Tümör Dokusundan Sonikasyon Destekli Protein Ekstraksiyonu – Protokol

Bu protokol, doku parçalama sırasında kontrollü bir prob sonikasyonu adımı ekleyerek standart CPTAC üre lizisi iş akışını geliştiren, tümör dokusu için sonikasyon destekli bir protein ekstraksiyon yöntemini açıklar. Yerleşik, derin kapsamlı CPTAC proteom ve fosfoproteom hazırlama stratejisini temel alan bu değişiklik, hücrelerin ve hücre altı yapıların parçalanmasını iyileştirir, numune viskozitesini azaltır ve yalnızca üre lizisiyle geri kazanılması genellikle daha zor olan proteinlerin, özellikle membrana bağlı ve DNA’ya bağlanan veya çekirdekle ilişkili proteinlerin salınmasını artırır. Temel alınan çalışmada, sonikasyon destekli iş akışı, sonraki CPTAC tarzı sindirim, TMT etiketleme, fraksiyonlama, fosfopeptit zenginleştirme ve LC-MS/MS analiz hattıyla uyumluluğu korurken hem proteinlerin hem de fosfopeptitlerin tespitini artırmıştır.

Derin Kapsamlı Proteomik ve Fosfoproteomik Analiz İçin Tümör Dokusundan Sonikasyon Destekli Protein Ekstraksiyonu

Aşağıdaki protokol, kriyojenik olarak toz haline getirilmiş tümör dokusundan 8 M üre lizis tamponunda protein ekstraksiyonu için optimize edilmiştir: Eklenen prob tipi sonikasyon adımı, sindirim ve sonraki LC-MS/MS analizinden önce, geri kazanılması zor protein sınıflarının, özellikle membranla ve DNA/çekirdekle ilişkili proteinlerin geri kazanımını iyileştirir. Li et al. (2025) tarafından yürütülen ve temel alınan çalışmada, sonikasyon eklenmesi membran ve çekirdekle ilişkili proteinlerin tespitini artırmış ve çalışmanın iş akışı kapsamında >12.000 protein ve >25.000 fosfopeptit içeren derin kapsamlı bir analizi desteklemiştir.

Protokolün Uygulama Alanı

Bu prosedürü şu numuneler ve iş akışları için kullanın:

• taze dondurulmuş, kriyojenik olarak toz haline getirilmiş tümör dokusu
• üre bazlı ekstraksiyonun hâlihazırda yerleşik olduğu hücre peletleri veya diğer biyolojik numuneler
• triptik sindirim ve isteğe bağlı TMT etiketleme kullanan global proteomik ve fosfoproteomik iş akışları

Li et al. (2025) tarafından yürütülen çalışma, iş akışının hücre hatları, kan ve idrar gibi diğer numune türlerine de uygulanabileceğini belirtmektedir; ancak numune türüne göre optimizasyon gerekebilir.

Sonikasyon adımı eklenmiş, optimize edilmiş numune hazırlama iş akışı. Optimize edilmiş iş akışı ve deney tasarımı, global proteomik ve fosfoproteomik analiz için CPTAC numune hazırlama protokolünü temel almaktadır.
Çalışma ve şema: ©Li et al., 2025

Çalışma Prensibi

Orijinal çalışmada, standart CPTAC üre lizisi iş akışına sonikasyon eklenmiş ve membranlar ve çekirdeklerle ilişkili proteinlerin tespitinin iyileştiği bulunmuştur. Yazarlar, sonikasyon parametrelerinin numune boyutu/konsantrasyonu açısından – sonotrot boyutu, enerji girdisi ve darbe zamanlaması seçilerek – hassas biçimde ayarlanması gerektiğini belirtmektedir.

Örneğin Hielscher UP200Ht ve UP200St modelleri için bu, şunlar anlamına gelir:

• ana kontrol değişkenleri olarak genlik ve darbe modunu kullanın
• numuneleri işlem boyunca soğuk tutun (yani buz üzerinde)
• temkinli ayarlarla başlayın
• numune berraklığına, sıcaklığa, protein verimine ve sonraki aşamalardaki peptit kalitesine göre optimize edin

 
Hielscher’in 200 watt gücündeki UP200Ht ve UP200St sonikatör modellerinin her ikisi de ayarlanabilir genlik ve darbe ayarlarıyla küçük ve orta numune hacimleri için tasarlanmıştır; her iki ultrasonik homojenizatör de hassas parametre ayarı için dijital dokunmatik ekran kontrolü, otomatik veri kaydı, takılabilir sıcaklık sensörü, uzaktan kontrol ve numune aydınlatması sunar.
 

