Tümör Dokusundan Sonikasyon Destekli Protein Ekstraksiyonu – protokol

Bu protokol, doku parçalanması sırasında kontrollü bir prob-sonikasyon adımı ekleyerek standart CPTAC üre lizis iş akışını geliştiren tümör dokusu için sonikasyon destekli bir protein ekstraksiyon yöntemini açıklamaktadır. Yerleşik derin ölçekli CPTAC proteom ve fosfoproteom hazırlama stratejisi üzerine inşa edilen bu modifikasyon, hücre ve hücre altı yapı bozulmasını iyileştirir, numune viskozitesini azaltır ve özellikle membrana bağlı ve DNA'ya bağlı veya çekirdekle ilişkili proteinler olmak üzere, tek başına üre lizisi ile geri kazanılması tipik olarak daha zor olan proteinlerin salınımını artırır. Altta yatan çalışmada, sonikasyon destekli iş akışı, hem proteinlerin hem de fosfopeptitlerin tespitini artırırken, aşağı akış CPTAC tarzı sindirim, TMT etiketleme, fraksiyonlama, fosfopeptit zenginleştirme ve LC-MS/MS analiz hattı ile uyumluluğu korudu.

Derin Proteomik ve Fosfoproteomik Analiz için Tümör Dokusundan Sonikasyon Destekli Protein Ekstraksiyonu

The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.

Protokol için Uygulama Alanı

Bu prosedürü şunlar için kullanın:

• taze dondurulmuş, kriyopulverize tümör dokusu
• üre bazlı ekstraksiyonun halihazırda yapıldığı hücre peletleri veya diğer biyolojik numuneler
• triptik sindirim ve isteğe bağlı TMT etiketleme kullanan global proteomik ve fosfoproteomik iş akışları

Li ve arkadaşları (2025) tarafından yapılan çalışmada, iş akışının hücre hatları, kan ve idrar gibi diğer numune türleri için de geçerli olduğu, ancak numune türüne göre optimizasyon gerekebileceği belirtilmektedir.

Uygulanan sonikasyon adımı ile optimize edilmiş numune hazırlama iş akışı. Optimize edilmiş iş akışı ve deneysel tasarım, global proteomik ve fosfoproteomik analiz için CPTAC numune hazırlama protokolüne dayanmaktadır.
Çalışma ve şema: ©Li ve ark., 2025

Çalışma prensibi

Orijinal çalışmada standart CPTAC üre lizis iş akışına sonikasyon eklenmiş ve membranlar ve çekirdeklerle ilişkili proteinlerin daha iyi tespit edildiği görülmüştür. Yazarlar, sonikasyon parametrelerinin numune boyutu/konsantrasyonu açısından ince ayarlanması gerektiğini belirtmektedir – Sonotrot boyutu, enerji girişi ve darbe zamanlamasını seçerek.

Örnek olarak Hielscher UP200Ht ve UP200St için bu şu anlama gelir:

• ana kontrol değişkenleri olarak genlik ve darbe modunu kullanın
• numuneleri baştan sona soğuk tutun (örn. buz üzerinde)
• muhafazakar ayarlarla başlayın
• numune berraklığı, sıcaklık, protein verimi ve aşağı akış peptit kalitesine göre optimize edin

 
Hielscher 200 watt sonikatör modelleri UP200Ht ve UP200St, ayarlanabilir genlik ve darbe ayarları ile küçük ve orta hacimli numuneler için tasarlanmıştır; her iki ultrasonik homojenizatör de hassas parametre ayarı için dijital dokunmatik ekran kontrolü, otomatik veri kaydı, takılabilir sıcaklık sensörü, uzaktan kumanda, numune aydınlatması sağlar.
 

Sonikasyon Destekli Protein Ekstraksiyonu için Reaktifler

Üre lizis tamponu

Kullanmadan hemen önce taze olarak hazırlayın:

• 8 M üre
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8.0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL aprotinin
• 10 µg/mL leupeptin
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Fosfataz İnhibitör Kokteyli 2, 1:100 (v/v)
• Fosfataz İnhibitör Kokteyli 3, 1:100 (v/v)

Katkı maddeleri eklenmeden önce üre tamamen çözülmelidir; inhibitörler kullanımdan hemen önce eklenmelidir; tampon buz üzerinde tutulmalıdır; ve katkı maddeleri eklendikten sonra kuvvetli vorteksleme yerine girdaplama önerilir.
 

