Ultrasonication plazmid DNA parçalamak için güvenilir bir tekniktir. Hassas bir şekilde kontrol edilebilen genlik, nabız modu ve sıcaklık kontrolü, zarar vermeyen plazmid parçalanması için bir ultrasonicator'un en önemli özellikleridir. Ek olarak, bazı ajanların kullanımı plazmid bozulmasına karşı korunmaya yardımcı olur. Hielscher Ultrasonics, tek şişelerden kontrollü plazmid parçalanması, aynı anda çok sayıda numunenin yanı sıra çok kuyulu plakaların sonikasyonu için çeşitli çözümler sunar. Başarılı ultrasonik plazmid parçalanması hakkında daha fazla bilgi edinin!

Ultrasonication kullanarak Plazmid Kesme

DNA örnekleri ultrasonik dalgalara maruz kaldığında, ultrasonik olarak üretilen titreşimler, mekanik kuvvetler yoluyla yüksek moleküler ağırlıklı DNA moleküllerini kesen veya kıran sıvıda akustik kavitasyon oluşturur. Sonikasyon, yüksek çözünürlük elde etmek için küçük parça boyutlarının kesinlikle çok önemli olduğu Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) gibi uygulamalar da dahil olmak üzere toplu DNA kesme deneyleri için en yaygın kullanılan yöntemdir. (Bkz. Tseng ve ark., 2012)
Plazmid DNA'sı (pDNA), halka şekli ile karakterize edilen ve bakterilerde ve bazı ökaryotlarda bulunan DNA'nın spesifik bir şeklidir.
Süper sarmal pDNA, otomatik dizileme ve transfeksiyon gibi aşağı akış işlemlerinde en iyi sonuçları gösterdiği için plazmid DNA'sının istenen şeklidir. Ultrasonication başarıyla süper sarmal pDNA da dahil olmak üzere pDNA parçalamak için uygundur.
Thompson ve ark. (2008), süper sarmal DNA'yı parçaladığı bilinen plazmid sonikasyonunun, sekans phred20 okuma uzunluklarını, Beckman Coulter'ın kontrol şablonundan veya enzimatik olarak doğrusallaştırılmış plazmidlerden önemli ölçüde farklı olmadıkları noktaya kadar iyileştirmenin etkili bir yolu olduğunu göstermiştir.

Plazmid Vektörlerinin Kullanımı

Plazmidler genellikle genleri klonlamak, aktarmak ve manipüle etmek için araçlar olarak kullanılır. Plazmidler bu amaçlar için deneysel olarak kullanıldığında, vektör olarak adlandırılırlar. DNA fragmanları veya genleri bir plazmid vektörüne yerleştirilebilir ve rekombinant plazmid olarak adlandırılır. Plazmid vektörleri, rekombinant DNA'yı bir konakçı hücreye sürmek için araçlar olarak kullanılır ve moleküler klonlamanın önemli bir bileşenidir.
“Viral olmayan vektörler, çeşitli karmaşık hastalıkları tedavi etmek için gen terapisinde potansiyel kullanımları için kapsamlı bir şekilde çalışılmaktadır. Viral olmayan vektörler, plazmid DNA'sını fiziksel, kimyasal ve enzimatik bozunmaya karşı korur ve DNA molekülünü hedef bölgeye iletir. Örneğin, katyonik lipozomlar, kitosan ve diğer pozitif yüklü nanopartiküller, elektrostatik etkileşimler yoluyla plazmid DNA'sı ile kompleksler oluşturur. Bununla birlikte, kolayca oluşan katyonik lipozomlar / plazmid DNA kompleksleri nispeten büyüktür (yani, 300-400 nm) ve doğada heterojendir, bu da farmasötik uygulamalarda kullanılmalarını zorlaştırır. Büyük ve heterojen plazmid DNA / lipozomlar, plazmid DNA / aerosoller ve plazmid DNA / peptit kompleksleri ultrasonikasyon kullanılarak daha küçük ve homojen parçacıklara indirgenebilir.” (Sarker ve ark., 2019)
Plazmid vektörlerinin kullanımı için belirgin bir örnek CRISPR-Cas9'dur. CRISPR-Cas9 sistemi tipik olarak hücrelere tek bir büyük plazmid veya bir hedef dizisini, bir CRISPR kılavuzunu ve Cas9'u kodlayan birden fazla küçük plazmid olarak teslim edilir.

Nanoçökeltme ile DNA yüklü PLGA Nanopartiküllerin Ultrasonik Hazırlanması

Jo ve ark. (2020), bir model CRISPR-Cas9 plazmidinin birincil kemik iliği kaynaklı makrofajlara verilmesi için bir nanopartikül taşıyıcısı oluşturmak üzere poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) kullanmıştır. PLGA nanopartiküllerinin nanoçökelmesi için, iki farklı uç gruba (ester ve amin grupları) sahip PLGA, pozitif yüklü amin uç kapaklarının, DNA'nın negatif yüklü omurgası ile arasındaki yük etkileşimleri nedeniyle kapsülleme verimliliğini ve yüklemeyi arttırması amacıyla kullanılmıştır. 50 mL'lik bir polipropilen konik santrifüj tüpünde, 100 mg Pluronik F127, vorteks karıştırma ile 20 mL otoklavlanmış DI suyunda çözüldü ve ardından ultrasonik bir banyo kullanılarak 30 dakikalık nazik sonikasyon (CupHorn'a bakın). Otoklavlanmış bir manyetik karıştırma çubuğu eklendi ve diğer çözeltiler yapılırken çözelti 600 RPM'de 30 dakika boyunca karıştırıldı. DNA'nın spesifik olmayan adsorpsiyonunu en aza indirmek için cam eşya yerine plastik laboratuvar gereçleri kullanıldı. DMF'de çözünmüş PLGA (44.48 mg / ml) ve THF'de çözünmüş TIPS pentasen (0.667 mg / ml) çözeltileri ayrı ayrı yapıldı. PLGA, 30 dakika boyunca sonikleştirilmeden önce DMF'de 30 dakika boyunca sessiz bir şekilde ıslatılmaya bırakıldı. (tam protokol için bakınız Jo ve ark., 2020)

Sonication sırasında Plazmid DNA Koruması

Plazmidler ve süper sarmal plazmidler dahil olmak üzere DNA oldukça hassas bir bozunmadır. Mevcut tüm parçalanma yöntemleri bazı dezavantajları için bilinmektedir. Ultrasonik DNA parçalanması, koruyucu önlemlerle birlikte kontrollü sonikasyon, DNA iplikçiklerinin kesme ve ısıya bağlı hasarını azaltmaya izin verdiği için tercih edilen yöntemlerden biridir.
Ultrasonik DNA kesme sırasında düşük genlik ayarları, nabız modu ve sıcaklık kontrolünün yanı sıra, bazı ajanların kullanımı DNA bozulmasına karşı önemli koruyucu etki göstermiştir. Örneğin, çeşitli polimerler, peptitler ve lipitler ultrasonikasyon sırasında plazmid DNA'sını korur.

Plazmid DNA'sının ve plazmid DNA / IL nanokomplekslerinin ultrasonik kesme stresine karşı stabilitesi agaroz jel elektroforez testi kullanılarak araştırıldı. Hem plazmid DNA'sı hem de plazmid DNA / IL nanokompleksleri, farklı zaman noktaları için ultrasonik kesme stresine maruz bırakıldı. Plazmid DNA'sı 0, 10, 20, 30 ve 40 dakika boyunca ultrasonik kesme stresine maruz kaldı. Bununla birlikte, plazmid DNA / IL nanokompleksleri 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ve 120 dakika boyunca ultrasonik kesme stresine maruz bırakıldı.
(çalışma ve resim: ©Sarker ve ark., 2019)

Sarker ve ark. (2019), plazmid DNA / iyonik sıvı (pDNA / IL) nanoyapıları 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ve 120 dakika boyunca ultrasonik kesme stresine maruz kaldığında ve ticari olarak temin edilebilen katyonik gen dağıtım ajanı lipofectamin ile kompleksleştiğinde, floresan pozitif hücrelerin yüzdesinin% 80,% 98,% 97,% 85,% 78,% 65 olduğunu göstermiştir. Sırasıyla% 65 ve% 50 (aşağıdaki tabloya bakın). Floresan pozitif hücrelerin yüzdesi, nanoyapılar 10 ve 20 dakika boyunca ultrasonik kesme stresine maruz kaldığında artmış ve daha sonra yavaş yavaş azalmıştır.

İyonik sıvının [Bmim] [PF6] plazmid DNA'sının COS7 hücrelerine verilmesi üzerindeki etkisi. Plazmid DNA / IL (iyonik sıvı) nanokompleksleri, 120 dakikaya kadar ultrasonik kesme stresine maruz bırakıldı ve COS7 hücrelerine teslim edilmeden önce LA ile kompleksleştirildi. Veriler, 10 farklı mikroskobik alanda sayılan GFP pozitif HeLa hücrelerinin ortalama sayısını (%) göstermektedir ve deney üç farklı günde birden çok kez gerçekleştirilmiştir. (Çalışma ve grafik: ©Sarker ve ark., 2019)

Ultrasonik Lisat Hazırlama

Ultrasonik Hücre Lizis Protokolü
Bir hücre ayırma yöntemiyle (örneğin, immünomanyetik hücre ayırma, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS), yoğunluk gradyanı santrifüjleme, immünoyoğunluk hücre izolasyonu) ile hazırlanan zenginleştirilmiş bir hücre örneği ile başlayın.
Hücre örnekleri, deneysel amaç ve prob tipi ultrasonicator için uygun bir lizis tamponunun hacmini göstermelidir.
Hipotonik tamponlar, ultrasonik hücre lizisini arttırdıkları için tercih edilir. Katkı maddelerinin ve tuz konsantrasyonunun uygun şekilde kullanılması önemlidir.
Ultrasonik lizis cihazınızı seçin: Şişelerin dolaylı sonikasyonu için VialTweeter veya CupHorn önerilir. Multiwell-plakalar için, UIP400MTP ideal ultrasonicator olduğunu. Ve klasik prob tipi sonikasyon, bir mikro ucu ile UP100H veya UP200Ht olarak ultrasonik bir homojenizatör en uygun olanlardır.
Prob tipi sonication için protokol: Ultrasonicator probu bir mikrosantrifüj tüp içinde örnek hacmine yerleştirin ve yaklaşık 10 saniye boyunca sonikat. DNA örneğine bağlı olarak, sonikasyon bir veya iki kez daha tekrarlanabilir. Gerekli ultrasonik enerji girişi (Ws / mL) örnek viskozitesine ve DNA tipine bağlıdır. Buz banyosu ve ultrasonicator titreşim modu ile soğutma, numunenin termal olarak bozulmasını önlemeye yardımcı olur.
Ultrasonik lizisten sonra, numune pelet kalıntılarını ayırmak için santrifüj edilir (lysed hücreler, çekirdekler ve lysed organeller içeren)
Numune hemen daha fazla işlenmezse, canlılığını korumak için uygun bir sıcaklıkta saklanabilir.

DNA Parçalanması için Ultrasonikatörler

Hielscher Ultrasonics DNA, RNA ve kromatin parçalanması için çeşitli ultrason tabanlı platformlar sunar. Bu farklı platformlar ultrasonik problar (sonotrodes), birden fazla tüp veya çok kuyulu plakaların (örneğin, 96 kuyu plakaları, mikrotiter plakalar), sonoreactors ve ultrasonik cuphorns eşzamanlı numune hazırlanması için dolaylı sonication çözümleri içerir. DNA kesme için tüm platformlar, hassas bir şekilde kontrol edilebilen ve tekrarlanabilir sonuçlar sunan frekans ayarlı, yüksek performanslı ultrasonik işlemciler tarafından desteklenmektedir.

Herhangi Bir Örnek Numarası ve Boyutu için Ultrasonik İşlemciler

Hielscher'ın çok örnekli ultrasonicators VialTweeter (10 test tüpüne kadar) ve UIP400MTP (mikroplakalar / multiwell plakalar için) ile istenen DNA parça boyutu dağılımını ve verimini elde ederken yoğun ve hassas bir şekilde kontrol edilebilir ultrasonikasyon nedeniyle numune işleme süresini azaltmak kolayca mümkün hale gelir. Ultrasonik DNA parçalanması, plazmid hazırlama adımlarını verimli, güvenilir ve ölçeklenebilir hale getirir. Protokoller, sabit ultrason parametreleri uygulanarak bir numuneden çok sayıda örneğe doğrusal olarak ölçeklendirilebilir.
Bir ila beş parmaklı prob ultrasonicators daha küçük örnek numaralarının hazırlanması için idealdir. Hielscher'ın laboratuar ultrasonicators DNA ile ilgili uygulama için ideal ultrasonik bozucu seçebilirsiniz böylece farklı güç düzeyleri ile mevcuttur.