Ultrasonikasyon ile BL21 Hücrelerinin Hücre Lizisi
BL21 hücreleri, proteinleri yüksek verimli bir şekilde ifade etme yetenekleri nedeniyle araştırma laboratuvarlarında, biyoteknolojide ve endüstriyel üretimde yaygın olarak kullanılan bir E. coli türüdür. Ultrasonik hücre bozulması, lizis ve protein ekstraksiyonu, hedeflenen proteinleri BL21 hücrelerinin hücresel iç kısmından izole etmek ve toplamak için yaygın bir yöntemdir. Ultrasonikasyon hücreyi tamamen bozar ve tüm sıkışmış proteinleri serbest bırakır, proteinin% 100'ünü kullanılabilir hale getirir.
Protein Ekspresyonu için BL21 Hücreleri
BL21 hücresi, bir T7 RNA polimeraz-IPTG indüksiyon sistemi kullanılarak transformasyon ve yüksek seviyeli protein ekspresyonu için uygun, kimyasal olarak yetkin bir E. coli bakteri türüdür. BL21 hücreleri, bir T7 promotörün kontrolü altındaki herhangi bir genin yüksek verimli protein ekspresyonuna izin verir. E. coli suşu BL21 (DE3), T7 promotör bazlı ekspresyon vektörleri ile birleştirilmiş bir T7 RNA polimeraz bazlı protein üretim suşudur ve rekombinant proteinler üretmek için laboratuvarlarda ve endüstride yaygın olarak uygulanır. BL21'de (DE3), rekombinant proteini kodlayan genin ekspresyonu, geleneksel E. coli RNAP'tan sekiz kat daha hızlı transkribe eden kromozomal olarak kodlanmış T7 RNA polimeraz (T7 RNAP) tarafından kopyalanır. Bu, BL21 (DE3) suşunu oldukça verimli hale getirir ve onu en çok tercih edilen protein ekspresyon hücre sistemlerinden biri haline getirir.
BL21 Hücrelerinden Ultrasonik Lizis ve Protein Ekstraksiyonu Protokolü
BL21 hücrelerinin hücre lizisi çoğunlukla, lizis tamponu olarak sodyum lauroil sarkosinat (sarkosil olarak da bilinir) ile kombinasyon halinde ultrasonikasyon kullanılarak gerçekleştirilir. Ultrasonik hücre bozulması ve protein ekstraksiyonunun avantajları, ultrasonicators'ın güvenilirliği, tekrarlanabilirliği ve basit, güvenli ve hızlı çalışmasında yatmaktadır. Aşağıdaki protokol, ultrasonik BL21 hücre lizisi için adım adım bir yön vermektedir:
- Şaperon proteinlerini uzaklaştırmak için, BL21 bakteri peletleri 50 ml buz gibi soğuk Sodyum Tris-EDTA (STE) tamponunda (10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl ve 100 mM PMSF ile desteklenmiş) yeniden süspanse edildi.
- 500 ul lizozim (10 mg / ml) eklenir ve hücreler 15 dakika buz üzerinde inkübe edilir.
- Daha sonra 500 ul DTT ve 7 ml sarkosil (STE tamponunda oluşturulan (a/h)) eklenir.
- Tüm saflaştırma tamponlarını buz gibi soğuk tutmak ve numuneleri her zaman buz üzerinde tutmak çok önemlidir. Tüm arıtma adımları mümkünse soğuk odada yapılmalıdır.
- Ultrasonik lizis ve protein ekstraksiyonu için, numuneler VialTweeter Çoklu Örnek Ultrasonikatör 4 x 30 saniye boyunca% 100 genlikte, her sonikasyon arasında 2 dakikalık bir aralıkla. Alternatif olarak, mikro uçlu bir prob tipi ultrasonik homojenizatör, örneğin, UP200Ht S26d2 ile (3 x 30 saniye, ultrasonik döngüler arasında 2 dakikalık duraklama, � genlik) kullanılabilir.
- Daha sonraki saflaştırma adımları için, numuneler buz üzerinde tutulmalı veya alternatif olarak daha fazla işleme tabi tutulana kadar -80°C'de saklanmalıdır.
Ultrasonik hücre bozucu UP200St lizis ve protein ekstraksiyonu için mikro uçlu S26d2 ile
Prescise Sıcaklık Kontrolü Altında Ultrasonik Lizis
Biyolojik numunelerle çalışırken hassas ve güvenilir sıcaklık kontrolü çok önemlidir. Yüksek sıcaklıklar, numunelerde termal olarak indüklenen protein bozunmasını başlatır.
Tüm mekanik numune hazırlama teknikleri gibi, sonikasyon da ısı oluşturur. Bununla birlikte, VialTweeter kullanılırken numunelerin sıcaklığı iyi kontrol edilebilir. Numunelerinizi analiz için VialTweeter ve VialPress ile hazırlarken sıcaklıklarını izlemek ve kontrol etmek için size çeşitli seçenekler sunuyoruz.
- Numune sıcaklığının izlenmesi: VialTweeter'ı çalıştıran ultrasonik işlemci UP200St, akıllı bir yazılım ve takılabilir bir sıcaklık sensörü ile donatılmıştır. Sıcaklık sensörünü UP200St'ye takın ve sıcaklık sensörünün ucunu numune tüplerinden birine yerleştirin. Dijital renkli dokunmatik ekran aracılığıyla, UP200St'nin menüsünde örnek sonikasyonunuz için belirli bir sıcaklık aralığı ayarlayabilirsiniz. Ultrasonicator, maksimum sıcaklığa ulaşıldığında otomatik olarak duracak ve örnek sıcaklığı, ayarlanan sıcaklığın ∆ daha düşük değerine düşene kadar duraklayacaktır. Sonra sonikasyon otomatik olarak tekrar başlar. Bu akıllı özellik, ısı kaynaklı bozulmayı önler.
- VialTweeter bloğu önceden soğutulabilir. Titanyum bloğu önceden soğutmak için VialTweeter bloğunu (yalnızca dönüştürücüsüz sonotrot!) buzdolabına veya dondurucuya koyun, numunedeki sıcaklık artışını ertelemeye yardımcı olur. Mümkünse, numunenin kendisi de önceden soğutulabilir.
- Sonikasyon sırasında soğutmak için kuru buz kullanın. Kuru buzla dolu sığ bir tepsi kullanın ve ısının hızla dağılabilmesi için VialTweeter'ı buzun üzerine yerleştirin.
Dünya çapındaki müşteriler, biyolojik, biyokimyasal, tıbbi ve klinik laboratuvarlarda günlük numune hazırlama çalışmaları için VialTweeter ve VialPress'i kullanıyor. UP200St işlemcinin akıllı yazılımı ve sıcaklık kontrolü, sıcaklık güvenilir bir şekilde kontrol edilir ve ısı kaynaklı numune bozulması önlenir. VialTweeter ve VialPress ile ultrasonik numune hazırlama, son derece güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar verir!
Lizis Uygulamanız için En Uygun Ultrasonik Bozucuyu Bulun
Hielscher Ultrasonics, laboratuvarlar, tezgah üstü ve endüstriyel ölçekli sistemler için yüksek performanslı ultrasonik hücre bozucular ve homojenizatörler uzun süredir deneyimli bir üreticidir. Bakteri hücre kültürü boyutunuz, araştırma veya üretim hedefiniz ve saat veya gün başına işlenecek hücre hacmi, uygulamanız için doğru ultrasonik hücre bozucuyu bulmak için temel faktörlerdir.
Hielscher Ultrasonics, çoklu örneklerin (VialTweeter ile 10 şişeye kadar) ve kütle örneklerinin (yani, UIP400MTP ile mikrotitre plakaları / ELISA plakaları) eşzamanlı sonikasyonu için çeşitli çözümler sunar, ayrıca 50 ila 400 watt arasında farklı güç seviyelerine sahip klasik prob tipi laboratuvar ultrasonicator, büyük üretimde ticari hücre bozulması ve protein ekstraksiyonu için birim başına 16.000 watt'a kadar tamamen endüstriyel ultrasonik işlemcilere sahiptir. Tüm Hielscher ultrasonicators tam yük altında 24/7/365 operasyon için üretilmiştir. Sağlamlık ve güvenilirlik, ultrasonik cihazlarımızın temel özellikleridir.
Tüm dijital ultrasonik homojenizatörler, ultrasonik cihazı laboratuvar ve üretim tesislerinde uygun bir çalışma aracı haline getiren akıllı yazılım, renkli dokunmatik ekran ve otomatik veri protokolü ile donatılmıştır.
Biyolojik numunelerinizi işlemek için ne tür hücreler, hangi hacim, hangi sıklıkta ve hangi hedefle yapmanız gerektiğini bize bildirin. Proses gereksinimleriniz için size en uygun ultrasonik hücre bozucuyu önereceğiz.
Aşağıdaki tablo, kompakt el tipi homojenizatörler ve MultiSample Ultrasonikatörlerden ticari uygulamalar için endüstriyel ultrasonik işlemcilere kadar ultrasonik sistemlerimizin yaklaşık işleme kapasitesinin bir göstergesini vermektedir:
| Numune Hacmi | Akış Oranı | Önerilen Cihaz |
|---|---|---|
| 96 kuyulu / mikrotitre plakalar | n.a. | UIP400MTP |
| 10 şişe à 0,5 ila 1,5 mL | n.a. | UP200St'de VialTweeter |
| 00,01 ila 250 mL | 5 ila 100 mL/dk | UP50H |
| 00,01 ila 500 mL | 10 - 200mL/min | UP100H |
| 10 - 2000mL | 20 - 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1 - 20L | 0,2 - 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 - 100L | 2 - 10L/min | UIP4000hdT |
| n.a. | 10 - 100L/min | UIP16000 |
| n.a. | daha büyük | grubu UIP16000 |
Bizimle İletişime Geçin! / Bize Sor!
UIP400MTP plakalı sonikatör 96 oyuklu plakalarda yüksek verimli hücre bozulması için
ultrasonikatör UP200Ht küçük numunelerin sonikasyonu için 2mm mikrotip S26d2 ile
Tampon çözeltilerinin verimli ve güvenilir bir şekilde hazırlanması için ultrasonik doku homojenizatörünüzü nasıl kullanabileceğiniz hakkında daha fazla bilgi edinin!
