Drosophila Melanogaster Numunelerinin Ultrasonik Lizisi

Drosophila melanogaster, laboratuvarlarda model organizma olarak yaygın biçimde kullanılır. Bu nedenle Drosophila melanogaster numunelerinin lizisi, hücre parçalama, protein ekstraksiyonu ve DNA kesme gibi analiz öncesi hazırlama adımlarının sıklıkla gerçekleştirilmesi gerekir. Ultrasonik parçalayıcılar güvenilir ve verimlidir; yalnızca ultrasonik proses parametreleri ayarlanarak lizis, protein ekstraksiyonu veya DNA fragmantasyonu gibi çeşitli işlemleri kolaylıkla gerçekleştirmek için kullanılabilirler. Böylece ultrasonik homojenizatörler, geniş bir uygulama yelpazesine sahip esnek araçlardır.

Ultrasonik Lizis ve Protein Ekstraksiyonu

Lizis, hücrelerin çözünürleştirilmesi, doku homojenizasyonu ve protein ekstraksiyonu, biyoloji laboratuvarlarında ultrasonik parçalayıcılarla gerçekleştirilen tipik işlemlerdir. Ultrasonik parçalayıcılar ve hücre parçalayıcıları, hayvan dokularını, böcekleri (ör. Drosophila melanogaster, C. elegans) veya bitki örneklerini homojenize etmek için son derece uygundur. Ultrasonik işlemenin sonraki uygulamaları, hücre süspansiyonlarının ve peletlerin lizisini ve hücre içi proteinlerin ekstraksiyonunu kapsar.
Ultrasonik lizis ve protein ekstraksiyonu, yerleşik protokoller temelinde gerçekleştirilebilen, son derece güvenilir ve tekrarlanabilir proseslerdir. Ultrasonik proses şiddeti; genlik, çevrim / darbe modu, sıcaklık ve numune hacmi gibi sonikasyon parametreleri aracılığıyla hassas biçimde ayarlanabildiğinden, bir kez doğrulanmış protokoller aynı sonucu verecek şekilde tekrar tekrar uygulanabilir.

Ultrasonik DNA ve RNA Fragmantasyonu

Hücre lizisi ve protein ekstraksiyonundan sonra, numune hazırlamada yaygın olarak gereken bir adım, örneğin kromatin immünopresipitasyonundan (ChIP) önce DNA, RNA ve kromatinin kesilmesi ve fragmantasyonudur. DNA ve RNA fragmantasyonu, DNA’yı bir arada tutan kovalent bağların fiziksel kuvvetlerle kırılması yoluyla güvenilir biçimde gerçekleştirilebilir. Sonikasyon gibi fiziksel kesme yöntemleri kullanıldığında önce DNA zincirleri kırılır, ardından DNA daha küçük parçalara ayrılır.
Ultrasonik DNA fragmantasyonu, DNA’nın hedeflenen bir uzunluğa, örneğin 500bp (baz çifti) uzunluğuna kesilmesinde güvenilir ve verimlidir. Ultrasonik DNA fragmantasyonunun başlıca avantajları arasında ultrasonik proses parametrelerinin ve şiddetinin hassas kontrolü yer alır. Ultrasonik proses parametreleri, sonikasyon şiddeti, çevrimler ve süre hassas biçimde ayarlanarak düzenlenebilir. Bu, istenen DNA boyutlarının oluşturulmasını mümkün kılar; hedeflenen DNA uzunluğu güvenilir biçimde üretilebilir ve yeniden üretilebilir. Ultrasonik DNA kesme, yüksek molekül ağırlıklı DNA fragmanları oluşturmak için de idealdir.

Drosophila melanogaster Numunelerinin Ultrasonik Lizisi İçin Protokoller

Aşağıda Drosophila numunelerinin ultrasonik destekli lizisi, protein ekstraksiyonu ve DNA veya kromatin fragmantasyonu için çeşitli protokoller bulabilirsiniz.

