Ultrasonik DNA Kesme

DNA ve RNA kesme işlemi sırasında, uzun DNA molekülleri daha küçük parçalara ayrılır, bu da yeni nesil dizileme (NGS) kütüphanesi yapımı için örneklerin hazırlanmasında çok önemli bir adımdır. Ultrasonik DNA kesme, DNA veya RNA'yı 100 bp ila 5 kb arasında değişen parçalara ayırmak için akustik kavitasyon kuvvetleri kullanır. Bu yöntem, parça boyutu üzerinde hassas kontrol sağlayarak, optimum dizileme sonuçları için istenen DNA uzunluğuna özelleştirmeyi kolaylaştırır.

Ultrasonikasyon kullanarak DNA Kesme

Hielscher Ultrasonics, DNA, RNA ve kromatin kesme için çeşitli ultrason tabanlı çözümler sunar. Bir mikrotip kullanarak doğrudan sonikasyon için bir prob tipi ultrasonicators (örneğin UP100H) arasında seçim yapın veya aynı anda çeşitli örneklerin dolaylı DNA hazırlığı için VialTweeeter veya ultrasonik cuphorn kullanın. Hielscher, ihtiyaçlarınızı göz önünde bulundurarak ideal bir cihaz sunar: 1 veya en fazla 10 numuneniz olsun, mikrolitreden litre hacmine kadar hacimler – Hielscher sonicators, DNA, RNA ve kromatin parçalarını doğru uzunlukta hazırlamak için gereksinimlerinizi karşılayacaktır. Tekrarlanabilirlik, kolay kullanım ve hassas kontrol, yeni nesil dizileme için güvenilir bir kitaplık sağlar.
Enzimatik DNA parçalanmasının aksine, ultrasonik kesme, herhangi bir kimyasal eklemeden saf mekanik kesme kuvvetleri uygular. Proses parametrelerinin hassas bir şekilde ayarlanmasıyla, ultrasonik kesme, yüksek moleküler ağırlıklı DNA fragmanları (plazmit ve genomik DNA) üretir.
Saflaştırılmış nükleik asitler, bir parçalanma aşamasından önce veya sonra amplifiye edilebilir.
Sonikasyon parametreleri (güç, darbe döngüsü / patlamalar, zaman ve sıcaklık) yazılım ayarları ile güvenli bir şekilde kontrol edilebilir.

Ultrasonik DNA Kesme Protokolleri

Kromatin İmmünopresipitasyon Testi için

Kısaca, hücreler 60 mm çapında tabaklara (tabak başına 400.000) kaplandı ve RhoA siRNA (tarif edildiği gibi) ile transfekte edildi; 72 saat sonra, proteinleri DNA'ya çapraz bağlamak için 37 ° C'de 10 dakika boyunca formaldehit (nihai konsantrasyon,% 1) ile inkübe edildiler. Çapraz bağlama reaksiyonu, 125 mmol / L nihai konsantrasyon veren 1.25 mol / L glisin onda biri hacminin eklenmesiyle söndürüldü. Hücreler buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkandı, 1 mmol/L fenilmetilsülfonil florür, 1 Ag/mL aprotinin ve 1 Ag/mL pepstatin A içeren radyoimmünopresipitasyon test tamponunda [150 mmol/L NaCl, %1 NP40, %0.5 deoksikolat, %0.1 SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)] yeniden süspanse edildi ve 30 dakika buz üzerinde tutuldu. Daha sonra, hücre lizatları bir buz üzerinde sonikasyon ile sonikleştirildi. Hielscher UP200S ultrason sonikatörü (3 x 40 s, genlik% 40, döngü 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), çapraz bağlı kromatinler 200 ila 1.000 bp arasında DNA parçaları elde etmek için kesilene kadar. Tam lizatın onda biri, farklı örneklerde bulunan DNA miktarını ölçmek için kullanıldı ve şu şekilde kabul edildi: “toplam giriş DNA'sı”. Süpernatanlar, spesifik olmayan arka planı azaltmak için somon sperm DNA'sı / protein agaroz-% 50 bulamacı ile inkübe edildi. İmmünopresipitasyon daha sonra gece boyunca 4 ° C'de 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) veya antikor olmadan (negatif kontrol) yapıldı. Bu süpernatanlar 5 mol / L NaCl ile desteklendi ve protein-DNA çapraz bağlarını geri döndürmek için gece boyunca 65 ° C'de ısıtıldı. İmmünokompleksler ayrıca DNaz ve RNaz içermeyen proteinaz K ile muamele edildi ve DNA, fenol / kloroform ekstraksiyonu ve etanol çökeltme ile saflaştırıldı. PCR, insan iNOS geninin promotör bölgesi içindeki bir diziye karşılık gelen spesifik primerlerle yapıldı (p1 primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier ve diğerleri, 2008)