Bilmeye Değer Gerçekler
Escherichia Coli Bakterileri
Escherichia coli, spor oluşturmayan, Gram negatif olan ve düz çubuk şekli ile karakterize edilen bir bakteri türüdür. E.coli bakterileri insan ve hayvanların çevresinde, gıdalarda ve bağırsaklarında bulunur. E. coli genellikle peritrichous flagella kullanılarak hareketlidir, ancak hareketsiz türleri de vardır. E.coli, fakültatif olarak anaerobik kemoorganotrof organizmalar olarak adlandırılır, bu da hem solunum hem de fermentatif metabolizma yeteneğine sahip oldukları anlamına gelir. Çoğu E.coli türü iyi huyludur ve vücutta yararlı işlevleri yerine getirir, örneğin zararlı bakteri türlerinin büyümesini baskılamak, vitaminleri sentezlemek vb.
B tipi olarak adlandırılan Escherichia coli bakteri hücresi, bakteriyofaj duyarlılığı veya kısıtlama-modifikasyon sistemleri gibi mekanizmaları araştırmak için araştırmalarda yaygın olarak kullanılan özel bir E.coli suşları kategorisidir. Ayrıca, E.coli bakterileri, biyoteknoloji ve yaşam bilimleri laboratuvarlarında protein ekspresyonu için güvenilir bir iş gücü olarak değerlendirilmektedir. Örneğin, E.coli, endüstriyel ölçekte proteinler ve oligosakkaritler gibi bileşikleri sentezlemek için kullanılır. Proteaz eksikliği, yüksek glikoz seviyesinde düşük asetat üretimi ve gelişmiş geçirgenlik gibi spesifik özellikler nedeniyle, E. coli B hücreleri, genetik olarak tasarlanmış proteinlerin üretimi için en sık kullanılan konakçı hücrelerdir.
Rekombinant Protein
Rekombinant proteinler (rProt), kimyasal üretim, ilaç, kozmetik, insan ve hayvan tıbbı, tarım, gıda ve atık arıtma endüstrileri dahil olmak üzere çeşitli dallarda önemli önem kazanmaktadır.
Rekombinant proteinin üretimi, bir ekspresyon sisteminin kullanılmasını gerektirir. Rekombinant DNA üretimi için eksprese edici hücre sistemleri olarak hem prokaryotik hem de ökaryotik hücreler kullanılabilir. Bakteri hücresi düşük maliyet, kolay ölçeklenebilirlik ve basit besiyeri koşulları gibi faktörler nedeniyle protein ekspresyonu için en yaygın olarak kullanılırken, memeli, maya, alg, böcek ve hücresiz sistemler yerleşik alternatiflerdir. Protein tipi, fonksiyonel aktivite ve ayrıca eksprese edilen proteinin gerekli verimi, protein ekspresyonu için kullanılan hücre sisteminin seçimini etkiler.
Rekombinant proteini eksprese etmek için, belirli bir hücrenin, rekombinant DNA şablonunu içeren bir DNA vektörü ile transfekte edilmesi gerekir. Şablonla transfekte edilen hücreler daha sonra kültürlenir. Hücresel mekanizmanın bir sonucu olarak, hücreler ilgilenilen proteini yazıya döker ve çevirir, böylece hedeflenen proteini üretir.
İfade edilen proteinler hücresel matris içinde sıkışıp kaldığından, proteinleri serbest bırakmak için hücrenin parçalanması (parçalanması ve kırılması) gerekir. Sonraki bir saflaştırma adımında, protein ayrılır ve saflaştırılır.
Tedavide kullanılan ilk rekombinant protein 1982 yılında rekombinant insan insülini olmuştur. Günümüzde tıbbi tedaviler için dünya çapında 170'den fazla rekombinant protein türü üretilmektedir. Tıpta yaygın olarak kullanılan rekombinant proteinler, örneğin rekombinant hormonlar, interferonlar, interlökinler, büyüme faktörleri, tümör nekroz faktörleri, kan pıhtılaşma faktörleri, trombolitik ilaçlar ve diyabet, cücelik, miyokard enfarktüsü, konjestif kalp yetmezliği, serebral apopleksi, multipl skleroz, nötropeni, trombositopeni, anemi, hepatit, romatoid artrit, astım, Crohn hastalığı ve kanser tedavileri gibi önemli hastalıkların tedavisinde kullanılan enzimlerdir. (bkz. Phuc V. Pham, Omik Teknolojileri ve Biyo-Mühendislik, 2018)
Literatür / Referanslar
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
VialTweeter sonikatör 10 numunenin aynı anda sonikasyonu için, örneğin BL21 hücrelerini bozmak için
Yüksek performanslı ultrasonik! Hielscher'ın ürün yelpazesi, kompakt laboratuvar ultrasonicator'dan tezgah üstü ünitelere kadar tam endüstriyel ultrasonik sistemlere kadar tüm spektrumu kapsar.