Proteomski radni tokovi s visokopropusnom digestijom proteina

Proteomika je ključno područje za razumijevanje bioloških procesa i sistema, a digestija proteina predstavlja kritičan korak u njenim radnim tokovima. Tradicionalno se digestija proteina provodi u otopini pomoću proteolitičkih enzima poput tripsina, koji specifično hidrolizira peptidne veze na ostacima lizina i arginina. Ovaj proces stvara peptide koji su vrlo pogodni za ionizaciju i fragmentaciju u primjenama masene spektrometrije (MS). Međutim, konvencionalne metode digestije zahtijevaju 12–24 sata do završetka, što stvara značajna uska grla u proteomskim radnim tokovima.
Ultrazvučna obrada nudi snažnu alternativu, dramatično skraćujući vrijeme digestije sa sati na samo nekoliko minuta. Kada se kombinira s naprednim sonikatorima za više uzoraka, kao što su Hielscher CupHorn, VialTweeter i sonikator za ploče s 96 jažica UIP400MTP, ultrazvučna obrada omogućava ubrzanu, visokopropusnu proteomiku. Ove tehnologije pojednostavljuju radne tokove, skraćuju vrijeme pripreme uzoraka i povećavaju efikasnost bez ugrožavanja reproducibilnosti ili kvaliteta podataka.

Uloga ultrazvučne energije u digestiji proteina

Ultrazvučna obrada koristi fokusirane ultrazvučne talase za stvaranje kavitacije – lokaliziranih mikromjehurića koji kolabiraju i stvaraju intenzivne smične sile. Ovaj fenomen pospješuje prijenos mase, potiče miješanje enzima sa supstratima i razvija strukture proteina, izlažući mjesta cijepanja proteolitičkim enzimima poput tripsina.
Rezultat? Značajno smanjenje vremena digestije bez ugrožavanja efikasnosti ili reproducibilnosti.

Ultrazvučno potpomognuta proteolitička digestija: metodologija i rezultati

Ubrzani protokol digestije

Ultrazvučno potpomognuta digestija kombinira proteolitičke enzime i ultrazvučnu energiju radi ubrzanja radnih tokova. Na primjer, uz upotrebu Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), radni tok digestije odvija se na sljedeći način:

1. Redukcija: Uzorci proteina (0,5 mg/mL, 20 µL) tretiraju se DTT-om (2 µL, 110 mM) u puferu amonijevog bikarbonata (12,5 mM). Ultrazvučna obrada primjenjuje se pri amplitudi od 50% tokom 5 minuta.
2. Alkilacija: Nakon dodavanja IAA (2 µL, 400 mM), ultrazvučna obrada ponavlja se pod istim uvjetima.
3. Digestija: Uzorci se razrjeđuju i inkubiraju s nanočesticama s imobiliziranim tripsinom. Završni ciklus ultrazvučne obrade (5 minuta) dovršava digestiju. Peptidi se odvajaju, suše i pohranjuju za MS analizu.

Ova ultrazvučna metoda smanjuje ukupno vrijeme pripreme sa 12 sati na manje od 30 minuta. Uprkos ubrzanom procesu, prinos i kvalitet peptida ostaju u skladu s tradicionalnim metodama preko noći.

Efikasnost ultrazvučne digestije proteina

U komparativnim studijama s proteomima E. coli:

• Identifikacija proteina: Ultrazvučno digestirani uzorci identificirali su 777 proteina za 5 minuta, u usporedbi s 817 za 12 sati. Zajedničke identifikacije proteina premašile su 70%.
• Reproducibilnost: Ponovljene analize pokazale su vrijednosti korelacije iznad 98% unutar svake metode, što dokazuje pouzdanost.
• Selektivnost: Određeni proteini su se preferencijalno digestirali jednom ili drugom metodom, pri čemu je ultrazvučna digestija favorizirala 65 proteina, a digestija preko noći 54 proteina. Takve nijansirane razlike naglašavaju jedinstveni potencijal ultrazvučne obrade za specifične primjene.

Rezultati label-free kvantifikacije sedam proteina dodanih u E. coli
uzorak. Sljedeći proteini dodani su na dva različita nivoa, kako je navedeno u koloni
nazvanoj “Theo Ratio”. Theo Ratio je teorijski omjer između dva nivoa korištena u ovom
eksperimentu. Goveđi serumski albumin (ALBU), β-laktoglobulin (LACB), α-S1 kazein (CASA1),
α-S2 kazein (CASA2), citokrom c (CYC), ovalbumin (OVAL) i karbonska anhidraza 2
(CAH2). Omjeri su izračunati pomoću LFQ intenziteta proteina dobivenih iz MaxQuant
analize. Studentov t-test primijenjen je za usporedbu vrijednosti dobivenih svakom metodom (p>0,01, n=3, t-theoretical=4,6).
Studija i grafika: © Martins et al., 2019)

Tripsin imobiliziran na nanočesticama

Integracija nanočestica s imobiliziranim tripsinom (npr. T-FMNPs) s ultrazvučnom obradom dodatno unapređuje proteomske radne tokove. Ove nanočestice pružaju veliku površinu za interakcije enzima i supstrata, čime povećavaju efikasnost. Kada se primjenjuje na složene proteome, kao što je E. coli, kombinirana metoda postiže:

• Brzina: Potpuna digestija u roku od 5 minuta.
• Tačnost: Kvantifikacija proteina uporediva s tradicionalnim metodama (p > 0,01, n=3).
• Skalabilnost: Prilagodba platformama s više jažica poput UIP400MTP omogućava visokopropusnu obradu.

