C. Elegans Numunelerinin Ultrasonik Hazırlanması

Bir nematod olan C. elegans, biyolojide yaygın olarak kullanılan bir model organizmadır. Analiz öncesi numune hazırlama; lizis, protein ve lipit ekstraksiyonunun yanı sıra RNA fragmantasyonu gerektirir ve bunlar sonikasyon yoluyla güvenilir biçimde gerçekleştirilebilir. Ultrasonik hücre parçalayıcıları, C. elegans numunelerinin hızlı hazırlanması için güvenilir, gelişmiş ve kullanımı kolay cihazlardır.

C. elegans Numunelerinin Ultrasonik Hazırlanması

Caenorhabditis elegans, genomik, gelişim biyolojisi ve hastalıkları araştırmak amacıyla araştırma laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılan yuvarlak solucanlardır. C. elegans genomundaki birçok genin insanlarda işlevsel karşılıkları vardır. Bu nedenle bu nematod, insan hastalıkları için son derece yararlı bir modeldir. C. elegans türünün yaygın kullanımını destekleyen diğer avantajlar; bakteri (ör. E. coli) içeren plaklarda kolay ve ucuz yetiştirilmesi, şeffaflığı, kolay işlenebilmesi ve solucanların dondurularak daha uzun süre saklanabilmesidir.
Protein ve lipit analizleri laboratuvarlarda rutin işlemlerdir ve ultrasonik numune hazırlama, C. elegans nematodlarını her gelişim evresinde (yani embriyolar, L1–L4 larvaları, yetişkinler) lize etmek için yerleşik yöntemdir. C. elegans, hedeflenen proteinlerin aşırı ekspresyonu için bir protein ekspresyon sistemi olarak da kullanıldığından, yüksek protein verimi sağlayan güvenilir ve tekrarlanabilir bir lizis ve protein ekstraksiyonu yöntemi gereklidir. Ultrasonik hücre parçalama ve ekstraksiyon sistemleri, prob tipi homojenizatörler ve çoklu numune sonikatörleri olarak sunulmaktadır. Kolay numune hazırlamaya ve her türlü numune boyutu ve sayısına yönelik çözümler sunan Hielscher Ultrasonics, laboratuvar işleminiz için ideal ultrasonik hücre parçalayıcısına sahiptir.

C. Elegans Parçalama ve Lizisi için Ultrasonik Protokoller

C. elegans türünün ultrasonik homojenizasyonu ve lizisi ile ardından gerçekleştirilen protein ve lipit ekstraksiyonu, farklı homojenizasyon ve lizis tamponları vb. kullanılarak çeşitli işlemlerle gerçekleştirilebilir. Tüm lizis protokollerinin ortak noktası, protein bozunmasını önlemek için numunelerin sürekli buz üzerinde tutulması gerektiğidir. Aşağıda, yüksek kaliteli protein veya lipit içeren C. elegans numunelerinin hazırlanması için bazı güvenilir ve hızlı ultrasonik lizis ve ekstraksiyon protokollerini sunuyoruz.

Ultrasonik C. elegans Lizisinin Avantajları

• güvenilir
• tekrarlanabilir
• hassas sıcaklık kontrollü
• güvenilir proses kontrolü
• nazik yöntem
• kolay uygulanabilir
• güvenli

C. elegans Numunelerinden Ultrasonik Protein Ekstraksiyonu

C. elegans solucanlarının ultrasonik lizisi ve protein ekstraksiyonu çeşitli protokoller kullanılarak gerçekleştirilebilir. Aşağıda, tekrarlanabilir protein ekstraksiyonu sonuçları için birkaç güvenilir ve hızlı lizis protokolü sunuyoruz.

Sonikasyonla C. elegans Solucanlarından Hızlı Sitozolik Ekstrakt Hazırlama

Aşağıdaki protokolle C. elegans lizatlarını 30 dakikadan kısa sürede hazırlayabilirsiniz.
C. elegans toplama
İstenen C. elegans solucanlarını fosfat tamponlu salin (PBS) içeren bir 1,5ml tüpe alın veya bir plaktan 1,5ml PBS ile yıkayarak toplayın. Pelet oluşturmak için 2000rpm hızında 1min santrifüjleyin. Numuneleri her zaman buz üzerinde tutun.
Ardından solucanları PBS ile iki kez yıkayın.
Daha sonra solucanları iki kez yıkamak için ddH₂O kullanın.
Solucanları en az 500ul homojenizasyon tamponunda (HB) yeniden süspanse edin. Solucan numuneleri artık ultrasonik lizis için hazırdır.
Daha yüksek protein ekstraktı kalitesi için bakteriyel kontaminasyonu azaltmak amacıyla solucanları her birinde 5min olmak üzere PBS ve steril, ultra saf suyla (ddH₂O) yıkamayı veya sükroz flotasyonu gerçekleştirmeyi tercih edebilirsiniz. Solucan numunelerini sürekli buz üzerinde tutun.

Ultrasonik C. elegans Lizis Protokolü

• Ultrasonik homojenizatörün kullanıma hazır olması için sonikatörü önceden hazırladığınızdan emin olun (prob takılı, sonikasyon programı önceden ayarlanmış). 

Sonikatörünüz bir standa monte edilmişse, numune tüplerinizi içeren buz banyosunu ultrasonik probun altına yerleştirin ve ultrasonik probu 1,5ml tüpün içine sokun.

• UP200St veya UP200Ht sonikatörüyle C. elegans lizisi için ultrasonik işlem, bir mikro uç (ör. 2mm S26d2 probu; soldaki resme bakın) kullanılarak %40 genlikte, aralarda 30sec duraklamalarla 1sec boyunca gerçekleştirilmelidir. Her biri 1 saniye süren ve aralarında 30sec duraklamalar bulunan 5 sonikasyon döngüsü C. elegans lizisi için idealdir. Lizisi ilk kez gerçekleştiriyorsanız, her darbeden sonra numunenin küçük alikotlarında lizisin ilerleyişini mikroskopla kontrol edebilirsiniz.
• Solucanlar parçalandığında lizis başarıyla tamamlanır. Aşırı sonikasyon, çekirdeklerin parçalanmasına yol açar ve numunenin viskoz hâle gelmesi veya köpürmesiyle görünür olur. Numune bozunmasını önlemek için gerekirse daha fazla darbe kullanın. Yüksek kaliteli protein ekstraktları elde etmek için her ultrasonik darbe döngüsünün süresini artırmayın.
• Ultrasonik olarak lize edilmiş solucanları 4ºC sıcaklıkta, 14.000rpm hızında 10min santrifüjleyerek hücre lizatını berraklaştırın.
• Ardından süpernatantı yeni bir tüpe aktarın ve immünopresipitasyon veya diğer analizler için hazırlayın.

Homojenizasyon tamponuna ilişkin not: Yukarıdaki ultrasonik lizis protokolü için homojenizasyon tamponunu aşağıdaki şekilde hazırlayın:

UIP400MTP Plaka Sonikatörü Kullanılarak 96 Kuyucuklu Plakalarda Yüksek Numune İşleme Kapasiteli C. elegans Lizisi

C. elegans Lizisi (yetişkin nematodlar)
UIP400MTP %80 genlik, 20 döngü (her sonikasyon döngüsü: 30 sec AÇIK, 30 sec KAPALI)
Lizis tamponu:

• Seçenek 1) %4 SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Seçenek 2) Ko-immünopresipitasyon (co-IP) için: 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, %0,5 NP-40 (Complete proteinaz inhibitörü kokteyli)

Yüksek Numune İşleme Kapasiteli DNA Fragmantasyonu
C. elegans (yetişkin nematodlar) DNA 200–300bp: UIP400MTP plaka sonikatörü – %80 genlik, 30 darbe olarak ayarlayın – her biri 30sec açık, 30sec kapalı

Yüksek numune işleme kapasiteli numune hazırlama için UIP400MTP Plaka Sonikatörü, çok kuyucuklu plakalardaki, mikrotitre plakalarındaki ve 96 kuyucuklu plakalardaki numuneleri eşit biçimde sonike eder

Nicel Afinite Saflaştırma Analizleri için C. elegans Türünün Ultrasonik Lizisi

C. elegans embriyoları (her tekrar için ∼2 milyon), genç gebe hermafroditlere çamaşır suyu uygulanarak üç biyolojik tekrar hâlinde taze olarak toplandı ve buz üzerinde (döngü: 0,5 s, genlik: %40–45, 5 darbe/seans, 5 seans, seanslar arası süre: 30 s; UP200S ultrasonik işlemcisi ve S26d2 mikro ucu (Hielscher Ultrasonics GmbH) kullanılarak) lizis tamponunda (toplam hacim: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, %10 gliserol, proteaz inhibitörü karışımı, %0,1 Nonidet P-40 Substitute) sonike edildi. Sonikasyondan sonra Nonidet P-40 Substitute %1’e kadar eklendi ve lizatlar 4°C sıcaklıkta 30 min uçtan uca döndürülerek inkübe edildi; ardından 4°C sıcaklıkta 20.000 × g ile 20 min santrifüjlendi. Berraklaştırılmış lizat daha sonra üst lipit tabakası bozulmadan aspire edildi ve ikiye bölünerek anti-GFP agaroz boncuklarına veya bloke edilmiş kontrol boncuklarına (40–50 μl) aktarıldı. 4°C sıcaklıkta 60–90 min uçtan uca döndürmeden sonra boncuklar, %0,1 Nonidet P-40 Substitute içeren lizis tamponuyla bir kez yıkandı; ardından tampon I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) veya tampon II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) ya da her ikisiyle iki kez yıkandı. GFP:MBK-2 pull-down işlemleri için farklı yıkama koşulları kullanılarak iki ayrı deney gerçekleştirildi. Proteinler, oda sıcaklığında 50 μl 6 m üre/2 M tiyoüre içinde orbital çalkalamayla elüe edildi. MBK-1::GFP pull-down deneyleri için proteinler, 90°C sıcaklıkta 50μl 8 m guanidinyum klorür içinde çalkalanarak iki kez elüe edildi ve ardından etanol çöktürmesi uygulandı. Elüe edilen protein numuneleri daha sonra çözelti içinde sindirildi.
(bkz. Chen et al., 2016)

Ultrasonik Solucan Homojenizasyonu ve Lizisi

C.elegans lizisi ve protein ekstraksiyonu işlemi için her numunede ilgili evreden 30.000 nematod toplandı ve buz soğukluğundaki S-basal ile yıkandı, 1500 rpm hızında 2 min. santrifüjlenerek yoğunlaştırıldı, kalıntı bakterileri uzaklaştırmak için buz soğukluğundaki S-basal ile altı kez yıkandı ve ardından kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde saklandı. Protein ekstraksiyonu için gebe yetişkin solucanların son S-basal yıkamasından sonra sıkı bir pelet oluşturmasına izin verildi. Solucan peletleri daha sonra 1 ml buz soğukluğundaki Ekstraksiyon Tamponunda [20 mM potasyum fosfat, pH 7,4, 2mM EDTA, %1 Triton-X-100, proteaz inhibitörleri (Sigma P2714)] yeniden süspanse edildi ve hemen işlendi.
∼30.000 gebe yetişkin solucan (∼100 mg yaş ağırlığa karşılık gelir), 1 ml buz soğukluğundaki ekstraksiyon tamponunda, prob tipi bir sonikatör (ör. MS2 mikro uçlu UP50H sonikatörü) kullanılarak buz üzerinde %40 genlikte, 3 sec açık ve 30 sec kapalı olacak şekilde 10 döngü boyunca sonike edildi. (bkz. Baskharan et al. 2012)

C. elegans Türünden Ultrasonik Lipit Ekstraksiyonu

Metabolomiğin bir dalı olan lipidomikte, biyolojik sistemlerin lipit bileşimi karakterize edilir ve analiz edilir. C. elegans, metabolik lipitlerin etkileşimini ve bunların sağlık ve yaşam süresi üzerindeki etkilerini araştırmak için lipidomikte yaygın olarak kullanılır.
Ultrasonik lizis ve ekstraksiyon, C. elegans embriyolarından, larvalarından ve yetişkin solucanlarından sfingolipitler gibi lipitleri serbestleştirmek için kullanılır. Ultrasonik işlem, solucan homojenatlarını hazırlamak ve ardından numuneden lipitleri ekstrakte etmek için kullanılır.
C. elegans Türünden Ultrasonik Lipit Ekstraksiyonu Protokolü
C. elegans peletini buz üzerinde çözdürün ve 0,5 ml ultrawater ile yeniden süspanse edin. 
C. elegans numunelerini sürekli buz üzerinde tutarak 1,5mL test tüplerinde sonike edin.
Sonikasyon için prob tipi bir sonikatör olan UP200Ht gibi bir cihaz, ultrasonik numune hazırlama ünitesi VialTweeter (10 numunenin eş zamanlı sonikasyonu) veya UIP400MTP (96 kuyucuklu plakalar gibi çok kuyucuklu plakaların sonikasyonu için) kullanılabilir.
UP200Ht sonikatörüyle ultrasonik lizis için S26d2 mikro ucunu kullanın. Dijital menüde ultrasonik döngü modunu önceden ayarlayın. Genliği %10’a ve sonikasyon döngü modunu, her ultrasonik darbe uygulaması arasında 30 sec. duraklama olacak şekilde 2 sec darbelerden oluşan 20 döngüye ayarlayın.
Süpernatantları vidalı kapaklı cam tüplere aktarın. 
Her cam tüpe 1 ml ultrawater ve ardından 6 ml kloroform/metanol (oran = 2:1) karışımı ekleyerek Folch ekstraksiyonu gerçekleştirin.
Her cam tüpü 4 kez 30 sec vorteksleyin. 
Faz ayrımını daha da iyileştirmek için tüpleri 1.258 x g ile 15 min santrifüjleyin (Eppendorf, 5810 R). 
Alt hidrofobik fraksiyonu bir cam Pasteur pipetiyle temiz bir cam tüpe aktarın. 
Alt hidrofobik fraksiyonu azot akışı altında bir azot evaporatöründe kurutun. 
Kurutulmuş peleti kullanıma kadar -80 °C sıcaklıktaki bir dondurucuda saklayın. 


