Hielscher Ultrason Teknolojisi

E. Coli Ultrasonik Liziz

  • E.coli bakterileri mikrobiyoloji ve biyoteknoloji en yaygın olarak kullanılan bakterilerdir.
  • Ultrasonik hücre bozucular, E. coli liziz güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar verir.
  • Yoğun henüz tam olarak kontrol edilebilir ve kavitasyon kesme kuvvetleri tamamen parçalama ve yüksek ekstraksiyon verimi (örneğin, proteinler, DNA) ile sonuçlanır.

Kavitasyon tarafından Hücre bozulması

Escherichia coli bakteri güvenilir ultrasonik doku homojenleştiriciler kullanılarak lize edilmiştir.Ultrasonik prob tipi homojenleştirici ile Yaklaşık yapmaktadır. (20 kHz de) saniyede 20.000 devir ve sıvılar veya supsensions içinde kavitasyona neden. ayrı hücrelerin yırtılma vakum benzeri basınç ve yüksek sıcaklık akustik kavitasyon mikroskopik alanları. sıcaklıklar birkaç bin dereceye ulaşabilir rağmen, kavitasyon hacimleri önemli ölçüde sürecini ısıtmak kalmamak küçüktür. Ultrason akustik kavitasyon oluşturulur ve kesme kuvvetleri delmek veya E.coli hücre zarı kırmak – ultrasonik Homojenizatörün cihaz ayarına bağlı.

Ultrasonik Liziz Avantajları

  • liziz kesin kontrolü (ağırlık, büyüklük, sıcaklık)
  • Belirli örnekler optimum adaptasyon
  • sıcaklık kontrolü
  • Çok küçük, çok büyük numuneler için (litre uL)
  • Saf mekanik işlem
  • üretime laboratuardan doğrusal bir ayarlama
aynı işlem koşulları altında 10 tüplük bir eş zamanlı numune hazırlanmasına imkân verir VialTweeter ultrasonik cihaz. (Büyütmek için tıklayın!)

VialTweeter Ultrasonik liziz için

Bilgi talebi





Kimya ve enzymtic lizis sorunlu olabilir iken – protein yapılarını değiştirmek ve arıtma sorunları ve enzimatik lizis tanıtmak kimyasal lizis uzun bir bekleme süresi gerektirir ve tekrarlanabilir olmadığı – Ultrasonik bozulması sofistike, hızlı hücre parçalama yöntemidir.
Ultrasonik lysis sadece mekanik güçlere dayanır. Hiçbir kimyasal ilave edilir, sonication kesme kuvvetleri ile hücre duvarını kırar. Kimyasal lisis protein yapısını değiştirebilir ve arıtma problemlerine neden olabilir. Enzimatik bozulma uzun kuluçka süreleri gerektirir ve tekrarlanabilir değildir. E.coli bakteri hücrelerinin Ultrasonik hücre bozulması hızlı, basit, güvenilir ve tekrarlanabilir. Bu nedenle Hielscher ultrasonicators örnek hazırlanması için dünya çapında biyolojik ve biyokimyasal laboratuvarlarda kullanılan, pre-ananlitics, in-vitro diyagonstikler ve manifold tahliller.

Genel öneriler

akış reaktörü ile UP400St ultrasonikatörSonication hücre süspansiyonları çok küçük, orta ve büyük miktarlarda parçalanması için en popüler tekniktir – 100L / st kadar piko litre arasında (bir ultrasonik akış hücresi kullanılarak). Hücreler sıvı kesme ve kavitasyon ile lize edilmiştir. DNA, aynı zamanda, sonikasyon sırasında kesilmiş, yüzden, hücre süspansiyonuna DNaz eklemek gerekli değildir.
Sıcaklık kontrolü:
örnek ön soğutma ve buz üzerinde sonikasyon esnasında numune tutarak, numunenin termal bozunma kolayca önlenebilir örnek.
İdeal olarak, numuneler liziz sırasında buz soğuk tutulmalıdır, ancak sıcaklık kültür veya doku kaynağının sıcaklığının üzerinde yükselmezse çoğu numune için yeterli. Bu nedenle, buz üzerinde süspansiyon tutmak ve 5-10 sec ve 10-30 sn duraklatır birkaç kısa ultrason darbeleri ile sonikat için tavsiye edilir. Duraklama sırasında, ısı düşük sıcaklık yeniden kurmak için dağılabilir. Daha büyük hücre örnekleri için, soğutma ceketli çeşitli akış hücresi reaktörleri mevcuttur.