Kliknite ovdje za detaljan protokol s uputama korak po korak!
(usp. Martins et al., 2019)

Proteolitička digestija velikom brzinom i visokom propusnošću pomoću Hielscher sonikatora

Najbolji modeli sonikatora za proteomiku

Hielscher Ultrasonics nudi različite modele sonikatora za istovremenu pripremu više uzoraka, čime olakšava visokopropusne radne tokove. Bilo da radite s viralama, epruvetama, pločama s više jažica (npr. pločama sa 6, 24 ili 96 jažica) ili Petrijevim posudama – nudimo vam idealne sonikatore za vaše eksperimente.

Sonikator za ploče s više jažica UIP400MTP

Za vrhunsku propusnost, UIP400MTP pruža mogućnost ultrazvučne obrade ploča s 96 jažica. Kompatibilan s bilo kojom standardnom mikropločom, UIP400MTP ne zahtijeva skupe vlasničke potrošne materijale i daje vam slobodu da odaberete najbolju ploču s više jažica za svoje istraživanje. Ravnomjernom isporukom energije preko cijele ploče omogućava brzu redukciju, alkilaciju i digestiju do 200 složenih proteoma za samo 1 sat. Ovaj nivo automatizacije i efikasnosti presudan je za visokopropusnu proteomiku i kliničke primjene. Saznajte više o sonikatoru za ploče s više jažica!

VialTweeter

VialTweeter je prilagođen laboratorijama kojima je potrebna istovremena ultrazvučna obrada do 10 viala ili epruveta. Njegov neinvazivni pristup eliminira rizike od unakrsne kontaminacije, a istovremeno osigurava reproducibilnu digestiju proteina. Ovaj uređaj je idealan za istraživače koji rade s ograničenim volumenima uzoraka ili različitim vrstama uzoraka.
Saznajte više o sonikatoru za više epruveta VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

CupHorn sonikator je snažan uređaj namijenjen istovremenoj obradi više uzoraka u zatvorenim posudama. Osigurava ravnomjernu raspodjelu ultrazvučne energije i preciznu kontrolu temperature. Mogućnost istovremene obrade do pet uzoraka, zajedno s kompatibilnošću s radnim tokovima koji obuhvataju redukciju, alkilaciju i digestiju, čini CupHorn pouzdanim alatom za proteomiku zasnovanu na MS metodama.
Saznajte više o CupHorn SonoReactoru!

Protokol korak po korak za ultrazvučno potpomognutu proteolitičku digestiju pomoću tripsina imobiliziranog na nanočesticama

Ovaj protokol autora Martins et al. (2019) optimiziran je za brzu digestiju proteina pomoću ultrazvučne energije i tripsina imobiliziranog na nanočesticama (T-FMNPs). Navedeni koraci osiguravaju efikasnu redukciju, alkilaciju i proteolizu pogodnu za primjene masene spektrometrije (MS).
Koraci protokola

1. Redukcija disulfidnih veza
   • Dodajte 2 µL otopine DTT-a (110 mM) u 20 µL uzorka proteina (0,5 mg/mL) u AmBic puferu.
   • Stavite epruvetu s uzorkom u sonoreaktor UP200St-CupHorn.
   • Sonicirajte uzorak 2,5 minute pri amplitudi od 50% (200 W, 26 kHz).
   • Napravite kratku pauzu radi hlađenja, zatim sonicirajte još 2,5 minute pod istim uvjetima.
2. Alkilacija reduciranih ostataka cisteina
   • Dodajte 2 µL otopine IAA (400 mM) u reducirani uzorak proteina.
   • Sonicirajte 2,5 minute pri amplitudi od 50% kako biste olakšali alkilaciju.
   • Napravite pauzu radi hlađenja, zatim sonicirajte dodatnih 2,5 minute.

   Napomena: Svedite izlaganje alkiliranog uzorka svjetlu na minimum kako biste spriječili razgradnju IAA.

3. Razrjeđivanje uzorka
   • Razrijedite alkilirani uzorak proteina do konačnog volumena od 100 µL pomoću 25 mM AmBic pufera koji sadrži 4% acetonitrila (v/v).
   • Temeljito promiješajte nježnim pipetiranjem.
4. Proteolitička digestija pomoću tripsina imobiliziranog na nanočesticama
   • Dodajte 20 µL otopine T-FMNP (3 mg/mL) u razrijeđeni uzorak proteina.
   • Sonicirajte smjesu u sonoreaktoru 2,5 minute pri amplitudi od 50%.
   • Napravite pauzu radi hlađenja, zatim sonicirajte još 2,5 minute pod istim uvjetima.
5. Odvajanje nanočestica s tripsinom
   • Pomoću magneta odvojite T-FMNPs od supernatanta koji sadrži digestirane peptide.
   • Prenesite supernatant u novu mikrocentrifugalnu epruvetu.
6. Priprema peptida za MS analizu
   • Osušite supernatant koji sadrži peptide u vakuumskoj centrifugi.
   • Pohranite osušene peptide na -20°C do daljnje analize masenom spektrometrijom.