Ultrasonik DNA Kesme

DNA ve RNA kesme sırasında uzun DNA molekülleri daha küçük parçalara ayrılır; bu, yeni nesil dizileme (NGS) kütüphanesi oluşturmak üzere numunelerin hazırlanmasında kritik bir adımdır. Ultrasonik DNA kesme, DNA veya RNA’yı 100 bp ile 5 kb arasında değişen fragmanlara ayırmak için akustik kavitasyon kuvvetlerini kullanır. Bu yöntem, fragman boyutu üzerinde hassas kontrol sağlayarak optimum dizileme sonuçları için istenen DNA uzunluğuna göre uyarlamayı kolaylaştırır.

Ultrasonikasyon Kullanılarak DNA Kesme

Hielscher Ultrasonics, DNA, RNA ve kromatin kesme için ultrason temelli çeşitli çözümler sunar. Mikro uç kullanarak doğrudan sonikasyon için prob tipi bir ultrasonikatör (ör. UP100H) seçin veya çeşitli numunelerin eş zamanlı dolaylı DNA hazırlığı için VialTweeeter ya da ultrasonik cuphorn kullanın. Hielscher, ihtiyaçlarınızı göz önünde bulundurarak ideal cihazı sunar: ister 1 ister 10’a kadar numuneniz olsun, hacimler mikrolitreden litreye kadar değişsin – Hielscher sonikatörleri, DNA, RNA ve kromatin fragmanlarını doğru uzunlukta hazırlama gereksinimlerinizi karşılar. Tekrarlanabilirlik, kolay kullanım ve hassas kontrol, yeni nesil dizileme için güvenilir bir kütüphane oluşturulmasını sağlar.
Enzimatik DNA fragmantasyonunun aksine ultrasonik kesme, herhangi bir kimyasal eklemeden tamamen mekanik kesme kuvvetleri uygular. Proses parametrelerinin hassas biçimde ayarlanmasıyla ultrasonik kesme, yüksek molekül ağırlıklı DNA fragmanları (plazmit ve genomik DNA) üretir.
Saflaştırılmış nükleik asitler, fragmantasyon adımından önce veya sonra çoğaltılabilir.
Sonikasyon parametreleri (güç, darbe döngüsü / darbe dizileri, süre ve sıcaklık), yazılım ayarları aracılığıyla güvenli biçimde kontrol edilebilir.

Ultrasonik DNA Kesme Protokolleri

Kromatin İmmünopresipitasyon Testi İçin

Kısaca, hücreler 60mm çapındaki kaplara (kap başına 400.000) ekildi ve RhoA siRNA ile transfekte edildi (açıklandığı gibi); 72 h sonra, proteinleri DNA’ya çapraz bağlamak için formaldehit ile (son konsantrasyon, %1) 37°C sıcaklıkta 10 min inkübe edildi. Çapraz bağlama reaksiyonu, hacmin onda biri kadar 1,25 mol/L glisin eklenerek durduruldu ve 125 mmol/L son konsantrasyon elde edildi. Hücreler buz soğukluğunda PBS ile iki kez yıkandı, 1 mmol/L fenilmetilsülfonil florür, 1 Ag/mL aprotinin ve 1 Ag/mL pepstatin A içeren radyoimmünopresipitasyon testi tamponunda [150 mmol/L NaCl, %1 NP40, %0,5 deoksikolat, %0,1 SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] yeniden süspanse edildi ve 30 min buz üzerinde tutuldu. Ardından hücre lizatları, buz üzerinde bir Hielscher UP200S ultrason sonikatörü (3 x 40 s, genlik %40, döngü 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) kullanılarak, çapraz bağlı kromatinler 200 ile 1.000 bp arasında DNA fragmanları verecek şekilde kesilene kadar sonikasyona tabi tutuldu. Toplam lizatın onda biri, farklı numunelerde bulunan DNA miktarını ölçmek için kullanıldı ve “toplam girdi DNA’sı” olarak kabul edildi. Süpernatantlar, özgül olmayan arka planı azaltmak için somon spermi DNA’sı/protein agaroz içeren %50’lik süspansiyon ile inkübe edildi. Ardından immünopresipitasyon, 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) ile veya antikor olmadan (negatif kontrol) 4°C sıcaklıkta gece boyunca gerçekleştirildi. Bu süpernatantlara 5 mol/L NaCl eklendi ve protein-DNA çapraz bağlarını geri çevirmek için 65°C sıcaklıkta gece boyunca ısıtıldı. İmmün kompleksler ayrıca DNaz ve RNaz içermeyen proteinaz K ile işlendi ve DNA, fenol/kloroform ekstraksiyonu ve etanol çöktürmesi ile saflaştırıldı. PCR, insan iNOS geninin promotör bölgesindeki bir diziye karşılık gelen özgül primerlerle gerçekleştirildi (p1 primeri: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 primeri: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP ekspresyon çalışmaları

Ekspresyon çalışmaları için, EGFP (Geliştirilmiş Yeşil Floresan Protein) geni kromozomal ssu bölgesine entegre edilmiş rekombinant L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 suşu (Jena Bioscience, Almanya), daha önce açıklandığı gibi çeşitli besiyerlerinde, ayrıca 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Almanya) eklenerek yetiştirildi. Yetiştirme sırasında 1 ml numuneler alındı, santrifüjlendi (2000 × g, 20°C, 10 min) ve %0,9 NaCl çözeltisiyle yıkandı. Pelet, tamponda (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) yeniden süspanse edildi ve ultrasonik işlemci UP400S kullanılarak sonikasyonla parçalandı (uygulanan enerji ∼ 400 Ws). Hücre kalıntıları santrifüjleme ile uzaklaştırıldı (6000 × g, 4°C, 5 min) ve Laemmli (1970) yöntemine göre indirgen koşullar altında %12,5 poliakrilamid jellerle sodyum dodesil sülfat – poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) kullanılarak analiz edildi. EGFP ekspresyonu, çalkalanan kültürde incelendi. (Fritsche et al. 2007)

Kromatin immünopresipitasyonu

Kromatin immünopresipitasyon testi, ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, ABD) kullanılarak üreticinin talimatlarına göre bazı değişikliklerle gerçekleştirildi. Kısaca, farklılaşmış insan podositleri oda sıcaklığında 10 min boyunca %1 formaldehit ile çapraz bağlandı. Hücreler buz soğukluğunda PBS ile yıkandı ve fiksasyon reaksiyonu, oda sıcaklığında 5 min süreyle 0,125 M glisin eklenerek durduruldu. Hücreler tekrar buz soğukluğunda PBS ile yıkandı ve kaptan kazınarak alındı. Hücreler santrifüjleme ile pelet hâline getirildi ve lizis tamponunda yeniden süspanse edildi. Santrifüjlemeden sonra, pelet hâlindeki çekirdekler kesme tamponunda yeniden süspanse edildi, 30 min buz üzerinde inkübe edildi ve kromatin, örneğin UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Almanya) kullanılarak buz üzerinde %25 güçte, her biri 20 sec süren 5 darbeyle sonikasyon yoluyla yaklaşık 200–600 bp boyutundaki fragmanlara kesildi. Kesilmiş kromatin daha sonra santrifüjlendi ve süpernatant toplandı. İmmünopresipitasyonlar için 60 μl kromatin, 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, ABD), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Birleşik Krallık) veya NF-κB p50 (Abcam) antikorlarıyla ya da negatif kontrol olarak tavşan IgG (Zymed Laboratories) ile 4°C sıcaklıkta hafifçe döndürülerek gece boyunca inkübe edildi. Manyetik boncuklara bağlı immün kompleksler, manyetik bir stand kullanılarak toplandı, kapsamlı biçimde yıkandı ve protein/DNA çapraz bağları geri çevrilerek DNA, gerçek zamanlı PCR analizi için elüe edildi. (Ristola et al. 2009)

Çip dizisi analizi için EHEC DNA hazırlığı

Hücre lizatlarının ve ekstrakte edilmiş DNA’ların hazırlanması
İstenen son konsantrasyona ulaşacak şekilde PBS içinde süspanse edilen bakteri peletleri, ultrasonik parçalayıcı UP100H (Hielscher GmbH, Almanya) ile, MS1 mikro ucu (1mm çapında) takılı olarak işlendi. Çalışma frekansı 30 kHz ve etkin çıkış gücü 100 W idi. İşlem sırasında numuneler buz-su banyosunda soğutuldu, karıştırıldı ve santrifüjlendi. Numuneler akış sitometrisi çalışmalarında kullanılırken, sonraki işlemler için numunelere ısıl işlem uygulandı (95°C, 5 min). Ham hücre lizatları fenol:kloroform:izoamil alkol (25:24:1) karışımıyla işlendi. Lizat numunesine bu karışımdan eşit hacimde eklendi, çözelti 15 s boyunca kuvvetlice vortekslendi ve yaklaşık 22°C oda sıcaklığında (RT) 15.000 x g’de 2 min santrifüjlendi. Genomik DNA’yı içeren üst sulu faz dikkatlice ayrıldı ve yeni, steril bir Eppendorf tüpünde toplandı.
Ardından numuneler, DNA’yı fragmanlara ayırmak için sonikasyona tabi tutuldu. Sonikasyon adımı, yukarıda açıklanan koşullarla aynı koşullarda gerçekleştirildi. Fragmantasyonun genomik DNA üzerindeki etkilerini değerlendirmek için numuneler agaroz jel elektroforezi kullanılarak analiz edildi.
(…) Daha önce 2,5 min sonikasyona tabi tutulmuş numuneler, ısıl işlem ve santrifüjlemeden sonra bir ekstraksiyon adımına tabi tutuldu. Açığa çıkan DNA, fenol:kloroform:izoamil alkol karışımıyla iki kez ekstrakte edildi ve ardından 0 – 15 min süreyle ikinci sonikasyona tabi tutuldu. Ekstraksiyon sonrası ultrasonik fragmantasyona tabi tutulan DNA’nın boyut dağılımını belirlemek için agaroz jel elektroforezi kullanıldı (sağ üstteki şekil). Yüksek derecede fragmante olmuş DNA, 2,5 min veya daha uzun süre sonikasyona tabi tutulan numunelerde ortadan kalkan yüksek molekül ağırlıklı bantlar yerine bir DNA yaymasının bulunmasıyla belirginleşti. Daha uzun sonikasyon, fragman uzunluklarını kademeli olarak yaklaşık 150 – 600 bp’ye düşürdü ve 15 min sonikasyon, çoğunlukla yaymanın üst kısmından görülebileceği gibi bu fragmanları daha da parçaladı. Böylece ortalama DNA fragman boyutu, ultrasonikasyon süresiyle kademeli olarak azaldı ve 5 min işlem, çip dizisi testleri için en uygun DNA fragman boyutlarının elde edilmesini sağladı. Son olarak, önce 2 min ultrasonik işlem, DNA ekstraksiyonu (2×) ve ardından 5 min sonikasyondan oluşan DNA analiti hazırlama prosedürü oluşturuldu. (Basselet et al. 2008)

Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP)

HEK293 hücreleri yukarıda açıklandığı gibi kültüre edildi ve oda sıcaklığında 45 min boyunca 2 mM disüksinimidil glutarat ile fikse edildi. Ardından hücreler PBS ile iki kez yıkandı. Kromatin, oda sıcaklığında 10 min boyunca %1 (v/v) formaldehit kullanılarak çapraz bağlandı ve buz soğukluğunda PBS ile iki kez yıkandı. Çapraz bağlama reaksiyonu, oda sıcaklığında 5 min boyunca 0,125 M son konsantrasyonda glisin ile inkübasyon yoluyla durduruldu. Tripsin ile inkübasyondan sonra hücreler, hücre kültürü kabından kazınarak alındı ve PBS ile iki kez yıkandı. Hücre peleti lizis tamponunda (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl ve %0,5 (v/v) Nonidet P-40) yeniden süspanse edildi, 10 min buz üzerinde inkübe edildi ve Dounce homojenizatörüyle homojenize edildi. Ardından çekirdekler santrifüjleme ile pelet hâline getirildi (3500 x g, 5 min, 4 °C) ve çekirdek tamponunda (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA ve %1 (w/v) SDS) yeniden süspanse edildi. Çekirdekler, her biri 20-s süren üç darbeyle sonikasyon yoluyla, UP50H sonikatörü (Hielscher Ultraschall Technologie) 0,5 döngü ve %30 genlik ayarında kullanılarak parçalandı ve çoğunluğu 200 – 1000 bp boyutunda olan genomik DNA fragmanları elde edildi. ChIP için 50g DNA, immünopresipitasyon tamponunda (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, %1,1 (v/v) Triton X-100 ve %0,01 (w/v) SDS) 4 kat seyreltildi. (Weiske et al. 2006)

Kromatin immünopresipitasyonu (ChIP) ile histon modifikasyonu analizi

Kısaca, 6 x 10⁶ hücre PBS ile iki kez yıkandı ve kültür plakasında, oda sıcaklığında 15 min boyunca %0,5 formaldehit varlığında çapraz bağlandı. Çapraz bağlama reaksiyonu, 0,125 M glisin eklenerek durduruldu. Sonraki tüm adımlar 48°C sıcaklıkta gerçekleştirildi. Tüm tamponlar önceden soğutuldu ve proteaz inhibitörleri (Complete Mini, Roche) içeriyordu. Hücreler PBS ile iki kez yıkandı ve ardından kazınarak alındı. Toplanan peletler, 1 ml lizis tamponunda (%1 SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) çözüldü ve soğuk etanol banyosunda %100 genlikte 10 döngü boyunca UP50H sonikatörü (Hielscher, Teltow, Almanya) kullanılarak sonikasyona tabi tutuldu. Kromatin fragmantasyonu %1 agaroz jelde görüntülendi. Elde edilen fragmanlar 200–500pb aralığındaydı. Çözünür kromatin, sonikasyona tabi tutulan numunelerin 48°C sıcaklıkta 14.000g’de 10 min santrifüjlenmesiyle elde edildi. Çözünür fraksiyon, seyreltme tamponunda (%1 Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) 1/10 oranında seyreltildi, ardından alikotlara ayrıldı ve kullanılıncaya kadar 80°C sıcaklıkta saklandı. (Rodriguez et al. 2008)