Sonikasyon Destekli Protein Ekstraksiyonu İçin Reaktifler

Üre lizis tamponu

Kullanımdan hemen önce taze olarak hazırlayın:

• 8 M üre
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL aprotinin
• 10 µg/mL leupeptin
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Fosfataz İnhibitör Kokteyli 2, 1:100 (v/v)
• Fosfataz İnhibitör Kokteyli 3, 1:100 (v/v)

Katkı maddeleri eklenmeden önce üre tamamen çözünmüş olmalıdır; inhibitörler kullanımdan hemen önce eklenmelidir; tampon buz üzerinde tutulmalıdır; katkı maddeleri eklendikten sonra kuvvetli vorteksleme yerine kabı hafifçe dairesel hareketlerle çalkalamak önerilir.
 

Ek reaktifler:

• BCA protein tayini reaktifleri
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• İyodoasetamid
• LysC
• Tripsin
• Formik asit
• çoklanmış kantitatif proteomik kullanılıyorsa TMT reaktifleri
• fosfopeptit zenginleştirme yapılıyorsa IMAC reaktifleri

Sonikasyon Destekli Protein Ekstraksiyonu İçin Ekipman

Gerekli

Önerilen prob seçimi

Yaklaşık 200–1000 µL hacmindeki numuneler için, küçük hacimlerin doğrudan yüksek yoğunlukta işlenmesine uygun, küçük çaplı bir sonotrot kullanın. Hielscher farklı sonotrot çapları sunar ve daha küçük uç çapları uçta daha yüksek yoğunluk sağlar.

Pratik not: Aşırı köpüklenme veya kap duvarıyla temas olmadan verimli karıştırma sağlayan en küçük probu kullanın.

Aynı anda birden fazla numuneyle çalışıyorsanız, VialTweeter çok tüplü sonikatörünü veya UIP400MTP mikroplaka sonikatörünü değerlendirebilirsiniz!

Adım Adım Talimatlar: Sonikasyon Destekli Protein Ekstraksiyonu Prosedürü

A. Ön Soğutma ve Hazırlık

1. Santrifüjü 4°C sıcaklığa soğutun.
2. Taze üre lizis tamponu hazırlayın ve buz üzerinde tutun.
3. UP200Ht veya UP200St cihazını ses yalıtım kabini içinde bir standa kurun.
4. Numune tüplerini dik ve sabit tutacak kadar büyük bir buz banyosu hazırlayın.

Tamponun taze hazırlanması ve işlemlerin soğuk koşullarda yapılması kritik öneme sahiptir.

B. İlk Üre Ekstraksiyonu

1. Kriyojenik olarak toz haline getirilmiş dokuyu buz üzerinde tutun.
2. Her 50 mg yaş doku için 200 µL soğutulmuş üre lizis tamponu ekleyin.
3. Yüksek hızda 5–10 s vorteksleyin.
4. 4°C sıcaklıkta 15 min inkübe edin.
5. Vorteksleme ve inkübasyon adımını bir kez daha tekrarlayın.
6. 4°C sıcaklıkta 20.000g ile 10 min santrifüjleyin.
7. Lizatı/süpernatantı temiz, düşük bağlanmalı bir tüpe aktarın.

C. UP200Ht veya UP200St Kullanılarak Sonikasyon

Sonikasyon İçin Başlangıç Koşulları

• Genlik: %20–30 ile başlayın
• Darbe süresi: 5 s AÇIK
• Soğutma: darbeler arasında buz üzerinde 2 min
• Döngü sayısı: 4 döngü
• Toplam aktif sonikasyon süresi: 20 s
• Soğutma dâhil toplam işlem süresi: yaklaşık 8–10 min

