Ultrasonication kullanarak Plazmid Hazırlama

Ultrasonication plazmid DNA parçalamak için güvenilir bir tekniktir. Hassas bir şekilde kontrol edilebilen genlik, nabız modu ve sıcaklık kontrolü, zarar vermeyen plazmid parçalanması için bir ultrasonicator'un en önemli özellikleridir. Ek olarak, bazı ajanların kullanımı plazmid bozulmasına karşı korunmaya yardımcı olur. Hielscher Ultrasonics, tek şişelerden kontrollü plazmid parçalanması, aynı anda çok sayıda numunenin yanı sıra çok kuyulu plakaların sonikasyonu için çeşitli çözümler sunar. Başarılı ultrasonik plazmid parçalanması hakkında daha fazla bilgi edinin!

Bilgi talebi





Ultrasonik DNA parçalanması, Yeni Nesil Dizilemede (NGS) yaygın olarak kullanılan güvenilir ve verimli bir tekniktir.

The UIP400MTP çok kuyulu plakaların hassas bir şekilde kontrol edilen ultrasonikasyonuna izin verir. UIP400MTP'nin uygulamalarından biri, özel olarak hedeflenen uzunlukta fragmanlar elde etmek için plazmid DNA'sının parçalanmasıdır.

Ultrasonication kullanarak Plazmid Kesme

DNA örnekleri ultrasonik dalgalara maruz kaldığında, ultrasonik olarak üretilen titreşimler, mekanik kuvvetler yoluyla yüksek moleküler ağırlıklı DNA moleküllerini kesen veya kıran sıvıda akustik kavitasyon oluşturur. Sonikasyon, yüksek çözünürlük elde etmek için küçük parça boyutlarının kesinlikle çok önemli olduğu Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) gibi uygulamalar da dahil olmak üzere toplu DNA kesme deneyleri için en yaygın kullanılan yöntemdir. (Bkz. Tseng ve ark., 2012)
Plazmid DNA'sı (pDNA), halka şekli ile karakterize edilen ve bakterilerde ve bazı ökaryotlarda bulunan DNA'nın spesifik bir şeklidir.
Süper sarmal pDNA, otomatik dizileme ve transfeksiyon gibi aşağı akış işlemlerinde en iyi sonuçları gösterdiği için plazmid DNA'sının istenen şeklidir. Ultrasonication başarıyla süper sarmal pDNA da dahil olmak üzere pDNA parçalamak için uygundur.
Thompson ve ark. (2008), süper sarmal DNA'yı parçaladığı bilinen plazmid sonikasyonunun, sekans phred20 okuma uzunluklarını, Beckman Coulter'ın kontrol şablonundan veya enzimatik olarak doğrusallaştırılmış plazmidlerden önemli ölçüde farklı olmadıkları noktaya kadar iyileştirmenin etkili bir yolu olduğunu göstermiştir.

Ultrasonik DNA Parçalanmasının Avantajları

  • Tam kontrol edilebilir
  • Tekrarlanabilir sonuçlar
  • DNA fragman uzunluklarını hedeflemek için ayarlanabilir
  • sıcaklık kontrolü
  • Her örnek boyutuna göre ölçeklendirilebilir
Video, yüksek yoğunluklu ultrason kullanarak herhangi bir standart çok kuyulu plakanın güvenilir numune hazırlanmasına izin veren ultrasonik numune hazırlama sistemi UIP400MTP'yi göstermektedir. UIP400MTP'nin tipik uygulamaları arasında hücre lizisi, DNA, RNA ve kromatin kesmenin yanı sıra protein ekstraksiyonu sayar.