Çapraz Bağlama İmmünopresipitasyonu (CLIP) Testi İçin Ultrasonik Lizis

CLIP testi, daha önce bildirildiği şekilde bazı değişikliklerle gerçekleştirildi. 0–1 günlük yabani tip dişilerden alınan yaklaşık 20 mg yumurtalık, UV ile çapraz bağlandı (3 × 2000 μJ/cm2), 300 U RNAseOUT eklenmiş 1 mL RCB tamponunda (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, %0,1 Triton X-100, 250 mM sükroz, 1 mM DTT, 1× EDTA içermeyen Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF) buz üzerinde homojenize edildi ve 30 min boyunca buz üzerinde tutuldu. Homojenata, buz üzerinde, %80 güçte, aralarında 60 s bekleme süresi bulunan 20 s süreli beş darbe halinde, Hielscher ultrasonik işlemcisi UP100H (100 W, 30 kHz) kullanılarak sonikasyon uygulandı ve homojenat santrifüjlendi (4°C sıcaklıkta 5 min boyunca 16.000 × g). Çözünür ekstrakt, 20 μl Protein-G dynabeads ile 4°C sıcaklıkta 20 min boyunca ön temizlemeye tabi tutuldu. İmmünoblotlama ve RNA girdisinin nicel tayini (%1) için numuneler ayrıldıktan sonra HP1, ön temizlemeden geçirilmiş 450 μl ekstrakttan anti-HP1 9A9 antikoru ile 50 μl Protein-G dynabeads eşliğinde 4 h inkübasyon yoluyla immünopresipite edildi. İmmünopresipitatlar RCB ile 4 kez yıkandı. İmmünopresipite edilmiş RNA’ları elüe etmek için pelet halindeki boncuklar, 100 μL UltraPure DEPC ile işlenmiş su içinde 5 min kaynatıldı. RNA hazırlama için geri kazanılan süpernatanta 900 μL Qiazol Reagent eklendi. Saflaştırılan RNA, üreticinin protokolüne göre oligo dT, rastgele heksamerler ve SuperScript ters transkriptaz III kullanılarak cDNA sentezlemek için şablon olarak kullanıldı.
(Cassale et al. 2019)

