E. Coli Ultrasonik Liziz

  • E.coli bakterileri mikrobiyoloji ve biyoteknoloji en yaygın olarak kullanılan bakterilerdir.
  • Ultrasonik hücre bozucular, E. coli liziz güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar verir.
  • Yoğun henüz tam olarak kontrol edilebilir ve kavitasyon kesme kuvvetleri tamamen parçalama ve yüksek ekstraksiyon verimi (örneğin, proteinler, DNA) ile sonuçlanır.

E. coli'nin Ultrasonik Hücre Bozulması Neden Tercih Edilen Yöntemdir?

Ultrasonik homojenizatörler veya prob tipi ultrasonicators yoğun ultrason verimli hücre duvarları ve membranları bozar gibi E. coli lizis için çeşitli avantajlar sunuyoruz. Prob tipi ultrasonicators yaygın aşağıdaki nedenlerden dolayı E. coli lizis için kullanılır:

  • Hücre duvarlarının verimli bir şekilde bozulması: E. coli, geleneksel lizis yöntemleri kullanılarak kırılması zor olabilen peptidoglikandan oluşan yarı sert bir hücre duvarına sahiptir. Bir prob tipi ultrasonicator, hücreleri çevreleyen sıvıda kavitasyon kabarcıkları oluşturan yoğun ultrasonik dalgalar üretir. Bu kabarcıklar çöktüğünde, hücre duvarlarının mekanik olarak bozulmasına neden olan yüksek hızlı sıvı jetleri ve şok dalgaları üretirler ve biyomoleküller gibi hücresel içerikleri etkili bir şekilde serbest bırakırlar.
  • Gelişmiş penetrasyon: Prob / sonotrode tarafından üretilen ultrasonik dalgalar, numunenin derinliklerine nüfuz edebilir, daha fazla sayıda E. coli hücresine ulaşabilir ve bunları eşit şekilde tedavi edebilir. Bu, lizisin numune boyunca daha homojen olmasını sağlamaya yardımcı olur ve bu da daha yüksek hücre bozulma verimliliği ile sonuçlanır.
  • Azaltılmış İşlem Süresi: Prob tipi ultrasonicator tarafından verilen enerji son derece konsantre ve lokalize, hızlı ve verimli hücre lizis yol açar. Boncuk dövme veya enzimatik lizis gibi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, sonikasyon dakikalar hatta saniyeler içinde E. coli lizisi elde edebilir. Dondurarak çözme gibi birçok alternatif teknik birkaç tur tedavi gerektirirken, ultrasonik lizis hücreleri tek bir işlem adımında açar.
  • Sıcaklık kontrolü: Son teknoloji ultrasonicators sıcaklık sensörleri ve maksimum işlem sıcaklığı ayarlamak için izin akıllı yazılım ile donatılmıştır. Ultrasonicator sıcaklık sınırına ulaşıldığında otomatik olarak duraklar ve ayarlanmış bir sıcaklık noktasına ulaşıldığında sonikasyon işlemini başlatır. Numunelerin bir buz banyosunda soğutulması, numune sıcaklığını düşük tutmak ve ısıya bağlı numune bozulmasını önlemek için basit bir yöntemdir.
  • Ölçeklenebilirlik: Prob tipi ultrasonicators el tipi cihazlardan büyük ölçekli endüstriyel modellere kadar çeşitli boyutlarda mevcuttur. Bu, onları laboratuvarda küçük hacimlerin işlenmesi veya aşı üretimi veya moleküllerin biyosentezi gibi daha büyük biyoişleme uygulamaları için ölçeklendirme için uygun hale getirir.
  • Çok yönlü -lük: Ultrasonicators DNA kesme, protein ekstraksiyonu, doku homojenizasyonu, nanopartikül dispersiyonu ve emülsifikasyon gibi hücre lizis ötesinde çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. Bu nedenle, bir prob tipi ultrasonicator'a yatırım yapmak, araştırma veya endüstriyel ortamlarda çok yönlülük sağlar.
  • UP200St gibi prob tipi ultrasonicators güvenilir doku homojenizatörleri ve hücre kırıcılar, bu nedenle yaygın olarak genetikte numune hazırlama için kullanılır, örneğin, E.coli lizis için

    E.coli hücrelerinden protein ekstraksiyonu, ultrasonik prob UP200St

    Prob tipi ultrasonicator E. coli lizis için birçok avantaj sunar. Ultrasonik işlem parametreleri üzerinde güvenilir ve hassas kontrol, istenen sonuçları elde etmek için güç, süre ve numune işleme gibi çalışma parametrelerini optimize etmeyi sağlar.
     

