ELISA Testleri için Ultrasonik Numune Hazırlama
ELISA gibi tahliller, in vitro teşhis, hastalıkla ilgili protein tespiti ve kalite kontrolü (örn. gıda alerjenlerinin izlenmesi) için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ultrasonik numune hazırlama, hücreyi parçalamak ve hücre içi proteinleri, DNA'yı, RNA'yı ve organelleri izole etmek için hızlı, güvenilir ve tekrarlanabilir bir tekniktir. Hielscher Ultrasonics, tek numunelerin, çoklu şişelerin yanı sıra mikrotitre plakaları ve 96 oyuklu plakalar için uygun şekilde hazırlanması için çeşitli ultrasonik çözümler sunar.
ELISA (ELISA Türkçesi) – Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi
ELISA, enzime bağlı immünosorbent testi anlamına gelir ve ligand bağlayıcı testler kategorisinin yaygın olarak kullanılan bir biyokimyasal analiz tekniğidir. ELISA'da, özel bağlanma özelliklerine sahip sabit bir katı faz üzerine sıvı bir numune eklenir. Normalde, sabit katı faz, bir kuyu plakasına veya ELISA plakasına kaplama olarak uygulanır. Daha sonra, çeşitli sıvı reaktifler sırayla eklenir, inkübe edilir ve yıkanır, böylece son olarak kuyudaki son sıvıda optik bir değişiklik (örneğin, bir enzimatik reaksiyonun ürünü ile renk gelişimi) meydana gelir. Optik değişim, analitin miktarının kantitatif olarak adlandırılan bir yöntemle ölçülmesine izin verir. “okuma". Kantitatif okuma için, iletilen ışığın yoğunluğunu tespit etmek ve ölçmek için bir spektrofotometre, florometre veya luminometre kullanılır. Algılama hassasiyeti, analitik reaksiyonlar sırasında sinyalin amplifikasyonundan etkilenir. Enzim reaksiyonları iyi araştırılmış ve güvenilir amplifikasyon süreçleri olduğundan, sinyali oluşturmak için enzimler kullanılır. Enzimler, doğru miktar tayinine izin vermek için sabit oranlarda tespit reaktiflerine bağlanır, bu da "enzime bağlı" immünosorbent testi adını da açıklar.
ELISA testleri mikrotitre plaklarda / 96 oyuklu plakalarda gerçekleştirildiğinden, plaka bazlı test tekniği olarak bilinir ve örneğin klinik in vitro teşhis, araştırma, ilaç geliştirme vb. antikorları, peptitleri, proteinleri ve hormonları tespit etmek ve ölçmek için kullanılır.
ELISA tekniği tıpta, biyoteknolojide, bitki patolojisinde sıklıkla bir tanı aracı olarak kullanılmaktadır ve aynı zamanda birçok endüstride önemli bir kalite kontrol ölçümüdür.
Ultrasonik numune hazırlama ünitesi VialTweeter ELISA tahlillerinden önce hücre lizisi ve protein ekstraksiyonu için kullanılır
ELISA Öncesi Ultrasonik Numune Hazırlama
ELISA testi yapılmadan önce, numuneler hücre lizisi ve hücre içi proteinlerin, DNA'nın, RNA'nın vb. ekstraksiyonu gibi hazırlık aşamaları gerektirir. Ultrasonik hücre lizisi ve protein izolasyonunun avantajı, yüksek verimliliği, güvenilirliği ve tekrarlanabilirliğidir. Bu faktörlerin tümü, yüksek kaliteli teşhis ve araştırma sonuçları elde etmek için önemlidir
- Homojen numune işleme
- Tam lizis
- Tam protein ekstraksiyonu (örn. antikorlar, DNA)
- Hücre tipine optimum adaptasyon
- Herhangi bir numune boyutu için
- Tekrarlanabilir
- sıcaklık kontrollü
- SD kartta otomatik veri protokolü
Pre-ELISA Ultrasonik Hücre Lizisi için Protokol
- Hücre Kültürleri için: Ultrasonik hücre lizizinden önce, hücreleri bir mikrosantrifüjde 270 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspirasyon ile çıkarın ve hücreleri 30 – 100 μL RIPA tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücre peletini buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
- Şimdi, hücre örneği ultrasonik lizis için hazır:
Prob tipi bir ultrasonicator kullanın (örn. UP200Ht S26d2 probu ile) veya ultrasonik bir çoklu numune cihazı (örneğin, 10 şişeye kadar eşzamanlı sonikasyon için VialTweeter veya mikrotitre plakaları / 96 oyuklu plakalar için UIP400MPT) hazırlamanız gereken numune miktarına bağlı olarak.
Tek bir numunenin prob tipi sonikasyonu için, hücreleri 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin. - Ultrasonicator'ın dijital menüsünde ultrasonik sürenizi, toplam enerji girişinizi, döngü modunuzu ve / veya sıcaklık sınırlarınızı önceden ayarlayın. Bu, son derece güvenilir sonikasyon ve tekrarlanabilirlik sağlar.
- Sonotrotu yerleştirin ve ultrasonik cihazı açın. Numuneyi düzgün bir şekilde sonikasyon yapmak için ultrasonik probun mikro ucunu numunenin içinden yavaşça hareket ettirin.
Çoğu hücre için, ultrasonik lizis, 10 saniyelik sonikasyonun 2-4 döngüsünden sonra tamamlanacaktır. - Sonikasyondan sonra, sonotrotu numuneden çıkarın. Numuneler 5 dakika buz üzerinde inkübe edilmelidir. Ardından, kalıntıları pelet yapmak için 20 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanları yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Analitleri etiketleyin ve -20°C'de saklayın.
- Ultrasonik sonotrot, alkolle doldurulmuş bir beherde alkol veya sonikat ile düzgün bir şekilde silinerek temizlenebilir, örn.% 70 etanol. Titanyumdan yapılan tüm ultrasonik problar otoklavlanabilir.
E.coli hücrelerinden protein ekstraksiyonu ultrasonik prob UP200St
- Fazla hemoliz kanını iyice çıkarmak için dokuyu buz gibi PBS (0.01M, pH = 7.4) ile durulayın.
- Dokuyu (böbrek, kalp, akciğer, dalak vb.) tartın ve PBS'de homojenize edilen küçük parçalara ayırın. Gerekli PBS hacmi dokunun ağırlığı ile ilgilidir. Genel bir kural olarak, 1 g doku yaklaşık 9 mL PBS gerektirir. PBS'ye bir miktar proteaz inhibitörü eklenmesi önerilir. (Alternatif olarak RIPA veya proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyli içeren hipotonik lizis tamponu kullanılabilir.)
- Doku boyutuna bağlı olarak, kısa bir vorteks tedavisi (15 saniyelik darbelerde yaklaşık 1-2 dakika) dokuyu ön tedavi etmek için yardımcı olabilir.
- Ultrasonicator'ınıza bir mikro uç, örneğin S26d2 monte edin. Numune tüpünü doku ile birlikte bir buz banyosuna yerleştirin.
- Numuneyi ultrasonicator ile sonikleştirin, örneğin UP200St (% 80 genlik) 1 dakika boyunca nabız modunda (15 saniye açık, 15 saniye duraklama). Numuneyi buz banyosunda saklayın.
- Homojenatlar daha sonra analiz için proteini zenginleştirmek amacıyla spesifik havuzlar (sitozolik, nükleer, mitokondriyal veya lizozomal) elde etmek üzere santrifüjlenir. Numuneyi 5000×g'da 5 dakika santrifüjleyerek süpernatan alınır.
Sonotrot MTP-24-8-96, mikrotitre plakalarının kuyularının sonikasyonu için sekiz ultrasonik proba sahiptir.
Sonikasyon Sırasında Güvenilir Sıcaklık Kontrolü
Sıcaklık, biyolojik numunelerin işlenmesi için, örneğin proteinlerin termal bozunmasını önlemek için özellikle önemli olan, prosesi etkileyen çok önemli bir faktördür. Tüm mekanik numune hazırlama teknikleri gibi, sonikasyon da ısı oluşturur. Bununla birlikte, Hielscher Ultrasonik cihazları kullanırken numunelerin sıcaklığı iyi kontrol edilebilir. Numunelerinizi prob tipi ultrasonicator veya VialTweeter ile önceden analitik olarak hazırlarken sıcaklığınızı izlemek ve kontrol etmek için size çeşitli seçenekler sunuyoruz.
- Örnek sıcaklığın izlenmesi: Tüm Hielscher dijital ultrasonik işlemciler akıllı bir yazılım ve takılabilir bir sıcaklık sensörü ile donatılmıştır. Sıcaklık sensörünü ultrasonik cihaza takın (örn. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, Çok kuyulu plaka sonikatör UIP400MTP) ve sıcaklık sensörünün ucunu numune tüplerinden birine yerleştirin. Dijital renkli dokunmatik ekran aracılığıyla, ultrasonik işlemcinin menüsünde örnek sonikasyonunuz için belirli bir sıcaklık aralığı ayarlayabilirsiniz. Ultrasonicator, maksimum sıcaklığa ulaşıldığında otomatik olarak durur ve örnek sıcaklığı, ayarlanan sıcaklığın ∆ daha düşük değerine düşene kadar duraklar. Sonra sonikasyon otomatik olarak tekrar başlar. Bu akıllı özellik, ısı kaynaklı bozulmayı önler.
- Ultrasonik çoklu numune ünitesi VialTweeter ile ilgili olarak, numune tüplerini tutan titanyum blok önceden soğutulabilir. Titanyum bloğu önceden soğutmak için VialTweeter bloğunu (yalnızca dönüştürücüsüz sonotrot!) buzdolabına veya dondurucuya koyun, numunedeki sıcaklık artışını ertelemeye yardımcı olur. Mümkünse, numunenin kendisi de önceden soğutulabilir.
- Sonikasyon sırasında soğutmak için bir buz banyosu veya kuru buz kullanın. Sonikasyon sırasında örnek tüp(ler)inizi bir buz banyosuna yerleştirin. VialTweeter için kuru buzla dolu sığ bir tepsi kullanın ve ısının hızla dağılabilmesi için VialTweeter'ı kuru buzun üzerine yerleştirin.
Dünya çapındaki müşteriler, biyolojik, biyokimyasal, tıbbi ve klinik laboratuvarlarda günlük numune hazırlama çalışmaları için Hielscher prob tipi ultrasonicators ve çoklu numune sonikasyon üniteleri VialTweeter ve UIP400MTP kullanıyor. Hielscher işlemcilerin akıllı yazılımı ve sıcaklık kontrolü, sıcaklık güvenilir bir şekilde kontrol edilir ve ısıya bağlı numune bozulması önlenir. Hielscher ultrasonik çözümleri ile ultrasonik numune hazırlama, son derece güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar verir!
Tahliller için çok kuyulu plaka sonikatör UIP400MTP kullanarak yüksek verimli sonikasyon hakkında daha fazla bilgi edinin!
Bizimle İletişime Geçin! / Bize Sor!
Hielscher Ultrasonics, laboratuvar, pilot ve endüstriyel ölçekte karıştırma uygulamaları, dispersiyon, emülsifikasyon ve ekstraksiyon için yüksek performanslı ultrasonik homojenizatörler üretmektedir.
Literatür / Referanslar
- Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
Bilmeye Değer Gerçekler
Ne Tür ELISA Var?
Çalışma prensipleri ile ayırt edilen birkaç ELISA türü vardır. Doğrudan ELISA, dolaylı ELISA, sandviç ELISA, rekabetçi ELISA ve ters ELISA olarak bilinirler. Aşağıda, size çeşitli ELISA türleri ve bunların temel özellikleri ve farklılıkları hakkında bir genel bakış sunuyoruz.
ELISA kalitatif veya kantitatif bir formatta çalıştırılabilir. Kalitatif sonuçlar basit bir pozitif veya negatif sonuç sağlarken, kantitatif ELISA'da numunenin optik yoğunluğu (OD), tipik olarak hedef molekülün bilinen bir konsantrasyon çözeltisinin seri seyreltilmesi olan standart bir eğri ile karşılaştırılır.
Doğrudan ELISA
Doğrudan ELISA, sadece enzim etiketli bir birincil antikorun kullanıldığı ve ikincil antikorların gerekli olmadığı Elisa'nın en basit test şeklidir. Enzim işaretli primer antikor doğrudan hedefe, yani antijene bağlanır. Tamponlanmış antijen çözeltisi, bir mikrotitre plakasının (genellikle 96 oyuklu plakalar, ELISA plakaları) her bir oyuğuna eklenir ve burada yük etkileşimleri yoluyla plastik yüzeye yapışır. Birincil antikora bağlı enzim, substratı ile reaksiyona girdiğinde, spektrofotometre, florometre veya luminometre ile ölçülebilen görünür bir sinyal üretir.
Dolaylı ELISA
Dolaylı ELISA testi için hem birincil antikor hem de ikincil antikor gereklidir. Bununla birlikte, doğrudan ELISA'nın aksine, birincil antikor değil, ikincil antikor bir enzim ile işaretlenir. Antijen kuyu plakasına immobilize edilir ve birincil antikor tarafından bağlanır. Daha sonra, enzim etiketli ikincil antikor, birincil antikora bağlanır. Son olarak, ikincil antikora bağlı enzim, tespit edilebilen görünür bir sinyal üretmek için substratı ile reaksiyona girer.
Sandviç ELISA
Doğrudan ve dolaylı ELISA testlerinde, antijen hareketsiz hale getirilir ve kuyu plakasının yüzeyine kaplanırken, sandviç ELISA'da antikor, ELISA plakasının plastik yüzeyine hareketsiz hale getirilir. Sandviç ELISA'daki hareketsizleştirilmiş antikorlar, yakalama antikorları olarak bilinir. Yakalama antikorlarına ek olarak, sandviç ELISA'da ayrıca tespit antikorları da gereklidir. Tespit antikorları, etiketlenmemiş bir birincil tespit antikoru ve enzim etiketli bir ikincil tespit antikoru içerir.
Kademeli olarak, ilgilenilen antijen, plakaya hareketsiz hale getirilen yakalama antikoruna bağlanır. Daha sonra, birincil tespit antikoru antijene bağlanır. Daha sonra, ikincil tespit antikoru, birincil tespit antikoruna bağlanır. Son reaksiyon adımında, enzim, optik olarak tespit edilebilen görünür bir sinyal üretmek için substratı ile reaksiyona girer.
Rekabetçi ELISA
İnhibisyon ELISA olarak da bilinen rekabetçi ELISA, bir inhibitör antijenin kullanımını içerdiği için en karmaşık ELISA tipidir. Doğrudan, dolaylı ve sandviç ELISA olmak üzere üç formatın her biri, rekabetçi ELISA formatına uyarlanabilir. Rekabetçi ELISA'da, inhibitör antijen ve ilgilenilen antijen, birincil antikora bağlanmak için rekabet eder.
Rekabetçi ELISA için, etiketlenmemiş antikor, antijeninin, yani numunenin varlığında inkübe edilir. Bu bağlı antikor/antijen kompleksleri daha sonra antijen kaplı bir kuyucuğa eklenir.
Plaka yıkanır, böylece bağlanmamış antikorlar çıkarılır. Rekabetçi ELISA, numunede ne kadar çok antijen varsa, o kadar fazla antijen-antikor kompleksi oluşması nedeniyle adını almıştır. Bu, kuyudaki antijene bağlanmak için daha az bağlanmamış antikor olduğu ve antijenlerin mevcut bir antikor için rekabet etmesi gerektiği anlamına gelir. Birincil antikorla eşleşen ikincil bir antikor eklenir. Bu ikinci antikor enzime bağlıdır. Substrat eklendiğinde, kalan enzimler bir kromojenik veya floresan sinyal üretir.
Bu noktada, sinyalin nihai doygunluğunu önlemek için reaksiyon durdurulur.
Bazı rekabetçi ELISA kitleri, enzime bağlı bir antikor yerine enzime bağlı bir antijen içerir. Etiketli antijen, örnek antijen (etiketlenmemiş) ile birincil antikor bağlanma bölgeleri için rekabet eder. Numunede ne kadar az antijen olursa, kuyuda o kadar fazla etiketli antijen tutulur ve sinyal o kadar güçlü olur.
Ters ELISA
Ters ELISA kuyu plakaları kullanmaz, ancak antijenleri test sıvısında asılı bırakır. Ters ELISA testi, antijen yoluyla bağlı antikor miktarını ölçer. Batı Nil virüsü zarf proteinini ve virüse özgü antikorları nasıl bulabildiğini tespit etmek ve araştırmak için özel olarak geliştirilmiştir.
ELISA için Hangi Enzimatik Markörler Kullanılır?
Aşağıdaki liste, ELISA testlerinde kullanılan ve testin sonuçlarının tamamlandıktan sonra ölçülmesine izin veren en yaygın enzimatik belirteçleri vermektedir.
- OPD (o-fenilendiamin dihidroklorür), genellikle konjuge bir protein olarak kullanılan HRP'yi (Yaban Turpu Peroksidaz) tespit etmek için kehribar rengine döner.
- TMB (3,3′,5,5′-tetrametilbenzidin) HRP'yi tespit ettiğinde maviye döner ve sülfürik veya fosforik asit ilavesinden sonra sararır.
- ABTS (2,2′-Azinobis [3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit]-diamonyum tuzu) HRP'yi tespit ederken yeşile döner.
- PNPP (p-Nitrofenil Fosfat, Disodyum Tuzu) alkalin fosfataz tespit edildiğinde sararır.