Drosophila melanogaster örneklerinin ultrasonik lizisi

Drosophila melanogaster, laboratuvarlarda model organizma olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu nedenle, Drosophila melanogaster numunelerinin lizisi, hücre parçalanması, protein ekstraksiyonu ve DNA kesimi gibi pre-analitik hazırlama adımları sıklıkla gerçekleştirilmelidir. Ultrasonik ayırıcılar güvenilir ve verimlidir ve sadece ultrasonik işlem parametrelerini ayarlayarak lizis, protein ekstraksiyonu veya DNA parçalanması gibi çeşitli görevleri kolaylıkla gerçekleştirmek için kullanılabilir. Ultrasonik homojenizatörler bu nedenle geniş bir uygulama yelpazesine sahip esnek araçlardır.

Ultrasonik Lizis ve Protein Ekstraksiyonu

Lizis, hücre çözündürme, doku homojenizasyonu ve protein ekstraksiyonu, biyolojik laboratuvarlarda ultrasonik çözücüler için tipik görevlerdir. Ultrasonik ayırıcılar ve hücre bozucular, hayvan dokularını, böcekleri (örneğin, Drosophila melanogaster, C. elegans) veya bitki örneklerini homojenize etmek için çok uygundur. Ultrasonication'ın sonraki uygulamaları, hücre süspansiyonlarının ve peletlerin parçalanmasının yanı sıra hücre içi proteinlerin ekstraksiyonudur.
Ultrasonik lizis ve protein ekstraksiyonu, yerleşik protokoller temelinde gerçekleştirilebilen son derece güvenilir ve tekrarlanabilir işlemlerdir. Ultrasonik işlem yoğunluğu, genlik, döngü? darbe modu, sıcaklık ve numune hacmi gibi sonikasyon parametreleri ile tam olarak ayarlanabildiğinden, kanıtlanmış protokoller aynı sonuçla tekrar tekrar tekrarlanabilir.

Ultrasonik DNA ve RNA Parçalanması

Hücre lizisi ve protein ekstraksiyonundan sonra, numune hazırlamada yaygın olarak gerekli olan bir adım, örneğin kromatin immünopresipitasyonundan (ChIP) önce DNA, RNA ve kromatinin kesilmesi ve parçalanmasıdır. DNA ve RNA parçalanması, DNA'yı bir arada tutan kovalent bağların fiziksel kuvvetler tarafından kırılmasıyla güvenilir bir şekilde sağlanabilir. Sonikasyon gibi fiziksel kesme kullanılarak, önce DNA iplikleri kırılır, daha sonra DNA daha küçük parçalara ayrılır.
Ultrasonik DNA parçalanması, DNA'nın hedeflenen bir uzunluğa, örneğin 500bp'ye (baz çiftleri) kesilmesinde güvenilir ve etkilidir. Ultrasonik DNA parçalanmasının başlıca avantajları, ultrasonik işlem parametrelerinin ve yoğunluğunun hassas kontrolünü içerir. Ultrasonik işlem parametreleri, sonikasyon yoğunluğunu, döngülerini ve zamanını tam olarak ayarlayarak ayarlanabilir. Bu, istenen DNA boyutlarının oluşturulmasını mümkün kılar ve hedeflenen DNA uzunluğu güvenilir bir şekilde üretilebilir ve çoğaltılabilir. Ultrasonik DNA kesme, yüksek moleküler ağırlıklı DNA parçaları oluşturmak için de idealdir.

Drosophila melanogaster'in Ultrasonik Lizisi için Protokoller

Aşağıda, Drosophila örneklerinin ultrasonik destekli lizisi, protein ekstraksiyonu ve DNA veya kromatin parçalanması için çeşitli protokoller bulabilirsiniz.