Ultrasonicator UIP400MTP çok iyi plaka sonication için

Plazmid Vektörlerinin Kullanımı

Plazmidler genellikle genleri klonlamak, aktarmak ve manipüle etmek için araçlar olarak kullanılır. Plazmidler bu amaçlar için deneysel olarak kullanıldığında, vektör olarak adlandırılırlar. DNA fragmanları veya genleri bir plazmid vektörüne yerleştirilebilir ve rekombinant plazmid olarak adlandırılır. Plazmid vektörleri, rekombinant DNA'yı bir konakçı hücreye sürmek için araçlar olarak kullanılır ve moleküler klonlamanın önemli bir bileşenidir.
“Viral olmayan vektörler, çeşitli karmaşık hastalıkları tedavi etmek için gen terapisinde potansiyel kullanımları için kapsamlı bir şekilde çalışılmaktadır. Viral olmayan vektörler, plazmid DNA'sını fiziksel, kimyasal ve enzimatik bozunmaya karşı korur ve DNA molekülünü hedef bölgeye iletir. Örneğin, katyonik lipozomlar, kitosan ve diğer pozitif yüklü nanopartiküller, elektrostatik etkileşimler yoluyla plazmid DNA'sı ile kompleksler oluşturur. Bununla birlikte, kolayca oluşan katyonik lipozomlar / plazmid DNA kompleksleri nispeten büyüktür (yani, 300-400 nm) ve doğada heterojendir, bu da farmasötik uygulamalarda kullanılmalarını zorlaştırır. Büyük ve heterojen plazmid DNA / lipozomlar, plazmid DNA / aerosoller ve plazmid DNA / peptit kompleksleri ultrasonikasyon kullanılarak daha küçük ve homojen parçacıklara indirgenebilir.” (Sarker ve ark., 2019)
Plazmid vektörlerinin kullanımı için belirgin bir örnek CRISPR-Cas9'dur. CRISPR-Cas9 sistemi tipik olarak hücrelere tek bir büyük plazmid veya bir hedef dizisini, bir CRISPR kılavuzunu ve Cas9'u kodlayan birden fazla küçük plazmid olarak teslim edilir.

Nanoçökeltme ile DNA yüklü PLGA Nanopartiküllerin Ultrasonik Hazırlanması

Jo ve ark. (2020), bir model CRISPR-Cas9 plazmidinin birincil kemik iliği kaynaklı makrofajlara verilmesi için bir nanopartikül taşıyıcısı oluşturmak üzere poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) kullanmıştır. PLGA nanopartiküllerinin nanoçökelmesi için, iki farklı uç gruba (ester ve amin grupları) sahip PLGA, pozitif yüklü amin uç kapaklarının, DNA'nın negatif yüklü omurgası ile arasındaki yük etkileşimleri nedeniyle kapsülleme verimliliğini ve yüklemeyi arttırması amacıyla kullanılmıştır. 50 mL'lik bir polipropilen konik santrifüj tüpünde, 100 mg Pluronik F127, vorteks karıştırma ile 20 mL otoklavlanmış DI suyunda çözüldü ve ardından ultrasonik bir banyo kullanılarak 30 dakikalık nazik sonikasyon (CupHorn'a bakın). Otoklavlanmış bir manyetik karıştırma çubuğu eklendi ve diğer çözeltiler yapılırken çözelti 600 RPM'de 30 dakika boyunca karıştırıldı. DNA'nın spesifik olmayan adsorpsiyonunu en aza indirmek için cam eşya yerine plastik laboratuvar gereçleri kullanıldı. DMF'de çözünmüş PLGA (44.48 mg / ml) ve THF'de çözünmüş TIPS pentasen (0.667 mg / ml) çözeltileri ayrı ayrı yapıldı. PLGA, 30 dakika boyunca sonikleştirilmeden önce DMF'de 30 dakika boyunca sessiz bir şekilde ıslatılmaya bırakıldı. (tam protokol için bakınız Jo ve ark., 2020)

İlgili uygulamalar:

  • DNA'nın ekstraksiyonu
  • DNA'nın kapsüllenmesi
  • Nanopartikül kaplı DNA'nın dispersiyonu
  • Plazmid DNA'sının hücrelere verilmesi
ÖRNEKLERİn dolaylı sonication için UP200St TD_CupHorn

Örneklerin dolaylı sonikasyonu için UP200St CupHorn, örneğin DNA ekstraksiyonu ve parçalanması için.

Bilgi talebi





Sonication sırasında Plazmid DNA Koruması

Plazmidler ve süper sarmal plazmidler dahil olmak üzere DNA oldukça hassas bir bozunmadır. Mevcut tüm parçalanma yöntemleri bazı dezavantajları için bilinmektedir. Ultrasonik DNA parçalanması, koruyucu önlemlerle birlikte kontrollü sonikasyon, DNA iplikçiklerinin kesme ve ısıya bağlı hasarını azaltmaya izin verdiği için tercih edilen yöntemlerden biridir.
Ultrasonik DNA kesme sırasında düşük genlik ayarları, nabız modu ve sıcaklık kontrolünün yanı sıra, bazı ajanların kullanımı DNA bozulmasına karşı önemli koruyucu etki göstermiştir. Örneğin, çeşitli polimerler, peptitler ve lipitler ultrasonikasyon sırasında plazmid DNA'sını korur.

İyonik sıvılar, plazmid DNA'sını sonikasyon sırasında hasarlara karşı koruyabilir.

Plazmid DNA'sının ve plazmid DNA / IL nanokomplekslerinin ultrasonik kesme stresine karşı stabilitesi agaroz jel elektroforez testi kullanılarak araştırıldı. Hem plazmid DNA'sı hem de plazmid DNA / IL nanokompleksleri, farklı zaman noktaları için ultrasonik kesme stresine maruz bırakıldı. Plazmid DNA'sı 0, 10, 20, 30 ve 40 dakika boyunca ultrasonik kesme stresine maruz kaldı. Bununla birlikte, plazmid DNA / IL nanokompleksleri 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ve 120 dakika boyunca ultrasonik kesme stresine maruz bırakıldı.
(çalışma ve resim: ©Sarker ve ark., 2019)

Sarker ve ark. (2019), plazmid DNA / iyonik sıvı (pDNA / IL) nanoyapıları 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ve 120 dakika boyunca ultrasonik kesme stresine maruz kaldığında ve ticari olarak temin edilebilen katyonik gen dağıtım ajanı lipofectamin ile kompleksleştiğinde, floresan pozitif hücrelerin yüzdesinin% 80,% 98,% 97,% 85,% 78,% 65 olduğunu göstermiştir. Sırasıyla% 65 ve% 50 (aşağıdaki tabloya bakın). Floresan pozitif hücrelerin yüzdesi, nanoyapılar 10 ve 20 dakika boyunca ultrasonik kesme stresine maruz kaldığında artmış ve daha sonra yavaş yavaş azalmıştır.

Plazmid DNA'sının ultrasonik parçalanması

İyonik sıvının [Bmim] [PF6] plazmid DNA'sının COS7 hücrelerine verilmesi üzerindeki etkisi. Plazmid DNA / IL (iyonik sıvı) nanokompleksleri, 120 dakikaya kadar ultrasonik kesme stresine maruz bırakıldı ve COS7 hücrelerine teslim edilmeden önce LA ile kompleksleştirildi. Veriler, 10 farklı mikroskobik alanda sayılan GFP pozitif HeLa hücrelerinin ortalama sayısını (%) göstermektedir ve deney üç farklı günde birden çok kez gerçekleştirilmiştir. (Çalışma ve grafik: ©Sarker ve ark., 2019)

Plazmid DNA, ultrasonik parçalanmadan önce bir ajan ekleyerek korunabilir.

Plazmid DNA, ultrasonik parçalanmadan önce bir ajan ekleyerek korunabilir: Çıplak pDNA (A) ve 1.5 mM CaCl2 ve% 20 (v / v) t-butanol (B) ile formüle edilmiş pDNA'nın sonikasyona bağlı bozulması
Numuneler, her şeridin üstünde belirtildiği gibi, 120'lere kadar 20W'lık bir prob ile sonikleştirildi. Şerit H, Hyperladder I ™️ işaretleyicisine karşılık gelir. OC ve SC plazmid bantları belirtilir.
(çalışma ve resimler: ©Wu ve ark., 2009)