    Bilgi talebi





     

    Bu eğitimde, lizis, hücre bozulması, protein izolasyonu, laboratuvarlarda DNA ve RNA parçalanması, analiz ve araştırma gibi numune hazırlama görevleriniz için ne tür bir sonikatörün en iyisi olduğu açıklanmaktadır. Uygulamanız, numune hacminiz, numune numaranız ve veriminiz için ideal sonikatör tipini seçin. Hielscher Ultrasonics sizin için ideal ultrasonik homojenizatör sahiptir!

    Bilim ve Analizde Hücre Bozulması ve Protein Ekstraksiyonu için Mükemmel Sonikatör Nasıl Bulunur

    Video Küçük Resmi

    Ultrasonik DNA parçalanması, Yeni Nesil Dizilemede (NGS) örnek hazırlama adımı olarak sıklıkla kullanılır

    E. coli EDL933'ün genomik DNA'sının elektroforetik analizleri 0 – 15 dakika ultrasonikasyona tabi tutulmuştur. L, DNA Merdivenini gösterir.
    (çalışma ve resim: ©Basselet et al. 2008)

    Ultrasonik Kavitasyon Kullanarak Hücre Bozulması

    Ultrasonik prob tipi homojenizatörler saniyede yaklaşık 20.000 döngü (20kHz'de) ile çalışır ve sıvılarda veya süspansiyonlarda kavitasyona neden olur. Akustik kavitasyon, vakum benzeri basınçların mikroskobik alanları ve hücreleri parçalayan yüksek sıcaklıklar. Sıcaklıklar birkaç bin santigrat dereceye ulaşabilse de, kavitasyon hacimleri o kadar küçüktür ki, işlemi önemli ölçüde ısıtmazlar. Ultrason tarafından üretilen akustik kavitasyon ve kesme kuvvetleri, E.coli gibi bakteri hücrelerinin hücre zarını deler veya kırar. Hielscher ultrasonicators ultrasonik yoğunluk, genlik, enerji girişi ve sıcaklık gibi işlem parametreleri üzerinde hassas kontrol sağlar. Böylece, ultrasonik lizis işlemi hücre tipine, hücre kültürüne ve işlem hedefine en uygun şekilde ayarlanabilir.
     

    Ultrasonik Liziz Avantajları

    • liziz kesin kontrolü (ağırlık, büyüklük, sıcaklık)
    • Güvenilir, tekrarlanabilir sonuçlar
    • Belirli örnekler optimum adaptasyon
    • sıcaklık kontrolü
    • Çok küçük, çok büyük numuneler için (litre uL)
    • Tamamen mekanik arıtma
    • Kullanıcı dostu, güvenli çalışma
    • üretime laboratuardan doğrusal bir ayarlama
    aynı işlem koşulları altında 10 tüplük bir eş zamanlı numune hazırlanmasına imkân verir VialTweeter ultrasonik cihaz. (Büyütmek için tıklayın!)

    VialTweeter Ultrasonik liziz için

    Bilgi talebi





    Ultrasonik Homojenleştirici vs Diğer Lizis Teknikleri

    Kimyasal ve enzimatik lizis sorunlu olabilirken – protein yapılarını değiştirmek ve arıtma sorunları ve enzimatik lizis tanıtmak kimyasal lizis uzun bir bekleme süresi gerektirir ve tekrarlanabilir olmadığı – Ultrasonik bozulması sofistike, hızlı hücre parçalama yöntemidir.
    Ultrasonik lizis sadece mekanik kuvvetlere dayanmaktadır. Hiçbir kimyasal madde eklenmez, sonikasyon kesme kuvvetleri ile hücre duvarını kırar. Kimyasal liziz, protein yapısını değiştirebilir ve saflaştırma problemlerine neden olabilir. Enzimatik bozulma uzun inkübasyon süreleri gerektirir ve tekrarlanamaz. E.coli bakteri hücrelerinin ultrasonik hücre bozulması hızlı, basit, güvenilir ve tekrarlanabilir. Bu nedenle Hielscher ultrasonicators örnek hazırlama, pre-ananlitikler, in-vitro diagonstics ve manifold tahliller için dünya çapında biyolojik ve biyokimyasal laboratuvarlarda kullanılmaktadır.

