Ultrasonikasyon kullanarak Plazmid Hazırlama
Ultrasonication, plazmid DNA'yı parçalamak için güvenilir bir tekniktir. Hassas bir şekilde kontrol edilebilir genlik, nabız modu ve sıcaklık kontrolü, zarar vermeyen plazmid parçalanması için bir ultrasonicator'ın en önemli özellikleridir. Ek olarak, bazı ajanların kullanımı plazmit bozulmasına karşı korunmaya yardımcı olur. Hielscher Ultrasonics, tek şişelerden kontrollü plazmid parçalanması için çeşitli çözümler sunar, aynı anda çok sayıda numunenin yanı sıra çok kuyulu plakaların sonikasyonu. Başarılı ultrasonik plazmid parçalanması hakkında daha fazla bilgi edinin!
The UIP400MTP Çok kuyulu plakaların hassas bir şekilde kontrol edilen ultrasonikasyonuna izin verir. UIP400MTP uygulamalarından biri, özel olarak hedeflenen uzunlukta fragmanlar elde etmek için plazmit DNA'nın parçalanmasıdır.
Ultrasonikasyon kullanarak Plazmid Kesme
DNA örnekleri ultrasonik dalgalara maruz kaldığında, ultrasonik olarak üretilen titreşimler, mekanik kuvvetler yoluyla yüksek moleküler ağırlıklı DNA moleküllerini kesen veya kıran sıvıda akustik kavitasyon oluşturur. Sonikasyon, yüksek çözünürlük elde etmek için küçük parça boyutlarının kesinlikle çok önemli olduğu Kromatin İmmünopresipitasyon (ChIP) gibi uygulamalar da dahil olmak üzere toplu DNA kesme deneyleri için en yaygın kullanılan yöntemdir. (bkz. Tseng ve diğerleri, 2012)
Plazmid DNA (pDNA), halka şekli ile karakterize edilen ve bakterilerde ve bazı ökaryotlarda bulunan spesifik bir DNA şeklidir.
Süper sarmal pDNA, otomatik dizileme ve transfeksiyon gibi aşağı akış işlemlerinde en iyi sonuçları gösterdiği için istenen plazmit DNA formudur. Ultrasonication, süper sarmal pDNA da dahil olmak üzere pDNA'yı başarıyla parçalamak için uygundur.
Thompson ve ark. (2008), süper sarmal DNA'yı parçaladığı bilinen plazmit sonikasyonunun, dizi phred20 okuma uzunluklarını, Beckman Coulter'ın kontrol şablonundan veya enzimatik olarak doğrusallaştırılmış plazmitlerden önemli ölçüde farklı olmadıkları noktaya kadar iyileştirmenin etkili bir yolu olduğunu göstermiştir.
- Hassas bir şekilde kontrol edilebilir
- Tekrarlanabilir sonuçlar
- Hedef DNA parçası uzunluklarına göre ayarlanabilir
- Sıcaklık kontrolü
- Herhangi bir örnek boyutuna göre ölçeklendirilebilir
Plazmid Vektörlerinin Kullanımı
Plazmitler genellikle genleri klonlamak, aktarmak ve manipüle etmek için araçlar olarak kullanılır. Plazmitler bu amaçlar için deneysel olarak kullanıldığında vektörler olarak adlandırılırlar. DNA fragmanları veya genleri, rekombinant plazmit adı verilen bir plazmit oluşturarak bir plazmit vektörüne yerleştirilebilir. Plazmid vektörleri, rekombinant DNA'yı bir konakçı hücreye sürmek için araçlar olarak kullanılır ve moleküler klonlamanın önemli bir bileşenidir.