Çapraz Bağlama İmmünopresipitasyon (CLIP) Testi için Ultrasonik Lizis

CLIP testi, daha önce bildirildiği gibi bazı modifikasyonlarla gerçekleştirildi. 0 ila 1 günlük yabani tip dişilerden yaklaşık 20 mg yumurtalıklar UV çapraz bağlandı (3 × 2000 μJ? cm2), 1 mL RCB tamponunda buz üzerinde homojenize edildi (50 mM HEPES pH 7.4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2,% 0.1 Triton X-100, 250 mM sükroz, 1 mM DTT, 1× EDTA içermeyen Tam Proteaz İnhibitörleri, 1 mM PMSF) 300 U RNAseOUT ile desteklenmiş ve 30 dakika boyunca buz üzerine yerleştirilmiştir. Homojenat, buz üzerinde,% 80 güçte,% 20 saniyelik patlamalarda beş kez, Hielscher Ultrasonik İşlemci kullanılarak 60 saniyelik bir dinlenme ile sonikleştirildi UP100H (100 W, 30 kHz) ve santrifüjlenmiş (4 ° C'de 5 dakika boyunca 16000 × g). Çözünür ekstrakt, 4 ° C'de 20 dakika boyunca 20 μl Protein-G dynabeads ile önceden temizlendi. İmmünoblotlama ve RNA girişinin kantitasyonu (%1) için numunelerin çıkarılmasından sonra, HP1, 50 μl Protein-G dynabeads ile 4 saat inkübe edilerek 450 μl önceden temizlenmiş ekstrakttan anti-HP1 9A9 antikoru ile immünopresipite edildi. İmmünopresipitatlar RCB ile 4 kez yıkandı. İmmünopresipite edilmiş RNA'ları elüte etmek için, peletlenmiş boncuklar 100 μL UltraPure DEPC ile muamele edilmiş Su içinde 5 dakika kaynatıldı. RNA hazırlığı için geri kazanılan süpernatana 900 μL Qiazol Reaktifi eklendi. Saflaştırılan RNA, üreticinin protokolüne göre oligo dT, rastgele heksamerler ve SuperScript ters transkriptaz III kullanılarak cDNA'yı sentezlemek için bir şablon olarak kullanıldı.
(Cassale ve ark. 2019)

