Western Blotting için Ultrasonik Lizis
- Western blot, bir doku homojenatı veya hücre özütü örneğindeki spesifik proteinlerin tespiti için analitik bir prosedürdür.
- Bir Western blot'u çalıştırmak veya enzim aktivitesini ölçmek için, birçok tahlil, hücrede hapsolmuş malzemelere (örneğin proteinler, DNA, hücre altı fragmanlar) erişim gerektirir.
- Sonikasyon, kontrollü hücre bozulması ve lizisi için güvenilir ve kullanımı kolay bir yöntemdir.
Ultrasonik Hücre Bozulması
Dokulardan ve kültürlenmiş hücrelerden protein ekstraksiyonu, birçok biyolojik, biyokimyasal ve analitik teknik (PAGE, Western blotting, ELISA, kütle spektrometresi, vb.) veya protein saflaştırması için ilk adımdır. Yüksek bir protein verimi elde etmek için, hücre materyali ve dokusunun verimli bir şekilde parçalanması / parçalanması gerekir. Bitki hücresi veya hayvan dokusu olsun, sonikasyon hücre lizatınızı kolay ve hızlı bir şekilde hazırlama yöntemidir.
Sonication'ın avantajları
- Hızlı & Verimli
- Kolay kullanım
- yüksek protein verimi
- Tekrarlanabilir / tekrarlanabilir
- Hassas kontrol
- Ölçeklenebilir

VialTweeter sonikatör hücre bozulması ve protein izolasyonu gibi ultrasonik numune hazırlama için
Western Immunoblotting için İmmünopresipitasyon Protokolü
A. Reaktifler
Çözeltilerin hazırlanması için Milli-Q gibi arıtılmış su kullanın.
- 1X Fosfat Tamponlu Salin (PBS)
- 1X Hücre Lizis Tamponu: 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, %1 Triton X-100, 2.5 mM Sodyum pirofosfat, 1 mM β-gliserofosfat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptin
Önemli: Kullanmadan hemen önce 1 mM PMSF ekleyin. - 15 μl Protein A+15 μl Protein G IP için yeterlidir, ancak birincil antikorunuza ve numune hacminize bağlı olabilir. Önceden karıştırılmış protein A / G agarozu da kullanabilirsiniz (örneğin, tavşan IgG aşağı çekme için Protein A ve fare IgG aşağı çekme için Protein G)
- 3X SDS Numune Tamponu: 187,5 mM Tris-HCl (25°C'de pH 6,8), %6 w/v SDS, 0 gliserol, 150 mM DTT, %0,03 w/v bromofenol mavisi
B. Hücre lizatlarının hazırlanması
- Hücreleri hasat edin. Hücreleri denatüre olmayan koşullar altında hasat etmek için, ortamı çıkarın ve hücreleri buz gibi soğuk PBS ile bir kez durulayın.
- PBS'yi çıkarın ve her bir plakaya (10 cm) 0,5 ml buz gibi soğuk 1X hücre lizis tamponu ekleyin ve plakaları 5 dakika buz üzerinde inkübe edin.
- Hücreleri plakalardan kazıyın ve mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Buz üzerinde tutun.
- Buz gibi soğuk immünopresipitasyon tamponunda 10 saniye boyunca iki kez sonikat (IP tamponu: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA,% 0.1 NP-40 ve proteaz inhibitörü karışımı). Sonikasyon için, VialTweeter veya gibi bir prob ultrasonicator UP100H veya UP200Ht en uygun olanlardır.
- Lizatları 15.000 g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. (Gerekirse, lizat –80 ° C'de saklanabilir.)
- Süpernatanıma birincil antikoru ekleyin. Primer antikora sahip süpernatant, hafif ajitasyon altında 4 ° C'de 1 saat inkübe edilir. Birincil antikor tipik olarak western blotlama için kullanılandan 10 kat daha konsantre bir miktarda eklenir. (100μL'de 1μg ile başlayabilirsiniz.)
- Süpernatant daha sonra eşit miktarda Protein A-agaroz (Invitrogen) ve Protein G agaroz karışımı ile 1 saat daha inkübe edilir.
- Agaroz peletlerini IP tamponu ile üç kez yıkayın. Daha sonra, bağlı proteinleri SDS-PAGE yükleme tamponu ile 95 ° C'de 5 dakika ısıtarak ekstrakte edin.
C. İmmünopresipitasyon
- 200 μl hücre lizatı alın ve birincil antikor ekleyin. Gece boyunca 4 ° C'de hafifçe sallanarak inkübe edin.
- Protein A veya G agaroz boncukları ekleyin (20 μl% 50 boncuk bulamacı). 4 ° C'de 1-3 saat hafifçe sallanarak inkübe edin.
- 4 ° C'de 30 saniye boyunca mikrosantrifüj edin. Peletleri 500 μl 1X hücre lizis tamponu ile beş kez yıkayın. Yıkama sırasında buz üzerinde tutun.
- Peleti 20 μl 3X SDS numune tamponu ile yeniden süspanse edin. Vorteks, daha sonra 30 saniye mikrosantrifüj edin.
- Numuneyi 2-5 dakika boyunca 95-100 ° C'ye ısıtın ve 14.000 X g'de 1 dakika mikrosantrifüj edin.
- Numuneyi (15-30 μl) SDS-PAGE jel (-15) üzerine yükleyin.
- Örneği Western blotting ile analiz edin.
Sonicator UP50H ile Western Blot Analizi
Kriebisch ve ark. (2011):
Total protein, 1,25(OH) ile tedavi edilen MC3T3-E1 hücrelerinden izole edildi2D3 (10−8 M) veya araç. Hücreler 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich) içeren bir tampon ile parçalandı; 150 mM NaCl (Fisher Bilimsel); % 0.1 sodyum dodesil sülfat (SDS) (Fisher Scientific); % 1 IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) ve% 0.5 sodyum deoksikolat (Merck). Hücre lizatı, döngü 1'de 2 × 10 saniye boyunca ve amplitüd 80 ile sonikleştirildi. UP50H Ultrasonik İşlemci (Hielscher, Ultrason Teknolojisi, Teltow, Almanya). Daha sonra malzeme 14.000 rpm'de 10 dakika santrifüjlendi ve süpernatant Western blotlama için kullanıldı. Yirmi beş μg protein, numune tamponu ve indirgeyici ajan (Invitrogen) içinde kaynatıldı ve daha sonra %4-12 poliakrilamid jeller (Invitrogen) kullanılarak SDS-PAGE ile ayrıldı ve bir nitroselüloz membrana (GE sağlık hizmeti) aktarıldı. Membran 1 saat süreyle %1 kazein (Sigma-Aldrich) ve %1 Tris (1 M) içeren TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7.6; 150 mM NaCl) ile bloke edildi. Bloke edildikten sonra, membran gece boyunca 4 ° C'de birincil antikor (tavşan anti-insan CBS 1/500, Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, ABD'nin laboratuvarında geliştirilmiştir) ile hafif ajitasyon ile inkübe edildi. Yaban turpu peroksidaz (HPR) konjuge ikincil antikoru (Dako) ile inkübasyon, oda sıcaklığında 1 saat süreyle gerçekleştirildi. Tüm lekeler geliştirilmiş kemilüminesans (Perkin Elmer) ile geliştirilmiştir.
Ultrasonik hücre lizisi ve ekstraksiyonu, lizat hazırlama ve proses iyileştirmeleri için öneriler için en iyi uygulamalar hakkında daha fazla bilgi edinmek için buraya tıklayın!
Aşağıdaki tablo size laboratuvar boyutu ultrasonicators yaklaşık işleme kapasitesi hakkında bir gösterge vermektedir:
Önerilen Cihaz | Numune Hacmi | Akış Oranı |
---|---|---|
UIP400MTP 96 Kuyulu Plaka Sonikatörü | Çok kuyulu / mikrotitre plakaları | n.a. |
Ultrasonik CupHorn | Şişeler veya beher için CupHorn | n.a. |
GDmini2 | ultrasonik mikro akış reaktörü | n.a. |
VialTweeter | 0,5 - 1,5 mL | n.a. |
UP100H | 1 - 500mL | 10 - 200mL/min |
UP200Ht, UP200St | 10 ila 1000 mL | 20 ila 200 mL/dk |
UP400St | 10 - 2000mL | 20 - 400mL/min |
Ultrasonik Elek Çalkalayıcı | n.a. | n.a. |
Bizimle İletişime Geçin! / Bize Sor!