“Viral olmayan vektörler, çeşitli karmaşık hastalıkları tedavi etmek için gen terapisinde potansiyel kullanımları açısından kapsamlı bir şekilde incelenmektedir. Viral olmayan vektörler, plazmit DNA'yı fiziksel, kimyasal ve enzimatik bozulmaya karşı korur ve DNA molekülünü hedef bölgeye iletir. Örneğin, katyonik lipozomlar, kitosan ve diğer pozitif yüklü nanopartiküller, elektrostatik etkileşimler yoluyla plazmit DNA ile kompleksler oluşturur. Bununla birlikte, kolayca oluşan katyonik lipozomlar/plazmid DNA kompleksleri nispeten büyüktür (yani 300-400 nm) ve doğası gereği heterojendir, bu da farmasötik uygulamalarda kullanımlarını zorlaştırır. Büyük ve heterojen plazmit DNA / lipozomlar, plazmit DNA / aerosoller ve plazmit DNA / peptit kompleksleri, ultrasonikasyon kullanılarak daha küçük ve homojen parçacıklara indirgenebilir.” (Sarker ve ark., 2019)
Plazmit vektörlerinin kullanımı için öne çıkan bir örnek CRISPR-Cas9'dur. CRISPR-Cas9 sistemi tipik olarak hücrelere tek bir büyük plazmit veya bir hedef diziyi, bir CRISPR kılavuzunu ve Cas9'u kodlayan birden fazla küçük plazmit olarak iletilir.
DNA Yüklü PLGA Nanopartiküllerin Nanoçökeltme ile Ultrasonik Hazırlanması
Jo ve ark. (2020), bir model CRISPR-Cas9 plazmidinin birincil kemik iliği türevi makrofajlara verilmesi için bir nanopartikül taşıyıcı oluşturmak üzere poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) kullandı. PLGA nanopartiküllerinin nanoçökeltilmesi için, pozitif yüklü amin uç kapaklarının, kendisi ile DNA'nın negatif yüklü omurgası arasındaki yük etkileşimleri nedeniyle kapsülleme verimliliğini ve yüklemeyi artırması amacıyla iki farklı uç gruba (ester ve amin grupları) sahip PLGA kullanılmıştır. 50 mL'lik bir polipropilen konik santrifüj tüpünde, 100 mg Pluronic F127, 20 mL otoklavlanmış DI su içinde girdap karıştırma ile çözüldü ve ardından ultrasonik bir banyo kullanılarak 30 dakikalık hafif sonikasyon yapıldı (CupHorn'a bakın). Otoklavlanmış bir manyetik karıştırma çubuğu eklendi ve çözelti 600 RPM'de 30 dakika boyunca karıştırılırken, diğer çözeltiler yapıldı. DNA'nın spesifik olmayan adsorpsiyonunu en aza indirmek için cam eşya yerine plastik laboratuvar gereçleri kullanıldı. DMF (44.48 mg / ml) içinde çözünmüş PLGA ve THF (0.667 mg / ml) içinde çözünmüş TIPS pentasen çözeltileri ayrı ayrı yapıldı. PLGA, 30 dakika boyunca sonikasyona tabi tutulmadan önce 30 dakika boyunca DMF'de sessizce ıslanmaya bırakıldı. (tam protokol için bkz. Jo ve diğerleri, 2020)
- DNA'nın Ekstraksiyonu
- DNA'nın kapsüllenmesi
- Nanoparçacık kaplı DNA'nın dağılımı
- Plazmid DNA'nın hücrelere verilmesi
UP200St CupHorn, örneğin DNA ekstraksiyonu ve parçalanması için numunelerin dolaylı sonikasyonu için.
Sonikasyon sırasında Plazmid DNA Koruması
Plazmitler ve süper sarmal plazmitler dahil olmak üzere DNA oldukça hassas bozunmadır. Mevcut tüm parçalanma yöntemleri belirli dezavantajlarla bilinmektedir. Ultrasonik DNA parçalanması tercih edilen yöntemlerden biridir, çünkü koruyucu önlemlerle birlikte kontrollü sonikasyon, DNA ipliklerinin kesme ve ısı kaynaklı hasarını azaltmaya izin verir.
Ultrasonik DNA kesme sırasında düşük genlik ayarları, titreşim modu ve sıcaklık kontrolünün yanı sıra, bazı ajanların kullanımı DNA bozulmasına karşı önemli koruyucu etki göstermiştir. Örneğin, çeşitli polimerler, peptitler ve lipitler, ultrasonikasyon sırasında plazmit DNA'yı korur.
