• DNA ve RNA kesme sırasında DNA molekülleri daha küçük parçalara ayrılır. DNA / RNA parçalanması, yeni nesil sıralama (NGS) için kütüphaneler oluşturmak için gereken önemli örnek hazırlık adımlarından biridir.
• Ultrasonik DNA kesme 100 parçalara DNA veya RNA kırmak için akustik kavitasyon kuvvetleri kullanır – 5kb BP.
• Ultrasonik kesme istenen DNA uzunluğuna hassas DNA parçalanması ve adaptasyon için izin verir.

Ultrasonication kullanarak DNA Kesme

Hielscher Ultrasonics, DNA, RNA ve kromatin kesme için çeşitli ultrason tabanlı çözümler sunmaktadır. bir mikrotip kullanılarak doğrudan sonikasyon için bir sonda tipi ultrasonicators (örneğin UP100H) arasında seçim veya VialTweeeter ya da aynı zamanda çeşitli numunelerde dolaylı DNA hazırlığı için ultrasonik cuphorn kullanın. Hielscher ihtiyaçlarınızı göz önünde bulundurarak ideal bir cihaz sunar: 1 veya en fazla 10 numuneler, mikrolitre gelen litrelik hacimlerde için hacimleri var Hava – Hielscher ultrasonik işlemciler doğru uzun uzadıya DNA, RNA ve kromatin parçaları hazırlamak için gereksinimlerini karşılamak için kullanılabilir. Tekrarlanabilirlik, kolay kullanım ve hassas kontrol nesil dizilemesi için güvenilir bir kütüphane sağlar.
enzimatik DNA fragmantasyonu aksine, ultrasonik kesme herhangi bir kimyasal madde eklemeden saf mekanik kesme kuvvetleri uygular. işlem parametrelerinin doğru bir ayar ile, ultrasonik kesme, yüksek moleküler ağırlıklı DNA fragmanları (plazmid ve genomik DNA ') oluşturur.
Saflaştırılmış nükleik asitler, önce ya da bir parçalama adımı sonrasında amplifiye edilebilir.
Ultrasonik titreşim parametreleri (güç, darbe evresi / patlamaları, zaman ve sıcaklık) yazılımı ayarları aracılığıyla güvenli bir şekilde kontrol edilebilir.

Ultrasonik DNA, makaslama Protokolleri

Kromatin immünopresipitasyon deneyi için

Kısaca, hücreler 60 mm çaplı kaplarda (çanakta 400,000) kaplandı ve RhoA siRNA (tarif edildiği gibi) ile transfekte edildi; 72 saat sonra, proteinleri DNA'ya çapraz bağlamak için 37 ° C'de 10 dakika süreyle formaldehit (nihai konsantrasyon,% 1) ile inkübe edildi. Çapraz bağlama reaksiyonu, 125 mmol / L nihai konsantrasyon vererek, onda biri 1.25 mol / L glisin hacminin ilavesiyle söndürüldü. Hücreler iki kez buz soğukluğunda PBS ile yıkandı, radyo-imünopresipitasyon deney tamponu içinde yeniden süspansiyon haline getirildi [150 mmol / L NaCl,% 1 NP40,% 0.5 deoksikolat,% 0.1 SDS, 5 mmol / L EDTA, 50 mmol / L Tris-HCl (pH 8.0) )] 1 mmol / L fenilmetilsülfonil fluorür, 1 Ag / mL aprotinin ve 1 Ag / mL pepstatin A içeren ve 30 dakika boyunca buz üzerinde tutulan]. Daha sonra, hücre lizatları buz ile sonike edildi Hielscher UP200S ultrason sonikatör ile (3 x 40 s, genlik% 40, döngü 1; Hielscher ultrason GmbH), çapraz bağlı chromatins kadar 200 ve 1000 bp arasındaki DNA fragmanları elde etmek için kesilmiştir. Bütün lizat onda biri farklı örnek DNA'lara miktarını ölçmek için kullanılan ve kabul edildi “toplam giriş DNA,”. Üst fazlar, spesifik olmayan arka planı azaltmak için somon spermi DNA / protein agaroz% 50 karışımı ile inkübe edilmiştir. İmmünopresipitasyon daha sonra 5, anti-NF-nB p65 Ag (Upstate) ya da antikor olmayan (negatif kontrol) ile 4 ° C'de gece boyunca yapıldı. Bu üst fazlar 5 mol / L NaCl ile takviye edilmiş ve protein-DNA çapraz bağlar dönmek için 65 ° C'de gece boyunca ısıtıldı. bağışıklık kompleksleri ayrıca DNase- ve RNase-barındırmayan proteinaz K ile muamele edilmiştir ve DNA fenol / kloroform ekstraksiyonu ve etanol çökeltmesiyle saflaştırılır. PCR, insan İNOS geninin promotör bölge içindeki bir dizisine karşılık gelen spesifik primerler ile yapıldı (p1-primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶ p2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier ve diğ., 2008)