E.Coli Lisatlar Hazırlanması için protokoller

İfade analizi ve rekombinant proteinin saflaştırılması

E.coli pelet ultrasonik sistemi ile ses dalgalarına maruz bırakıldı UP100H (Hielscher). Bu amaç için, hücre topakları soğutulmuş lizis tamponu (50 mM Tris-HCI, pH = 7.5, 100 mM NaCI, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) içinde yeniden süspansiyon haline getirildi ve 10 dakika süreyle buz üzerinde soğutuldu. Daha sonra, hücre süspansiyonu, soğutma için 30 saniyelik aralıklarla, ardından 10 saniye 10 öbekler ile ses dalgalarına maruz bırakıldı. Son olarak, hücre döküntüsü 14000 rpm'de 15 dakika boyunca 4 ° C'de ultra-santrifüj ile uzaklaştırılmıştır. rPR ekspresyonunun doğrulanması için, üst faz% 12 poliakrilamid jeli üzerinde çalıştırıldı ve SDS-PAGE ve Western blot ile analiz edilmiştir. RPR saflaştırılması Ni kullanılarak yapıldı2 ' den fazla-NTA reçine, üreticinin kılavuzuna göre (Invitrogen, ABD). Bu aşamada, doğal saflaştırma yöntemi kullanılmıştır. Saflaştırılmış proteinin saflığı% 12 poliakrilamid jeli ve ardından Coomassie mavi boyaması ile elektroforez kullanılarak değerlendirildi. Saflaştırılmış protein konsantrasyonu mikro BCA protein tahlil kiti (Pierce, ABD) ile ölçüldü. (Azarnezhad ve ark. 2016)

liziz, hücre bozulması ve DNA kesme için ultrasonik hücre bölücü UP100H (100W).

Ultrasonik homojenleştirici UP100H 100W

Hücre Büyümesi, çapraz bağlanması ve E. coli hücre ekstrelerinin hazırlanması

SeqA ve RNA polimeraz ChIP-Chip E.coli MG1655 veya MG1655 ΔseqA için bir OD, 37 ° C 'de büyütülmüştür600 50 ml LB (yaklaşık% 0,2 glikoz) içinde yaklaşık 0.15 kadar, ml ortam maddesi başına 27 ul formaldehit (% 37) ilave edildi (nihai konsantrasyon% 1). Çapraz bağlama 20 dakika oda sıcaklığında yavaş çalkalamada (100 rpm) gerçekleştirildi, ardından 10 ml 2.5 M glisin ile söndürüldü (nihai konsantrasyon 0.5 M). Isı şoku deneyleri için, E. coli MG1655, 30 ° C'de bir OD'ye 65 ml LB ortamında büyütülmüştür.600 yaklaşık 0.3. Daha sonra kültür, 30 ml önceden aktarıldı, 43 ° C'de bir balon içinde ısıtılır ve geriye kalan, 30 ° C'de muhafaza edildi. Hücreler 30 ° C'de tutulan veya 43 ° C daha önce daha yavaş Oda sıcaklığında çalkalayarak 5 dakika boyunca olması dışında yukarıda tarif edildiği gibi çapraz bağlanması ve söndürme oldu. Hücreler santrifüj ile toplanır ve soğuk TBS (pH 7.5) ile iki kez yıkanmıştır. 1 mi liziz tamponunda yeniden süspansiyon işleminden sonra (10 mM Tris (pH 8.0),% 20 sukroz, 50 mM NaCI, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lizozim) ve 4 ml IP bunu takiben 30 dakika boyunca 37 ° C 'de inkübasyon tampon, hücreler 12 kez 30 sn ve 30 saniye sonları ile buz üzerinde sonike edilmiştir UP400St ultrasonik işlemci% 100 güç ile (Hielscher ultrason GmbH). 9000 g'de 10 dakika santrifüje tabi tutulduktan sonra, üstte yüzen 800 ul tümbölen -20 ° C'de saklandı. (2010 Waldminghaus)

Aşırı üretimi ve enzimlerin saflaştırılması.

