Drosophila melanogaster laboratuvarlarda model organizma olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu nedenle Drosophila melanogaster örneklerinin lysis, hücre bozulması, protein ekstraksiyonu ve DNA kesme gibi analitik öncesi hazırlık adımları sıklıkla yapılmalıdır. Ultrasonik dismembrators güvenilir ve verimli ve sadece ultrasonik işlem parametreleri ayarlayarak rahat lysis, protein çıkarma veya DNA parçalanması gibi çeşitli görevleri gerçekleştirmek için kullanılabilir. Ultrasonik homogenizers böylece uygulamaları geniş bir yelpazede esnek araçlardır.

Ultrasonik Lysis ve Protein Ekstraksiyon

Lysis, hücre çözünürasyonu, doku homojenizasyonu ve protein ekstraksiyonu biyolojik laboratuvarlarda ultrasonik dismembrators için tipik görevlerdir. Ultrasonik dismembrators ve hücre ayırıcılar iyi hayvan dokuları, böcekler (örneğin, Drosophila melanogaster, C. elegans) veya bitki örnekleri homojeize için uygundur. Ultrasonikasyon sonraki uygulamalar hücre süspansiyonları ve pelet yanı sıra hücre içi proteinlerin çıkarılması lysis vardır.
Ultrasonik lysis ve protein ekstraksiyon son derece güvenilir ve tekrarlanabilir süreçler, hangi kurulan protokoller temelinde yapılabilir. Ultrasonik işlem yoğunluğu tam genlik, döngü / darbe modu, sıcaklık ve örnek hacmi gibi sonication parametreleri ile ayarlanabilir bu yana, bir kez kanıtlanmış protokolleri tekrar tekrar aynı sonuç ile tekrarlanabilir.

Ultrasonik DNA ve RNA Parçalanma

Hücre lisisi ve protein ekstraksiyonundan sonra, örnek hazırlanmasında sık karşılaşılan bir adım DNA, RNA ve kromatinin, örneğin kromatin immünopresiksiyonundan (ChIP) önce parçalanmasıdır. DNA ve RNA parçalanma, DNA'yı fiziksel kuvvetler le bir arada tutan kovalent bağların kırılması ile güvenilir bir şekilde elde edilebilir. Sonication gibi fiziksel yamultma kullanılarak, ilk başta DNA iplikçikleri kırılır, sonra DNA daha küçük parçalara ayrılır.
Ultrasonik DNA parçalanması güvenilir ve hedeflenen bir uzunlukta, örneğin 500bp (baz çiftleri) DNA kesme verimlidir. Ultrasonik DNA parçalanma önemli avantajları ultrasonik süreç parametreleri ve yoğunluğu hassas kontrolü içerir. Ultrasonik işlem parametreleri sonication yoğunluğu, döngüleri ve tam olarak ayarlayarak ayarlanabilir. Bu da istenilen DNA boyutlarının oluşturulmasını mümkün kılar ve hedeflenen DNA uzunluğu güvenilir bir şekilde üretilebilir ve çoğaltılabilir. Ultrasonik DNA kesme de yüksek molekül ağırlıklı DNA parçaları oluşturmak için idealdir.

Drosophila melanogaster Ultrasonik Lysis için Protokoller

Aşağıda ultrasonik destekli lisis, protein ekstraksiyonu ve DNA veya Drosophila örneklerinin kromatin parçalanması için çeşitli protokoller bulabilirsiniz.

Çapraz bağlantı İmmünoenopenaz (CLIP) Tsay için Ultrasonik Lysis

CLIP tsay daha önce bazı değişiklikler ile bildirilen olarak yapıldı. 0-1 günlük yabani tip dişilerin yaklaşık 20 mg yumurtalıkları UV çapraz bağlı (3 × 2000 μJ/cm2), 1 mL RCB tampon (50 mM HEPES pH 7.4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, %0.1 Triton X-100, 250 mM sakkaroz, 1 mM DTT, 1× EDTA içermeyen Komple Proteaz Inhibitörleri, 1 mM PMSF) 300 U RNAseOUT ile desteklenerek 30 dakika buz üzerine yerleştirilir. Homogenate buz üzerinde sonicated oldu, 80% güç, Hielscher Ultrasonik İşlemci kullanarak arasında 60 s dinlenme ile 20 s patlamaları beş kez UP100H (100 W, 30 kHz) ve santrifüj (4°C'de 5 dk için 16000 × g). Çözünür ekstresi 4°C'de 20 dk için 20 μl Protein-G dinaboncuklar ile önceden temizlendi. RNA girdisinin immünoblotve nicelliği için örnekler alındıktan sonra (%1), HP1 anti-HP1 9A9 antikor ile 450 μl pretemizlenmiş ekstresi ile 4 h 50 l Protein-G dinabedile 4 saat boyunca immünoptriye alındı. İmmünopresipitatlar RCB ile 4 kez yıkandı. İmmünopresipitated RNA'ları etkisiz hale getirmek için peletli boncuklar 100 μL UltraPure DEPC ile işlenmiş su da 5 dk. 900 μL Qiazol Reaktifi RNA hazırlığı için kurtarılan supernatant'a ilave edilmiştir. RNA saflaştırılmış üreticiprotokolüne göre oligo dT, rasgele hexamers ve SuperScript ters transkriptase III kullanarak cDNA sentezlemek için bir şablon olarak kullanılmıştır.
(Cassale ve ark. 2019)

