E. Coli’nin Ultrasonik Lizisi

E. coli bakterileri, mikrobiyoloji ve biyoteknolojide en yaygın kullanılan bakterilerdir.
Ultrasonik hücre parçalayıcılar, E. coli lizisi için güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.
Yoğun ancak hassas biçimde kontrol edilebilir kavitasyon ve kesme kuvvetleri, tam parçalanma ve yüksek ekstraksiyon verimleri sağlar (ör. proteinler, DNA).

E. coli’nin Ultrasonik Hücre Parçalanması Neden Tercih Edilen Yöntemdir?

Ultrasonik homojenizatörler veya prob tipi sonikatörler, yoğun ultrason hücre duvarlarını ve zarlarını verimli biçimde parçaladığı için E. coli lizisinde çeşitli avantajlar sunar. Prob tipi sonikatörler, aşağıdaki nedenlerle E. coli lizisinde yaygın olarak kullanılır:

Hücre duvarlarının verimli biçimde parçalanması: E. coli, peptidoglikandan oluşan ve geleneksel lizis yöntemleriyle parçalanması zor olabilen yarı sert bir hücre duvarına sahiptir. Prob tipi bir sonikatör, hücreleri çevreleyen sıvıda kavitasyon kabarcıkları oluşturan yoğun ultrasonik dalgalar üretir. Bu kabarcıklar çöktüğünde, hücre duvarlarının mekanik olarak parçalanmasına neden olan yüksek hızlı sıvı jetleri ve şok dalgaları oluşturarak biyomoleküller gibi hücresel içerikleri etkin biçimde serbest bırakır.

Artırılmış nüfuz etme: Prob / sonotrot tarafından üretilen ultrasonik dalgalar numunenin derinliklerine nüfuz ederek daha fazla E. coli hücresine ulaşabilir ve bunları eşit biçimde işleyebilir. Bu, lizisin numunenin tamamında daha homojen olmasını sağlamaya yardımcı olarak hücre parçalama verimliliğini artırır.

Azaltılmış işlem süresi: Prob tipi sonikatörün sağladığı enerji son derece yoğun ve bölgeseldir; bu da hızlı ve verimli hücre lizisi sağlar. Boncuklarla parçalama veya enzimatik lizis gibi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında sonikasyon, E. coli lizisini dakikalar, hatta saniyeler içinde gerçekleştirebilir. Dondurma ve çözdürme gibi birçok alternatif teknik birkaç işlem turu gerektirirken ultrasonik lizis hücreleri tek bir işlem adımında açar.

Sıcaklık Kontrolü: En son teknolojiye sahip sonikatörler, maksimum işlem sıcaklığının ayarlanmasına olanak tanıyan sıcaklık sensörleri ve akıllı yazılımla donatılmıştır. Sıcaklık sınırına ulaşıldığında sonikatör otomatik olarak duraklar ve ayarlanan sıcaklık noktasına ulaşıldığında sonikasyon işlemini başlatır. Numuneleri buz banyosunda soğutmak, numune sıcaklığını düşük tutmak ve ısının neden olduğu numune bozunmasını önlemek için basit bir yöntemdir.

Ölçeklenebilirlik: Prob tipi sonikatörler, elde taşınan cihazlardan büyük ölçekli endüstriyel modellere kadar çeşitli boyutlarda mevcuttur. Bu, onları laboratuvarda küçük hacimleri işlemek veya aşı üretimi ya da moleküllerin biyosentezi gibi daha büyük biyoproses uygulamaları için ölçek büyütmek açısından uygun kılar.

Çok yönlülük: Sonikatörler, hücre lizisinin yanı sıra DNA’nın kesme kuvvetleriyle parçalanması, protein ekstraksiyonu, doku homojenizasyonu, nanopartikül dispersiyonu ve emülsifikasyon gibi çeşitli uygulamalarda kullanılabilir. Bu nedenle prob tipi bir sonikatöre yatırım yapmak, araştırma veya endüstriyel ortamlarda çok yönlülük sağlar.