EGFP ifade çalışmaları

Daha önce tarif edildiği gibi ekspresyon çalışmaları, rekombinant tür L. tarentolae p10 :: 12. F9Begfp1.4dBsat (Jena Bioscience, Almanya) EGFP (Geliştirilmiş yeşil floresan protein) için gen ile için, kromozomal çeşitli ortamında kültive edilerek, entegre SSU ve ilave olarak, 100 mg l ile takviye^-1 Nourseotrisin (Jena Bioscience, Almanya). Ekim esnasında 1 ml'lik numuneler santrifüjlenmiş, (2000 x g, 20 ° C, 10 dakika) alınmıştır ve% 0.9 NaCl çözeltisi ile yıkanır. Pelet tamponu (20 mM Hepes, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) içinde yeniden süspansiyona alınmış ve ultrasonik işlemci ile sonifikasyon ile parçalanmıştır UP400S (Enerjinin uygulanması ~ 400 Ws). % 12.5 polyacralamide jellerle Laemmli yöntemine (1970) göre, indirgeyici koşullar altında poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) - Hücre birikintisi, santrifüjleme (6000 x g, 4 ° C, 5 dakika) ile ayrılmış ve sodyum dodesil sülfat ile analiz edilmiştir . EGFP ifade çalkalanmış kültür içinde incelenmiştir. (Fritsche ve ark., 2007)

kromatin immünopresipitasyon

Kromatin immüno deneyi ChIP-IT kullanılarak gerçekleştirilmiştir^Tm bazı değişikliklerle üreticinin talimatlarına göre (Aktif Motif Carlsbad, CA, ABD) ifade edin. Kısaca, farklılaştırılmış insan podositler çapraz bağlı olan, oda sıcaklığında 10 dakika süre ile% 1 formaldehid ile. Hücreler buzla soğutulmuş PBS ile yıkandı ve tespit reaksiyon, oda sıcaklığında 0.125 M glisin 5 dk için ilave edilerek durduruldu. Hücreler, buz gibi soğuk PBS ile yıkanır ve çanak kazındı. Hücreler, santrifüj ile topak haline getirildi ve lisis tamponda yeniden süspansiyon haline getirildi. Santrifüj işleminden sonra, topak haline çekirdekler, kesme tamponu içerisinde yeniden süspanse edildi, 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir ve kromatin sonikasyon, örn kesildi UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Almanya)% 20 güçte 5 atım, her biri 20 saniye, buz üzerinde yaklaşık 200-600 bp'lik parçalara bölünür. Kesilen kromatin daha sonra santrifüje edildi ve süpernatant toplandı. İmmünopresipitasyonlar için 60 µl kromatin 1 µg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, ABD), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, İngiltere) veya NF-κB p50 (Abcam) antikorları veya tavşanla inkübe edildi. IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, ABD), negatif bir kontrol olarak, gece boyunca 4 ° C'de hafif bir dönüşle. Manyetik boncuklara bağlanan immün kompleksler, manyetik bir stand kullanılarak toplandı, yoğun bir şekilde yıkandı ve protein / DNA çapraz bağları tersine çevrildi ve DNA, gerçek zamanlı PCR analizi için elute edildi. (Ristola ve diğ. 2009)

yonga dizi analizi için EHEC DNA hazırlama

Hücre lizatları ve ekstre DNA'lar düzenlenmesi
istenen son konsantrasyona PBS içinde süspansiyon haline Bakteri peletleri ile muamele edildi ultrason bölücü UP100H (Hielscher GmbH, Almanya) bir mikrotüp MS1 (çap olarak 1 mm) ile teçhiz edilmiştir. Çalışma frekansı 30 kHz ve etkili çıkış gücü 100 W idi. İşlem sırasında, örnekler bir buz-su banyosunda soğutuldu, karıştırıldı ve santrifüjlendi. Örnekler akış sitometrisi çalışmaları için kullanılmış, daha sonraki işlemler için ise numuneler bir ısıl işleme tabi tutulmuştur (95 ° C, 5 dak). Ham hücre lizatları bir fenol: kloroform: izoamil alkol (25: 24: 1) karışımı ile işlendi. Bu karışımın eşit bir hacmi lizat örneğine ilave edildi, çözelti 15 saniye boyunca kuvvetlice vortekslendi ve 22 ° C'de oda sıcaklığında (RT) 2 dakika süreyle 15,000 x g'de santrifüjlendi. Genomik DNA'yı içeren üst sulu faz dikkatlice ayrıldı ve yeni bir steril Eppendorf tüpünde toplandı.
Daha sonra, DNA'yı parçalamak için örnekler sonike edildi. Sonikasyon adımı, yukarıda açıklandığı gibi aynı koşullarda gerçekleştirildi. Genomik DNA üzerindeki parçalanma etkilerini değerlendirmek için örnekler agaroz jel elektroforezi kullanılarak analiz edildi.
(…Daha önce 2.5 dakika süreyle sonike edilen numuneler, ısıl işlem ve santrifüj işleminden sonra bir ekstraksiyon adımına tabi tutuldu. Serbest bırakılan DNA iki kez bir fenol: kloroform: izoamil alkol karışımı ile ekstrakte edildi ve daha sonra 0 - 15 dakika süreyle ikinci sonikasyona tabi tutuldu. Ekstraksiyon sonrası ultrasonik fragmantasyona maruz kalan DNA'nın boyut dağılımını belirlemek için Agaroz jel elektroforezi kullanıldı (Şekil sağ üst tarafta). Yüksek oranda parçalanmış DNA, 2.5 dakika veya daha uzun süre sonike edilen örneklerden elimine edilen yüksek moleküler ağırlıklı bantlardan ziyade bir DNA smearının varlığından aşikardı. Daha uzun sonikasyon, parça uzunluklarını kademeli olarak yaklaşık 150 - 600 bp'ye indirdi ve 15 dakika boyunca sonikasyon, daha çok yaymanın üst kısmı tarafından görülebileceği gibi bu fragmanları daha da bozdu. Bu nedenle, ortalama DNA fragmanı boyutu, ultrasonication süresi ile yavaş yavaş azaldı ve 5 dakikalık tedavi, çip dizi deneyleri için en uygun DNA fragmanlarının boyutlarını elde etmesine izin verdi. Sonunda, ultrasonik işlemin ilk 2 dakikasını, DNA ekstraksiyonunu (2x) ve müteakip 5 dakikalık sonikasyonunu içeren DNA analit hazırlama prosedürü oluşturuldu. (Basselet ve diğ. 2008)