    Ultrasonik Lizis için Genel Öneriler

    Sonication hücre süspansiyonları çok küçük, orta ve büyük miktarlarda parçalanması için en popüler tekniktir – 100L / st kadar piko litre arasında (bir ultrasonik akış hücresi kullanılarak). Hücreler sıvı kesme ve kavitasyon ile lize edilmiştir. DNA, aynı zamanda, sonikasyon sırasında kesilmiş, yüzden, hücre süspansiyonuna DNaz eklemek gerekli değildir.
     

    Ultrasonik E.coli lizisi sırasında sıcaklık kontrolü
    Ultrasonik hücre bozucu UP100H (100W) hücre bozulması ve bitki bileşiklerinin ekstraksiyonu için.örnek ön soğutma ve buz üzerinde sonikasyon esnasında numune tutarak, numunenin termal bozunma kolayca önlenebilir örnek.
    İdeal olarak, numuneler lizis sırasında buz gibi soğuk tutulmalıdır, ancak çoğu numune için sıcaklığın kültür veya doku kaynağının sıcaklığının üzerine çıkmaması yeterlidir. Bu nedenle, süspansiyonu buz üzerinde tutmak ve 5-10 saniyelik birkaç kısa ultrasonik darbe ve 10-30 saniyelik duraklamalarla sonikasyon yapmak tavsiye edilir. Duraklamalar sırasında, düşük bir sıcaklığı yeniden oluşturmak için ısı dağılabilir. Daha büyük hücre numuneleri için, soğutma ceketli çeşitli akış hücresi reaktörleri mevcuttur.
    Başarılı bir ultrasonik lizis için ayrıntılı ipuçlarını ve önerileri buradan okuyun!

    E. coli lizatlarının ultrasonik hazırlanması için protokoller

    Araştırmacılar E.coli hücre bozulması için Hielscher ultrasonik homojenizatörler kullanın. Aşağıda, çeşitli E. coli ile ilgili uygulamalar için Hielscher ultrasonik homojenizatörler kullanarak E.coli lizisi için çeşitli test edilmiş ve kanıtlanmış protokoller bulabilirsiniz.
     

    Bu video klip Hielscher ultrasonik homojenizatör UP100H, laboratuvarlarda örnek hazırlama için yaygın olarak kullanılan bir ultrasonicator gösterir.

    Ultrasonik Homojenizatör UP100H

    Video Küçük Resmi

    Hücre Büyümesi, Çapraz Bağlama ve Ultrasonik Kullanarak E. coli Hücre Ekstraktlarının Hazırlanması

    SeqA ve RNA polimeraz ChIP-Chip E.coli MG1655 veya MG1655 ΔseqA için bir OD, 37 ° C 'de büyütülmüştür600 50 ml LB (yaklaşık% 0,2 glikoz) içinde yaklaşık 0.15 kadar, ml ortam maddesi başına 27 ul formaldehit (% 37) ilave edildi (nihai konsantrasyon% 1). Çapraz bağlama 20 dakika oda sıcaklığında yavaş çalkalamada (100 rpm) gerçekleştirildi, ardından 10 ml 2.5 M glisin ile söndürüldü (nihai konsantrasyon 0.5 M). Isı şoku deneyleri için, E. coli MG1655, 30 ° C'de bir OD'ye 65 ml LB ortamında büyütülmüştür.600 yaklaşık 0.3. Daha sonra 30 ml kültür, 43 ° C'de önceden ısıtılmış bir şişeye aktarıldı ve geri kalanı 30 ° C'de tutuldu. Çapraz bağlama ve söndürme, hücrelerin oda sıcaklığında daha yavaş sallanmadan önce 5 dakika boyunca 30 veya 43 ° C'de tutulması dışında yukarıda tarif edildiği gibiydi. Hücreler santrifüjleme ile toplandı ve iki kez soğuk TBS (pH7.5) ile yıkandı. 1 ml lizis tamponunda (10 mM Tris (pH 8.0), % 20 sakaroz, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lizozim) yeniden süspansiyon ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübasyondan sonra 4 ml IP tamponu ilavesinden sonra, hücreler% 100 güç ayarında Hielscher ultrasonik işlemci UP400St kullanılarak 12 kez 30 sn ve 30 sn molalarla buz üzerinde sonikleştirildi. 9000 g'da 10 dakika boyunca santrifüjlemeden sonra, süpernatantın 800 μl aliquote'u -20 ° C'de saklandı. (Waldminghaus 2010)
     