UP200St gibi prob tipi sonikatörler, güvenilir doku homojenizatörleri ve hücre parçalayıcılarıdır; bu nedenle genetik alanında numune hazırlamak için, örneğin E.coli lizisinde, yaygın olarak kullanılır

E.coli hücrelerinden protein ekstraksiyonu, UP200St ultrasonik probu ile verimli biçimde gerçekleştirilir

Prob tipi sonikatör, E. coli lizisi için birçok avantaj sunar. Ultrasonik işlem parametrelerinin güvenilir ve hassas biçimde kontrol edilmesi, istenen sonuçları elde etmek için güç, süre ve numunenin işlenmesi gibi çalışma parametrelerinin optimize edilmesine olanak tanır.

Bu eğitim videosu, laboratuvar, analiz ve araştırma çalışmalarında lizis, hücre parçalama, protein izolasyonu, DNA ve RNA parçalama gibi numune hazırlama işlemleriniz için hangi sonikatör tipinin en uygun olduğunu açıklar. Uygulamanıza, numune hacminize, numune sayınıza ve işlem kapasitenize uygun ideal sonikatör tipini seçin. Hielscher Ultrasonics, sizin için ideal ultrasonik homojenizatöre sahiptir!

Ultrasonik DNA parçalanması, Yeni Nesil Dizilemede (NGS) numune hazırlama adımı olarak sıklıkla kullanılır

0 – 15 min ultrasonik işleme tabi tutulan E. coli EDL933’ün genomik DNA’sının elektroforetik analizleri. L, DNA merdivenini gösterir.
(çalışma ve görsel: ©Basselet et al. 2008)

Ultrasonik Kavitasyon ile Hücre Parçalama

Ultrasonik prob tipi homojenizatörler saniyede yaklaşık 20.000 döngüyle (20kHz frekansta) çalışır ve sıvılarda veya süspansiyonlarda kavitasyona neden olur. Akustik kavitasyon, hücreleri parçalayan, vakuma benzer basınçlara ve yüksek sıcaklıklara sahip mikroskobik bölgeler oluşturur. Sıcaklıklar birkaç bin santigrat dereceye ulaşabilse de kavitasyon hacimleri o kadar küçüktür ki işlemi önemli ölçüde ısıtmazlar. Ultrasonun oluşturduğu akustik kavitasyon ve kesme kuvvetleri, E.coli gibi bakteri hücrelerinin hücre zarını deler veya parçalar. Hielscher sonikatörleri, ultrasonik yoğunluk, genlik, enerji girdisi ve sıcaklık gibi işlem parametrelerinin hassas biçimde kontrol edilmesine olanak tanır. Böylece ultrasonik lizis işlemi hücre tipine, hücre kültürüne ve işlem hedefine en uygun biçimde ayarlanabilir.

Ultrasonik Lizisin Avantajları

lizisin hassas kontrolü (yoğunluk, genlik, sıcaklık)
güvenilir, tekrarlanabilir sonuçlar
belirli numunelere en uygun biçimde uyarlama
sıcaklık kontrolü
çok küçükten çok büyüğe kadar numuneler için (µL’den litreye)
tamamen mekanik işlem
kullanıcı dostu, güvenli çalışma
laboratuvardan üretime doğrusal ölçek büyütme

VialTweeter ultrasonik cihazı, aynı işlem koşullarında en fazla 10 viyalin eş zamanlı numune hazırlamasına olanak tanır. (Büyütmek için tıklayın!)

VialTweeter ile ultrasonik lizis

Ultrasonik Homojenizatör ve Diğer Lizis Tekniklerinin Karşılaştırılması

Kimyasal lizis protein yapılarını değiştirebildiği ve saflaştırma sorunlarına yol açabildiği, enzimatik lizis ise uzun inkübasyon süreleri gerektirdiği ve tekrarlanabilir olmadığı için kimyasal ve enzimatik lizis sorunlu olabilirken ultrasonik parçalama, gelişmiş ve hızlı bir hücre parçalama yöntemidir.
Ultrasonik lizis yalnızca mekanik kuvvetlere dayanır. Hiçbir kimyasal eklenmez; sonikasyon, hücre duvarını kesme kuvvetleriyle parçalar. Kimyasal lizis protein yapısını değiştirebilir ve saflaştırma sorunlarına yol açabilir. Enzimatik parçalama uzun inkübasyon süreleri gerektirir ve tekrarlanabilir değildir. E.coli bakteri hücrelerinin ultrasonik olarak parçalanması hızlı, basit, güvenilir ve tekrarlanabilirdir. Bu nedenle Hielscher sonikatörleri, dünya genelindeki biyoloji ve biyokimya laboratuvarlarında numune hazırlama, analiz öncesi işlemler, in vitro tanı ve çok çeşitli analizler için kullanılır.

Ultrasonik Lizis için Genel Öneriler

Sonikasyon, çok küçük, orta ve büyük miktarlardaki hücre süspansiyonlarının lizisi için en popüler tekniktir – pikolitreden 100L/hr değerine kadar (ultrasonik akış hücresi kullanılarak). Hücreler, sıvının kesme kuvvetleri ve kavitasyonla lize edilir. Sonikasyon sırasında DNA da kesme kuvvetleriyle parçalandığından hücre süspansiyonuna DNaz eklemek gerekli değildir.

Ultrasonik E.coli lizisi sırasında sıcaklık kontrolü
Numuneyi önceden soğutarak ve sonikasyon sırasında buz üzerinde tutarak numunenin termal bozunması kolayca önlenebilir.
İdeal olarak numuneler lizis sırasında buz soğukluğunda tutulmalıdır; ancak çoğu numune için sıcaklığın kültürün veya doku kaynağının sıcaklığının üzerine çıkmaması yeterlidir. Bu nedenle süspansiyonun buz üzerinde tutulması ve 5–10 sec süren birkaç kısa ultrasonik darbe ile aralarında 10–30 sec duraklamalar uygulanarak sonikasyon yapılması önerilir. Duraklamalar sırasında ısı uzaklaşarak düşük sıcaklığın yeniden sağlanmasına olanak tanır. Daha büyük hücre numuneleri için soğutma ceketli çeşitli akış hücresi reaktörleri mevcuttur.
Başarılı bir ultrasonik lizis için ayrıntılı ipuçlarını ve önerileri burada okuyun!

E. Coli Lizatlarının Ultrasonik Hazırlanması için Protokoller

Araştırmacılar, E.coli hücrelerini parçalamak için Hielscher ultrasonik homojenizatörlerini kullanır. Aşağıda, E. coli ile ilgili çeşitli uygulamalarda Hielscher ultrasonik homojenizatörleri kullanılarak E.coli lizisi için test edilmiş ve kanıtlanmış çeşitli protokoller bulabilirsiniz.

Ultrason Kullanılarak Hücre Büyümesi, Çapraz Bağlama ve E. coli Hücre Ekstraktlarının Hazırlanması

SeqA ve RNA polimeraz ChIP-Chip için E. coli MG1655 veya MG1655 ΔseqA, 37°C’de OD₆₀₀ değeri yaklaşık 0,15 olacak şekilde 50 ml LB (+ %0,2 glikoz) içinde yetiştirildi; ardından besiyerinin her ml’si için 27 μl formaldehit (%37) eklendi (son konsantrasyon %1). Çapraz bağlama, oda sıcaklığında 20 min boyunca yavaş çalkalama (100 rpm) ile gerçekleştirildi; ardından 10 ml 2,5 M glisin eklenerek reaksiyon durduruldu (son konsantrasyon 0,5 M). Isı şoku deneyleri için E. coli MG1655, 65 ml LB besiyerinde 30°C’de OD₆₀₀ değeri yaklaşık 0,3 olacak şekilde yetiştirildi. Ardından 30 ml kültür, 43°C’de önceden ısıtılmış bir erlene aktarıldı ve kalan kısmı 30°C’de tutuldu. Çapraz bağlama ve reaksiyonun durdurulması, oda sıcaklığında yeniden yavaş çalkalama öncesinde hücrelerin 30 veya 43°C’de 5 min tutulması dışında yukarıda açıklandığı gibi gerçekleştirildi. Hücreler santrifüjle toplandı ve soğuk TBS (pH7.5) ile iki kez yıkandı. Hücreler 1 ml lizis tamponunda (10 mM Tris (pH 8,0), %20 sakkaroz, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lizozim) yeniden süspanse edilip 37°C’de 30 min inkübe edildikten ve ardından 4 ml IP tamponu eklendikten sonra, Hielscher UP400St ultrasonik işlemcisi kullanılarak %100 güç ayarında, buz üzerinde 30 sec süreyle 12 kez ve aralarda 30 sec duraklamalarla sonikasyona tabi tutuldu. 9000 g’de 10 min santrifüjden sonra süpernatantın 800 μl’lik alikotları -20°C’de saklandı. (Waldminghaus 2010)