decahistidine (His10) etiketli proteinlerinin fazla üretimi, E. coli BL21 (DE3) pET19b yapıları ile transforme edildi. Bir gece boyunca ön kültür santrifüjleme ile hasat edilmiş ve% 1 bir ekspresyon kültürünün aşılanması için kullanıldı. pET19mgtB taşıyan hücreler OD (600 nm'lik bir optik yoğunluk elde edilene dek 22 ° C 'de büyütülmüştür600) 0.7. Kültür 17 ° C'de aktarıldı ve 100 uM IPTG ile indüklenmiştir. 16 saat sonra, kültür 4 ° C'de 7,500 x gr santrifüjleme ile hasat edilmiştir. Hücreler, bir S2 mikro-uçlu sonotrot ile ultrasonikasyon ile pH 7.4'te 0.3 M NaCl ile 50 mM fosfat tamponlanmış tuzlu su (PBS) içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş ve bozulduğu UP200St 0.5 bir döngü ve% 75 'lik bir genişlikte ultrasonikatör (Hielscher Teltow, Almanya).
decahistidine-etiketli GtfC aşın üretiminin bir OD 37 ° C'de uyarılmıştır600 100 uM IPTG ile 0.6 arasında. Hücreler daha sonra, 4 saat süreyle inkübe hasat edilmiş ve MgtB için yukarıda belirtildiği şekilde parçalanmıştır.
Ham hücre ekstreleri hücre debrisini çökeltmek için 15.000 x g ve 4 ° C'de santrifüj edildi. açıklık ekstraktlar ÄKTAprime Plus sistemini (GE Healthcare) kullanılarak 1 ml HisTrap FF Ham sütun üzerine yüklenmiştir. enzimler His-etiketli proteinlerin gradyan elüsyon için üreticinin protokolüne uygun olarak saflaştırılmıştır. Ayrıştırılan protein çözeltileri 4 ° C'de 0.3 M NaCl ile 50 mM PBS, pH 7.4, 1.000 hacmine karşı iki kez diyaliz edilmiştir. Saflaştırma,% 12 SDS-PAGE ile analiz edilmiştir. proteinin konsantrasyonu Roti-Quant (Cari Roth GmbH, Karlsruhe, Almanya) kullanılarak Bradford metodu ile tespit edilmiştir. (Rabausch ve ark. 2013)

E.coli Bakteri Protein ekstraksiyonu
ilgi konusu bir yem proteini (bu durumda, Arabidopsis thaliana MTV1) bir GST etiketinin kaynaştırılır ve BL21 Escherichia coli (E. coli) hücrelerinde ifade edilmiştir.
1. (50 ml bakteri kültürü karşılık gelir), GST-MTV1 ve GST'nin bir pelet alın ve 2.5 ml buz gibi soğuk ekstraksiyon tamponu her süspansiyon haline getirin.
2. Bir ultrasonikatör kullanın UP100H bunlar, parçalanır düşük donukluk ve yüksek viskoziteye ile gösterilir kadar bakteriyel hücrelerin bozulması için (küçük miktarlar için MS3 mikrotip-sonotrot (2-5 ml) içerisine ile donatılmış). Bu buz üzerinde yürütülecek olan ve (örneğin, 10 san sonikasyon böylece 10 saniye buz üzerinde ve ardından) aralıklarla ses dalgalarına maruz önerilir. Bakım çok yüksek yoğunlukla ses dalgalarına önemle dikkat edilmesi gerekmektedir. köpük veya beyaz bir çökelti oluşumu tespit edilirse, yoğunluk düşürülmesi gerekir.
3., 4 ° C'de 20 dakika boyunca, 16,000 x g'de lize bakteriler 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine çözeltisi ve santrifüj aktarın.

E. coli 'de Allisin modifiye edilmiş proteinler,

VialTweeter küçük bir örnek homojenizasyon için rahat ultrasonikatör olduğunu5,5'-ditiobis (2-nitrobenzoik asit) (DTNB) tayini yolu ile sülfhidril içerik belirlenmesi
Bir E. coli MG1655, gece boyunca kültür MOPS minimum ortamı (: 1: 100) inoküle etmek için kullanıldı. 0.4'lük bir A600 ulaşılana kadar kültür aerobik olarak yetiştirildi. Kültür stres tedavisi için üç adet 15 ml'lik kültürlerin bölünmüştür. Tedavi edilmemiş kültür negatif kontrol olarak görev yapmıştır. 0.79 mM alisin (128 ug mi-1) Ya da 1mM diamid kalan iki kültürlerin her birine ilave edildi. Kültürler 15 dakika inkübe edildi. Her kültürün 5 mi santrifüj (8,525 x g, 4 ° C, 10 dakika) ile toplandı. Hücreler, PBS (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na 1 ml ile iki kez yıkanmıştır2HPO4, 2 mM KH2Po4, PH 7.4) 13,000 x g, 4 ° C, 10 dakika (anaerobik kullanımdan önce depolanmış) ve bir santrifüj edilir. Hücreler, ultrasonikasyon ile 4 ° C'de Parçalanmadan önce (6 mM guanidinyum HCI, pH 7.4 PBS) liziz tamponu içerisinde yeniden süspanse edildi (VialTweeter ultrasonikatör, Hielscher GmbH, Almanya) (3 x 1 dakika). Hücre birikintisi, santrifüjleme (13.000 x g, 4 ° C, 15 dakika) ile pellet haline getirilmiştir. süpernatant, manyetik bir karıştırıcı ile bir 3.5 ml'lik QS-makro küvetin (10 mm) aktarıldı ve liziz tamponu için 1 ml ile karıştırıldı. Numunelerin Sönüm oda sıcaklığında PSC-718 sıcaklık kontrollü bir hücre kabı (Jasco) ile donatılmış bir Jasco V-650 spektrofotometre ile 412 nm'de izlendi. 3 mM ditiobis (2-nitrobenzoik asit) çözeltisi 100 ul ilave edildi. o doymuş hale ulaşana kadar Extinction izlendi. tiyol konsantrasyonunun hesaplanması sönüm katsayısı £ değenni kullanılarak gerçekleştirilmiştir412 = 13.700 M-1 santimetre-1 tio-2-nitrobenzoik asit (TNB) dir. Hücresel tiyol konsantrasyonları 6.7 x 10 E. coli hücrelerinin bir hacme göre hesaplanmıştır-15 Litre ve A'nın bir hücre yoğunluğu600 = 0.5 (1 eşdeğer x 108 hücreler mi-1 kültür). (Müller ve ark. 2016)

İn Vivo Glutatyon Tayini

E. coli MG1655 bir A kadar 200 ml toplam hacim içinde MOPS minimal ortamda büyütülmüştür600 0.5 ulaşılmıştır. Kültür stres tedavisi için 50 ml'lik kültürlerden bölünmüştür. 0.79 mM alisin, 1 mM diamid, ya da dimetil sülfoksit (kontrol) ile inkübe edildikten 15 dakika sonra, hücreler 10 dakika boyunca 4 ° C 'de 4,000g hasat edilmiştir. Hücreler, KPE tamponu 700μl peletlerin yeniden süspansiyondan KPE tamponu ile iki kere yıkanmıştır. giderildikten için,% 10 300l (ağırlık / hacim) sülfosalisilik asit, önceki ultrasonikasyon (3 x 1 dakika ile hücrelerin bozulmasına ilave edildi; VialTweeter ultrasonikatör). Süpernatanlar (30 dakika, 13,000 gr, 4 ° C) santrifüj edildikten sonra toplanmıştır. Sülfosalisilik asit konsantrasyonları KPE tamponun 3 hacminde eklenerek% 1 azalmıştır. Toplam glutatyon ve GSSG ölçümleri, yukarıda tarif edildiği gibi gerçekleştirildi. Hücresel glutatyon konsantrasyonları E. hacmine göre hesaplanmıştır 6.7 coli hücreleri×10-15 Litre ve A'nın bir hücre yoğunluğu600 01 .5 (eşdeğer×108 hücreler mi-1 kültür). GSH konsantrasyonları toplam glutatyon 2 [GSSG] çıkarılması ile elde edilmiştir. (Müller ve ark. 2016)

hücre erimesi ve biyolojik materyalin çıkarılması için Ultrasonik Topu (büyütmek için tıklayın!)

Sonda tipi ultrasonikatör UP400St

E. coli 'de insan mAspAT ekspresyonu

hücre içi madde ekstraksiyonu için ultrasonik hücre bölücü UP400St (400W) (örneğin, proteinler, organeller, DNA, RNA gibi)optik yoğunluk elde edilene dek 37 ° C'de kültive tek Luria-Bertani (LB) ortamı ihtiva eden 100 ug / ml ampisilin, 30 mL ekspresyon vektörünü barındıran E. coli BL21 (DE3), ve sonra, (OD600) 0.6 olmuştur. Hücreler, 10 dakika boyunca 4000 x g'de santrifüjleme ile hasat edilmiş ve 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden 3 L taze LB ortamı içinde yeniden süspansiyon haline getirildi.
Daha sonra, protein ifadesi 16ºC 20 saat boyunca 1 mM izopropil β-ᴅ-1-tiyogalaktopiranosit (IPTG) ile teşvik edildi. Hücreler, 15 dakika boyunca 8000 x g'de santrifüjleme ile hasat edilmiş ve tampon A (20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 7.4) ile yıkandı. Yaklaşık olarak 45 g (ıslak ağırlık) hücreleri 3 litrelik kültürden elde edilmiştir. Santrifüj işleminden sonra, hücre pelletleri, buz-soğuğu ekstre etme tampon A (1 L kültür için), 40 mL içinde yeniden süspanse edildi ve bir cihazı kullanılarak buz-soğuk sıcaklıkta ultrasonikasyon ile lize UP400St Alet (Dr. Hielscher GmbH, Almanya). Hücre liziz çözünür (süpernatant) katılmış ve çökelen (pelet) fraksiyonları ayırmak için 15 dakika 12,000 rpm'de santrifüjlendi. (Jiang ve ark., 2015)