Sonikasyon Adımları

1. Lizatı sonikasyona uygun bir tüpe aktarın. İyi ısı alışverişine ve probun güvenli biçimde daldırılmasına olanak tanıyan dar, ince duvarlı bir tüp kullanın.
2. Tüpü buz banyosuna yerleştirin. Makale, sonikasyon sırasında soğutmanın ısı hasarını önlemek için kritik öneme sahip olduğunu belirtmektedir.
3. Prob ucunu numuneye daldırın. Kararlı kavitasyon için ucu yeterince sıvı içinde tutun, ancak tüpün duvarına veya tabanına değmesine izin vermeyin.
4. Başlangıç genliğinde 5 s süreli bir darbe uygulayın.
5. Numuneyi hemen yeniden tamamen buza yerleştirip 2 min bekletin.
6. 4 döngü tamamlanana kadar tekrarlayın.
7. Döngüden sonra lizatı inceleyin.
8. Yalnızca gerekirse devam edin; her seferinde 5 s süreli bir ek darbe uygulayın ve her zaman ardından tam soğutma yapın.
9. Lizat daha homojen ve daha az ipliksi/viskoz hale geldiğinde durun.
   Son nokta, sürekli viskoz bir akış yerine damlalar oluşturan, daha yarı saydam bir lizattır.
10. 4°C sıcaklıkta yaklaşık 16.000g ile 15 min santrifüjleyin.
11. Berraklaştırılmış süpernatantı yeni bir tüpe aktarın ve protein konsantrasyonunu ölçün.

Sonikasyon uygulanmış ve uygulanmamış numuneler arasında global proteomik ve fosfoproteomik karşılaştırması.
a. Sonikasyon uygulanmış veya uygulanmamış tüm PDX tümör dokularında tanımlanan proteinlerin sayısı (global proteomik). b. Sonikasyon uygulanmış veya uygulanmamış tüm PDX tümör dokularında tanımlanan fosfopeptitlerin sayısı (IMAC zenginleştirmesi). Yalnızca bolluk oranı 25. persentile eşit veya ondan büyük olan proteinler ve fosfopeptitler sayılmıştır. Bolluk oranı aynı türdeki numuneler arasında hesaplanmıştır.
Çalışma ve grafikler: ©Li et al., 2025

Sonraki Sindirim ve Analiz Aşamaları

Sonikasyon ve berraklaştırmadan sonra, orijinal CPTAC tarzı iş akışında açıklandığı şekilde ilerleyin:

1. Üre konsantrasyonunu <2 M düzeyine düşürmek için lizatı 50 mM Tris-HCl pH 8,0 ile 1:3 (v/v) oranında seyreltin.
2. Her 50 µg protein için 1 mAU LysC ekleyin ve 25°C sıcaklıkta 2 h inkübe edin.
3. 1:49 enzim:substrat (w/w) oranında tripsin ekleyin ve 25°C sıcaklıkta gece boyunca sindirin.
4. Son konsantrasyon %1 olacak şekilde formik asit ekleyerek reaksiyonu durdurun.
5. Gerektiği şekilde tuz giderme, TMT etiketleme, fraksiyonlama, fosfopeptit zenginleştirme ve LC-MS/MS aşamalarına devam edin.

TMT etiketli MS analizinden elde edilen fosfopeptitlerin diferansiyel ekspresyonu.
a. Sonikasyon uygulanmamış numunelere kıyasla sonikasyon uygulanmış numunelerde ekspresyonu artmış bazı insan fosfopeptitlerinin (protein-sequence başlangıcı ve sonu) vurgulandığı bazal alt tip. b. Sonikasyon uygulanmamış numunelere kıyasla sonikasyon uygulanmış numunelerde ekspresyonu artmış bazı insan fosfopeptitlerinin (protein_sequence başlangıcı ve sonu) vurgulandığı luminal alt tip. c. Sonikasyon uygulanmış bazal alt tip tümörlerde ekspresyonu artmış fosfopeptitlerin proteinlerine dayalı zenginleştirilmiş KEGG yolakları. d. Sonikasyon uygulanmış luminal alt tip tümörlerde ekspresyonu artmış fosfopeptitlerin proteinlerine dayalı zenginleştirilmiş KEGG yolakları.
Çalışma ve grafikler: ©Li et al., 2025

Tasarım, Üretim ve Danışmanlık – Almanya’da Üretilen Kalite

Hielscher ultrasonikatörleri, en yüksek kalite ve tasarım standartlarıyla tanınır. Sağlamlık ve kolay kullanım, ultrasonikatörlerimizin endüstriyel tesislere sorunsuz entegrasyonuna olanak tanır. Hielscher ultrasonikatörleri zorlu koşulların ve güçlük içeren ortamların üstesinden kolayca gelir.

Hielscher Ultrasonics, ISO sertifikalı bir şirkettir ve en son teknolojiye ve kullanıcı dostu özelliklere sahip yüksek performanslı ultrasonikatörlere özel önem verir. Elbette Hielscher ultrasonikatörleri CE uyumludur ve UL, CSA ve RoHs gerekliliklerini karşılar.

Literatür / Kaynaklar

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.