EGFP-ekspresyon çalışmaları

Ekspresyon çalışmaları için, rekombinant suş L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Almanya) EGFP (Gelişmiş Yeşil Floresan Protein) geni ile entegre, kromozomal ssu entegre, daha önce tarif edildiği gibi çeşitli ortamlarda yetiştirildi ve ek olarak 100 mg l ile desteklendi.^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Almanya). Kültivasyon sırasında 1 ml numune alındı, santrifüj edildi (2000 × g, 20°C, 10 dk) ve %0.9 NaCl çözeltisi ile yıkandı. Pelet, tampon (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) içinde yeniden süspanse edildi ve ultrasonik işlemci ile sonifikasyon ile parçalandı UP400S (enerji uygulaması ∼ 400 Ws). Hücre artıkları santrifüjleme (6000 × g, 4°C, 5 dakika) ile uzaklaştırıldı ve .5 poliakrilamid jeller ile Laemmli (1970) yöntemine göre indirgeme koşulları altında sodyum dodesil sülfat – poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile analiz edildi. EGFP ekspresyonu ajite kültürde incelendi. (Fritsche ve ark. 2007)

Kromatin İmmünopresipitasyonu

Kromatin immünopresipitasyon testi, ChIP-IT kullanılarak gerçekleştirildi^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, ABD) bazı değişikliklerle üreticinin talimatlarına göre. Kısaca, farklılaşmış insan podositleri, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 1 formaldehit ile çapraz bağlandı. Hücreler buz gibi soğuk PBS ile yıkandı ve oda sıcaklığında 5 dakika süreyle 0.125 M glisin ilave edilerek fiksasyon reaksiyonu durduruldu. Hücreler tekrar buz gibi PBS ile yıkandı ve tabaktan kazındı. Hücreler santrifüjleme ile peletlendi ve lizis tamponunda yeniden süspanse edildi. Santrifüjlemeden sonra, peletlenmiş çekirdekler kesme tamponunda yeniden süspanse edildi, 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edildi ve kromatin, sonikasyon ile kesildi, örn. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Almanya)% 25 güçte, buz üzerinde her biri 20 saniyelik 5 darbe, yaklaşık 200-600 bp'lik parçalar halinde. Kesilen kromatin daha sonra santrifüj edildi ve süpernatan toplandı. İmmünopresipitasyonlar için, 60 μl kromatin, 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, ABD), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, İngiltere) veya NF-κB p50 (Abcam) antikorları veya tavşan IgG (Zymed Laboratories) ile negatif kontrol olarak, gece boyunca 4 ° C'de hafif rotasyonla inkübe edildi. Manyetik boncuklara bağlı immünokompleksler, manyetik bir stand kullanılarak toplandı, yoğun bir şekilde yıkandı ve protein/DNA çapraz bağları tersine çevrildi ve gerçek zamanlı PCR analizi için DNA ayrıştırıldı. (Ristola ve ark. 2009)

Çip dizisi analizi için EHEC DNA hazırlığı

Hücre lizatlarının ve ekstrakte edilmiş DNA'ların düzenlenmesi
PBS'de istenen nihai konsantrasyona kadar süspanse edilen bakteri peletleri aşağıdakilerle muamele edildi: ultrason bozucu UP100H (Hielscher GmbH, Almanya) bir mikrotip MS1 (1 mm çapında) ile donatılmıştır. Çalışma frekansı 30 kHz ve efektif çıkış gücü 100 W idi. İşlem sırasında numuneler buzlu su banyosunda soğutuldu, karıştırıldı ve santrifüjlendi. Numuneler akış sitometrisi çalışmaları için kullanılırken, daha sonraki işlemler için numuneler bir ısıl işleme (95 ° C, 5 dakika) tabi tutuldu. Ham hücre lizatları, fenol:kloroform:izoamil alkol (25:24:1) karışımı ile işlendi. Bu karışımın eşit bir hacmi lizat numunesine ilave edildi, çözelti 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde girdaplandı ve 15.000 x g'da 2 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) yaklaşık 22 ° C santrifüjlendi. Genomik DNA'yı içeren üst sulu faz dikkatlice ayrıldı ve yeni bir steril Eppendorf tüpünde toplandı.
Daha sonra, DNA'yı parçalamak için örnekler sonikleştirildi. Sonikasyon adımı, yukarıda tarif edildiği gibi aynı koşullarda gerçekleştirildi. Genomik DNA üzerindeki parçalanma etkilerini değerlendirmek için örnekler agaroz jel elektroforezi kullanılarak analiz edildi.
(…) Daha önce 2.5 dakika boyunca sonikleştirilen numuneler, ısıl işlem ve santrifüjlemeden sonra bir ekstraksiyon aşamasına tabi tutuldu. Serbest bırakılan DNA, bir fenol: kloroform: izoamil alkol karışımı ile iki kez ekstrakte edildi ve daha sonra 0 - 15 dakika boyunca ikinci sonikasyona tabi tutuldu. Ekstraksiyon sonrası ultrasonik parçalanmaya maruz kalan DNA'nın boyut dağılımını belirlemek için agaroz jel elektroforezi kullanıldı (Şek. sağ üst tarafta). Yüksek oranda parçalanmış DNA, 2.5 dakika veya daha uzun süre sonikasyona tabi tutulan örneklerden elimine edilen yüksek moleküler ağırlıklı bantlar yerine bir DNA yaymasının varlığından belirgindi. Daha uzun sonikasyon, parça uzunluklarını kademeli olarak yaklaşık 150 - 600 bp'ye düşürdü ve 15 dakikalık sonikasyon, çoğunlukla smear'ın üst kısmı tarafından görülebileceği gibi, bu parçaları daha da bozdu. Böylece, ortalama DNA fragmanı boyutu, ultrasonikasyon süresi ile kademeli olarak azaldı ve 5 dakikalık tedavi, çip dizisi tahlilleri için en uygun DNA fragmanlarının boyutlarını elde etmeye izin verdi. Sonunda, ilk 2 dakikalık ultrasonik tedavi, DNA ekstraksiyonu (2×) ve ardından 5 dakikalık sonikasyonu içeren DNA analit hazırlama prosedürü kuruldu. (Basselet ve ark. 2008)