Ultrasonik Prob ile Enzimlerin Aşırı Üretimi ve Saflaştırılması

Dekahistidin (His10) etiketli proteinlerin aşırı üretimi için E. coli BL21(DE3), pET19b yapılarıyla transforme edildi. Bir gecelik ön kültür santrifüjle toplandı ve %1’i bir ekspresyon kültürünü inoküle etmek için kullanıldı. pET19mgtB taşıyan hücreler, 600 nm’deki optik yoğunluk (OD600) 0,7 olana kadar 22°C’de yetiştirildi. Kültür 17°C’ye alındı ve 100 μM IPTG ile indüklendi. 16 h sonra kültür, 4°C’de 7.500 × g’de santrifüjle toplandı. Hücreler, pH 7,4’te 0,3 M NaCl içeren 50 mM fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse edildi ve Hielscher UP200St sonikatöründe S2 mikro uçlu sonotrot kullanılarak 0,5 döngü ve %75 genlik ayarında ultrasonik olarak parçalandı.
Dekahistidin etiketli GtfC’nin aşırı üretimi, 37°C’de OD₆₀₀ değeri 0,6 iken 100 μM IPTG ile indüklendi. Hücreler daha sonra 4 h inkübe edildi, toplandı ve yukarıda MgtB için belirtildiği gibi lize edildi.
Ham hücre ekstraktları, hücre kalıntılarını çöktürmek için 15.000 × g’de ve 4°C’de santrifüj edildi. Berraklaştırılmış ekstraktlar, ÄKTAprime Plus sistemi kullanılarak 1 ml’lik HisTrap FF Crude kolonlarına yüklendi. Enzimler, His etiketli proteinlerin gradyan elüsyonuna yönelik üretici protokolüne göre saflaştırıldı. Elüe edilen protein çözeltileri, 4°C’de 0,3 M NaCl içeren, pH 7,4’teki 50 mM PBS’nin 1.000 hacmine karşı iki kez diyaliz edildi. Saflaştırma %12 SDS-PAGE ile analiz edildi. Protein konsantrasyonu, Roti-Quant kullanılarak Bradford yöntemiyle belirlendi. (Rabausch et al. 2013)

E. coli Bakterilerinden Ultrasonik Protein Ekstraksiyonu
İlgilenilen bir yem protein (bu durumda Arabidopsis thaliana’nın MTV1 proteini), bir GST etiketiyle birleştirilir ve BL21 Escherichia coli (E. coli) hücrelerinde eksprese edilir.

