Ultrasonikasyon ile BL21 Hücrelerinin Lizisi

BL21 hücreleri, proteinleri yüksek verimlilikle eksprese etme yetenekleri nedeniyle araştırma laboratuvarlarında, biyoteknolojide ve endüstriyel üretimde yaygın olarak kullanılan bir E. coli suşudur. Ultrasonik hücre parçalama, lizis ve protein ekstraksiyonu, hedeflenen proteinleri BL21 hücrelerinin içinden izole etmek ve toplamak için yaygın olarak kullanılan yöntemdir. Ultrasonikasyon hücreyi tamamen parçalar ve içeride hapsolmuş tüm proteinleri serbest bırakarak proteinin %100’ünü kullanılabilir hâle getirir.

Protein Ekspresyonu için BL21 Hücreleri

BL21 hücresi, T7 RNA polimeraz-IPTG indüksiyon sistemi kullanılarak transformasyon ve yüksek düzeyde protein ekspresyonu için uygun olan, kimyasal olarak kompetan bir E. coli bakteri suşudur. BL21 hücreleri, T7 promotörünün kontrolü altındaki herhangi bir genin yüksek verimlilikle protein ekspresyonuna olanak tanır. E. coli suşu BL21(DE3), T7 promotörüne dayalı ekspresyon vektörleriyle birleştirilen, T7 RNA polimerazına dayalı bir protein üretim suşudur ve rekombinant protein üretmek için laboratuvarlarda ve endüstride yaygın olarak kullanılır. BL21(DE3) suşunda, rekombinant proteini kodlayan genin ekspresiyonu, geleneksel E. coli RNAP enziminden sekiz kat daha hızlı transkripsiyon yapan, kromozomal olarak kodlanmış T7 RNA polimeraz (T7 RNAP) tarafından transkribe edilir. Bu, BL21(DE3) suşunu son derece verimli kılar ve onu en çok tercih edilen protein ekspresyonu hücre sistemlerinden biri hâline getirir.

BL21 Hücrelerinden Ultrasonik Lizis ve Protein Ekstraksiyonu için Protokol

BL21 hücrelerinin lizisi çoğunlukla lizis tamponu olarak sodyum lauroil sarkozinatın (sarkosil olarak da bilinir) ultrasonikasyonla birlikte kullanılmasıyla gerçekleştirilir. Ultrasonik hücre parçalama ve protein ekstraksiyonunun avantajları, güvenilirlik ve tekrarlanabilirliğin yanı sıra ultrasonikatörlerin basit, güvenli ve hızlı çalıştırılabilmesidir. Aşağıdaki protokol, ultrasonik BL21 hücre lizisi için adım adım talimatlar sunar:

• Şaperon proteinlerini uzaklaştırmak için BL21 bakteri peletleri, buz soğukluğundaki 50 ml Sodyum Tris-EDTA (STE) tamponunda (100 mM PMSF eklenmiş 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl içeren) yeniden süspanse edildi.
• Ardından 500 ul lizozim (10 mg/ ml) eklenir ve hücreler buz üzerinde 15 min inkübe edilir.
• Daha sonra 500 ul DTT ve 7 ml sarkosil (STE tamponunda hazırlanmış %10 (w/v)) eklenir.
• Tüm saflaştırma tamponlarının buz soğukluğunda tutulması ve numunelerin her zaman buz üzerinde bulundurulması esastır. Mümkünse tüm saflaştırma adımları soğuk odada gerçekleştirilmelidir.



• Ultrasonik lizis ve protein ekstraksiyonu için numuneler VialTweeter MultiSample ultrasonikatöründe her sonikasyon arasında 2 min aralık bırakılarak %100 genlikte 4 x 30 sec boyunca sonikasyona tabi tutulur. Alternatif olarak, mikro uçlu prob tipi bir ultrasonik homojenizatör, örneğin UP200Ht homojenizatörü S26d2 ile (3 x 30 sec, ultrasonik döngüler arasında 2 min. ara, %80 genlik) kullanılabilir.
• Sonraki saflaştırma adımları için numuneler buz üzerinde tutulmalı veya alternatif olarak sonraki işleme kadar -80°C sıcaklıkta saklanmalıdır.

Hassas Sıcaklık Kontrolü Altında Ultrasonik Lizis

Biyolojik numunelerle çalışırken hassas ve güvenilir sıcaklık kontrolü büyük önem taşır. Yüksek sıcaklıklar, numunelerde ısı kaynaklı protein bozunmasını başlatır.
Tüm mekanik numune hazırlama teknikleri gibi sonikasyon da ısı üretir. Ancak VialTweeter kullanıldığında numunelerin sıcaklığı iyi bir şekilde kontrol edilebilir. Numunelerinizi analiz için VialTweeter ve VialPress ile hazırlarken sıcaklıklarını izlemek ve kontrol etmek için çeşitli seçenekler sunuyoruz.