Ultrasonik Lisat Hazırlama

Ultrasonik Hücre Lizis Protokolü
Ultrasonicator UP200Ht mikrotip S26d2 biyolojik örneklerin ultrasonik liziz içinBir hücre ayırma yöntemiyle (örneğin, immünomanyetik hücre ayırma, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS), yoğunluk gradyanı santrifüjleme, immünoyoğunluk hücre izolasyonu) ile hazırlanan zenginleştirilmiş bir hücre örneği ile başlayın.
Hücre örnekleri, deneysel amaç ve prob tipi ultrasonicator için uygun bir lizis tamponunun hacmini göstermelidir.
Hipotonik tamponlar, ultrasonik hücre lizisini arttırdıkları için tercih edilir. Katkı maddelerinin ve tuz konsantrasyonunun uygun şekilde kullanılması önemlidir.
Ultrasonik lizis cihazınızı seçin: Şişelerin dolaylı sonikasyonu için VialTweeter veya CupHorn önerilir. Multiwell-plakalar için, UIP400MTP ideal ultrasonicator olduğunu. Ve klasik prob tipi sonikasyon, bir mikro ucu ile UP100H veya UP200Ht olarak ultrasonik bir homojenizatör en uygun olanlardır.
Prob tipi sonication için protokol: Ultrasonicator probu bir mikrosantrifüj tüp içinde örnek hacmine yerleştirin ve yaklaşık 10 saniye boyunca sonikat. DNA örneğine bağlı olarak, sonikasyon bir veya iki kez daha tekrarlanabilir. Gerekli ultrasonik enerji girişi (Ws / mL) örnek viskozitesine ve DNA tipine bağlıdır. Buz banyosu ve ultrasonicator titreşim modu ile soğutma, numunenin termal olarak bozulmasını önlemeye yardımcı olur.
Ultrasonik lizisten sonra, numune pelet kalıntılarını ayırmak için santrifüj edilir (lysed hücreler, çekirdekler ve lysed organeller içeren)
Numune hemen daha fazla işlenmezse, canlılığını korumak için uygun bir sıcaklıkta saklanabilir.

DNA Parçalanması için Ultrasonikatörler

Hielscher Ultrasonics DNA, RNA ve kromatin parçalanması için çeşitli ultrason tabanlı platformlar sunar. Bu farklı platformlar ultrasonik problar (sonotrodes), birden fazla tüp veya çok kuyulu plakaların (örneğin, 96 kuyu plakaları, mikrotiter plakalar), sonoreactors ve ultrasonik cuphorns eşzamanlı numune hazırlanması için dolaylı sonication çözümleri içerir. DNA kesme için tüm platformlar, hassas bir şekilde kontrol edilebilen ve tekrarlanabilir sonuçlar sunan frekans ayarlı, yüksek performanslı ultrasonik işlemciler tarafından desteklenmektedir.

Herhangi Bir Örnek Numarası ve Boyutu için Ultrasonik İşlemciler

Hielscher'ın çok örnekli ultrasonicators VialTweeter (10 test tüpüne kadar) ve UIP400MTP (mikroplakalar / multiwell plakalar için) ile istenen DNA parça boyutu dağılımını ve verimini elde ederken yoğun ve hassas bir şekilde kontrol edilebilir ultrasonikasyon nedeniyle numune işleme süresini azaltmak kolayca mümkün hale gelir. Ultrasonik DNA parçalanması, plazmid hazırlama adımlarını verimli, güvenilir ve ölçeklenebilir hale getirir. Protokoller, sabit ultrason parametreleri uygulanarak bir numuneden çok sayıda örneğe doğrusal olarak ölçeklendirilebilir.
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s lab ultrasonicators are available with different power levels so that you can choose the ideal ultrasonic disruptor for your DNA-related application.

The VialTweeter is a MultiSample Ultrasonicator that allows for reliable sample preparation under precisely controlled temperature conditions.

Ultrasonik çoklu numune hazırlama ünitesi VialTweeter en fazla 10 şişe eşzamanlı sonication sağlar. Kelepçe cihaz VialPress ile, en fazla 4 ek tüpler yoğun sonication için ön basılabilir.

kesin işlem kontrolü

Hielscher ultrasonicators tarayıcı kontrolü ile uzaktan kontrol edilebilir. Sonication parametreleri izlenebilir ve proses gereksinimlerine tam olarak ayarlanabilir.Tam olarak kontrol edilebilir sonication ayarları, kapsamlı sonifikasyon DNA, RNA ve kromatin yok edebilir, ancak yetersiz ultrasonik kesme çok uzun DNA ve kromatin parçaları ile sonuçlanır. Hielscher'ın dijital ultrasonicators kolayca hassas sonication parametre ayarlanabilir. Belirli sonication ayarları da aynı yordamın hızlı tekrarı için programlanmış ayar olarak kaydedilebilir.
Tüm sonication otomatik olarak protokollenir ve yerleşik bir SD kartta CSV dosyası olarak saklanır. Bu, gerçekleştirilen denemelerin doğru bir şekilde belgelenmesine izin verir ve sonication çalıştırmalarını kolayca gözden geçirmeyi mümkün kılar.
Tarayıcı uzaktan kumandası ile, tüm dijital ultrasonicators herhangi bir standart tarayıcı aracılığıyla çalıştırılabilir ve izlenebilir. LAN bağlantısı çok basit bir tak-çalıştır kurulumu olduğundan, ek yazılımların yüklenmesi gerekli değildir.