GST-MTV1 ve GST’den birer pelet alın (50 ml bakteri kültürüne karşılık gelir) ve her birini 2,5 mL buz soğukluğundaki ekstraksiyon tamponunda yeniden süspanse edin.
Bakteri hücrelerini, opaklığın azalması ve viskozitenin artmasıyla anlaşılan lizis gerçekleşene kadar parçalamak için UP100H sonikatörünü (yaklaşık 2–5mL gibi küçük hacimler için MS3 mikro uçlu sonotrot ile donatılmış) kullanın. Bu işlem buz üzerinde gerçekleştirilmelidir ve aralıklı sonikasyon önerilir (ör. 10 sec sonikasyon, ardından buz üzerinde 10 sec duraklama ve bu şekilde devam edilmesi). Çok yüksek yoğunlukta sonikasyon yapmamaya dikkat edilmelidir. Köpürme veya beyaz bir çökelti oluşumu saptanırsa yoğunluk azaltılmalıdır.
Lize edilmiş bakteri çözeltisini 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve 4°C’de, 16.000 x g’de 20 min santrifüj edin.

Ultrasonik problar, hücreleri parçalamak ve E.coli'den molekülleri ve DNA'yı ekstrakte etmek için akustik kavitasyon kuvvetlerini kullanır.

UP400St gibi prob tipi sonikatörler E.coli’nin verimli lizisi için akustik kavitasyonun çalışma prensibini kullanır.

Sonikasyon Kullanılarak Rekombinant Proteinin Ekspresyon Analizi ve Saflaştırılması

E. coli peleti, Hielscher UP100H sonikatörü ile sonikasyona tabi tutuldu. Bu amaçla hücre peleti, soğutulmuş lizis tamponunda (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) yeniden süspanse edildi ve buz üzerinde 10 min soğutuldu. Ardından hücre süspansiyonu, her biri 10 s süren 10 kısa darbe ve bunları izleyen 30 s soğutma aralıklarıyla sonikasyona tabi tutuldu. Son olarak hücre kalıntıları, 4°C’de 15 min boyunca 14.000 rpm’de ultrasantrifüjle uzaklaştırıldı. rPR ekspresyonunu doğrulamak için süpernatant %12 poliakrilamid jelde yürütüldü ve SDS-PAGE ve Western blot ile analiz edildi. rPR saflaştırması, üretici kılavuzuna göre Ni2+-NTA reçinesi (Invitrogen, ABD) kullanılarak yapıldı. Bu aşamada doğal koşullarda saflaştırma yöntemi kullanıldı. Saflaştırılan proteinin saflığı, %12 poliakrilamid jelde elektroforez ve ardından Coomassie mavisiyle boyama kullanılarak değerlendirildi. Saflaştırılan protein konsantrasyonu, Micro BCA protein analiz kiti (PIERCE, ABD) ile ölçüldü. (Azarnezhad et al. 2016)

Bu video, laboratuvar numunelerinin dispersiyonu, homojenizasyonu, ekstraksiyonu veya gazdan arındırılması için kullanılan 200 watt gücündeki ultrasonik cuphorn cihazını göstermektedir.

E. coli Lizisi için Ultrasonik Homojenizatörler

Hielscher Ultrasonics, E. coli bakterileri ve diğer hücre tipleri, dokular ve hücre kültürlerinin güvenilir ve verimli lizisi için yüksek performanslı ultrasonik homojenizatörler tasarlar, üretir ve tedarik eder.
Ultrasonik probların yanı sıra dolaylı sonikasyon sistemlerinden oluşan geniş ürün portföyümüz, hücre parçalama ve ekstraksiyon uygulamanız için size ideal ultrasonik doku homojenizatörünü sunmamıza olanak tanır.

Tasarım, Üretim ve Danışmanlık – Almanya’da Üretilen Kalite

Hielscher sonikatörleri, en yüksek kalite ve tasarım standartlarıyla tanınır. Akıllı yazılım, sezgisel menü, programlanabilir ayarlar ve otomatik veri kaydı, Hielscher sonikatörlerinin özelliklerinden yalnızca birkaçıdır. Sağlamlık ve kolay kullanım, sonikatörlerimizin araştırma ve biyoteknoloji tesislerine sorunsuz biçimde entegre edilmesini sağlar. Hielscher sonikatörleri, zorlu koşulların ve yüksek gereksinimli ortamların bile kolayca üstesinden gelir.