1. Numune sıcaklığının izlenmesi: VialTweeter cihazını çalıştıran UP200St ultrasonik işlemcisi, akıllı bir yazılım ve takılabilir bir sıcaklık sensörüyle donatılmıştır. Sıcaklık sensörünü UP200St işlemcisine bağlayın ve sıcaklık sensörünün ucunu numune tüplerinden birine yerleştirin. Dijital renkli dokunmatik ekran üzerinden UP200St işlemcisinin menüsünde numune sonikasyonunuz için belirli bir sıcaklık aralığı ayarlayabilirsiniz. Ultrasonikatör, maksimum sıcaklığa ulaşıldığında otomatik olarak durur ve numune sıcaklığı ayarlanan sıcaklık ∆ değerinin alt değerine düşene kadar bekler. Ardından sonikasyon otomatik olarak yeniden başlar. Bu akıllı özellik, ısı kaynaklı bozunmayı önler.
2. VialTweeter bloğu önceden soğutulabilir. Titanyum bloğu önceden soğutmak için VialTweeter bloğunu (yalnızca sonotrot, transdüser olmadan!) buzdolabına veya dondurucuya koymak, numunedeki sıcaklık artışını geciktirmeye yardımcı olur. Mümkünse numunenin kendisi de önceden soğutulabilir.
3. Sonikasyon sırasında soğutmak için kuru buz kullanın. Kuru buzla doldurulmuş sığ bir tepsi kullanın ve ısının hızla dağılabilmesi için VialTweeter cihazını buzun üzerine yerleştirin.

Dünya genelindeki müşteriler, biyoloji, biyokimya, tıp ve klinik laboratuvarlarında günlük numune hazırlama çalışmaları için VialTweeter ve VialPress cihazlarını kullanır. UP200St işlemcisinin akıllı yazılımı ve sıcaklık kontrolü sayesinde sıcaklık güvenilir bir şekilde kontrol edilir ve ısı kaynaklı numune bozunması önlenir. VialTweeter ve VialPress ile ultrasonik numune hazırlama, son derece güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar verir!
 

Lizis Uygulamanız için En Uygun Ultrasonik Hücre Parçalayıcıyı Bulun

Hielscher Ultrasonics, laboratuvarlar, tezgâh üstü ve endüstriyel ölçekli sistemler için yüksek performanslı ultrasonik hücre parçalayıcılar ve homojenizatörler üreten, uzun yıllara dayanan deneyime sahip bir üreticidir. Bakteriyel hücre kültürünüzün büyüklüğü, araştırma veya üretim hedefiniz ve saat veya gün başına işlenecek hücre hacmi, uygulamanız için doğru ultrasonik hücre parçalayıcıyı bulmada temel faktörlerdir.
Hielscher Ultrasonics, birden çok numunenin (VialTweeter ile 10 viyale kadar) ve çok sayıda numunenin (yani UIP400MTP ile mikrotitre plakaları / ELISA plakaları) eş zamanlı sonikasyonu için çeşitli çözümlerin yanı sıra 50–400 watt arasında farklı güç düzeylerine sahip klasik prob tipi laboratuvar ultrasonikatörlerinden, büyük ölçekli üretimde ticari hücre parçalama ve protein ekstraksiyonu için birim başına 16.000 watta kadar güce sahip tamamen endüstriyel ultrasonik işlemcilere uzanan çözümler sunar. Tüm Hielscher ultrasonikatörleri, tam yük altında 24/7/365 çalışmak üzere üretilmiştir. Sağlamlık ve güvenilirlik, ultrasonik cihazlarımızın temel özellikleridir.
Tüm dijital ultrasonik homojenizatörler, ultrasonik cihazı laboratuvarlarda ve üretim tesislerinde kullanışlı bir çalışma aracı hâline getiren akıllı yazılım, renkli dokunmatik ekran ve otomatik veri kaydıyla donatılmıştır.
Biyolojik numunelerinizde hangi tür hücreleri, hangi hacimde, hangi sıklıkta ve hangi hedefle işlemeniz gerektiğini bize bildirin. Proses gereksinimleriniz için en uygun ultrasonik hücre parçalayıcıyı önereceğiz.

Aşağıdaki tablo, kompakt el tipi homojenizatörlerden ve MultiSample ultrasonikatörlerinden ticari uygulamalara yönelik endüstriyel ultrasonik işlemcilere kadar ultrasonik sistemlerimizin yaklaşık işleme kapasitesi hakkında fikir verir:

Literatür / Kaynaklar

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.