Plazmid DNA ve plazmid DNA / IL nanokomplekslerinin ultrasonik kesme stresine karşı stabilitesi, agaroz jel elektroforez testi kullanılarak araştırıldı. Hem plazmit DNA hem de plazmit DNA / IL nanokompleksleri, farklı zaman noktaları için ultrasonik kesme stresine maruz bırakıldı. Plazmid DNA, 0, 10, 20, 30 ve 40 dakika boyunca ultrasonik kesme stresine maruz bırakıldı. Bununla birlikte, plazmid DNA / IL nanokompleksleri 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ve 120 dakika boyunca ultrasonik kesme stresine maruz bırakıldı.
(çalışma ve resim: ©Sarker ve ark., 2019)
Sarker ve ark. (2019), plazmit DNA / iyonik sıvı (pDNA/IL) nanoyapılarının 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ve 120 dakika boyunca ultrasonik kesme gerilimine maruz kaldığında ve ticari olarak temin edilebilen katyonik gen dağıtım ajanı lipofektamin ile komplekslendiğinde, floresan pozitif hücrelerin yüzdesinin �, �, �, �, x, e, Sırasıyla e ve P (aşağıdaki tabloya bakın). Floresan pozitif hücrelerin yüzdesi, nanoyapılar 10 ve 20 dakika boyunca ultrasonik kesme stresine maruz kaldığında artmış ve daha sonra yavaş yavaş azalmıştır.
İyonik sıvının [Bmim][PF6] plazmit DNA'nın COS7 hücrelerine verilmesi üzerindeki etkisi. Plazmid DNA / IL (iyonik sıvı) nanokompleksleri, 120 dakikaya kadar ultrasonik kesme stresine tabi tutuldu ve COS7 hücrelerine verilmeden önce LA ile kompleks haline getirildi. Veriler, 10 farklı mikroskobik alanda sayılan GFP pozitif HeLa hücrelerinin ortalama sayısını (%) göstermektedir ve deney üç farklı günde birden çok kez gerçekleştirilmiştir. (Çalışma ve grafik: ©Sarker ve ark., 2019)
Plazmid DNA, ultrasonik parçalanmadan önce bir ajan eklenerek korunabilir: 1.5 mM CaCl2 ve% 20 (h / h) t-butanol (B) ile formüle edilmiş çıplak pDNA (A) ve pDNA'nın sonikasyona bağlı bozunması
Numuneler, her şeridin üstünde belirtildiği gibi, 120 saniyeye kadar 20W'lık bir prob ile sonikleştirildi. Şerit H, Hyperladder I ™️ işaretçisine karşılık gelir. OC ve SC plazmit bantları belirtilmiştir.
(çalışma ve resimler: ©Wu ve ark., 2009)
Ultrasonik Lizat Hazırlama
Ultrasonik Hücre Lizis Protokolü
Bir hücre ayırma yöntemi (örneğin, immünomanyetik hücre ayırma, floresanla aktive edilen hücre ayırma (FACS), yoğunluk gradyan santrifüjleme, immünoyoğunluk hücre izolasyonu) ile hazırlanan zenginleştirilmiş bir hücre örneği ile başlayın.
Hücre örnekleri, deneysel hedef ve prob tipi ultrasonicator için uygun bir lizis tamponu hacmi göstermelidir.
Hipotonik tamponlar, ultrasonik hücre lizizini arttırdıkları için tercih edilir. Katkı maddelerinin ve tuz konsantrasyonunun uygun bir şekilde kullanılması önemlidir.
Ultrasonik lizis cihazınızı seçin: Şişelerin dolaylı sonikasyonu için VialTweeter veya CupHorn önerilir. Çok kuyulu plakalar için, UIP400MTP ideal ultrasonikatördür. Ve klasik prob tipi sonikasyon, mikro uçlu UP100H veya UP200Ht gibi ultrasonik bir homojenizatör en uygun olanıdır.
Prob tipi sonikasyon için protokol: Ultrasonicator probunu bir mikrosantrifüj tüpündeki örnek hacmine yerleştirin ve yaklaşık 10 saniye boyunca sonikat yapın. DNA örneğine bağlı olarak, sonikasyon bir veya iki kez daha tekrarlanabilir. Gerekli ultrasonik enerji girişi (Ws / mL), numune viskozitesine ve DNA tipine bağlıdır. Ultrasonicator'ın buz banyosu ve titreşim modu ile soğutma, numunenin termal olarak bozulmasını önlemeye yardımcı olur.