    Ultrasonik Prob ile Enzimlerin Aşırı Üretimi ve Saflaştırılması

    Ultrasonicator UP100H, genellikle hücre kültürü plakalarının numune hazırlanması için kullanılan bir laboratuvar homojenizatörüdür.Dekahistidin (His10) etiketli proteinlerin aşırı üretimi için, E. coli BL21 (DE3), pET19b yapıları ile dönüştürüldü. Bir gecede santrifüjleme ile bir prekültür toplandı ve% 1'i bir ekspresyon kültürünü aşılamak için kullanıldı. pET19mgtB taşıyan hücreler, 600 nm'de (OD600) 0.7'lik bir optik yoğunluğa kadar 22 ° C'de büyütüldü. Kültür 17°C'ye aktarıldı ve 100 μM IPTG ile indüklendi. 16 saat sonra, kültür 4 ° C'de 7.500 × g'da santrifüjleme ile hasat edildi. Hücreler, pH 7.4'te 0.3 M NaCl ile 50 mM fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden askıya alındı ve Hielscher ultrasonicator UP200St'de 0.5 ve% 75'lik bir genlikte bir S2 mikro uç sonotrode ile ultrasonikasyon tarafından bozuldu.
    decahistidine-etiketli GtfC aşın üretiminin bir OD 37 ° C'de uyarılmıştır600 100 uM IPTG ile 0.6 arasında. Hücreler daha sonra, 4 saat süreyle inkübe hasat edilmiş ve MgtB için yukarıda belirtildiği şekilde parçalanmıştır.
    Ham hücre ekstraktları, hücre kalıntılarını çökeltmek için 15.000 × g ve 4 ° C'de santrifüj edildi. Arıtılmış ekstraktlar, bir ÄKTAprime Plus sistemi kullanılarak 1 ml'lik HisTrap FF Ham Kolonlara yüklendi. Enzimler, üreticinin His etiketli proteinlerin gradyan elüsyonu protokolüne göre saflaştırıldı. Sökülmüş protein çözeltileri, 4 ° C'de 0.3 M NaCl ile 1.000 hacim 50 mM PBS, pH 7.4'e karşı iki kez diyalize edildi. Saflaştırma  SDS-PAGE ile analiz edildi. Protein konsantrasyonu, Roti-Quant kullanılarak Bradford yöntemiyle belirlendi. (Rabausch ve ark. 2013)
     

    E. coli Bakterilerinden Proteinin Ultrasonik Ekstraksiyonu
    ilgi konusu bir yem proteini (bu durumda, Arabidopsis thaliana MTV1) bir GST etiketinin kaynaştırılır ve BL21 Escherichia coli (E. coli) hücrelerinde ifade edilmiştir.

    1. Bir pelet GST-MTV1 ve GST (50 ml bakteri kültürüne karşılık gelir) alın ve her birini 2,5 mL buz gibi soğuk ekstraksiyon tamponunda tekrar askıya alın.
    2. Bir ultrasonicator UP100H kullanın (yaklaşık 2-5mL'lik küçük hacimler için MS3 mikrotip-sonotrode ile donatılmış), bakteri hücrelerini lize edilene kadar bozmak için, azaltılmış opaklık ve artan viskozite ile gösterilir. Bunun buz üzerinde yapılması gerekir ve aralıklarla sonikasyon yapılması önerilir (örneğin, 10 saniye sonikasyon ve ardından buz üzerinde 10 saniye duraklama vb.). Çok yüksek yoğunlukta sonikasyon yapmamaya özen gösterilmelidir. Köpüklenme veya beyaz bir çökelti oluşumu tespit edilirse, yoğunluğun azaltılması gerekir.
    3. Lizlenmiş bakteri çözeltisini 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve 4 ° C'de, 20 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüjleyin.