Kromatin İmmünopresipitasyon Testi için Ultrasonik Lizis

Kromatin immünopresipitasyonu, Menet tarafından tarif edilen yönteme göre küçük modifikasyonlarla gerçekleştirildi. 0 ila 1 günlük vahşi tip dişilerden yaklaşık 20 mg yumurtalık, 1 mL NEB tamponunda (pH 8.0'da 10 mM HEPES-Na, pH 8'de 10 mM NaCl, pH 8'de 0.1 mM EGTA-Na, pH 8'de 0.5 mM EDTA-Na, 1 mM DTT, %0.5 NP-40, 0.5 mM Spermidin, 0.15 mM Spermin, 1× EDTA içermeyen Tam Proteaz İnhibitörleri) içinde homojenizatör? daldırma dağıtıcı ile 1 dakika (3000 rpm'de) homojenizatör? daldırma dağıtıcı ile homojenize edildi. Homojenat, önceden soğutulmuş bir cam hazneye aktarıldı ve sıkı bir havaneli ile 15 tam vuruş uygulandı. Serbest çekirdekler daha sonra 4 ° C'de 10 dakika boyunca 6000xg'de santrifüjlendi. Çekirdek içeren peletler 1 mL NEB içinde yeniden süspanse edildi ve sükroz gradyanı üzerinde 20 dakika boyunca 20000 × g'da santrifüjlendi (NEB'de 0.65 mL 1.6 M sükroz, NEB'de 0.35 mL 0.8 M sükroz). Pelet, 1 mL NEB ve formaldehit içinde% 1'lik bir nihai konsantrasyona kadar yeniden süspanse edildi. Çekirdekler oda sıcaklığında 10 dakika boyunca çapraz bağlandı ve 1/10 hacimce 1.375 M glisin eklenerek söndürüldü. Çekirdekler 6000 × g'da 5 dakika santrifüj edilerek toplandı. Çekirdekler 1 mL NEB içinde iki kez yıkandı ve 1 mL Lizis Tamponu (pH 7.6'da 15 mM HEPES-Na, 140 mM NaCl, 0.5 mM EGTA, pH 8'de 1 mM EDTA, %1 Triton X-100, 0.5 mM DTT, %0.1 Na Deoksikolat, %0.1 SDS, %0.5 N-lauroylsarcosine ve 1× EDTA içermeyen Tam Proteaz İnhibitörleri) içinde yeniden süspanse edildi. Çekirdekler, bir Hielscher Ultrasonik İşlemci kullanılarak sonikleştirildi UP100H (100 W, 30 kHz) 20 saniye boyunca altı kez ve buz üzerinde 1 dakika. Sonikasyonlu çekirdekler 13000 × g'da 4 ° C'de 4 dakika santrifüjlendi. Sonikasyonlu kromatinin çoğunluğu 500 ila 1000 baz çifti (bp) uzunluğundaydı. Her immünopresipitasyon için, 15 μg kromatin, 10 μg HP1 9A9 monoklonal antikoru (dönen bir tekerlekte 4 ° C'de 3 saat) varlığında inkübe edildi. Daha sonra 50 μl dynabeads protein G ilave edildi ve inkübasyon gece boyunca 4 ° C'de devam etti. Süpernatanlar atıldı ve numuneler iki kez Lizis Tamponunda (her biri 4 ° C'de 15 dakika) ve iki kez TE Tamponunda (1 mM EDTA, pH 8'de 10 mM TrisHCl) yıkandı. Kromatin, boncuklardan iki adımda ayrıştırıldı; ilk olarak 100 μl Elüitiyon Tamponu 1'de (10 mM EDTA,% 1 SDS, pH 8'de 50 mM TrisHCl) 65 ° C'de 15 dakika, ardından süpernatantın santrifüjlenmesi ve geri kazanılması. Boncuk materyali 100 μl TE + %0.67 SDS'de yeniden ekstrakte edildi. Kombine elüat (200 μl), çapraz bağları tersine çevirmek için gece boyunca 65 ° C'de inkübe edildi ve 65 ° C'de 15 dakika boyunca 50 μg? ml RNaseA ve 65 ° C'de 3 saat boyunca 500 μg? ml Proteinaz K ile muamele edildi. Numuneler fenol-kloroform ekstrakte edildi ve etanol çökeltildi. DNA 25 μl su içinde yeniden süspanse edildi. İmmünopresipe edilmiş DNA ile moleküler analizleri en üst düzeye çıkarmak için, aday genler, tek bir reaksiyonda benzer erime sıcaklıklarına sahip iki farklı primer seti kullanılarak optimize edilmiş bir dubleks-PCR protokolü aracılığıyla çiftler halinde amplifiye edildi.
(Casale ve ark. 2019)
 

Biyolojik Numuneler için Yüksek Performanslı Ultrasonik Hücre Bozucular

Hielscher Ultrasonics, hücre bozulması, lizis, protein ekstraksiyonu, DNA, RNA ve kromatin parçalanmasının yanı sıra diğer pre-analitik numune hazırlama adımları için yüksek performanslı ultrasonicators söz konusu olduğunda uzun süredir deneyimli ortağınızdır. Ultrasonik laboratuvar homojenizatörleri ve numune hazırlama ünitelerinden oluşan kapsamlı bir portföy sunan Hielscher, biyolojik uygulamanız ve gereksinimleriniz için ideal ultrasonik cihaza sahiptir.
gibi mikro uçlu klasik prob tipi ultrasonicator UP200St (200W; soldaki resme bakın) veya ultrasonik numune hazırlama ünitelerinden biri VialTweeter veya UP200St_TD_CupHorn VialHolder ile araştırma ve analitik laboratuvarlarda favori modellerdir. Klasik ultrasonik prob, daha az numunenin hazırlanması, çıkarılması veya parçalanması gerektiğinde idealdir. Numune hazırlama üniteleri VialTweeter ve UP200St_TD_CupHorn, sırasıyla 10 veya 5 şişeye kadar eşzamanlı sonikasyona izin verir.
Yüksek numune sayılarının (örn. 96 oyuklu plakalar, mikrotitre plakalar vb.) işlenmesi gerekiyorsa, UIP400MTP ideal sonikasyon kurulumudur. UIP400MTP, suyla doldurulmuş ve mikro kuyu plakalarını tutmak için yeterli alana sahip daha büyük bir cuphorn gibi işlev görür. 400 watt'lık güçlü bir ultrasonik işlemci ile güçlendirilen UIP400MTP, hücreleri bozmak, örnekleri parçalamak, peletleri çözmek, proteinleri çıkarmak veya DNA'yı kesmek için çok kuyulu plakaların çok düzgün ve yoğun bir sonikasyonunu sağlar.