Ek reaktifler:

• BCA protein tahlil reaktifleri
• 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
• DTT
• İyodoasetamid
• LysC
• tripsin
• Formik asit
• TMT reaktifleri, çoğullanmış kantitatif proteomik kullanıyorsanız
• IMAC reaktifleri, eğer fosfopeptit zenginleştirmesi yapılıyorsa

Sonikasyon Destekli Protein Ekstraksiyonu için Ekipman

Gerekli

Önerilen prob seçimi

200-1000 µL civarındaki numuneler için, küçük hacimlerin doğrudan yüksek yoğunlukta işlenmesine uygun küçük çaplı bir sonotrot kullanın. Hielscher birden fazla sonotrot çapı sunar ve daha küçük uç çapları uçta daha yüksek yoğunluk sağlar.

Pratik not: Aşırı köpürme veya kap duvarı teması olmadan verimli karıştırma sağlayan en küçük probu kullanın.

Aynı anda birden fazla örnekle çalışıyorsanız şunları düşünebilirsiniz Multi-Tube Sonicator VialTweeter veya Mikroplaka Sonikatörü UIP400MTP!

Adım Adım Talimatlar: Sonikasyon Destekli Protein Ekstraksiyonu Prosedürü

A. Ön Soğutma ve Hazırlama

1. Santrifüjü 4°C'ye soğutun.
2. Taze üre lizis tamponu hazırlayın ve buz üzerinde tutun.
3. UP200Ht veya UP200St'yi bir ses muhafazasının içindeki bir standa kurun.
4. Numune tüplerini dik ve sabit tutmaya yetecek büyüklükte bir buz banyosu hazırlayın.

Taze tampon hazırlama ve soğuk işleme kritik öneme sahiptir.

B. İlk Üre Ekstraksiyonu

1. Kriyopulverize edilmiş dokuyu buz üzerinde tutun.
2. 50 mg ıslak doku başına 200 µL soğutulmuş üre lizis tamponu ekleyin.
3. Vorteks 5-10 yüksek hızda.
4. 4°C'de 15 dakika inkübe edin.
5. Vorteks artı inkübasyon adımını bir kez daha tekrarlayın.
6. 4°C'de 10 dakika boyunca 20.000 g'de santrifüjleyin.
7. Lizat/süpernatantı temiz, düşük bağlayıcılı bir tüpe aktarın.

C. UP200Ht veya UP200St kullanarak sonikasyon

Sonikasyon için Başlangıç Koşulları

• Genlik: -30'dan başlayın
• Darbe uzunluğu: 5 sn AÇIK
• Soğutma: Darbeler arasında buz üzerinde 2 dakika
• Döngü sayısı: 4 döngü
• Toplam aktif sonikasyon süresi: 20 sn
• Soğutma dahil toplam işlem süresi: yaklaşık 8-10 dakika

Sonikasyon Adımları

1. Lizatı sonikasyon için uygun bir tüpe aktarın. İyi ısı alışverişi ve güvenli prob daldırma sağlayan dar, ince duvarlı bir tüp kullanın.
2. Tüpü bir buz banyosuna yerleştirin. Makalede sonikasyon sırasında soğutmanın ısı hasarını önlemek için kritik olduğu belirtilmektedir.
3. Prob ucunu numunenin içine daldırın. Sabit kavitasyon için ucu yeterince daldırın, ancak tüp duvarına veya tabanına temas etmesine izin vermeyin.
4. Başlangıç genliğinde 5 saniyelik bir puls çalıştırın.
5. Numuneyi hemen 2 dakika boyunca tamamen buza geri koyun.
6. 4 döngü tamamlanana kadar tekrarlayın.
7. Döngüden sonra lizatı inceleyin.
8. Yalnızca gerektiğinde, her seferinde 5 saniyelik bir ek puls kullanarak devam edin, her zaman tam soğutmayı takip edin.
9. Lizat daha homojen ve daha az lifli/viskoz hale geldiğinde durun.
   Son nokta, sürekli viskoz bir akıştan ziyade damlalar oluşturan daha yarı saydam bir lizattır.
10. 4°C'de 15 dakika boyunca yaklaşık 16.000 g'de santrifüjleyin.
11. Berraklaştırılmış süpernatantı yeni bir tüpe aktarın ve protein konsantrasyonunu ölçün.

Sonike edilmiş ve edilmemiş örnekler arasında global proteomik ve fosfoproteomik karşılaştırması.
a. Sonikasyon uygulanan veya uygulanmayan tüm PDX tümör dokularında tanımlanan proteinlerin sayısı (global proteomik). b. Sonikasyon uygulanan veya uygulanmayan tüm PDX tümör dokularında tanımlanan fosfopeptitlerin sayısı (IMAC zenginleştirme). Yalnızca bolluk oranı 25. yüzdelik dilime eşit veya daha büyük olan proteinler ve fosfopeptitler sayılmıştır. Bolluk oranı aynı örnek türleri arasında hesaplanmıştır.
Çalışma ve grafikler: ©Li ve diğerleri, 2025

Aşağı Akış Sindirimi ve Analizi

Sonikasyon ve berraklaştırmadan sonra, orijinal CPTAC tarzı iş akışında açıklandığı şekilde devam edin:

1. Üre miktarını azaltmak için lizatı 1:3 (v/v) 50 mM Tris-HCl pH 8.0 ile seyreltin <2 M.
2. 50 µg protein başına 1 mAU LysC ekleyin ve 25°C'de 2 saat inkübe edin.
3. 1:49 enzim:substrat (w/w) oranında tripsin ekleyin ve 25°C'de bir gece boyunca sindirin.
4. Son olarak %1'e kadar formik asit ile söndürün.
5. Tuz giderme, TMT etiketleme, fraksiyonlama, fosfopeptit zenginleştirme ve LC-MS/MS işlemlerine gerektiği şekilde devam edin.

TMT etiketli MS'den fosfopeptitlerin diferansiyel ifadesi.
a. Bazal alt tip, sonike edilmiş örneklerde nonsonike edilmiş örneklere kıyasla bazı insan fosfopeptitlerinin (protein dizisi başlangıcı ve sonu) yukarı düzenlendiğini vurgulamaktadır. b. Luminal alt tip, sonike edilmiş örneklerde nonsonike edilmiş örneklere kıyasla bazı insan fosfopeptitlerinin (protein_dizisi başlangıcı ve sonu) yukarı düzenlendiğini vurgulamaktadır. c. Tümörlerin sonike edilmiş bazal alt tipinde yukarı düzenlenmiş fosfopeptitlerin proteinlerine dayalı zenginleştirilmiş KEGG yolları. d. Tümörlerin sonike edilmiş luminal alt tipinde yukarı düzenlenmiş fosfopeptitlerin proteinlerine dayalı zenginleştirilmiş KEGG yolları.
Çalışma ve grafikler: ©Li ve diğerleri, 2025

Tasarım, İmalat ve Danışmanlık – Almanya'da Üretilen Kalite

Hielscher ultrasonicators en yüksek kalite ve tasarım standartları için iyi bilinir. Sağlamlık ve kolay kullanım, ultrasonicators'ımızın endüstriyel tesislere sorunsuz bir şekilde entegre edilmesini sağlar. Zorlu koşullar ve zorlu ortamlar Hielscher ultrasonicators tarafından kolayca ele alınır.

Hielscher Ultrasonics, ISO sertifikalı bir şirkettir ve en son teknoloji ve kullanıcı dostu özelliklere sahip yüksek performanslı ultrasonicators'a özel önem vermektedir. Tabii ki, Hielscher ultrasonicators CE uyumludur ve UL, CSA ve RoHs gereksinimlerini karşılar.

Literatür / Referanslar