Kromatin İmmünopresipitasyonu Testi İçin Ultrasonik Lizis

Kromatin immünopresipitasyonu, Menet tarafından açıklanan yönteme göre küçük değişikliklerle gerçekleştirildi. 0–1 günlük yabani tip dişilerden alınan yaklaşık 20 mg yumurtalık, 1 mL NEB tamponunda (pH 8,0’da 10 mM HEPES-Na, 10 mM NaCl, pH 8’de 0,1 mM EGTA-Na, pH 8’de 0,5 mM EDTA-Na, 1 mM DTT, %0,5 NP-40, 0,5 mM spermidin, 0,15 mM spermin, 1× EDTA içermeyen Complete Protease Inhibitors), bir homojenizatör / daldırma tipi disperser ile 1 min boyunca (3000 rpm hızda) homojenize edildi. Homojenat, önceden soğutulmuş bir cam Dounce homojenizatörüne aktarıldı ve sıkı oturan bir pistonla 15 tam strok uygulandı. Serbest çekirdekler daha sonra 4°C sıcaklıkta 10 min boyunca 6000xg kuvvetinde santrifüjlendi. Çekirdek içeren peletler, 1 mL NEB içinde yeniden süspanse edildi ve sükroz gradyanı üzerinde (NEB içinde 0,65 mL 1,6 M sükroz, NEB içinde 0,35 mL 0,8 M sükroz) 20 min boyunca 20.000 × g kuvvetinde santrifüjlendi. Pelet, 1 mL NEB ve nihai konsantrasyonu %1 olacak formaldehit içinde yeniden süspanse edildi. Çekirdekler oda sıcaklığında 10 min boyunca çapraz bağlandı ve 1/10 vol 1,375 M glisin eklenerek reaksiyon durduruldu. Çekirdekler, 5 min boyunca 6000 × g kuvvetinde santrifüjlenerek toplandı. Çekirdekler, 1 mL NEB içinde iki kez yıkandı ve 1 mL Lizis Tamponunda (pH 7,6’da 15 mM HEPES-Na, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, pH 8’de 1 mM EDTA, %1 Triton X-100, 0,5 mM DTT, %0,1 Na deoksikolat, %0,1 SDS, %0,5 N-lauroilsarkozin ve 1× EDTA içermeyen Complete Protease Inhibitors) yeniden süspanse edildi. Çekirdeklere Hielscher ultrasonik işlemcisi UP100H (100 W, 30 kHz) kullanılarak altı kez, her seferinde 20 s sonikasyon ve buz üzerinde 1 min tutma şeklinde sonikasyon uygulandı. Sonikasyon uygulanmış çekirdekler, 4°C sıcaklıkta 4 min boyunca 13.000 × g kuvvetinde santrifüjlendi. Sonikasyon uygulanmış kromatinin büyük kısmı 500–1000 baz çifti (bp) uzunluğundaydı. Her immünopresipitasyon için 15 μg kromatin, 10 μg HP1 9A9 monoklonal antikoru varlığında inkübe edildi (döner bir çark üzerinde 4°C sıcaklıkta 3 h). Ardından 50 μl dynabeads protein G eklendi ve inkübasyona 4°C sıcaklıkta gece boyunca devam edildi. Süpernatantlar atıldı ve numuneler Lizis Tamponunda iki kez (her yıkama 4 °C sıcaklıkta 15 min) ve TE Tamponunda (1 mM EDTA, pH 8’de 10 mM TrisHCl) iki kez yıkandı. Kromatin, boncuklardan iki adımda elüe edildi; önce 100 μl Elüsyon Tamponu 1 (10 mM EDTA, %1 SDS, pH 8’de 50 mM TrisHCl) içinde 65°C sıcaklıkta 15 min tutuldu, ardından santrifüjleme ve süpernatantın geri kazanılması gerçekleştirildi. Boncuk materyali, 100 μl TE + %0,67 SDS içinde yeniden ekstrakte edildi. Birleştirilmiş elüat (200 μl), çapraz bağları geri çevirmek için 65°C sıcaklıkta gece boyunca inkübe edildi ve 65°C sıcaklıkta 15 min boyunca 50 μg/ml RNaseA ile ve 65°C sıcaklıkta 3 h boyunca 500 μg/ml Proteinaz K ile işlem gördü. Numuneler fenol–kloroform ile ekstrakte edildi ve etanol ile çöktürüldü. DNA, 25 μl su içinde yeniden süspanse edildi. İmmünopresipite edilmiş DNA ile yapılan moleküler analizleri en üst düzeye çıkarmak için aday genler, tek bir reaksiyonda benzer erime sıcaklıklarına sahip iki farklı primer seti kullanılarak optimize edilmiş bir dupleks-PCR protokolü yoluyla çiftler halinde çoğaltıldı.
(Casale et al. 2019)
 

Biyolojik Numuneler İçin Yüksek Performanslı Ultrasonik Hücre Parçalayıcıları

Hielscher Ultrasonics; hücre parçalama, lizis, protein ekstraksiyonu, DNA, RNA ve kromatin fragmantasyonu ile diğer analiz öncesi numune hazırlama adımları için yüksek performanslı sonikatörler söz konusu olduğunda uzun yıllara dayanan deneyime sahip iş ortağınızdır. Ultrasonik laboratuvar homojenizatörleri ve numune hazırlama ünitelerinden oluşan kapsamlı bir portföy sunan Hielscher, biyolojik uygulamanız ve gereksinimleriniz için ideal ultrasonik cihaza sahiptir.
Mikro uçlu klasik prob tipi sonikatörlerden UP200St (200W; soldaki resme bakın) gibi bir model veya ultrasonik numune hazırlama ünitelerinden VialTweeter ya da UP200ST_TD_CupHorn ile VialHolder kombinasyonu, araştırma ve analiz laboratuvarlarında tercih edilen modellerdir. Klasik ultrasonik prob, az sayıda numunenin lizise, ekstraksiyona veya fragmantasyona tabi tutulması gerektiğinde idealdir. VialTweeter ve UP200St_TD_CupHorn numune hazırlama üniteleri, sırasıyla 10 veya 5 adede kadar viyalin eş zamanlı sonikasyonuna olanak tanır.
Çok sayıda numunenin (ör. 96 kuyucuklu plakalar, mikrotitre plakaları vb.) işlenmesi gerekiyorsa UIP400MTP ideal sonikasyon düzeneğidir. UIP400MTP, suyla doldurulan ve mikro kuyucuklu plakaları barındırmak için yeterli alana sahip, daha büyük bir cuphorn gibi çalışır. 400 watt gücünde bir ultrasonik işlemciden güç alan UIP400MTP; hücreleri parçalamak, numuneleri lizise tabi tutmak, peletleri çözünürleştirmek, proteinleri ekstrakte etmek veya DNA’yı kesmek amacıyla çok kuyucuklu plakalara son derece homojen ve yoğun sonikasyon uygular.

