Sonikasyon ile SARS-CoV-2 Coronavirus İnaktivasyonu için Protokol

Hielscher VialTweeter, koronavirüs SARS-COV-2'yi etkisiz hale getirmek için kullanılan benzersiz bir ultrasonik çoklu numune hazırlama ünitesidir. VialTweeter, aynı anda 10 adede kadar numune şişesi hazırlamaya izin verir ve bu nedenle toplu numune işleme için ideal bir ünitedir.

SARS-CoV-2 Koronavirüsünün VialTweeter ile Etkisiz Hale Getirilmesi

Fiksatifi çıkardıktan sonra, tek tabakalar, hücreleri 1 mL MEM /% 5 FBS'ye kazımadan önce fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez yıkandı ve Hielscher ultrasonik işlemci kullanılarak sonikleştirildi (3 × 10 saniye açık,% 100 güç ve genlikte 10 saniye kapalı) VialTweeter ile UP200St ek. Süpernatanlar, 3000 × g'da 10 dakika santrifüjlenerek berraklaştırıldı. 

Welch ve ark. (2020) tarafından hazırlanan SARS-CoV-2 koronavirüs inaktivasyonu için protokolün tamamını buradan okuyun:

Hücreler ve Virüs

Vero E6 hücreleri (Vero C1008; ATCC CRL-1586),  (h/h) fetal buzağı serumu (FCS) ile desteklenmiş modifiye Eagle'ın minimum esansiyel ortamında (MEM) kültürlendi. Kullanılan virüs, 29/01/2020 tarihinde Birleşik Krallık'taki ilk hasta kümesinden PHE tarafından izole edilen SARS-CoV-2 suşu hCOV-19/England/2/2020 idi. Bu virüs pasaj 1'de elde edildi ve pasaj 2 veya 3'te inaktivasyon çalışmaları için kullanıldı.
SARS-CoV-2 inaktivasyonu için kullanılan reaktifler ve kimyasalların yanı sıra reaktif sitotoksisitesinin giderilmesi için lütfen Welch ve ark. (2020).

Deterjanlar tarafından virüs inaktivasyonu – SARS-CoV-2 Koronavirüs İnaktivasyon protokolü, Welch ve ark. 2020

SARS-CoV-2 İnaktivasyonu

Ticari ürünler için, virüs preparatları (doku kültürü sıvısı, 1 × 10 arasında değişen titreler⁶ 1 × 10 için⁸ PFU/ml), varsa üreticinin kullanım talimatlarında önerilen konsantrasyonlarda ve temas sürelerinde veya test laboratuvarları tarafından özel olarak talep edilen konsantrasyonlar ve sürelerde reaktiflerle üç nüsha halinde muamele edildi. Üretici tarafından bir konsantrasyon aralığı verildiğinde, ürünün numuneye en düşük oranı test edildi (yani, önerilen en düşük test ürünü konsantrasyonu). Numune taşıma tüpü reaktifleri, üretici tarafından numune sıvısının reaktife hacim oranı belirtilmedikçe, bir hacim doku kültürü sıvısının on hacim reaktife oranı kullanılarak test edildi. Deterjanlar, fiksatifler ve çözücüler, belirtilen süreler için belirtilen konsantrasyonlarda test edildi. Tüm inaktivasyon adımları ortam oda sıcaklığında (18 – 25°C) gerçekleştirildi. Alternatif numune tiplerinin test edilmesi için virüs, belirtilen numune matrisine 1:9 oranında çivilendi, ardından yukarıdaki gibi test reaktifleri ile muamele edildi. Tüm deneyler, test reaktifi yerine eşdeğer hacimde PBS ile üçlü kontrol sahte muamele edilmiş numuneleri içeriyordu. Gerekli temas süresinin hemen ardından, 1 mL arıtılmış numune, uygun şekilde seçilmiş filtrasyon matrisi kullanılarak işlendi. İnaktivasyon testi için reaktif çıkarma, Pierce 4 mL Deterjan Giderme Spin Kolonları (Thermo Fisher) kullanılarak daha büyük bir spin kolon formatında veya boş Pierce 10 mL kapasiteli santrifüj kolonlarının (Thermo Fisher) SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR veya Sephadex LH-20 ile doldurularak 4 mL paketlenmiş boncuklar/reçine verecek şekilde gerçekleştirildi. Amicon filtreleri kullanılarak saflaştırma için, 2 × 500μl numuneler, daha önce tarif edilen yöntemle iki santrifüj filtre kullanılarak saflaştırıldı, daha sonra bir araya getirildi. Formaldehit ve gluteraldehit giderimli formaldehit için, 1× 500μl numune hacmine sahip bir filtre kullanıldı, 500μl PBS'de işlendikten sonra yeniden süspanse edildi ve 400ul MEM /% 5 FBS'ye eklendi. Enfekte olanların inaktivasyonu için tek katmanlar, 12,5 cm² Vero E6 hücrelerinin şişeleri (2.5 × 10⁶ 2.5 mL MEM /% 5 FBS'deki hücreler / şişe) MOI 0.001'de enfekte edildi ve 37 ° C /% 5 CO'da inkübe edildi₂ 24 saat boyunca. Süpernatant çıkarıldı ve hücreler 5 mL formaldehit veya formaldehit ve glutaraldehit kullanılarak oda sıcaklığında 15 veya 60 dakika boyunca sabitlendi. Fiksatif çıkarıldı ve hücreleri 1 mL MEM /% 5 FBS'ye kazımadan önce tek katmanlar PBS ile üç kez yıkandı ve VialTweeter eki (Hielscher Ultrason Teknolojisi) ile bir UP200St kullanılarak sonikleştirildi (3 × 10 saniye açık,% 100 güç ve genlikte 10 saniye kapalı). Süpernatanlar, 3000 × g'da 10 dakika santrifüjlenerek berraklaştırıldı.

Welch ve ark. 2020 protokolüne göre ultrasonik VialTweeter ile SARS-CoV-2 koronavirüs inaktivasyonu için kullanılan reaktifin ayrıntıları

Hielscher VialTweeter'ın kullanımı da dahil olmak üzere tam protokol burada bulunabilir:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Gelişmiş Ultrasonik Ayırıcılar ve Hücre Bozucular

Çok örnekli ultrasonicator VialTweeter, biyolojik, biyokimyasal ve klinik laboratuvarlarda örnek hazırlama için birçok ultrasonik çözümden sadece biridir. Hielscher Ultrasonics, uygulamanız için ideal ultrasonik çözücüyü sunar, örneğin hücre lizisi, hücre ekstraksiyonu, doku homojenizasyonu, lizat çözündürme, çözünme, numune gaz giderme vb.
Doğrudan veya dolaylı sonikasyonu tercih ediyorsanız ve ultrasonik numune tedavisinin hedefinin ne olduğunu, saat ve günde kaç numune işlemeniz gerektiğini bize bildirin. Günlük çalışma rutininiz için size en uygun ultrasonik üniteyi önereceğiz!
Hielscher Ultrasonics'in dijital ultrasonik işlemcileri akıllı yazılım, otomatik veri kaydı, sıcaklık kontrolü, sonikasyon süresi, döngü / darbe modu ve örnek aydınlatma ve tarayıcı uzaktan kumandası için kolay ön ayar seçenekleri ile donatılmıştır. Ultrasonik cihazlarımızı mümkün olduğunca akıllı hale getirmeye çalışıyoruz, böylece araştırma ve çalışma rutininiz mümkün olduğunca rahat ve başarılı hale geliyor.
VialTweeter ile ultrasonik numune hazırlama protokolleri de dahil olmak üzere daha fazla uygulama bulmak için buraya tıklayın!