96 jažica) ili Petrijevim zdjelicama – nudimo vam idealne sonikatore za vaše eksperimente.

UIP400MTP sonikator ploča sa više jažica

Za vrhunski protok, UIP400MTP pruža mogućnost ultrazvučne obrade ploča sa 96 jažica. Kompatibilan sa bilo kojom standardnom mikropločom, UIP400MTP ne zahtijeva skupe vlasničke materijale za jednokratnu upotrebu i daje vam slobodu da odaberete najbolju ploču s više jažica za vaše istraživanje. Isporukom ujednačene energije preko ploče, omogućava brzu redukciju, alkilaciju i probavu do 200 složenih proteoma za samo 1 sat. Ovaj nivo automatizacije i efikasnosti je ključan za proteomiku visoke propusnosti i kliničke aplikacije. Saznajte više o sonikatoru ploča sa više jažica!

VialTweeter

VialTweeter je skrojen za laboratorije koje zahtijevaju istovremenu sonikaciju do 10 bočica ili epruveta. Njegov neinvazivni pristup eliminira rizike od unakrsne kontaminacije, istovremeno osiguravajući ponovljivu probavu proteina. Ovaj uređaj je idealan za istraživače koji rade sa ograničenim količinama uzoraka ili različitim tipovima uzoraka.
Saznajte više o VialTweeter sonikatoru sa više cijevi!

Hielscher UP200St-CupHorn

CupHorn sonicator je moćan uređaj dizajniran za istovremenu obradu više uzoraka u zatvorenim posudama. Osigurava ravnomjernu raspodjelu ultrazvučne energije i preciznu kontrolu temperature. Mogućnost obrade do pet uzoraka istovremeno, zajedno sa njegovom kompatibilnošću sa smanjenim, alkiliranim i digestiranim radnim tokovima, čini CupHorn pouzdanim alatom za proteomiku zasnovanu na MS.
Saznajte više o CupHorn SonoReactoru!

Korak po korak protokol za ultrazvučnu proteolitičku probavu uz korištenje tripsina imobiliziranog nanočesticama

Ovaj protokol Martins et al. (2019) optimiziran je za brzu probavu proteina korištenjem ultrazvučne energije i tripsina imobiliziranog nanočesticama (T-FMNP). Navedeni koraci osiguravaju efikasnu redukciju, alkilaciju i proteolizu pogodnu za primjenu masene spektrometrije (MS).
Protocol Steps

1. Redukcija disulfidnih veza
   • Dodajte 2 µL DTT rastvora (110 mM) u uzorak od 20 µL proteina (0,5 mg/mL) u AmBic puferu.
   • Stavite epruvetu sa uzorkom u sonoreaktor UP200St-CupHorn.
   • Sonicirajte uzorak 2,5 minuta pri 50% amplitude (200 W, 26 kHz).
   • Pauzirajte na kratak interval da se ohladi, a zatim obradite sonikacijom još 2,5 minuta pod istim uslovima.
2. Alkilacija redukovanih ostataka cisteina
   • Dodajte 2 µL rastvora IAA (400 mM) redukovanom uzorku proteina.
   • Sonicirajte 2,5 minuta pri 50% amplitude da biste olakšali alkilaciju.
   • Pauzirajte za hlađenje, a zatim obradite sonikacijom dodatnih 2,5 minuta.

   Napomena: Minimizirajte izlaganje alkiliranog uzorka svjetlosti kako biste spriječili degradaciju IAA.

3. Razblaživanje uzorka
   • Razrijedite uzorak alkiliranog proteina do konačnog volumena od 100 µL koristeći 25 mM AmBic pufera koji sadrži 4% acetonitrila (v/v).
   • Temeljito promiješajte laganim pipetiranjem.
4. Proteolitička probava s tripsinom imobiliziranim nanočesticama
   • Dodajte 20 µL otopine T-FMNP (3 mg/mL) u razrijeđeni uzorak proteina.
   • Sonikirajte smjesu u sonoreaktoru 2,5 minuta pri 50% amplitude.
   • Pauzirajte za hlađenje, a zatim sonikirajte još 2,5 minuta pod istim uslovima.
5. Odvajanje nanočestica tripsina
   • Koristite magnet da odvojite T-FMNP od supernatanta koji sadrži digestirane peptide.
   • Prebacite supernatant u novu epruvetu za mikrocentrifugu.
6. Priprema peptida za MS analizu
   • Osušite supernatant koji sadrži peptide u vakuumskoj centrifugi.
   • Čuvati osušene peptide na -20°C do daljnje analize masenom spektrometrijom.