     

    Ultrasonik problar, hücreyi bozmak ve E.coli'den molekülleri ve DNA'yı çıkarmak için akustik kavitasyon kuvvetlerini kullanır.

    UP400St gibi prob tipi ultrasonicators E.coli'nin verimli lizisi için akustik kavitasyonun çalışma prensibini kullanın.

    İfade Analizi ve Sonication kullanarak Rekombinant Protein Saflaştırma

    E. coli pelet Hielscher ultrasonicator UP100H ile sonikleştirildi. Bu amaçla, hücre pelet soğutulmuş lizis tamponunda (50 mM Tris-HCl pH = 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) yeniden askıya alındı ve 10 dakika boyunca buz üzerinde soğutuldu. Daha sonra, hücre süspansiyonu, 10 s'lik 10 kısa patlama ve ardından soğutma için 30 s'lik aralıklarla sonikleştirildi. Son olarak, hücre kalıntıları 14000 rpm'de 15 dakika boyunca 4 ° C'de ultrasantrifüjleme ile uzaklaştırıldı. rPR ekspresyonunun doğrulanması için, süpernatant% 12 poliakrilamid jel üzerinde çalıştırıldı ve SDS-PAGE ve Western blotlama ile analiz edildi. rPR'nin saflaştırılması, üretici kılavuzuna göre Ni2 + -NTA reçinesi (Invitrogen, ABD) kullanılarak yapıldı. Bu aşamada yerli saflaştırma yöntemi kullanılmıştır. Saflaştırılmış proteinin saflığı,% 12 poliakrilamid jel üzerinde elektroforez ve ardından Coomassie mavisi boyama kullanılarak değerlendirildi. Saflaştırılmış protein konsantrasyonu Micro BCA protein tahlil kiti (PIERCE, ABD) ile ölçüldü. (Azarnezhad ve ark. 2016)
     

    Bu video, laboratuvar örneklerinin dağılması, homojenleştirilmesi, çıkarılması veya gazdan arındırılması için 200 watt ultrasonik cuphorn'u göstermektedir.

    Ultrasonik Cuphorn (200 Watt)

    Video Küçük Resmi

    E. coli Lizis için Ultrasonik Homojenizatörler

    Hielscher Ultrasonics tasarımları, üretir ve E. coli bakteri ve diğer hücre tipleri, dokular ve hücre kültürlerinin güvenilir ve verimli lizis için yüksek performanslı ultrasonik homojenizatörler sağlar.
    Ultrasonik probların geniş portföyü yanı sıra dolaylı sonikasyon sistemleri size hücre bozulması ve ekstraksiyon uygulamanız için ideal ultrasonik doku homojenizatörü sunmamızı sağlar.

    Tasarım, İmalat ve Danışmanlık – Almanya'da Üretilen Kalite

    Hielscher ultrasonicators tarayıcı kontrolü ile uzaktan kontrol edilebilir. Sonication parametreleri izlenebilir ve proses gereksinimlerine tam olarak ayarlanabilir.Hielscher ultrasonicators iyi onların en yüksek kalite ve tasarım standartları için bilinir. Akıllı yazılım, sezgisel menü, programlanabilir ayarlar ve otomatik veri protokolü Hielscher ultrasonicators sadece birkaç özellikleridir. Sağlamlık ve kolay kullanım, ultrasonicator'larımızın araştırma ve biyoteknoloji tesislerine sorunsuz entegrasyonunu sağlar. Zorlu koşullar ve zorlu ortamlar bile Hielscher ultrasonicators tarafından kolayca ele alınır.

