Ultrasonikasyon ile Plazmid Hazırlama

Ultrasonikasyon, plazmid DNA’yı parçalamak için güvenilir bir tekniktir. Hassas biçimde kontrol edilebilen genlik, darbeli çalışma modu ve sıcaklık kontrolü, plazmidlerin zarar görmeden parçalanması için bir sonikatörün en önemli özellikleridir. Ayrıca belirli ajanların kullanımı, plazmidlerin bozunmaya karşı korunmasına yardımcı olur. Hielscher Ultrasonics, tek tek viyallerde kontrollü plazmid parçalama, çok sayıda numunenin eş zamanlı sonikasyonu ve çok kuyucuklu plakalar için çeşitli çözümler sunar. Başarılı ultrasonik plazmid parçalama hakkında daha fazla bilgi edinin!

Ultrasonikasyon ile Plazmid Kesme

DNA numuneleri ultrasonik dalgalara maruz bırakıldığında, ultrasonik olarak oluşturulan titreşimler sıvıda akustik kavitasyon meydana getirir; bu kavitasyon, yüksek molekül ağırlıklı DNA moleküllerini mekanik kuvvetlerle keser veya parçalar. Sonikasyon, yüksek çözünürlük elde etmek için küçük parça boyutlarının kesinlikle kritik olduğu Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP) gibi uygulamalar da dahil olmak üzere, toplu DNA kesme deneylerinde en yaygın kullanılan yöntemdir. (bkz. Tseng et al., 2012)
Plazmid DNA (pDNA), halka biçimiyle karakterize edilen ve bakterilerde ve bazı ökaryotlarda bulunan özel bir DNA biçimidir.
Süper sarmallı pDNA, otomatik dizileme ve transfeksiyon gibi sonraki işlem aşamalarında en iyi sonuçları verdiğinden, plazmid DNA’nın istenen biçimidir. Ultrasonikasyon, süper sarmallı pDNA dahil olmak üzere pDNA’yı başarıyla parçalamaya uygundur.
Thompson et al. (2008), süper sarmallı DNA’yı parçaladığı bilinen plazmid sonikasyonunun, dizilerin phred20 okuma uzunluklarını Beckman Coulter’ın kontrol şablonundan veya enzimatik olarak doğrusallaştırılmış plazmidlerden anlamlı ölçüde farklı olmayacak düzeye kadar iyileştirmenin etkili bir yolu olduğunu göstermiştir.

Plazmid Vektörlerinin Kullanımı

Plazmidler, genleri klonlamak, aktarmak ve değiştirmek için sıklıkla araç olarak kullanılır. Plazmidler bu amaçlarla deneysel olarak kullanıldığında vektör olarak adlandırılır. DNA parçaları veya genler bir plazmid vektörüne yerleştirilerek rekombinant plazmid adı verilen yapı oluşturulabilir. Plazmid vektörleri, rekombinant DNA’yı bir konak hücreye taşımak için taşıyıcı olarak kullanılır ve moleküler klonlamanın temel bir bileşenidir.
“Viral olmayan vektörler, çeşitli karmaşık hastalıkların tedavisinde gen terapisi için potansiyel kullanımları açısından kapsamlı biçimde araştırılmaktadır. Viral olmayan vektörler, plazmid DNA’yı fiziksel, kimyasal ve enzimatik bozunmaya karşı korur ve DNA molekülünü hedef bölgeye taşır. Örneğin katyonik lipozomlar, kitosan ve diğer pozitif yüklü nanopartiküller, elektrostatik etkileşimler yoluyla plazmid DNA ile kompleksler oluşturur. Ancak kolayca oluşan katyonik lipozom/plazmid DNA kompleksleri nispeten büyüktür (yani 300–400 nm) ve yapıları heterojendir; bu da farmasötik uygulamalarda kullanılmalarını zorlaştırır. Büyük ve heterojen plazmid DNA/lipozom, plazmid DNA/aerosol ve plazmid DNA/peptit kompleksleri, ultrasonikasyon kullanılarak daha küçük ve homojen partiküllere indirgenebilir.” (Sarker et al., 2019)
Plazmid vektörlerinin kullanımına ilişkin öne çıkan bir örnek CRISPR–Cas9’dur. CRISPR–Cas9 sistemi hücrelere tipik olarak bir hedef diziyi, bir CRISPR kılavuzunu ve Cas9’u kodlayan tek bir büyük plazmid veya birden fazla küçük plazmid biçiminde taşınır.

Nanopresipitasyon Yoluyla DNA Yüklü PLGA Nanopartiküllerinin Ultrasonik Hazırlanması

Jo et al. (2020), model bir CRISPR–Cas9 plazmidinin kemik iliğinden türetilmiş primer makrofajlara taşınması için bir nanopartikül taşıyıcısı oluşturmak amacıyla poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) kullanmıştır. PLGA nanopartiküllerinin nanopresipitasyonu için, pozitif yüklü amin uç grupları ile DNA’nın negatif yüklü omurgası arasındaki yük etkileşimleri sayesinde bu uç gruplarının enkapsülasyon verimliliğini ve yüklemeyi artırması amacıyla, iki farklı uç grubuna (ester ve amin grupları) sahip PLGA kullanılmıştır. 50 mL’lik polipropilen konik bir santrifüj tüpünde, 100 mg Pluronic F127, 20 mL otoklavlanmış deiyonize suda vorteksle karıştırılarak çözündürülmüş, ardından ultrasonik banyo kullanılarak 30 min süreyle hafif sonikasyon uygulanmıştır (bkz. CupHorn). Otoklavlanmış bir manyetik karıştırma çubuğu eklenmiş ve diğer çözeltiler hazırlanırken çözelti 30 min boyunca 600 RPM’de karıştırılmıştır. DNA’nın özgül olmayan adsorpsiyonunu en aza indirmek için tüm işlem boyunca cam malzemeler yerine plastik laboratuvar malzemeleri kullanılmıştır. DMF içinde çözündürülmüş PLGA (44,48 mg/ ml) ve THF içinde çözündürülmüş TIPS pentasen (0,667 mg/ml) çözeltileri ayrı ayrı hazırlanmıştır. PLGA, 30 min süreyle sonikasyona tabi tutulmadan önce, DMF içinde ıslanması için 30 min boyunca hareketsiz bırakılmıştır. (tam protokol için bkz. Jo et al., 2020)

Sonikasyon Sırasında Plazmid DNA’nın Korunması

Plazmidler ve süper sarmallı plazmidler dahil olmak üzere DNA, bozunmaya karşı oldukça hassastır. Mevcut tüm parçalama yöntemlerinin belirli dezavantajları olduğu bilinmektedir. Kontrollü sonikasyon, koruyucu önlemlerle birlikte DNA zincirlerinde kesme ve ısı kaynaklı hasarı azaltmaya olanak tanıdığından, ultrasonik DNA parçalama tercih edilen yöntemlerden biridir.
Ultrasonik DNA kesme sırasında düşük genlik ayarları, darbeli çalışma modu ve sıcaklık kontrolünün yanı sıra, belirli ajanların kullanımı da DNA bozunmasına karşı belirgin bir koruyucu etki göstermiştir. Örneğin çeşitli polimerler, peptitler ve lipitler, ultrasonikasyon sırasında plazmid DNA’yı korur.

Plazmid DNA’nın ve plazmid DNA/IL nanokomplekslerinin ultrasonik kesme gerilimine karşı kararlılığı, agaroz jel elektroforezi analizi kullanılarak araştırılmıştır. Hem plazmid DNA hem de plazmid DNA/IL nanokompleksleri farklı süreler boyunca ultrasonik kesme gerilimine maruz bırakılmıştır. Plazmid DNA, 0, 10, 20, 30 ve 40 dakika boyunca ultrasonik kesme gerilimine maruz bırakılmıştır. Buna karşılık plazmid DNA/IL nanokompleksleri, 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ve 120 dakika boyunca ultrasonik kesme gerilimine maruz bırakılmıştır.
(çalışma ve görsel: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019), plazmid DNA / iyonik sıvı (pDNA/IL) nanoyapıları 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ve 120 min boyunca ultrasonik kesme gerilimine maruz bırakılıp ticari olarak temin edilebilen katyonik gen taşıma ajanı lipofektamin ile kompleksleştirildiğinde, floresans pozitif hücrelerin yüzdesinin sırasıyla %80, %98, %97, %85, %78, %65, %65 ve %50 olduğunu göstermiştir (aşağıdaki grafiğe bakın). Nanoyapılar 10 ve 20 min boyunca ultrasonik kesme gerilimine maruz bırakıldığında floresans pozitif hücrelerin yüzdesi artmış, daha sonra yavaşça azalmıştır.

İyonik sıvı [Bmim][PF6] ‘nın plazmid DNA’nın COS7 hücrelerine taşınması üzerindeki etkisi. Plazmid DNA/IL (iyonik sıvı) nanokompleksleri, COS7 hücrelerine taşınmadan önce 120 dakikaya kadar ultrasonik kesme gerilimine maruz bırakılmış ve LA ile kompleksleştirilmiştir. Veriler, 10 farklı mikroskobik alanda sayılan GFP pozitif HeLa hücrelerinin ortalama sayısını (%) göstermektedir ve deney üç farklı günde birden çok kez gerçekleştirilmiştir. (Çalışma ve grafik: ©Sarker et al., 2019)

Ultrasonik Lizat Hazırlama

Ultrasonik Hücre Lizisi Protokolü
Bir hücre ayırma yöntemiyle (örneğin immünomanyetik hücre ayırma, floresansla aktive edilen hücre ayırma (FACS), yoğunluk gradyanı santrifüjlemesi, immün yoğunlukla hücre izolasyonu) hazırlanmış, zenginleştirilmiş bir hücre numunesiyle başlayın.
Hücre numuneleri, deneysel amaca ve prob tipi sonikatöre uygun hacimde lizis tamponu içermelidir.
Ultrasonik hücre lizisini artırdıkları için hipotonik tamponlar tercih edilir. Katkı maddelerinin ve tuz konsantrasyonunun uygun biçimde kullanılması önemlidir.
Ultrasonik lizis cihazınızı seçin: Viyallerin dolaylı sonikasyonu için VialTweeter veya CupHorn önerilir. Çok kuyucuklu plakalar için UIP400MTP ideal sonikatördür. Klasik prob tipi sonikasyon için ise mikro uçlu UP100H veya UP200Ht gibi bir ultrasonik homojenizatör en uygun seçenektir.
Prob tipi sonikasyon protokolü: Sonikatör probunu bir mikrosantrifüj tüpündeki numune hacmine yerleştirin ve yaklaşık 10 saniye boyunca sonikasyon uygulayın. DNA numunesine bağlı olarak sonikasyon bir veya iki kez daha tekrarlanabilir. Gerekli ultrasonik enerji girdisi (Ws/mL), numunenin viskozitesine ve DNA tipine bağlıdır. Buz banyosuyla soğutma ve sonikatörün darbeli çalışma modu, numunenin termal olarak bozunmasını önlemeye yardımcı olur.
Ultrasonik lizisten sonra numune, çökelti kalıntılarını (lizise uğramamış hücreleri, çekirdekleri ve lizise uğramamış organelleri içeren) ayırmak için santrifüjlenir.
Numune hemen sonraki işlemlere tabi tutulmayacaksa, canlılığını korumak için uygun bir sıcaklıkta saklanabilir, saklanabilir.

DNA Parçalama için Sonikatörler

Hielscher Ultrasonics, DNA, RNA ve kromatin parçalama için çeşitli ultrason temelli platformlar sunar. Bu farklı platformlar; ultrasonik probları (sonotrotları), birden fazla tüpün veya çok kuyucuklu plakanın (örneğin 96 kuyucuklu plakalar, mikrotitre plakaları) eş zamanlı numune hazırlığı için dolaylı sonikasyon çözümlerini, sonoreaktörleri ve ultrasonik cuphornları içerir. DNA kesme için kullanılan tüm platformlar, hassas biçimde kontrol edilebilen ve tekrarlanabilir sonuçlar sunan, frekans ayarlı, yüksek performanslı ultrasonik işlemcilerle çalışır.

Her Numune Sayısı ve Boyutu için Ultrasonik İşlemciler

Hielscher çok numuneli sonikatörleri VialTweeter (10 adede kadar deney tüpü için) ve UIP400MTP (mikroplakalar/çok kuyucuklu plakalar için) ile, yoğun ve hassas biçimde kontrol edilebilen ultrasonikasyon sayesinde numune işleme süresini azaltmak ve aynı zamanda istenen DNA parça boyutu dağılımını ve verimini elde etmek kolayca mümkün olur. Ultrasonik DNA parçalama, plazmid hazırlama adımlarını verimli, güvenilir ve ölçeklenebilir hale getirir. Sabit ultrason parametreleri uygulanarak protokoller tek bir numuneden çok sayıda numuneye doğrusal olarak ölçeklenebilir.
Bir ila beş parmaklı prob sonikatörleri, daha az sayıda numunenin hazırlanması için idealdir. Hielscher laboratuvar sonikatörleri farklı güç seviyelerinde sunulduğundan, DNA ile ilgili uygulamanız için ideal ultrasonik parçalayıcıyı seçebilirsiniz.