Sonikasyon ile SARS-CoV-2 Koronavirüsünün İnaktivasyonu İçin Protokol

Hielscher VialTweeter, SARS-COV-2 koronavirüsünü inaktive etmek için kullanılan benzersiz bir ultrasonik çoklu numune hazırlama ünitesidir. VialTweeter, aynı anda 10 adede kadar numune vialinin hazırlanmasına olanak tanır ve bu nedenle toplu numune işleme için ideal ünitedir.

VialTweeter ile SARS-CoV-2 Koronavirüsünün İnaktivasyonu

Fiksatif uzaklaştırıldıktan sonra tek katmanlar fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez yıkandı; ardından hücreler kazınarak 1mL MEM/%5 FBS içine alındı ve sonikasyona tabi tutuldu (güç ve genlik %100 düzeyindeyken 3 × 10 saniye açık, 10 saniye kapalı). Bu işlem için Hielscher ultrasonik işlemcisi VialTweeter donanımlı UP200St kullanıldı. Süpernatanlar, 3000 × g değerinde 10 dakika santrifüjlenerek berraklaştırıldı. SARS-CoV-2 koronavirüsünün inaktivasyonu için Welch ve ark. (2020) tarafından hazırlanan protokolün tamamını aşağıda okuyabilirsiniz:

Hücreler ve Virüs

Vero E6 hücreleri (Vero C1008; ATCC CRL-1586), %10 (v/v) fetal buzağı serumu (FCS) eklenmiş modifiye Eagle minimum esansiyel besiyerinde (MEM) kültüre edildi. Kullanılan virüs, PHE tarafından 29/01/2020 tarihinde Birleşik Krallık’taki ilk hasta kümesinden izole edilen SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020 suşuydu. Bu virüs 1. pasajda elde edildi ve inaktivasyon çalışmalarında 2. veya 3. pasajda kullanıldı.
SARS-CoV-2 inaktivasyonu için kullanılan reaktifler ve kimyasalların yanı sıra reaktif sitotoksisitesinin giderilmesi hakkında bilgi için lütfen Welch ve ark. (2020) tarafından hazırlanan bilimsel rapora bakın.

Deterjanlarla virüs inaktivasyonu – Welch ve ark. 2020 tarafından hazırlanan SARS-CoV-2 Koronavirüsü İnaktivasyon protokolü

SARS-CoV-2 İnaktivasyonu


Ticari ürünler için virüs preparatları (titreleri 1 × 10⁶ ile 1 × 10⁸ PFU/ml arasında değişen doku kültürü sıvısı), mevcut olduğunda üreticinin kullanım talimatlarında önerilen konsantrasyonlarda ve temas süreleri boyunca veya test laboratuvarlarının özellikle talep ettiği konsantrasyonlarda ve süreler boyunca reaktiflerle üç tekrarlı olarak muamele edildi. Üretici tarafından bir konsantrasyon aralığı verildiğinde, en düşük ürün/numune oranı test edildi (yani test ürününün önerilen en düşük konsantrasyonu). Üretici tarafından numune sıvısının reaktife hacim oranı belirtilmediği sürece, numune taşıma tüpü reaktifleri bir hacim doku kültürü sıvısına on hacim reaktif oranı kullanılarak test edildi. Deterjanlar, fiksatifler ve çözücüler belirtilen konsantrasyonlarda ve belirtilen süreler boyunca test edildi. Tüm inaktivasyon adımları ortamın oda sıcaklığında (18 – 25°C) gerçekleştirildi. Alternatif numune türlerinin test edilmesi için belirtilen numune matriksine 1:9 oranında virüs eklendi, ardından yukarıda açıklandığı gibi test reaktifleriyle muamele edildi. Tüm deneylerde, test reaktifi yerine eşdeğer hacimde PBS ile yalancı muamele uygulanmış üç tekrarlı kontrol numuneleri yer aldı. Gerekli temas süresinin hemen ardından, muamele edilmiş numunenin 1mL’si uygun şekilde seçilmiş filtrasyon matriksi kullanılarak işlendi. İnaktivasyon testi için reaktiflerin uzaklaştırılması, Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher) kullanılarak veya boş Pierce 10mL kapasiteli santrifüj kolonları (Thermo Fisher), 4mL paketlenmiş boncuk/reçine elde edilecek şekilde SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR veya Sephadex LH-20 ile doldurularak daha büyük bir santrifüj kolonu formatında gerçekleştirildi. Amicon filtreleriyle saflaştırma için, 2 × 500μl numune daha önce açıklanan yöntemle iki santrifüj filtresi kullanılarak saflaştırıldı ve ardından birleştirildi. Formaldehitin ve glutaraldehitle birlikte formaldehitin uzaklaştırılması için 1× 500μl numune hacmiyle bir filtre kullanıldı; numune işlemden sonra 500μl PBS içinde yeniden süspanse edildi ve 400ul MEM/%5 FBS içine eklendi. Enfekte tek katmanların inaktivasyonu için, 12,5 cm² yüzey alanına sahip flasklardaki Vero E6 hücreleri (2,5 × 10⁶ hücre/flask, 2,5mL MEM/%5 FBS içinde) MOI 0,001 ile enfekte edildi ve 37°C/%5 CO₂ ortamında 24 saat inkübe edildi. Süpernatan uzaklaştırıldı ve hücreler, oda sıcaklığında 15 veya 60 dakika boyunca 5mL formaldehit ya da formaldehit ve glutaraldehit kullanılarak fikse edildi. Fiksatif uzaklaştırıldı ve hücreler kazınarak 1mL MEM/%5 FBS içine alınmadan önce tek katmanlar PBS ile üç kez yıkandı; ardından VialTweeter donanımlı bir UP200St (Hielscher Ultrasound Technology) kullanılarak sonikasyona tabi tutuldu (güç ve genlik %100 düzeyindeyken 3 × 10 saniye açık, 10 saniye kapalı). Süpernatanlar, 3000 × g değerinde 10 dakika santrifüjlenerek berraklaştırıldı.


Welch ve ark. 2020 tarafından hazırlanan protokole göre ultrasonik VialTweeter ile SARS-CoV-2 koronavirüsünün inaktivasyonu için kullanılan reaktifin ayrıntıları

Hielscher VialTweeter kullanımını da içeren protokolün tamamına buradan ulaşabilirsiniz:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Gelişmiş Ultrasonik Parçalayıcılar ve Hücre Parçalayıcılar

Çoklu numune sonikatörü VialTweeter, biyoloji, biyokimya ve klinik laboratuvarlarında numune hazırlamaya yönelik çok sayıda ultrasonik çözümden yalnızca biridir. Hielscher Ultrasonics, hücre lizisi, hücre ekstraksiyonu, doku homojenizasyonu, lizatın çözünürleştirilmesi, çözündürme, numuneden gaz giderme vb. uygulamalarınız için ideal ultrasonik parçalayıcıyı sunar.
Saatte ve günde kaç numune işlemeniz gerektiğini, doğrudan mı yoksa dolaylı sonikasyonu mu tercih ettiğinizi ve ultrasonik numune işleminin amacını bize bildirin. Günlük çalışma rutininiz için size en uygun ultrasonik üniteyi önereceğiz!
Hielscher Ultrasonics tarafından üretilen dijital ultrasonik işlemciler; akıllı yazılım, otomatik veri kaydı, sıcaklık kontrolü, sonikasyon süresi ve çevrim/darbe modu için kolay ön ayar seçeneklerinin yanı sıra numune aydınlatması ve tarayıcı üzerinden uzaktan kontrol ile donatılmıştır. Araştırmalarınızın ve çalışma rutininizin mümkün olduğunca rahat ve başarılı olması için ultrasonik cihazlarımızı mümkün olduğunca akıllı hale getirmeye çalışıyoruz.
VialTweeter ile ultrasonik numune hazırlama protokollerini de içeren daha fazla uygulama bulmak için buraya tıklayın!