    Hielscher Ultrasonics, ISO sertifikalı bir şirkettir ve state-of-the-son teknoloji ve kullanıcı dostu özelliğine sahip yüksek performanslı ultrasonicator'lara özel önem vermektedir. Tabii ki, Hielscher ultrasonicators CE uyumlu ve UL, CSA ve RoHs gereksinimlerini karşılamak.

    Aşağıdaki tablo size bizim ultrasonicators yaklaşık işleme kapasitesinin bir göstergesidir:

    Numune Hacmi Akış Oranı Önerilen Cihaz
    çok kuyulu / mikrotitre plakaları n.a. UIP400MTP
    CupHorn şişeler veya beher için n.a. ultrasonik cuphorn
    ultrasonik mikro akış reaktörü n.a. GDmini2
    0,5 ila 1,5 mL ile 10 şişeye kadar n.a. VialTweeter
    0,5 - 1,5 mL n.a. VialTweeter
    1 - 500mL 10 - 200mL/min UP100H
    10 - 2000mL 20 - 400mL/min UP200Ht, UP400St
    0,1 - 20L 0,2 - 4L/min UIP2000hdT
    10 - 100L 2 - 10L/min UIP4000
    n.a. 10 - 100L/min UIP16000
    n.a. daha büyük grubu UIP16000

    Bizimle iletişime geçin! / Bize sor!

    Daha fazla bilgi isteyin

    Ultrasonik doku homojenizatörleri ve hücre kırıcılar, lizis uygulamaları ve fiyatları hakkında ek bilgi talep etmek için lütfen aşağıdaki formu kullanın. Sürecinizi sizinle tartışmaktan ve gereksinimlerinizi karşılayan bir ultrasonik homojenizatör sunmaktan mutluluk duyacağız!









    Lütfen dikkat Gizlilik Politikası.


    Video, yüksek yoğunluklu ultrason kullanarak herhangi bir standart çok kuyulu plakanın güvenilir numune hazırlanmasına izin veren ultrasonik numune hazırlama sistemi UIP400MTP'yi göstermektedir. UIP400MTP'nin tipik uygulamaları arasında hücre lizisi, DNA, RNA ve kromatin kesmenin yanı sıra protein ekstraksiyonu sayar.

    Ultrasonicator UIP400MTP çok iyi plaka sonication için

    Video Küçük Resmi

    Ultrasonik E. coli Lizis için Ek Protokoller

    Ultrasonik VialTweeter kullanarak E. coli'de Allisin modifiye Proteinler

    Ultrasonik işlemci UP200ST'de VialTweeter5,5'-ditiobis (2-nitrobenzoik asit) (DTNB) tayini yolu ile sülfhidril içerik belirlenmesi
    MOPS minimal ortamını aşılamak için bir E. coli MG1655 gece kültürü kullanıldı (1:100). Kültür, 0.4'lük bir A600'e ulaşılana kadar aerobik olarak yetiştirildi. Kültür, stres tedavisi için üç adet 15 ml'lik kültüre ayrıldı. Tedavi edilmeyen bir kültür, olumsuz bir kontrol görevi gördü. Kalan iki kültürden birine 0.79 mM allisin (128 μg ml-1) veya 1 mM diamide eklendi. Her kültürün 5 ml'si santrifüjleme ile hasat edildi (8.525 × g, 4°C, 10 dakika). Hücreler iki kez 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, kullanımdan önce anaerobik olarak depolanmış) ile yıkandı ve santrifüj edildi (13.000 × g, 4°C, 10 dk). Hücreler, ultrasonikasyon (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Almanya) (3 × 1 dk). Hücre enkazı santrifüjleme ile peletlendi (13.000 × g, 4 °C, 15 dakika). Süpernatant, manyetik bir karıştırma çubuğu ile 3.5 ml'lik bir QS-makro küvete (10 mm) aktarıldı ve 1 ml lizis tamponu ile karıştırıldı. Numunelerin neslinin tükenmesi, oda sıcaklığında PSC-718 sıcaklık kontrollü hücre tutucu ile donatılmış bir Jasco V-650 spektrofotometresi ile 412 nm'de izlendi. 3 mM'lik bir ditiyobis (2-nitrobenzoik asit) çözeltisinin 100μl'si ilave edildi. Neslinin tükenmesi, doygunluğa ulaşana kadar izlendi. Tiol konsantrasyonunun hesaplanması, yok olma katsayısı kullanılarak gerçekleştirildi ε412 = 13.700 M-1 santimetre-1 tio-2-nitrobenzoik asit (TNB) dir. Hücresel tiyol konsantrasyonları 6.7 x 10 E. coli hücrelerinin bir hacme göre hesaplanmıştır-15 litre ve A600 hücre yoğunluğu = 0.5 (1 × 10'a eşdeğer)8 hücreler mi-1 kültür). (Müller ve ark. 2016)
     