Akıllı Yazılım ile Hassas Kontrol

200 watt'tan itibaren tüm Hielscher sonication çözümleri dijital renkli dokunmatik ekran ve akıllı bir yazılım ile donatılmıştır. Akıllı veri protokolü aracılığıyla, tüm ultrasonik işlem parametreleri, ultrasonicator başlatılır başlatılmaz otomatik olarak yerleşik bir SD karta CSV dosyası olarak kaydedilir. Bu, araştırma ve protokollemeyi çok daha kolay hale getirir. Sonikasyon denemelerinden veya numune hazırlamadan sonra, her bir sonikasyon çalışmasının sonikasyon parametrelerini gözden geçirebilir ve karşılaştırabilirsiniz.
Sezgisel menü aracılığıyla, sonikasyondan önce çok sayıda parametre önceden ayarlanabilir: Örneğin, numunedeki sıcaklığı kontrol etmek ve termal bozulmasını önlemek için, numune sıcaklığının bir üst sınırı ayarlanabilir. Ultrasonik ünite ile birlikte gelen takılabilir bir sıcaklık sensörü, ultrasonik işlemciye gerçek sonikasyon sıcaklığı hakkında geri bildirim verir. Üst sıcaklık sınırına ulaşıldığında, ultrasonik cihaz ayarlanan ∆T'nin alt sınırına ulaşılana kadar duraklar ve ardından otomatik olarak tekrar sonikasyona başlar.
Belirli bir enerji girişi ile sonikasyon gerekiyorsa, sonikasyon çalışmasının son ultrasonik enerjisini önceden ayarlayabilirsiniz. Tabii ki, ultrasonik titreşim ve döngü modu da ayrı ayrı ayarlanabilir.
En başarılı sonikasyon parametrelerinizi yeniden kullanmak için, çeşitli sonikasyon modlarını (örneğin sonikasyon süresi, yoğunluk, döngü modu vb.) önceden ayarlanmış modlar olarak kaydedebilirsiniz, böylece kolay ve hızlı bir şekilde yeniden başlatılabilirler.
Daha fazla operasyonel kolaylık için, tüm dijital ultrasonik üniteler herhangi bir ortak tarayıcıda (örneğin, InternetExplorer, Safari, Chrome vb.) tarayıcı uzaktan kumandası ile çalıştırılabilir. LAN bağlantısı basit bir tak ve çalıştır kurulumudur ve ek yazılım yüklemesi gerektirmez.
Hielscher olarak, biyolojik numunelerin başarılı bir şekilde sonikasyonunun hassasiyet ve tekrarlanabilirlik gerektirdiğini biliyoruz. Bu nedenle, ultrasonicator'larımızı verimli, güvenilir, tekrarlanabilir ve uygun bir numune hazırlamayı sağlayan tüm özelliklere sahip akıllı cihazlar olarak tasarladık.

Aşağıdaki tablo, çok sayıda numunenin uygun ve güvenilir bir şekilde hazırlanması için ultrasonik mikro uçlar ve klasik ultrasonik homojenizatörlerden MultiSample ultrasonikatörlere kadar ultrasonik sistemlerimizin yaklaşık işleme kapasitesinin bir göstergesini vermektedir: