• Western blot doku homojenatı veya hücre özütleri numunesinde belirli proteinlerin tespiti için analitik işlemdir.
• bir Western blot çalıştırmak için ya da enzim aktivitesinin ölçülmesi için, pek çok deneyler hücrede tutulmuş malzemenin (örneğin, proteinler, DNA, hücre içi fragmanları) erişim gerektirir.
• Sonikasyon kontrollü hücre bozulması ve liziz için güvenilir ve kolay bir kolu bir yöntemdir.

Ultrasonik Hücre Parçalanması

dokular ve kültürlenmiş hücrelerden protein çıkarımı çok, biyolojik, biyokimyasal ve analitik teknikler (PAGE, Western blot, ELISA, kütle spektrometrisi, vs.) ya da protein saflaştırma için ilk adımdır. Yüksek protein verimi elde etmek için, hücre malzemesi ve doku verimli lize / bozulur olması gerekir. bitki hücresi veya hayvan dokusunda olsun, sonikasyon cep lizat kolay ve hızlı hazırlamak için bir yöntemdir.

Sonikleştirme Avantajları

• Hızlı & verimli
• kolay operasyon
• Yüksek protein verimi
• tekrarlanabilir / tekrarlanabilir
• tam kontrollü
• ölçeklenebilir

Batı İmmunoblotting için Immunoprecipitation Protokolü

A. Reaktifler

çözeltilerin hazırlanması için, örneğin, Milli-Q Saflaştırılmış su kullanın.

• 1X fosfat tamponlu salin (PBS)
• 1X hücre Liziz Tamponu: 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA,% 1 Triton X-100, 2.5 mM sodyum pirofosfat, 1 mM β-gliserofosfat, 1 mM Na3VO4, 1 ug / ml Löpeptin
  Önemli: Kullanılacak ekle 1 PMSF hemen önce.
• 15 ul protein A + 15 ul protein G IP için yeterli olmakla birlikte, birincil antikor ve örnek hacmine bağlı olabilir. Ayrıca, önceden karıştırılmış bir protein A / G agaroz kullanabilir (örneğin Protein A, tavşan IgG aşağı çekme ve Protein G fare IgG'sine aşağı çekme)
• 3X SDS numune tamponu: 187.5 mM Tris-HCI (25 ° C'de pH 6.8),% 6 w /% 0.03 mavi / hac bromofenol ağırlık SDS,% 30 gliserol, 150 mM DTT, hac

Hücre Lisatlar B.

• Hücreleri Hasat. nondenaturing koşullar altında hücrelerini elde etmek amacıyla, ortamını çıkarın ve buz gibi soğuk PBS ile bir kez hücreler yıkayın.
• PBS çıkarın ve her bir plakanın (10 cm), 0.5 ml buz gibi soğuk 1X hücre liziz tamponu ilave et ve 5 dakika süre ile buz üzerinde inkübe edin.
• plakalar ve hücreler kazıyın ve mikro santrifüj tüplerine aktarılır. buz üzerinde tutun.
• Ses dalgalarına maruz bırak, iki kez buz soğukluğunda immünopresipitasyon tamponu içinde 10 saniye süreyle (IP tampon: 50 mM Tris-HCI [pH 7.4], 150 mM NaCI, 5 mM EDTA,% 0.1 NP-40 ve proteaz inhibitörü karışımı). Sonication için, VialTweeter ya da bir prob ultrasonikatör gibi UP100H veya UP200Ht en uygun olanlardır.
• 4 ° C'de 10 dakika boyunca 15,000 g'de santrifüj lizatları.
• yeni bir tüpe süpernatant aktarın. (Gerekirse, lizat -80 ° C 'de muhafaza edilebilir).
• yüzer birincil antikor ekleyin. primer antikor ile yüzer hafif ajitasyon altında 4 ° C de 1 saat inkübe edilir. Primer antikor, batı lekeleme için kullanılan daha konsantre bir miktarda 10x ilave edilir. (Sen 100ııL başına 1 ug ile başlayabilir.)
• Yüzer madde daha sonra 1 saat daha Protein A-agaroz (Invitrogen) ve Protein G agaroz eşit miktarlarda karışımı ile başka inkübe edilir.
• İP tamponla agaroz saçma tanelerini üç kez yıkayın. Daha sonra, 5 dakika boyunca 95 ° C'de ısıtma ile, SDS-PAGE yükleme tamponu ile bağlı proteinleri çıkarmak.