Ultrasonik lizizden sonra, numune pelet kalıntılarını ayırmak için santrifüjlenir (parçalanmamış hücreler, çekirdekler ve parçalanmamış organeller içeren)
Numune hemen daha fazla işlenmezse, canlılığını korumak için uygun bir sıcaklıkta saklanabilir.
DNA parçalanması için ultrasonikatörler
Hielscher Ultrasonics, DNA, RNA ve kromatin parçalanması için çeşitli ultrason tabanlı platformlar sunar. Bu farklı platformlar arasında ultrasonik problar (sonotrodlar), çoklu tüplerin veya çok kuyulu plakaların (örneğin, 96 oyuklu plakalar, mikrotitre plakaları), sonoreaktörler ve ultrasonik küp boynuzlarının eşzamanlı numune hazırlanması için dolaylı sonikasyon çözümleri bulunur. DNA kesme için tüm platformlar, hassas bir şekilde kontrol edilebilen ve tekrarlanabilir sonuçlar veren frekans ayarlı, yüksek performanslı ultrasonik işlemciler tarafından desteklenmektedir.
Herhangi bir numune numarası ve boyutu için ultrasonik işlemciler
Hielscher'ın çok örnekli ultrasonicator'ları VialTweeter (10 test tüpüne kadar) ve UIP400MTP (mikroplakalar / çok kuyulu plakalar için) ile istenen DNA fragmanı boyutunu, dağılımını ve verimini elde ederken yoğun ve hassas bir şekilde kontrol edilebilir ultrasonikasyon nedeniyle örnek işleme süresini azaltmak kolayca mümkün hale gelir. Ultrasonik DNA parçalanması, plazmit hazırlama adımlarını verimli, güvenilir ve ölçeklenebilir hale getirir. Protokoller, sabit ultrason parametreleri uygulanarak bir numuneden çok sayıda örneğe doğrusal olarak ölçeklendirilebilir.
Bir ila beş parmaklı prob ultrasonicators, daha küçük numune sayılarının hazırlanması için idealdir. Hielscher'ın laboratuar ultrasonicators, DNA ile ilgili uygulamanız için ideal ultrasonik bozucuyu seçebilmeniz için farklı güç seviyelerinde mevcuttur.
Ultrasonik çoklu numune hazırlama ünitesi VialTweeter 10 şişeye kadar eşzamanlı sonikasyona izin verir. Kelepçeli cihaz VialPress ile, yoğun sonikasyon için öne 4 adede kadar ek tüp bastırılabilir.
Hassas proses kontrolü
Hassas bir şekilde kontrol edilebilir sonikasyon ayarları çok önemlidir, çünkü kapsamlı sonifikasyon DNA, RNA ve kromatini yok edebilir, ancak yetersiz ultrasonik kesme çok uzun DNA ve kromatin fragmanlarına neden olur. Hielscher'ın dijital ultrasonicators kolayca hassas sonication parametresine ayarlanabilir. Belirli sonikasyon ayarları, aynı prosedürün hızlı bir şekilde tekrarlanması için programlanmış ayar olarak da kaydedilebilir.
Tüm sonikasyon otomatik olarak protokollenir ve yerleşik bir SD kartta CSV dosyası olarak saklanır. Bu, gerçekleştirilen denemelerin doğru bir şekilde belgelenmesini sağlar ve sonikasyon çalışmalarını kolayca revize etmeyi mümkün kılar.
Tarayıcı uzaktan kumandası sayesinde, tüm dijital ultrasonicators herhangi bir standart tarayıcı üzerinden çalıştırılabilir ve izlenebilir. LAN bağlantısı çok basit bir tak ve çalıştır kurulumu olduğu için ek yazılımın yüklenmesi gerekli değildir.
Ultrasonik DNA Hazırlama Sırasında En Yüksek Kullanıcı Dostu
Tüm Hielscher ultrasonicators, yüksek performanslı ultrason sunmak için tasarlanmıştır, aynı zamanda her zaman çok kullanıcı dostu ve kullanımı kolaydır. Tüm ayarlar, renkli dokunmatik ekran veya tarayıcı uzaktan kumandası ile kolayca erişilebilen net bir menüde iyi yapılandırılmıştır. Programlanabilir ayarlara ve otomatik veri kaydına sahip akıllı yazılım, güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar için en uygun sonikasyon ayarlarını sağlar. Temiz ve kullanımı kolay menü arayüzü, Hielscher ultrasonicators'ı kullanıcı dostu ve verimli cihazlara dönüştürür.