Ultrasonik DNA Hazırlama Sırasında En Yüksek Kullanıcı Dostu

Tüm Hielscher ultrasonicators yüksek performanslı ultrason sunmak için tasarlanmıştır, aynı zamanda her zaman çok kullanıcı dostu ve kullanımı kolay olmak. Tüm ayarlar, renkli dokunmatik ekran veya tarayıcı uzaktan kumandası ile kolayca erişilebilen net bir menüde iyi yapılandırılmıştır. Programlanabilir ayarlara ve otomatik veri kaydına sahip akıllı yazılım, güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar için en uygun sonication ayarlarını sağlar. Temiz ve kullanımı kolay menü arayüzü, Hielscher ultrasonicators'ı kullanıcı dostu ve verimli cihazlara dönüştürmektedir.
Aşağıdaki tablo size hücre lizisi ve DNA parçalanması için laboratuar ultrasonicators yaklaşık işleme kapasitesinin bir göstergesini verir:

Numune Hacmi Akış Oranı Önerilen Cihaz
çok kuyulu plakalar Yok UIP400MTP
şişeler, küçük beher Yok ultrasonik cuphorn
10 şişeye kadar Yok VialTweeter
1 - 500mL 10 - 200mL/min UP100H
10 - 2000mL 20 - 400mL/min UP200Ht, UP400St

Bizimle iletişime geçin! / Bize sor!

Daha fazla bilgi isteyin

DNA ekstraksiyonu ve parçalanması, uygulama protokolleri ve fiyatları için ultrasonik homojenizatörler hakkında ek bilgi talep etmek için lütfen aşağıdaki formu kullanın. Sürecinizi sizinle tartışmaktan ve gereksinimlerinizi karşılayan bir ultrasonik sistem sunmaktan mutluluk duyacağız!









Lütfen dikkat Gizlilik Politikası.




Edebiyat / Referanslar

Bilinmesi Gereken Gerçekler

Plazmidler nedir?
Plazmid, kromozomal DNA'dan fiziksel olarak ayrı olan ve bağımsız olarak çoğalan küçük dairesel bir DNA molekülüdür. Plazmidler genellikle bir organizmanın hayatta kalmasına katkıda bulunan ve antibiyotik direnci gibi belirli avantajlar sağlayan genlerle ilişkilidir. Plazmidler en yaygın olarak bakterilerde küçük dairesel, çift sarmallı DNA molekülleri olarak bulunur; Bununla birlikte, plazmidler bazen arkelerde ve ökaryotik organizmalarda bulunur. Plazmidler moleküler biyoloji, genetik, biyokimya ve yaşam bilimlerinde önemli araçlardır. Genetik mühendisliğinde vektörler olarak bilinen plazmidler, belirli genleri çoğaltmak veya ifade etmek için kullanılır. Bir vektörün hedeflenen değişimine vektör tasarımı denir.

Hücre Araştırmalarında GFP Analizi
Yeşil Floresan Protein (GFP), fizyolojik süreçleri izlemek, protein lokalizasyonunu görselleştirmek ve transgenik ekspresyonu in vivo olarak tespit etmek için çok yönlü bir biyolojik belirteçtir. GFP, 488 nm lazer hattı tarafından uyarılabilir ve 510 nm'de optimum şekilde algılanır.


Yüksek performanslı ultrasonik! Hielscher ürün yelpazesi, tezgah üstü üniteler üzerindeki kompakt laboratuvar ultrasonicator'dan tam endüstriyel ultrasonik sistemlere kadar tüm spektrumu kapsar.

Hielscher Ultrasonics yüksek performanslı ultrasonik homojenizatörler üretir laboratuvar için endüstriyel boyut.