Kromatin İmmünoena kadar Ultrasonik Lysis

Menet tarafından küçük değişikliklerle tanımlanan yönteme göre kromatin immünopresipredasyon yapıldı. 0-1 günlük yabani tip dişiler 1 mL NEB tamponunda homojenize edildi (pH 8.0'da 10 mM HEPES-Na, 10 mM NaCl, 0.1 mM EGTA-Na pH 8, 0.5 mM EDTA-Na pH 8, 1 mM DTT, 0.5% NP-40, 0.5 mM Spermidin, 0.15 mM Spermine, 1× EDTA-ücretsiz Komple Protaz inhibitörleri) ile bir homogenizer / daldırma dağıtıcı 1 dk (at 3000 rpm). Homojen önceden soğutulmuş cam dounce transfer edildi ve 15 tam vuruş sıkı bir havaneli ile uygulandı. Serbest çekirdekler daha sonra 4°C'de 10 dk için 6000xg olarak santrifüj edildi. Çekirdek içeren peletler NEB'in 1 mL'sinde yeniden askıda ve 20000 × g'de 20 dakika sakaroz gradyan (NEB'de 0,6 5 ml, NEB'de 0,35 mL, NEB'de 0,8 M sakaroz) santrifüj edildi. Pelet 1 mL NEB ve formaldehit %1'lik son konsantrasyonda yeniden askıya alındı. Çekirdekler oda sıcaklığında 10 dakika boyunca çapraz bağlandı ve 1.375 M glisin 1/10 vol ekleyerek söndürüldü. Çekirdekler 6000 g × 5 dk santrifüj ile toplandı. Çekirdekler 1 mL NEB'de iki kez yıkanmış ve 1 mL Lysis Tampon 'da (pH 7.6'da 15 mM HEPES-Na, 140 mM NaCl, 0.5 mM EGTA, pH 8'de 1 mM EDTA, %1 Triton X-100, 0.5 mM DTT, 0.1% Na Deoksikolate, %0.1 SDS, %0.5 N-lauroylsarcosine ve 1× EDTA içermeyen Komple Protaz Inhibitörleri). Çekirdekleri bir Hielscher Ultrasonik İşlemci kullanılarak sonicated edildi UP100H (100 W, 30 kHz) 20 s ve 1 dakika buz üzerinde altı kez. Sonicated çekirdekleri 4°C'de 4 dk için 13000 × g olarak santrifüj edildi. Sonicated kromatin çoğunluğu uzunluğu 500-1000 baz çiftleri (bp) idi. Her immünoprediiçin 15 g kromatin 10 g HP1 9A9 monoklonal antikor (dönen bir tekerlekte 4°C'de 3 saat) varlığında inkübe edildi. Daha sonra 50 μl dinamit proteini G eklendi ve kuluçka ya da 4°C'de devam edildi. Süpernatantlar atılır ve numuneler Lysis Tampon'da iki kez (her yıkama 15 dk 4 °C) ve iki kez TE Tampon 'da (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl pH 8'de) yıkandı. Kromatin boncuklardan iki adımda uzak kaldı; 100 μl'lik Elüyyon Tampon1'de ilk (10 mM EDTA, %1 SDS, pH 8'de 50 mM TrisHCl) 65°C'de 15 dakika, ardından santrifüj ve süpernatantın geri kazanımı. Boncuk malzemesi 100 μl TE + %0.67 SDS'de yeniden çıkarıldı. Kombine eluat (200 μl) bir gecede 65°C'de inkübe edildi ve çapraz bağlantıları tersine çevirmek için 50 μg/ml RNaseA tarafından 65°C'de 15 dakika, 65°C'de ise 500 μg/ml Proteinase K ile 65°C'de 3 saat süreyle tedavi edildi. Örnekler fenol-kloroform çıkarıldı ve etanol çöktürülmüştür. DNA 25°l suda yeniden asılı ydı. DNA immünopsipitated ile moleküler analizleri maksimize etmek için, aday genler tek bir reaksiyonda benzer erime sıcaklıklarına sahip iki farklı astar seti kullanılarak optimize edilmiş bir dubleks-PCR protokolü ile çiftler halinde güçlendirilmiştir.
(Casale ve ark. 2019)
 

Biyolojik Örnekler için Yüksek Performanslı Ultrasonik Hücre Bozucular

Hielscher Ultrasonik hücre bozulması, lysis, protein ekstraksiyon, DNA, RNA ve kromatin parçalanma yanı sıra diğer analitik öncesi örnek hazırlama adımları için yüksek performanslı ultrasonicators söz konusu olduğunda uzun deneyimli ortağıdır. Ultrasonik laboratuvar homogenizers ve örnek hazırlama birimleri kapsamlı bir portföy sunan, Hielscher biyolojik uygulama ve gereksinimleri için ideal ultrasonik cihaz vardır.
Gibi mikro uçlu klasik prob tipi ultrasonicator UP200St (200W; soldaki resme bakın) veya ultrasonik numune hazırlama birimlerinden biri VialTweeter veya UP200ST_TD_CupHorn VialHolder ile araştırma ve analitik laboratuvarlarda favori modellerdir. Klasik ultrasonik prob ideal, daha az örnek hazırlamak lysed gerekir, ayıklanmış veya parçalanmış. Örnek hazırlama birimleri VialTweeter ve UP200St_TD_CupHorn, sırasıyla 10 veya 5 şişeye kadar eşzamanlı sonication için izin verir.
Yüksek numune numaraları (örn. 96-kuyu plakaları, mikrotiter plakalar vb.) işlenmesi gerekiyorsa, UIP400MTP ideal sonication kurulum. UIP400MTP, suyla dolu ve mikro kuyu plakalarını tutmak için yeterli alana sahip daha büyük bir cuphorn gibi çalışır. 400 watt güçlü ultrasonik işlemci tarafından desteklenmektedir, UIP400MTP hücreleri bozmak için çok düzgün ve çok iyi plakalar yoğun sonication sunar, lyse örnekleri, çözünür pelet, protein ayıklamak veya dna ayıklamak.

Akıllı Yazılım ile Hassas Kontrol

200 watt yukarı yayılan tüm Hielscher sonication çözümleri dijital renkli dokunmatik ekran ve akıllı bir yazılım ile donatılmıştır. Akıllı veri üzerinden tüm ultrasonik işlem parametreleri otomatik olarak csv dosyası olarak bir yerleşik SD-kart en kısa sürede ultrasonicator başlatılır kaydedilir. Bu araştırma ve protokol çok daha uygun hale getirir. Sonication denemeler veya örnek hazırlama sonra, sadece her sonication çalıştırmak sonication parametreleri gözden geçirebilirsiniz ve bunları karşılaştırın.
Sezgisel menü aracılığıyla, sonication önce çok sayıda parametre önceden ayarlanabilir: Örneğin, örnek sıcaklığı kontrol etmek ve termal bozulmasını önlemek için, örnek sıcaklığının bir üst sınırı ayarlanabilir. Ultrasonik birim ile birlikte gelen bir takılabilir sıcaklık sensörü, gerçek sonication sıcaklık ultrasonik işlemci geribildirim verir. Üst sıcaklık sınırına ulaşıldığında, ultrasonik aygıt ∆T kümesinin alt sınırına ulaşılıncaya kadar duraklar ve ardından otomatik olarak yeniden sonicating başlar.
Belirli bir enerji girişi ile sonication gerekiyorsa, sonication çalıştırmak son ultrasonik enerji önceden ayarlayabilirsiniz. Tabii ki, ultrasonik nabız ve döngü modu da ayrı ayrı ayarlanabilir.
En başarılı sonication parametrelerinizi yeniden kullanmak için, önceden ayarlanmış modlar olarak çeşitli sonication modları (örneğin sonication time, yoğunluk, döngü modu vb.) kaydedebilirsiniz, böylece kolay ve hızlı bir şekilde yeniden başlatılabilir.
Daha operasyonel kolaylık sağlamak için, tüm dijital ultrasonik birimler herhangi bir ortak tarayıcıda tarayıcı uzaktan kumanda sı aracılığıyla çalıştırılabilir (örn. InternetExplorer, Safari, Chrome vb.). LAN bağlantısı basit bir tak-n-çalıştır kurulumudur ve ek yazılım yüklemesi gerektirmez.
Hielscher olarak biyolojik numunelerin başarılı sonication hassas ve tekrarlanabilirlik gerektirdiğini biliyoruz. Bu nedenle ultrasonicators verimli, güvenilir, tekrarlanabilir ve uygun örnek hazırlanması sağlayan tüm özelliklere sahip akıllı cihazlar olarak tasarlanmıştır.

Aşağıdaki tablo, ultrasonik mikro ipuçları ve çok sayıda örnek uygun, güvenilir hazırlanması için MultiSample ultrasonicators için klasik ultrasonik homogenizers ultrasonik sistemlerin yaklaşık işleme kapasitesinin bir göstergesi verir: