Western Blotlama için Ultrasonik Lizis

• Western blot, doku homojenatı veya hücre ekstraktı numunesindeki belirli proteinlerin tespit edilmesine yönelik bir analiz yöntemidir.
• Western blot yapmak veya enzim aktivitesini ölçmek için birçok analiz, hücre içinde hapsolmuş materyallere (ör. proteinler, DNA, hücre altı parçalar) erişim gerektirir.
• Sonikasyon, kontrollü hücre parçalama ve lizis için güvenilir ve kolay uygulanabilen bir yöntemdir.

Ultrasonik Hücre Parçalama

Dokulardan ve kültürlenmiş hücrelerden protein ekstraksiyonu, birçok biyolojik, biyokimyasal ve analitik teknik (PAGE, Western blotlama, ELISA, kütle spektrometrisi vb.) veya protein saflaştırma işlemi için ilk adımdır. Yüksek protein verimi elde etmek için hücre materyali ve doku etkin biçimde parçalanmalı / lizise uğratılmalıdır. İster bitki hücresi ister hayvan dokusu olsun, sonikasyon hücre lizatınızı kolay ve hızlı bir şekilde hazırlamak için kullanılan yöntemdir.

Sonikasyonun Avantajları

• hızlı ve verimli
• kolay kullanım
• yüksek protein verimi
• yeniden üretilebilir / tekrarlanabilir
• hassas biçimde kontrol edilebilir
• ölçeklenebilir

Western İmmünoblotlama için İmmünopresipitasyon Protokolü

A. Reaktifler

Çözeltileri hazırlamak için Milli-Q gibi saflaştırılmış su kullanın.

• 1X Fosfat Tamponlu Salin (PBS)
• 1X Hücre Lizis Tamponu: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, %1 Triton X-100, 2,5 mM sodyum pirofosfat, 1 mM β-gliserofosfat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml löupeptin
  Önemli: Kullanımdan hemen önce 1 mM PMSF ekleyin.
• 15 μl Protein A+15 μl Protein G, IP için yeterlidir, ancak bu miktarın yeterliliği birincil antikorunuza ve numune hacminize bağlı olabilir. Önceden karıştırılmış protein A/ G agaroz da kullanabilirsiniz (ör. tavşan IgG’sini çekip ayırmak için Protein A ve fare IgG’sini çekip ayırmak için Protein G).
• 3X SDS Numune Tamponu: 187,5 mM Tris-HCl (25°C sıcaklıkta pH 6,8), %6 w/v SDS, %30 gliserol, 150 mM DTT, %0,03 w/v bromofenol mavisi

B. Hücre Lizatlarının Hazırlanması

• Hücreleri toplayın. Hücreleri denatürasyona yol açmayan koşullarda toplamak için besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri buz gibi soğuk PBS ile bir kez yıkayın.
• PBS’yi uzaklaştırın, her plakaya (10 cm) 0,5 ml buz gibi soğuk 1X hücre lizis tamponu ekleyin ve plakaları buz üzerinde 5 dakika inkübe edin.
• Hücreleri plakalardan kazıyarak ayırın ve mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Buz üzerinde tutun.
• Buz gibi soğuk immünopresipitasyon tamponunda iki kez 10 saniye boyunca sonike edin (IP tamponu: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, %0,1 NP-40 ve proteaz inhibitörü karışımı). Sonikasyon için VialTweeter veya prob tipi ultrasonikatörlerden UP100H ya da UP200Ht gibi cihazlar en uygun seçeneklerdir.
• Lizatları 4°C sıcaklıkta, 15.000 g’de 10 dakika santrifüjleyin.
• Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. (Gerekirse lizat –80°C sıcaklıkta saklanabilir.)
• Birincil antikoru süpernatanta ekleyin. Birincil antikor içeren süpernatant, hafifçe çalkalanarak 4°C sıcaklıkta 1 h inkübe edilir. Birincil antikor genellikle Western blotlamada kullanılandan 10x daha konsantre bir miktarda eklenir. (100μL başına 1μg ile başlayabilirsiniz.)
• Ardından süpernatant, eşit miktarlarda Protein A-agaroz (Invitrogen) ve Protein G agaroz karışımıyla 1 h daha inkübe edilir.
• Agaroz peletlerini IP tamponuyla üç kez yıkayın. Ardından, 95°C sıcaklıkta 5 dakika ısıtarak bağlı proteinleri SDS-PAGE yükleme tamponuyla ekstrakte edin.

C. İmmünopresipitasyon

• 200 μl hücre lizatı alın ve birincil antikor ekleyin. 4°C sıcaklıkta gece boyunca hafifçe sallayarak inkübe edin.
• Protein A veya G agaroz boncuklarından birini ekleyin (%50 boncuk süspansiyonundan 20 μl). 4°C sıcaklıkta 1–3 saat hafifçe sallayarak inkübe edin.
• 4°C sıcaklıkta 30 saniye mikrosantrifüjleyin. Peleti 500 µl 1X hücre lizis tamponuyla beş kez yıkayın. Yıkamalar sırasında buz üzerinde tutun.
• Peleti 20 μl 3X SDS numune tamponuyla yeniden süspanse edin. Vorteksleyin, ardından 30 saniye mikrosantrifüjleyin.
• Numuneyi 2–5 dakika boyunca 95–100°C sıcaklığa ısıtın ve 14.000 X g’de 1 dakika mikrosantrifüjleyin.
• Numuneyi (15–30 μl) SDS-PAGE jeline (%12–15) yükleyin.
• Numuneyi Western blotlama ile analiz edin.

UP50H Sonikatörü ile Western Blot Analizi

Prob tipi UP50H sonikatörünün kullanıldığı aşağıdaki protokol, Kriebisch ve ark. (2011) çalışmasında kullanılmıştır:
Toplam protein, MC3T3-E1 hücrelerinden izole edildi; bu hücreler 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) veya taşıyıcı ile muamele edilmişti. Hücreler, 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); %0,1 sodyum dodesil sülfat (SDS) (Fisher Scientific); %1 IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) ve %0,5 sodyum deoksikolat (Merck) içeren bir tamponla lizise uğratıldı. Hücre lizatı, çevrim 1 ve genlik 80 ayarlarında 2 × 10 s boyunca UP50H ultrasonik işlemcisi (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Almanya) kullanılarak sonike edildi. Daha sonra materyal 14.000 rpm’de 10 min santrifüjlendi ve süpernatant Western blotlama için kullanıldı. Yirmi beş μg protein, numune tamponu ve indirgeyici ajan (Invitrogen) içinde kaynatıldı; ardından %4–12 poliakrilamid jeller (Invitrogen) kullanılarak SDS-PAGE ile ayrıldı ve bir nitroselüloz membrana (GE health care) aktarıldı. Membran, %1 kazein (Sigma-Aldrich) ve %1 Tris (1 M) içeren TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) ile 1 h bloke edildi. Bloklamadan sonra membran, birincil antikorla (Prof. R. Banerjee’nin Ann Arbor, MI, ABD’deki laboratuvarında geliştirilen, insan CBS’sine karşı tavşan antikoru, 1/500) 4°C sıcaklıkta gece boyunca hafifçe çalkalanarak inkübe edildi. Yaban turpu peroksidazı (HPR) ile konjuge edilmiş ikincil antikorla (Dako) inkübasyon, oda sıcaklığında 1 h gerçekleştirildi. Tüm blotlar, artırılmış kemilüminesans (Perkin Elmer) ile görünür hâle getirildi.
 

Ultrasonik hücre lizisi ve ekstraksiyonu için en iyi uygulamalar, lizat hazırlama ve süreç iyileştirme önerileri hakkında daha fazla bilgi edinmek için buraya tıklayın!
 
Aşağıdaki tablo, laboratuvar ölçeğindeki ultrasonikatörlerimizin yaklaşık işleme kapasitesi hakkında fikir verir:

Literatür / Kaynaklar

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.