Akıllı Yazılım Aracılığıyla Hassas Kontrol

200 watt ve üzerindeki tüm Hielscher sonikasyon çözümleri, dijital renkli dokunmatik ekran ve akıllı yazılımla donatılmıştır. Akıllı veri kaydı sayesinde sonikatör çalıştırılır çalıştırılmaz tüm ultrasonik proses parametreleri, dahili SD karta CSV dosyası olarak otomatik biçimde kaydedilir. Bu, araştırma ve kayıt tutmayı çok daha kolay hale getirir. Sonikasyon denemelerinden veya numune hazırlamadan sonra, her sonikasyon işleminin parametrelerini kolayca inceleyebilir ve karşılaştırabilirsiniz.
Sezgisel menü aracılığıyla çok sayıda parametre sonikasyondan önce ayarlanabilir: Örneğin numunedeki sıcaklığı kontrol etmek ve numunenin ısıl bozunmasını önlemek için numune sıcaklığına bir üst sınır belirlenebilir. Ultrasonik üniteyle birlikte gelen, takılıp çıkarılabilir sıcaklık sensörü, ultrasonik işlemciye gerçek sonikasyon sıcaklığı hakkında geri bildirim verir. Üst sıcaklık sınırına ulaşıldığında ultrasonik cihaz, ayarlanmış ∆T’nin alt sınırına ulaşılana kadar duraklar ve ardından otomatik olarak yeniden sonikasyona başlar.
Belirli bir enerji girdisiyle sonikasyon gerekiyorsa, sonikasyon işleminin nihai ultrasonik enerjisini önceden ayarlayabilirsiniz. Elbette ultrasonik darbeleme ve çevrim modu da ayrı ayrı ayarlanabilir.
En başarılı sonikasyon parametrelerinizi yeniden kullanmak için çeşitli sonikasyon modlarını (ör. sonikasyon süresi, şiddeti, çevrim modu vb.) ön ayarlı modlar olarak kaydedebilir, böylece bunları kolayca ve hızla yeniden başlatabilirsiniz.
Daha fazla kullanım kolaylığı için tüm dijital ultrasonik üniteler, yaygın herhangi bir tarayıcıda (ör. InternetExplorer, Safari, Chrome vb.) tarayıcı üzerinden uzaktan kontrol ile çalıştırılabilir. LAN bağlantısı, basit bir tak ve çalıştır düzenidir ve ek yazılım kurulumu gerektirmez.
Hielscher olarak biyolojik numunelerin başarılı sonikasyonunun hassasiyet ve tekrarlanabilirlik gerektirdiğini biliyoruz. Bu nedenle sonikatörlerimizi; verimli, güvenilir, tekrarlanabilir ve kolay numune hazırlamaya olanak tanıyan tüm özelliklere sahip akıllı cihazlar olarak tasarladık.

Aşağıdaki tablo, çok sayıda numunenin kolay ve güvenilir biçimde hazırlanmasına yönelik ultrasonik mikro uçlar ve klasik ultrasonik homojenizatörlerden MultiSample sonikatörlerine kadar ultrasonik sistemlerimizin yaklaşık işleme kapasitesi hakkında fikir verir: