ELISA Testleri için Ultrasonik Numune Hazırlama

ELISA gibi testler, in vitro tanı, hastalıkla ilişkili proteinlerin tespiti ve kalite kontrolü (ör. gıda alerjenlerinin izlenmesi) için yaygın olarak kullanılır. Ultrasonik numune hazırlama, hücreleri lizise uğratmak ve hücre içi proteinleri, DNA, RNA ve organelleri izole etmek için hızlı, güvenilir ve tekrarlanabilir bir tekniktir. Hielscher Ultrasonics, tek numunelerin, birden fazla viyalin yanı sıra mikrotitre plakalarının ve 96 kuyucuklu plakaların kolayca hazırlanması için çeşitli ultrasonik çözümler sunar.

ELISA – Enzime Bağlı İmmünosorbent Test

ELISA, enzime bağlı immünosorbent test anlamına gelir ve ligand bağlanma testleri kategorisinde yer alan, yaygın olarak kullanılan bir biyokimyasal analiz tekniğidir. ELISA yönteminde, özel bağlanma özelliklerine sahip sabit bir katı fazın üzerine sıvı numune eklenir. Normalde sabit katı faz, kuyucuklu bir plakaya veya ELISA plakasına kaplama olarak uygulanır. Ardından çeşitli sıvı reaktifler sırayla eklenir, inkübe edilir ve yıkanır; böylece sonunda kuyucukta kalan sıvıda optik bir değişim (ör. enzimatik bir reaksiyonun ürünüyle renk oluşumu) meydana gelir. Optik değişim, analitin miktarının nicel “okuma” olarak adlandırılan bir işlemle ölçülmesini sağlar. Nicel okuma için, geçen ışığın şiddetini tespit etmek ve ölçmek üzere bir spektrofotometre, florometre veya luminometre kullanılır. Tespit duyarlılığı, analitik reaksiyonlar sırasında sinyalin güçlendirilmesinden etkilenir. Enzim reaksiyonları, kapsamlı biçimde araştırılmış ve güvenilir sinyal güçlendirme süreçleri olduğundan, sinyal oluşturmak için enzimler kullanılır. Doğru nicel tayin yapılabilmesi için enzimler tespit reaktiflerine sabit oranlarda bağlanır; bu durum, immünosorbent testin adındaki “enzime bağlı” ifadesini de açıklar.
ELISA testleri mikrotitre plakalarında / 96 kuyucuklu plakalarda gerçekleştirildiğinden, plaka tabanlı test tekniği olarak bilinir ve örneğin klinik in vitro tanıda, araştırmada, ilaç geliştirmede vb. antikorları, peptitleri, proteinleri ve hormonları tespit etmek ve miktarlarını belirlemek için kullanılır.
ELISA tekniği, tıpta, biyoteknolojide ve bitki patolojisinde sıklıkla bir tanı aracı olarak kullanılır ve aynı zamanda birçok endüstride önemli bir kalite kontrol ölçümüdür.

Eksiksiz VialTweeter kurulumu: UP200St ultrasonik işlemcisindeki VialTweeter sonotrodu

VialTweeter ultrasonik numune hazırlama ünitesi ELISA testlerinden önce hücre lizisi ve protein ekstraksiyonu için kullanılır

ELISA Öncesinde Ultrasonik Numune Hazırlama

ELISA testi gerçekleştirilebilmeden önce numuneler, hücre lizisi ve hücre içi proteinlerin, DNA, RNA vb. maddelerin ekstraksiyonu gibi hazırlık adımları gerektirir. Ultrasonik hücre lizisi ve protein izolasyonunun avantajı, yüksek verimliliği, güvenilirliği ve tekrarlanabilirliğidir. Bu faktörlerin tümü, yüksek kaliteli tanı ve araştırma sonuçları elde etmek için önemlidir

ELISA Öncesinde Ultrasonik Lizisin Avantajları

Homojen numune işleme
Tam lizis
Tam protein ekstraksiyonu (ör. antikorlar, DNA)
Hücre tipine en uygun uyarlama
Her numune boyutu için
Tekrarlanabilir
Sıcaklık kontrollü
Verilerin SD karta otomatik olarak kaydedilmesi

Bu eğitim videosu, laboratuvar, analiz ve araştırma çalışmalarında lizis, hücre parçalama, protein izolasyonu, DNA ve RNA parçalama gibi numune hazırlama işlemleriniz için hangi sonikatör tipinin en uygun olduğunu açıklar. Uygulamanıza, numune hacminize, numune sayınıza ve işlem kapasitenize uygun ideal sonikatör tipini seçin. Hielscher Ultrasonics, sizin için ideal ultrasonik homojenizatöre sahiptir!

ELISA Öncesi Ultrasonik Hücre Lizisi Protokolü

Hücre Kültürleri için: Ultrasonik hücre lizisinden önce, hücreleri bir mikrosantrifüjde 270 x g değerinde 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspirasyonla uzaklaştırın ve hücreleri 30 – 100 μL RIPA tamponunda yeniden süspanse edin. Ardından hücre peletini buz üzerinde 30 min inkübe edin.
Artık hücre numunesi ultrasonik lizise hazırdır:
Hazırlamanız gereken numune sayısına bağlı olarak prob tipi bir ultrasonik sonikatör (ör. UP200Ht sonikatörü, S26d2 probuyla) veya ultrasonik bir çoklu numune cihazı (ör. aynı anda 10 viyale kadar sonikasyon için VialTweeter ya da mikrotitre plakaları / 96 kuyucuklu plakalar için UIP400MPT) kullanın.
Tek bir numunenin prob tipi sonikasyonu için hücreleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin.
Sonikatörün dijital menüsünde ultrasonik işlem süresini, toplam enerji girdisini, döngü modunu ve/veya sıcaklık sınırlarını önceden ayarlayın. Bu, sonikasyonun son derece güvenilir ve tekrarlanabilir olmasını sağlar.
Sonotrodu yerleştirin ve ultrasonik cihazı açın. Numuneyi eşit biçimde sonikasyona tabi tutmak için ultrasonik probun mikro ucunu numune içinde nazikçe hareket ettirin.
Çoğu hücre için ultrasonik lizis, her biri 10 sec sonikasyon içeren 2–4 döngüden sonra tamamlanacaktır.
Sonikasyondan sonra sonotrodu numuneden çıkarın. Numuneler buz üzerinde 5 min inkübe edilmelidir. Ardından hücresel kalıntıları pelet hâline getirmek için 10.000 x g değerinde 20 min santrifüjleyin. Süpernatanları yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Analitleri etiketleyin ve -20°C sıcaklıkta saklayın.
Ultrasonik sonotrot, alkolle uygun şekilde silinerek veya alkolle, örneğin %70 etanolle doldurulmuş bir beherde sonikasyona tabi tutularak temizlenebilir. Titanyumdan yapılmış tüm ultrasonik problar otoklavlanabilir.

UP200St gibi prob tipi ultrasonik sonikatörler, güvenilir doku homojenizatörleridir ve genetik alanında numune hazırlama için, örneğin E.coli lizisi için yaygın olarak kullanılır

E.coli hücrelerinden protein ekstraksiyonu – UP200St ultrasonik probu ile

Doku Homojenatları için:

Fazla hemolize olmuş kanı iyice uzaklaştırmak için dokuyu buz gibi soğuk PBS (0,01M, pH=7,4) ile yıkayın.
Dokuyu (böbrek, kalp, akciğer, dalak vb.) tartın ve PBS içinde homojenize edilecek küçük parçalara ayıracak şekilde masere edin. Gereken PBS hacmi, dokunun ağırlığıyla ilişkilidir. Genel bir kural olarak, 1g doku için yaklaşık 9mL PBS gerekir. PBS çözeltisine bir miktar proteaz inhibitörü eklenmesi önerilir. (Alternatif olarak RIPA veya proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyli içeren hipotonik lizis tamponu kullanılabilir.)
Dokunun boyutuna bağlı olarak, kısa bir vorteks işlemi (15 sec darbeler hâlinde yaklaşık 1–2 min) dokunun ön işlemi için yararlı olabilir.
Sonikatörünüze bir mikro uç, örneğin S26d2, takın. Dokuyu içeren numune tüpünü bir buz banyosuna yerleştirin.
Numuneyi sonikatörünüzle, örneğin UP200St sonikatörüyle (%80 genlik), darbeli modda (15sec açık, 15sec duraklama) 1 min sonikasyona tabi tutun. Numuneyi buz banyosunda tutun.
Ardından homojenatlar, analiz için proteini zenginleştirmek amacıyla belirli fraksiyonlar (sitozolik, nükleer, mitokondriyal veya lizozomal) elde etmek üzere santrifüjlenir. Numune 5000×g değerinde 5 dakika santrifüjlenerek süpernatan elde edilir.

MTP-24-8-96 sonotrodu, mikrotitre plakalarının kuyucuklarının sonikasyonu için sekiz ultrasonik proba sahiptir.

Sonikasyon Sırasında Güvenilir Sıcaklık Kontrolü

Sıcaklık, süreci etkileyen kritik bir faktördür ve biyolojik numunelerin işlenmesinde, örneğin proteinlerin termal bozunmasını önlemek için özellikle önemlidir. Tüm mekanik numune hazırlama teknikleri gibi sonikasyon da ısı üretir. Bununla birlikte, Hielscher Ultrasonics cihazları kullanıldığında numunelerin sıcaklığı iyi bir şekilde kontrol edilebilir. Numunelerinizi analiz öncesinde prob tipi bir ultrasonik sonikatör veya VialTweeter ile hazırlarken sıcaklıklarını izlemek ve kontrol etmek için çeşitli seçenekler sunuyoruz.

Numune sıcaklığının izlenmesi: Tüm Hielscher dijital ultrasonik işlemcileri, akıllı bir yazılım ve takılabilir bir sıcaklık sensörüyle donatılmıştır. Sıcaklık sensörünü ultrasonik cihaza (ör. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, UIP400MTP çok kuyucuklu plaka sonikatörü) bağlayın ve sıcaklık sensörünün ucunu numune tüplerinden birine yerleştirin. Dijital renkli dokunmatik ekran aracılığıyla ultrasonik işlemcinin menüsünde numunenizin sonikasyonu için belirli bir sıcaklık aralığı ayarlayabilirsiniz. Sonikatör, maksimum sıcaklığa ulaşıldığında otomatik olarak duracak ve numune sıcaklığı ayarlanan sıcaklık ∆ değerinin alt sınırına düşene kadar bekleyecektir. Ardından sonikasyon otomatik olarak yeniden başlar. Bu akıllı özellik, ısı kaynaklı bozunmayı önler.
VialTweeter ultrasonik çoklu numune ünitesinde, numune tüplerini tutan titanyum blok önceden soğutulabilir. Titanyum bloğu önceden soğutmak için VialTweeter bloğunu (transdüser olmadan yalnızca sonotrodu!) buzdolabına veya dondurucuya koymak, numunedeki sıcaklık artışını geciktirmeye yardımcı olur. Mümkünse numunenin kendisi de önceden soğutulabilir.
Sonikasyon sırasında soğutma için buz banyosu veya kuru buz kullanın. Sonikasyon sırasında numune tüpünüzü veya tüplerinizi bir buz banyosuna yerleştirin. VialTweeter için kuru buzla doldurulmuş sığ bir tepsi kullanın ve ısının hızla uzaklaşabilmesi için VialTweeter ünitesini kuru buzun üzerine yerleştirin.

Dünya genelindeki müşteriler, biyolojik, biyokimyasal, tıbbi ve klinik laboratuvarlardaki günlük numune hazırlama çalışmalarında Hielscher prob tipi ultrasonik sonikatörlerinin yanı sıra VialTweeter ve UIP400MTP çoklu numune sonikasyon ünitelerini kullanır. Hielscher işlemcilerinin akıllı yazılımı ve sıcaklık kontrolü sayesinde sıcaklık güvenilir biçimde kontrol edilir ve numunelerin ısı kaynaklı bozunması önlenir. Hielscher ultrasonik çözümleriyle ultrasonik numune hazırlama, son derece güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar sunar!
Testler için UIP400MTP çok kuyucuklu plaka sonikatörüyle yüksek numune işleme kapasiteli sonikasyon hakkında daha fazla bilgi edinin!

Bizimle İletişime Geçin! / Bize Sorun!

Ultrasonik yüksek kesmeli homojenizatörler, laboratuvar, tezgâh üstü, pilot ve endüstriyel işlemlerde kullanılır.

Hielscher Ultrasonics, laboratuvar, pilot ve endüstriyel ölçekte karıştırma uygulamaları, dispersiyon, emülsifikasyon ve ekstraksiyon için yüksek performanslı ultrasonik homojenizatörler üretir.

İlgili Konular

Literatür / Kaynaklar

Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.

Bilinmesi Gereken Bilgiler

Hangi ELISA Türleri Vardır?

Çalışma prensiplerine göre birbirinden ayrılan çeşitli ELISA türleri vardır. Bunlar doğrudan ELISA, dolaylı ELISA, sandviç ELISA, kompetitif ELISA ve ters ELISA olarak bilinir. Aşağıda çeşitli ELISA türlerine ve bunların temel özellikleri ile farklılıklarına genel bir bakış sunuyoruz.
ELISA, nitel veya nicel formatta gerçekleştirilebilir. Nitel sonuçlar basit bir pozitif veya negatif sonuç verirken, nicel ELISA yönteminde numunenin optik yoğunluğu (OD), tipik olarak hedef molekülün bilinen konsantrasyondaki bir çözeltisinin seri seyreltilmesiyle oluşturulan bir standart eğriyle karşılaştırılır.

Doğrudan ELISA

Doğrudan ELISA, yalnızca enzimle işaretlenmiş bir birincil antikorun kullanıldığı ve ikincil antikorların gerekmediği en basit ELISA test biçimidir. Enzimle işaretlenmiş birincil antikor, doğrudan hedefe, yani antijene bağlanır. Tamponlanmış antijen çözeltisi, bir mikrotitre plakasının (genellikle 96 kuyucuklu plakalar, ELISA plakaları) her kuyucuğuna eklenir ve burada yük etkileşimleri yoluyla plastik yüzeye tutunur. Birincil antikora bağlı enzim substratıyla reaksiyona girdiğinde, spektrofotometre, florometre veya luminometre aracılığıyla ölçülebilen görünür bir sinyal üretir.

Dolaylı ELISA

Dolaylı ELISA testi için hem bir birincil antikor hem de bir ikincil antikor gerekir. Ancak doğrudan ELISA yönteminin aksine, enzimle işaretlenen antikor birincil antikor değil, ikincil antikordur. Antijen, kuyucuklu plakaya immobilize edilir ve birincil antikor antijene bağlanır. Ardından enzimle işaretlenmiş ikincil antikor, birincil antikora bağlanır. Son olarak ikincil antikora bağlı enzim, tespit edilebilen görünür bir sinyal üretmek üzere substratıyla reaksiyona girer.

Sandviç ELISA

Doğrudan ve dolaylı ELISA testlerinde antijen, kuyucuklu plakanın yüzeyine immobilize edilip kaplanırken, sandviç ELISA yönteminde antikor ELISA plakasının plastik yüzeyine immobilize edilir. Sandviç ELISA yönteminde immobilize edilen antikorlar, yakalama antikorları olarak bilinir. Yakalama antikorlarına ek olarak, sandviç ELISA yönteminde tespit antikorları olarak adlandırılan antikorlar da gerekir. Tespit antikorları, işaretlenmemiş bir birincil tespit antikorunu ve enzimle işaretlenmiş bir ikincil tespit antikorunu içerir.
Adım adım ilerleyen süreçte, ilgilenilen antijen plakaya immobilize edilmiş yakalama antikoruna bağlanır. Ardından birincil tespit antikoru antijene bağlanır. Daha sonra ikincil tespit antikoru birincil tespit antikoruna bağlanır. Son reaksiyon adımında enzim, optik olarak tespit edilebilen görünür bir sinyal üretmek üzere substratıyla reaksiyona girer.

Kompetitif ELISA

İnhibisyon ELISA olarak da bilinen kompetitif ELISA, bir inhibitör antijenin kullanımını içerdiği için en karmaşık ELISA türüdür. Üç formatın her biri, yani doğrudan, dolaylı ve sandviç ELISA, kompetitif ELISA formatına uyarlanabilir. Kompetitif ELISA yönteminde inhibitör antijen ve ilgilenilen antijen, birincil antikora bağlanmak için rekabet eder.
Kompetitif ELISA için işaretlenmemiş antikor, antijeninin, yani numunenin varlığında inkübe edilir. Oluşan bağlı antikor/antijen kompleksleri daha sonra antijenle kaplanmış bir kuyucuğa eklenir.
Plaka yıkanarak bağlanmamış antikorlar uzaklaştırılır. Kompetitif ELISA, numunede ne kadar fazla antijen varsa o kadar fazla antijen-antikor kompleksi oluşması nedeniyle bu adı alır. Bu, kuyucuktaki antijene bağlanabilecek daha az bağlanmamış antikor bulunduğu ve antijenlerin mevcut bir antikor için rekabet etmek zorunda olduğu anlamına gelir. Birincil antikora uygun bir ikincil antikor eklenir. Bu ikinci antikor enzime bağlıdır. Substrat eklendiğinde, kalan enzimler kromojenik veya floresan bir sinyal üretir.
Bu noktada, sinyalin sonunda doygunluğa ulaşmasını önlemek için reaksiyon durdurulur.
Bazı kompetitif ELISA kitleri, enzime bağlı antikor yerine enzime bağlı antijen içerir. İşaretlenmiş antijen, birincil antikorun bağlanma bölgeleri için numunedeki antijenle (işaretlenmemiş) rekabet eder. Numunede ne kadar az antijen varsa, kuyucukta o kadar fazla işaretlenmiş antijen tutulur ve sinyal o kadar güçlü olur.

Ters ELISA

Ters ELISA, kuyucuklu plakalar kullanmaz; antijenleri test sıvısında süspanse hâlde bırakır. Ters ELISA testi, bağlı antikor miktarını antijen aracılığıyla ölçer. Özellikle Batı Nil virüsünün zarf proteinini ve virüse özgü antikorları nasıl bulabildiğini tespit etmek ve araştırmak için geliştirilmiştir.

ELISA için Hangi Enzimatik Belirteçler Kullanılır?

Aşağıdaki liste, ELISA testlerinde kullanılan ve test tamamlandığında sonuçların ölçülmesini sağlayan en yaygın enzimatik belirteçleri sunar.

OPD (o-fenilendiamin dihidroklorür), sıklıkla konjuge protein olarak kullanılan HRP’yi (Yaban Turpu Peroksidazı) tespit etmek için kehribar rengine döner.
TMB (3,3′,5,5′-tetrametilbenzidin), HRP tespit edilirken maviye, sülfürik veya fosforik asit eklendikten sonra ise sarıya döner.
ABTS (2,2′-Azinobis [3-etilbenzotiyazolin-6-sülfonik asit]-diamonyum tuzu), HRP tespit edilirken yeşile döner.
PNPP (p-Nitrofenil Fosfat, Disodyum Tuzu), alkalin fosfataz tespit edilirken sarıya döner.