Hielscher Ultrasonics, ISO sertifikalı bir şirkettir ve en son teknolojiye ve kullanıcı dostu özelliklere sahip yüksek performanslı sonikatörlere özel önem verir. Elbette Hielscher sonikatörleri CE uyumludur ve UL, CSA ve RoHs gerekliliklerini karşılar.

Aşağıdaki tablo, sonikatörlerimizin yaklaşık işleme kapasitesi hakkında bilgi verir:

Parti Hacmi	Debi	Önerilen Cihazlar
çok kuyucuklu / mikrotitre plakaları	uygulanamaz	UIP400MTP
Viyaller veya beher için CupHorn	uygulanamaz	Ultrasonik CupHorn
ultrasonik mikro akış reaktörü	uygulanamaz	GDmini2
0,5 ile 1,5mL hacimli, en fazla 10 viyal	uygulanamaz	VialTweeter
0,5 ile 1,5mL	uygulanamaz	VialTweeter
1 ile 500mL	10 ile 200mL/min	UP100H
10 ile 2000mL	20 ile 400mL/min	UP200Ht, UP400St
0,1 ile 20L	0,2 ile 4L/min	UIP2000hdT
10 ile 100L	2 ile 10L/min	UIP4000
uygulanamaz	10 ile 100L/min	UIP16000
uygulanamaz	daha yüksek	Cihaz kümesi: UIP16000

Bize Ulaşın! / Bize Sorun!

Bu videoda, tüm standart çok kuyucuklu plakalarda yüksek yoğunluklu ultrason kullanarak güvenilir numune hazırlamaya olanak tanıyan UIP400MTP ultrasonik numune hazırlama sistemi gösterilmektedir. UIP400MTP'nin tipik uygulamaları arasında hücre lizisi, DNA, RNA ve kromatinin parçalanması ile protein ekstraksiyonu yer alır.

Ultrasonik E. coli Lizisi için Ek Protokoller

Ultrasonik VialTweeter Kullanılarak E. coli’de Allisinle Modifiye Edilmiş Proteinler

5,5′-Ditiyobis(2-nitrobenzoik asit) (DTNB) Analizi ile Sülfhidril İçeriğinin Belirlenmesi
MOPS minimal besiyerini inoküle etmek için bir gecelik E. coli MG1655 kültürü kullanıldı (1:100). Kültür, A600 değeri 0,4 olana kadar aerobik olarak yetiştirildi. Kültür, stres uygulaması için 15 ml’lik üç kültüre bölündü. İşlem uygulanmamış bir kültür negatif kontrol olarak kullanıldı. Kalan iki kültürün birine 0,79 mM allisin (128 μg ml-1), diğerine ise 1 mM diamid eklendi. Kültürler 15 min inkübe edildi. Her kültürden 5 ml, santrifüjle toplandı (8.525 × g, 4°C, 10 min). Hücreler 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, kullanımdan önce anaerobik koşullarda saklanmış) ile iki kez yıkandı ve santrifüj edildi (13.000 × g, 4°C, 10 min). Hücreler, 4°C’de ultrasonik parçalama öncesinde lizis tamponunda (6 mM guanidinyum HCl içeren PBS, pH 7,4) yeniden süspanse edildi; parçalama için kullanılan cihaz (VialTweeter sonikatörü, Hielscher GmbH, Almanya) idi (3 × 1 min). Hücre kalıntıları santrifüjle pelet haline getirildi (13.000 × g, 4 °C, 15 min). Süpernatant, manyetik karıştırma çubuğu içeren 3,5 ml’lik QS-macro küvete (10 mm) aktarıldı ve 1 ml lizis tamponuyla karıştırıldı. Numunelerin absorbansı, oda sıcaklığında PSC-718 sıcaklık kontrollü hücre tutucuyla donatılmış Jasco V-650 spektrofotometresi ile 412 nm’de izlendi. 3 mM ditiyobis(2-nitrobenzoik asit) çözeltisinden 100μl eklendi. Absorbans doygunluğa ulaşana kadar izlendi. Tiyol konsantrasyonu şu absorbans katsayısı kullanılarak hesaplandı: ϵ₄₁₂ = 13.700 M^-1 cm^-1 (tiyo-2-nitrobenzoik asit (TNB) için). Hücresel tiyol konsantrasyonları, E. coli hücre hacminin 6,7 × 10^-15 litre ve hücre yoğunluğunun A600 = 0,5 (1 × 10⁸ hücre ml^-1 kültüre eşdeğer) olması esas alınarak hesaplandı. (Müller et al. 2016)