Kromatin immünopresipitasyon (chip)

HEK293 hücreleri, yukarıda tarif edildiği gibi kültürlendi ve oda sıcaklığında 45 dakika boyunca 2 mM disüksinimidil-glutarat ile sabitlendi. Ardından, hücreler iki kez PBS ile yıkandı. Kromatin,% 1 (v / v) formaldehit kullanılarak oda sıcaklığında 10 dakika çapraz bağlandı ve iki kez buz gibi soğuk PBS ile yıkandı. Çapraz bağlama reaksiyonu, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 0.125 M'lik bir son konsantrasyonda glisin ile inkübe edilerek durduruldu. Tripsin ile inkübasyondan sonra, hücreler hücre kültürü kabından çıkarıldı ve iki kez PBS ile yıkandı. Hücre topağı liziz tamponu (5 mM Borular, pH 8.0, 85 mM KC1 ve% 0.5 (v / v) Nonidet P-40) içinde yeniden süspanse edildi, 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edildi ve bir Dounce homojenleştirici ile homojenleştirildi. Daha sonra, çekirdekler santrifüj (3500 xg, 5 dak, 4 ° C) ile topak haline getirilmiş ve çekirdek tamponu (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA ve% 1 (w / v) SDS) içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiştir. Çekirdekler, üç 20'li darbelerle sonikasyon ile kesintiye uğradı. UP50H sonikatör 1000 bp - Döngü 0,5 ayarında (Hielscher Ultraschall Technologie) ve 200 arasında bir kütle büyüklüğü ile genomik DNA fragmanları, sonuçta% 30 genlik. Çip için, DNA 50 g immünopresipitasyon tamponu (4-kat seyreltilmiş 16.7 mM Tris-HCI, pH 8.1, 167 mM NaCI, 1.2 mM EDTA,% 1.1 (h / h) Triton X-100 ve% 0.01 (ağırlık / h) SDS). (Weiske ve ark. 2006)

kromatin immünopresipitasyon histon modifikasyonu analizi (chip)

Kısaca, 6 x 10⁶ Hücreler iki kez PBS ile yıkanmış ve% 0.5 formaldehit varlığında oda sıcaklığında 15 dakika için kültür plakası üzerinde çapraz bağlanmış olabilir. Çapraz bağlama reaksiyonu, 0.125 M glisin ilave edilerek durduruldu. Tüm takip eden aşamalar 48 ° C'de gerçekleştirildi. Tüm tamponlar önceden soğutulmuş ve proteaz inhibitörleri (Complete Mini, Roche) ihtiva etmiştir. Hücreler iki kez PBS ile yıkandı ve daha sonra kazınmıştır. Toplanan peletler 1 mi liziz tamponunda (% 1 SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) ve 100% genlikte 10 döngü, bir kullanma için soğuk etanol banyosu içinde sonike edilmiştir UP50H sonikatör (Hielscher Teltow, Almanya). Kromatin parçalanma,% 1 agaroz jeli içinde görselleştirildi. Elde edilen fragmanlar, 200-500pb aralığındadır. Çözünür kromatin 48 ° C'de 10 dakika boyunca 14,000 g'de sonike örneklerinin santrifüj işleminden elde edilmiştir. Çözünebilen fraksiyon, seyreltme tamponu içinde 1/10 seyreltildi (% 1 Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCI) ve sonra alikotlandı ve kullanıma kadar 80 ° C'de saklanmıştır. (Rodriguez ve ark., 2008)