Kromatin İmmünopresipitasyon (ChIP)

HEK293 hücreleri yukarıda tarif edildiği gibi kültürlendi ve oda sıcaklığında 45 dakika boyunca 2 mM diseksinimidil-glutarat ile fikse edildi. Daha sonra, hücreler PBS ile iki kez yıkandı. Kromatin, oda sıcaklığında %1 (h/h) formaldehit kullanılarak 10 dakika boyunca çapraz bağlandı ve buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkandı. Çapraz bağlama reaksiyonu, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 0.125 M'lik bir nihai konsantrasyonda glisin ile inkübasyon ile durduruldu. Tripsin ile inkübasyondan sonra, hücreler hücre kültürü kabından kazındı ve PBS ile iki kez yıkandı. Hücre peleti, lizis tamponunda (5 mM Borular, pH 8.0, 85 mM KCl ve% 0.5 (h/h) Nonidet P-40) yeniden süspanse edildi, buz üzerinde 10 dakika inkübe edildi ve bir Dounce homojenizatör ile homojenize edildi. Daha sonra, çekirdekler santrifüjleme (3500 x g, 5 dk, 4 °C) ile peletlendi ve çekirdek tamponunda (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA ve% 1 (a/h) SDS) yeniden süspanse edildi. Çekirdekler, bir seferde üç adet 20 saniyelik darbelerle sonikasyon ile bozuldu. UP50H sonikatör (Hielscher Ultraschall Technologie) döngü 0.5 ve genlik 0 ayarında, 200 – 1000 bp kütle büyüklüğüne sahip genomik DNA fragmanları verir. ChIP için, 50g DNA, immünopresipitasyon tamponunda 4 kat seyreltildi (16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl, 1.2 mM EDTA, %1.1 (h/h) Triton X-100 ve %0.01 (a/h) SDS). (Weiske ve ark. 2006)

Kromatin immünopresipitasyonu (ChIP) ile histon modifikasyon analizi

Kısaca, 6 x 10⁶ hücreler PBS ile iki kez yıkandı ve %0.5 formaldehit varlığında oda sıcaklığında 15 dakika boyunca kültür plakası üzerinde çapraz bağlandı. Çapraz bağlama reaksiyonu 0.125 M glisin ilave edilerek durduruldu. Sonraki tüm adımlar 48 ° C'de gerçekleştirildi. Tüm tamponlar önceden soğutuldu ve proteaz inhibitörleri (Complete Mini, Roche) içeriyordu. Hücreler PBS ile iki kez yıkandı ve daha sonra kazındı. Toplanan peletler 1 ml lizis tamponunda (% 1 SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) çözüldü ve bir kullanarak% 100 genlikte 10 döngü boyunca soğuk bir etanol banyosunda sonikasyon edildi. UP50H sonikatör (Hielscher, Teltow, Almanya). Kromatin parçalanması% 1 agaroz jel içinde görselleştirildi. Elde edilen parçalar 200-500 pb aralığındaydı. Çözünür kromatin, sonikasyonlu numunelerin 14.000 g'da 48 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjlenmesiyle elde edildi. Çözünür fraksiyon, seyreltme tamponunda (% 1 Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) 1/10 oranında seyreltildi, daha sonra aliquoteed ve kullanıma kadar 80 ° C'de saklandı. (Rodriguez ve ark. 2008)