Ultrasonik Hücre Parçalayıcı Kullanılarak In Vivo Glutatyon Tayini

E.coli MG1655, toplam 200ml hacimde MOPS minimal besiyerinde A600 değeri 0,5 olana kadar yetiştirildi. Kültür, stres uygulaması için 50 ml’lik kültürlere bölündü. 0,79 mM allisin, 1 mM diamid veya dimetil sülfoksit (kontrol) ile 15 min inkübasyondan sonra hücreler, 4°C’de 4.000g’de 10 min santrifüjle toplandı. Peletler 700µl KPE tamponunda yeniden süspanse edilmeden önce hücreler KPE tamponuyla iki kez yıkandı. Proteinlerin uzaklaştırılması için hücrelerin ultrasonik olarak parçalanmasından önce 300l %10 (w/v) sülfosalisilik asit eklendi (3 x 1 min; VialTweeter sonikatörü). Santrifüjden sonra süpernatantlar toplandı (30 min, 13.000g, 4°C). Sülfosalisilik asit konsantrasyonları, 3 hacim KPE tamponu eklenerek %1’e düşürüldü. Toplam glutatyon ve GSSG ölçümleri yukarıda açıklandığı gibi gerçekleştirildi. Hücresel glutatyon konsantrasyonları, E. coli hücre hacminin 6,7×10^-15 litre ve hücre yoğunluğunun A600 0,5 (1×10⁸ hücre ml^-1 kültüre eşdeğer) olması esas alınarak hesaplandı. GSH konsantrasyonları, toplam glutatyondan 2[GSSG] çıkarılarak hesaplandı. (Müller et al. 2016)

Ultrasonik Homojenizatör Kullanılarak E. coli’de İnsan mAspAT Ekspresyonu

Ekspresyon vektörünü taşıyan E. coli BL21 (DE3) suşunun tek kolonisi, 100μg/mL ampisilin içeren 30 mL Luria-Bertani (LB) besiyerine konuldu ve ardından 37ºC’de optik yoğunluk (OD₆₀₀) 0,6 olana kadar yetiştirildi. Hücreler 4.000 × g’de 10 min santrifüjle toplandı ve 100μg/mL ampisilin içeren 3L taze LB besiyerinde yeniden süspanse edildi.
Ardından protein ekspresyonu, 16ºC’de 20 h boyunca 1 mM izopropil β-ᴅ-1-tiyogalaktopiranozit (IPTG) ile indüklendi. Hücreler 8.000 × g’de 15 min santrifüjle toplandı ve A tamponuyla (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4) yıkandı. 3 L kültürden yaklaşık 45g (yaş ağırlık) hücre elde edildi. Santrifüjden sonra hücre peletleri, buz soğukluğundaki 40 mL ekstraksiyon tamponu A içinde (1 L kültür için) yeniden süspanse edildi ve Hielscher UP400St ultrasonik hücre parçalayıcısı kullanılarak buz soğukluğunda ultrasonik lizise tabi tutuldu. Hücre lizatı, çözünür (süpernatant) ve çökelmiş (pelet) fraksiyonları ayırmak için 12.000 rpm’de 15 min santrifüj edildi. (Jiang et al. 2015)

İlgili Konular

Bilinmesi Gereken Bilgiler

E.coli

Escherichia coli (E. coli), sıcak kanlı organizmaların (endotermlerin) alt bağırsaklarında yaygın olarak bulunan, Escherichia cinsine ait gram negatif, fakültatif anaerobik, çubuk biçimli bir koliform bakteridir. Farklı özelliklere sahip çok sayıda E. coli suşu (veya alt tipi) vardır. E. coli suşlarının çoğu insanlar için zararsızdır; örneğin laboratuvarlarda araştırma uygulamaları için yaygın olarak kullanılan B ve K-12 suşları. Ancak bazı suşlar zararlıdır ve ciddi hastalıklara neden olabilir.
E. coli, kolayca manipüle edilebildiği için modern biyolojik mühendislik ve endüstriyel mikrobiyolojide önemli bir rol oynar. Yaygın laboratuvar uygulamaları, örneğin rekombinant deoksiribonükleik asit (DNA) oluşturmak veya model organizma olarak kullanmak üzere sıklıkla E. coli kullanımını içerir.
E. coli, heterolog proteinlerin üretimi için çok yönlü bir konaktır ve E. coli’de rekombinant protein üretmek için çok çeşitli protein ekspresyon sistemleri mevcuttur. Yüksek düzeyde protein ekspresyonuna izin veren plazmitler kullanılarak bakterilere genler aktarılabilir; bu da endüstriyel fermantasyon süreçlerinde bu proteinlerin yüksek miktarlarda üretilmesine olanak tanır.
E.coli, insülin üretmek için hücre fabrikaları olarak kullanılır. Diğer uygulamalar arasında aşılar ve immobilize enzimler geliştirmek ve üretmek, biyoyakıt üretmek ve biyoremediasyon için modifiye edilmiş E. coli hücrelerinin kullanılması yer alır.
K-12 suşu, Alkalen Fosfataz (ALP) enzimini aşırı eksprese eden mutant bir E. coli formudur. Bu mutasyon, enzimi sürekli kodlayan gendeki bir kusur nedeniyle oluşur. Bir gen herhangi bir inhibisyon olmadan bir ürün üretiyorsa bu, konstitutif aktivite olarak bilinir. Bu özel mutant form, ALP enziminin izolasyonu ve saflaştırılması için kullanılır.
E. coli bakterileri de hücre fabrikaları olarak yaygın biçimde kullanılır. Mühendislik yoluyla değiştirilmiş mikroorganizmalar (ör. bakteriler) ve bitki hücreleri, hücre fabrikaları olarak adlandırılan sistemler olarak kullanılabilir. Genetik olarak modifiye edilmiş bu hücreler, örneğin ilaç, gıda ve kimya endüstrisinde kullanılan moleküller, kimyasallar, polimerler, proteinler ve diğer maddeleri üretir. Biyomühendislikle geliştirilmiş bu tür hücrelerin içinde üretilen molekülleri serbest bırakmak için ultrasonik lizis, hücre duvarlarını parçalamaya ve hedef maddeleri çevreleyen sıvıya aktarmaya yönelik yaygın bir yöntemdir. Biyomühendislikle geliştirilmiş hücrelerin lizisi hakkında daha fazla bilgi edinin!

DNA’nın Ultrasonik Kesme Kuvvetleriyle Parçalanması

Ultrasonik kesme kuvvetleri, molekülleri, organelleri ve proteinleri hücre içinden serbest bırakmanın yanı sıra DNA zincirlerini parçalara ayırmak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Akustik kavitasyon, hücrelerden DNA’yı ekstrakte etmek ve analiz için ideal olan yaklaşık 600 – 800 bp uzunluğunda parçalar oluşturmak üzere hücre duvarlarını ve zarlarını parçalar.
DNA parçalanması için ultrasonik homojenizatörler hakkında daha fazla bilgi edinmek üzere buraya tıklayın!

Literatür / Kaynaklar

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

Yüksek performanslı ultrason teknolojisi! Hielscher ürün yelpazesi, kompakt laboratuvar sonikatöründen tezgâh üstü ünitelere ve tam endüstriyel ultrasonik sistemlere kadar tüm aralığı kapsar.

Hielscher Ultrasonics, yüksek performanslı ultrasonik homojenizatörleri laboratuvar ölçeğinden endüstriyel ölçeğe kadar üretir.