C İmmunopresipitasyon

• 200 ul hücre lizatı alın ve birincil antikor ekleyin. yumuşak, 4 ° C'de bir gece boyunca çalkalanarak inkübe edin.
• protein A veya G, agaroz boncuklar (% 50 boncuk çamuru 20 ul) ya da ekleyin. yumuşak, 4 ° C'de 1-3 saat süreyle sallanan kuluçkalayın.
• 4 ° C'de 30 saniye süreyle mikrosantrifüj. Yıkama 1X hücre liziz tamponu 500 ul ile beş kez pelet. yıkama sırasında buz üzerinde tutun.
• 20 ul 3X SDS numune tamponu ile pelletini. Girdap, sonra 30 saniye süreyle mikrosantrifüj.
• 14,000 X g'de 1 dakika süre ile, 95-100 ° 2-5 dakika C ve mikrosantrifüj numunenin ısıtın.
• SDS-PAGE jel (% 12-15) ile örnek (15-30 ul) yükleyin.
• Western lekesi ile numuneyi analiz edin.

ultrasonikatör UP50H ile Western Blot analizi

Aşağıdaki protokol Kriebisch ve arkadaşlarının çalışmasında kullanılmıştır. (2011):
Toplam protein, 1,25 ile muamele MC3T3-E1 hücreleri izole edilmiştir (OH)₂D₃ (10^-8 M) veya araç verildi. Hücreler, 50 mM Tris HCI, pH 8 (Sigma-Aldrich) ihtiva eden bir tampon maddesi ile lize edilmiştir; 150 mM NaCl (Fisher Scientific); % 0.1 sodyum dodesil sülfat (SDS) (Fisher Scientific); % 1 IGEPAL CA-630 (Sigma-AIdrich) ve% 0.5 sodyum deoksikolat (Merck). Hücre lizatı döngüsü 1, 2 x 10 sn boyunca soniklendi ve 80 genlik edildi UP50H Ultrasonik İşlemci (Hielscher, Ultrason Teknolojisi, Teltow, Almanya). Daha sonra materyal, 14,000 rpm'de 10 dakika santrifüjlendi ve süpernatan, Western blotlama için kullanıldı. Yirmi beş ofg protein, numune tamponu ve indirgeyici ajan (Invitrogen) içinde kaynatıldı ve daha sonra% 4-12 poliakrilamid jeller (Invitrogen) kullanılarak SDS-PAGE ile ayrıldı ve bir nitroselüloz zarına (GE sağlık bakımı) aktarıldı. Membran 1 saat süreyle% 1 kazein (Sigma-Aldrich) ve% 1 Tris (1 M) içeren TBS (10 mM Tris-HCI; pH 7.6; 150 mM NaCI) ile bloke edildi. Bloke edildikten sonra, zar, birincil antikor ile (4 ° C'de bir gece boyunca hafif çalkalama ile inkübe edildi) (Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, ABD laboratuarında geliştirilen tavşan anti-insan CBS 1/500). Bir horseradish peroksidaz (HPR) -konjuge sekonder antikor (Dako) ile inkübasyon, oda sıcaklığında 1 saat boyunca gerçekleştirildi. Bütün lekeler geliştirilmiş kemilüminesans (Perkin Elmer) tarafından geliştirilmiştir.

Edebiyat / Referanslar