Aşağıdaki tablo, hücre lizisi ve DNA parçalanması için laboratuvar ultrasonicators'ımızın yaklaşık işlem kapasitesinin bir göstergesini vermektedir:
| Numune Hacmi | Akış Oranı | Önerilen Cihaz |
|---|---|---|
| çok kuyulu plakalar | Yok | UIP400MTP |
| şişeler, küçük beher | Yok | Ultrasonik CupHorn |
| 10 şişeye kadar | Yok | VialTweeter |
| 1 - 500mL | 10 - 200mL/min | UP100H |
| 10 - 2000mL | 20 - 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
Bizimle İletişime Geçin! / Bize Sor!
Literatür / Referanslar
- Mark D. Thompson, Kelly G. Aukema, Dana M. O’Bryan, Stephen D. Rader, Brent W. Murray (2008): Plasmid sonication improves sequencing efficiency and quality in the Beckman Coulter CEQ system. BioTechniques 2008, 45:3, 327-329
- Fykse, Else; Olsen, Jaran; Skogan, Gunnar (2003): Application of sonication to release DNA from Bacillus cereus for quantitative detection by real-time PCR. Journal of microbiological methods 55, 2003. 1-10.
- Ming L. Wu; Sindélia S. Freitas; Gabriel A. Monteiro; Duarte M. F. Prazeres; José A. L. Santos (2009). Stabilization of naked and condensed plasmid DNA against degradation induced by ultrasounds and high-shear vortices. Biotechnology Applied Biochemistry 53(4), 2009.
- Sarker, Satya Ranjan; Ball, Andrew S.; Bhargava, Suresh Kumar; Soni., Sarvesh K. (2019): Evaluation of plasmid DNA stability against ultrasonic shear stress and its in vitro delivery efficiency using ionic liquid [Bmim][PF6]. RSC Advances 9, 2019. 29225-29231.
- Miguel Larguinho, Hugo M. Santos, Gonçalo Doria, H. Scholz, Pedro V. Baptista, José L. Capelo (2010): Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta, Volume 81, Issue 3, 2010. 881-886.
- Julie Ann Wyber; Julie Andrews; Antony D’Emanuele (1997): The Use of Sonication for the Efficient Delivery of Plasmid DNA into Cells. Pharmaceutical Research 14(6), 1997. 750–756.
Bilmeye Değer Gerçekler
Plazmidler nedir?
Bir plazmit, kromozomal DNA'dan fiziksel olarak ayrı olan ve bağımsız olarak çoğalan küçük dairesel bir DNA molekülüdür. Plazmitler genellikle bir organizmanın hayatta kalmasına katkıda bulunan ve antibiyotik direnci gibi belirli avantajlar sağlayan genlerle ilişkilidir. Plazmitler en yaygın olarak bakterilerde küçük dairesel, çift sarmallı DNA molekülleri olarak bulunur; Bununla birlikte, plazmitler bazen arkelerde ve ökaryotik organizmalarda bulunur. Plazmitler moleküler biyoloji, genetik, biyokimya ve yaşam bilimlerinde önemli araçlardır. Genetik mühendisliğinde vektörler olarak bilinen plazmitler, belirli genleri çoğaltmak veya ifade etmek için kullanılır. Bir vektörün hedeflenen değişikliğine vektör tasarımı denir.
Hücre Araştırmalarında GFP Analizi
Yeşil Floresan Protein (GFP), fizyolojik süreçleri izlemek, protein lokalizasyonunu görselleştirmek ve in vivo transgenik ekspresyonunu tespit etmek için çok yönlü bir biyolojik belirteçtir. GFP, 488 nm lazer çizgisi tarafından uyarılabilir ve 510 nm'de en iyi şekilde algılanır.
Hielscher Ultrasonics, yüksek performanslı ultrasonik homojenizatörler üretmektedir. laboratuvar Hedef endüstriyel boyut.