UIP400MTP plakalı sonikatör 96 oyuklu plakaların yüksek verimli sonikasyonu için
Western Blotting Hakkında
Lekeler, DNA, RNA ve proteinlerin ayrılabilmeleri için bir taşıyıcıya aktarıldığı analitik prosedürlerdir.
Güney lekesi DNA'nın tespiti için, Kuzey lekesi RNA için ve Batı lekesi proteinler için kullanılır.
Western blotlama aynı zamanda protein immünoblotlama olarak da adlandırılır, çünkü antijenini spesifik olarak tespit etmek için bir antikor kullanılır. Western Blotting, numunedeki spesifik proteinleri tespit etmek için en önemli analiz yöntemlerinden biridir. Western blot'ta, proteinler monoklonal veya poliklonal antikorlar kullanılarak tespit edilmek üzere zarlar üzerinde hareketsiz hale getirilir.
SDS-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile doğal proteinler, polipeptitin uzunluğuna göre 3 boyutlu yapı veya denatüre proteinler ile ayrılır. Proteinler daha sonra bir zara (tipik olarak nitroselüloz veya PVDF) aktarılır ve burada hedef proteine özgü antikorlarla boyanırlar. Jel elektroforez adımı, antikorların çapraz reaktivitesi sorununu çözmek için western blot analizine dahil edilir.
Daha sonra, ayrılan proteinler, antikorlarla boyandıkları bir matris (çoğunlukla bir nitroselüloz veya PVDF zarı üzerinde) üzerine lekelenir. Antikorlar bir prob olarak işlev görür ve hedef proteine özel olarak seçilir. Spesifik reaksiyonun yerinin ve yoğunluğunun analizi, verilen numunedeki hedef proteinlerin ekspresyon ayrıntılarını ortaya çıkarır. Western blotlama, jel elektroforezinin yüksek çözünürlüğü ve immünolojik testin güçlü özgüllüğü ve yüksek duyarlılığı nedeniyle 1ng kadar düşük olan hedef proteini tespit edebilir. Western blot yöntemi moleküler biyoloji, biyokimya, immünogenetik ve diğer moleküler araştırma alanlarında kullanılmaktadır.
Diğer ilgili teknikler arasında nokta blot analizi, immünohistokimya ve immünositokimya yer alır, burada antikorlar immünoboyama yoluyla doku ve hücrelerdeki proteinleri tespit etmek için kullanılır ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA).
Literatür / Referanslar
- Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
- Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
- Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.

VialTweeter sonikatör Birden fazla flakonun eş zamanlı numune hazırlanması için