Aşağıdaki tablo size bizim ultrasonicators yaklaşık işleme kapasitesinin bir göstergesidir:

Numune Hacmi Akış Oranı Önerilen Cihaz
0,5 - 1,5 mL n.a. VialTweeter
1 - 500mL 10 - 200mL/min UP100H
10 - 2000mL 20 - 400mL/min UP200Ht, UP400St
0,1 - 20L 0,2 - 4L/min UIP2000hdT
10 - 100L 2 - 10L/min UIP4000
n.a. 10 - 100L/min UIP16000
n.a. daha büyük grubu UIP16000

Bizimle iletişime geçin! / Bize sor!

Ultrasonik homojenleştirme hakkında ek bilgi istemek için lütfen aşağıdaki formu kullanın. İhtiyaçlarınızı karşılayacak bir ultrasonik sistem sunmaktan mutluluk duyacağız.









Lütfen dikkat Gizlilik Politikası.


Edebiyat referansları



Bilinmesi Gereken Gerçekler

Coli

Escherichia coli (E. coli), bir gram-negatif, fakültatif, aerobik olmayan, çubuk şeklinde, genel olarak sıcak kanlı canlıların (endotermler) alt bağırsakta bulunan Escherichia cinsi koliform bakterisi. E. çok sayıda farklı özelliklere sahip olan suşları (ya da alt-tipleri) coli vardır. En çok, E. coli suşları, örneğin insanlar için zararsızdır laboratuvarlarda araştırma uygulamaları için yaygın olarak kullanılan B ve K-12 suşu. Ancak, bazı suşları zararlıdır ve ciddi hastalıklara neden olabilir.
Bakteriler manipüle etmek kolaydır çünkü E.coli, modern biyolojik mühendislik ve endüstriyel mikrobiyoloji önemli bir rol oynar. E. coli, örneğin sık sık kullanımı dahil yaygın laboratuar uygulamaları Rekombinant deoksiribonükleik asit (DNA) oluşturmak için bir model organizma olarak hareket etmek.
E.coli heterolog proteinlerin üretimi için çok yönlü bir ev sahibi ve manifold protein ekspresyon sistemleri, E. coli içinde bir araya getiren proteinlerin üretilmesi için kullanılabilir. proteininin yüksek seviyede ekspresyonuna izin plazmidler kullanılarak, genler endüstriyel fermentasyon işlemlerinde büyük miktarlarda bu tip proteinleri üretmek için olanak sağlar bakteriler dahil edilebilir.
E. coli insülin üretmek için bir hücre fabrikalarında olarak kullanılır. Daha başka uygulamalar arasında, geliştirmek ve biyoyakıt üretmek, hem de biyolojik olarak temizlenmesi için aşılar ve hareketsiz enzimleri üretmek için modifiye E. coli hücrelerinin kullanımını içerir.
suşu, K-12, E. bir mutant formu enzimi Alkalin fosfataz (ALP) aşırı ifade eden coli'dir. Bu mutasyon, bu enzim için sürekli kodlar genindeki bir kusur meydana gelir. bir gen bir inhibisyonsuz bir ürün üretir, bu kurucu etkinlik olarak da bilinir. Bu özel mutant formu izolasyon ve saflaştırma ALP enzimi için kullanılır.

Ultrasonik DNA Kesme

Ultrasonik kesme kuvvetleri hücreden ayrı ve parçalar halinde DNA dizilerini kırmak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Akustik kavitasyon hücre duvarları ve zarlar hücrelerinden DNA özü ve yaklaşık 600 parçalarını meydana getirmek üzere keser – Analiz için idealdir uzunluğunda 800 bp.
DNA parçalanması için ultrasonik homojenizatör hakkında daha fazla bilgi için buraya tıklayın!