    Bir Ultrasonik Hücre Kırıcı kullanarak In Vivo Glutatyon Tayini

    E.coli MG1655, 0.5'lik bir A600'e ulaşılana kadar toplam 200ml'lik bir hacimde MOPS minimal ortamında yetiştirildi. Kültür, stres tedavisi için 50 ml'lik kültürlere ayrıldı. 0.79 mM allisin, 1 mM diamid veya dimetil sülfoksit (kontrol) ile 15 dakikalık inkübasyondan sonra, hücreler 10 dakika boyunca 4 ° C'de 4.000 g'da hasat edildi. Hücreler, 700μl KPE tamponunda peletlerin yeniden süspansiyonundan önce KPE tamponu ile iki kez yıkandı. Deproteinasyon için, ultrasonikasyon ile hücrelerin bozulmasından önce 300l% 10 (w / v) sülfosalisilik asit eklenmiştir (3 x 1 dakika; VialTweeter ultrasonikatör). Süpernatanlar (30 dakika, 13,000 gr, 4 ° C) santrifüj edildikten sonra toplanmıştır. Sülfosalisilik asit konsantrasyonları KPE tamponun 3 hacminde eklenerek% 1 azalmıştır. Toplam glutatyon ve GSSG ölçümleri, yukarıda tarif edildiği gibi gerçekleştirildi. Hücresel glutatyon konsantrasyonları E. hacmine göre hesaplanmıştır 6.7 coli hücreleri×10-15 litre ve A600 0.5 hücre yoğunluğu (1'e eşdeğer)×108 hücreler mi-1 kültür). GSH konsantrasyonları toplam glutatyon 2 [GSSG] çıkarılması ile elde edilmiştir. (Müller ve ark. 2016)

    Bir Ultrasonik Homojenleştirici kullanarak E. coli'de İnsan mAspAT'nin İfadesi

    hücre içi madde ekstraksiyonu için ultrasonik hücre bölücü UP400St (400W) (örneğin, proteinler, organeller, DNA, RNA gibi)optik yoğunluk elde edilene dek 37 ° C'de kültive tek Luria-Bertani (LB) ortamı ihtiva eden 100 ug / ml ampisilin, 30 mL ekspresyon vektörünü barındıran E. coli BL21 (DE3), ve sonra, (OD600) 0.6 olmuştur. Hücreler, 10 dakika boyunca 4000 x g'de santrifüjleme ile hasat edilmiş ve 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden 3 L taze LB ortamı içinde yeniden süspansiyon haline getirildi.
    Daha sonra, 16ºC'de 20 saat boyunca 1 mM izopropil β-ᴅ-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) ile protein ekspresyonu indüklendi. Hücreler 15 dakika boyunca 8.000 × g'da santrifüjleme ile toplandı ve tampon A (20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 7.4) ile yıkandı. 3 L kültüründen yaklaşık 45g (ıslak ağırlık) hücre elde edildi. Santrifüjlemeden sonra, hücre peletleri 40 mL (1 L kültürü için) buz gibi soğuk ekstraksiyon tamponu A'da yeniden askıya alındı ve Hielscher ultrasonik hücre kırıcı UP400St kullanılarak buz gibi soğuk sıcaklıkta ultrasonikasyon ile lize edildi. Hücre lizisi, çözünür (süpernatan) ve çökeltilmiş (pelet) fraksiyonları ayırmak için 15 dakika boyunca 12.000 rpm'de santrifüj edildi. (Jiang ve ark. 2015)
     



    Bilinmesi Gereken Gerçekler

    Coli

    Escherichia coli (E. coli), bir gram-negatif, fakültatif, aerobik olmayan, çubuk şeklinde, genel olarak sıcak kanlı canlıların (endotermler) alt bağırsakta bulunan Escherichia cinsi koliform bakterisi. E. çok sayıda farklı özelliklere sahip olan suşları (ya da alt-tipleri) coli vardır. En çok, E. coli suşları, örneğin insanlar için zararsızdır laboratuvarlarda araştırma uygulamaları için yaygın olarak kullanılan B ve K-12 suşu. Ancak, bazı suşları zararlıdır ve ciddi hastalıklara neden olabilir.
    Bakteriler manipüle etmek kolaydır çünkü E.coli, modern biyolojik mühendislik ve endüstriyel mikrobiyoloji önemli bir rol oynar. E. coli, örneğin sık sık kullanımı dahil yaygın laboratuar uygulamaları Rekombinant deoksiribonükleik asit (DNA) oluşturmak için bir model organizma olarak hareket etmek.
    E.coli heterolog proteinlerin üretimi için çok yönlü bir ev sahibi ve manifold protein ekspresyon sistemleri, E. coli içinde bir araya getiren proteinlerin üretilmesi için kullanılabilir. proteininin yüksek seviyede ekspresyonuna izin plazmidler kullanılarak, genler endüstriyel fermentasyon işlemlerinde büyük miktarlarda bu tip proteinleri üretmek için olanak sağlar bakteriler dahil edilebilir.
    E.coli, insülin üretmek için hücre fabrikaları olarak kullanılır. Diğer uygulamalar arasında, aşılar ve hareketsiz enzimler geliştirmek ve üretmek, biyoyakıt üretmek ve biyoremediasyon için modifiye E. coli hücrelerinin kullanılması yer almaktadır.
    suşu, K-12, E. bir mutant formu enzimi Alkalin fosfataz (ALP) aşırı ifade eden coli'dir. Bu mutasyon, bu enzim için sürekli kodlar genindeki bir kusur meydana gelir. bir gen bir inhibisyonsuz bir ürün üretir, bu kurucu etkinlik olarak da bilinir. Bu özel mutant formu izolasyon ve saflaştırma ALP enzimi için kullanılır.
    E. coli bakterileri hücre fabrikaları olarak da yaygın olarak kullanılmaktadır. Mühendislik mikropları (örneğin bakteriler) ve bitki hücreleri hücre fabrikaları olarak kullanılabilir. Genetiği değiştirilmiş bu hücreler, örneğin farmasötik, gıda ve kimya endüstrisinde kullanılan moleküller, kimyasallar, polimerler, proteinler ve diğer maddeleri üretir. Bu tür biyomühendislik hücrelerinin iç kısmında üretilen molekülleri serbest bırakmak için ultrasonik lizis, hücre duvarlarını bozmak ve hedef maddeleri çevreleyen sıvıya aktarmak için yaygın bir yöntemdir. Biyomühendislik hücrelerinin lizisi hakkında daha fazla bilgi edinin!

    Ultrasonik DNA Kesme

    Ultrasonik kesme kuvvetleri, molekülleri, organelleri ve proteinleri hücre içinden serbest bırakmak ve DNA iplikçiklerini parçalara ayırmak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Akustik kavitasyon, DNA'yı hücrelerden çıkarmak ve yaklaşık 600 parça üretmek için hücre duvarlarını ve zarlarını kırar – Analiz için idealdir uzunluğunda 800 bp.
    DNA parçalanması için ultrasonik homojenizatör hakkında daha fazla bilgi için buraya tıklayın!

    Edebiyat / Referanslar


    Yüksek performanslı ultrasonik! Hielscher ürün yelpazesi, kompakt laboratuar ultrasonicator tezgah üstü birimler üzerinden tam endüstriyel ultrasonik sistemlere kadar tüm spektrumu kapsar.

    Hielscher Ultrasonics yüksek performanslı ultrasonik homojenizatörler üretir laboratuvar için endüstriyel boyut.


    Sürecinizi konuşmanızdan memnuniyet duyarız.

    İletişime geçelim.