Solucan Lizatlarının Ultrasonik Hazırlanması

Solucan lizatı: L4 evresindeki solucanlar toplandı ve tüm bakterileri uzaklaştırmak amacıyla M9 tamponuyla (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl ve 0,87 mM MgSO₄) üç kez yıkandı. M9 tamponu mümkün olduğunca uzaklaştırıldıktan sonra solucanlar lizis tamponunda yeniden süspanse edildi: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM β-gliserol fosfat, %0,1 (v/v) Triton X-100, 50 mM sodyum florür, 1 mM sodyum ortovanadat, 5 mM sodyum pirofosfat, 0,2 mM fenilmetansülfonilflorür ve proteaz inhibitörü. Solucanlar sıvı azotta donduruldu ve 37°C sıcaklıkta çözdürüldü; bu işlem üç kez yapıldı. Ardından solucanlar, 10 numune tüpünün eş zamanlı hazırlanması için ultrasonik VialTweeter ünitesiyle kuru buz üzerinde sonike edildi. Sonikasyon, %50 genlikte 10 döngü hâlinde, her döngü 2 sec. sürecek ve sonikasyon uygulamaları arasında 30 sec duraklama olacak şekilde gerçekleştirildi. Daha sonra numuneler 12.000 rpm hızında, 4°C sıcaklıkta 15 min santrifüjlendi. Süpernatant toplandı ve -70°C sıcaklıkta saklandı. Bir alikot, Bradford analiziyle protein miktar tayini için kullanıldı.
Toplam glutatyon, GSH ve GSSG tayini: Glutatyon miktar tayini için lizat hazırlama ve tayin aynı gün gerçekleştirildi. Glukozla beslenen ve kontrol grubundaki L4 larvaları toplandı ve M9 tamponuyla üç kez yıkandı. M9 tamponu mümkün olduğunca uzaklaştırıldıktan sonra solucanlar buz soğukluğundaki metafosforik asitte (%5 w/v) yeniden süspanse edildi; ardından solucanlar ultrasonik VialTweeter ünitesiyle buz içinde %50 genlikte, her biri 2 sec. süren ve aralarında 30 sec. duraklama bulunan on sonikasyon döngüsü boyunca sonike edildi. Daha sonra 12.000 rpm hızında, 4 ̊C sıcaklıkta 15 min santrifüjlendi.
(bkz. Alcántar-Fernández et al., 2018)

İmmünopresipitasyon ve Western Blotlama Öncesi C. elegans Numune Hazırlama

Kısaca, embriyonik ekstraktlar için C. elegans L1 larvaları, büyük ölçekli sıvı S-besiyeri kültürlerinde yetişkinliğe kadar büyütüldü. Embriyolar standart çamaşır suyu yöntemiyle toplandı ve lizis tamponunda (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, %8,7 gliserol, %0,05 NP-40, 1􏰅 Proteaz İnhibitörü Kokteyli ve 1􏰅 Fosfataz İnhibitörü Kokteyli I ve II) süspanse edildi, sıvı azotta hızla donduruldu ve mikro uçlu bir sonikatör, örneğin UP200Ht sonikatörü ve S26d2 kullanılarak %30 genlikte 10 s boyunca 10 darbeyle ultrasonik hücre parçalama yoluyla lize edildi. Daha fazla sayıda numunenin hazırlanması gerekiyorsa ultrasonik VialTweeter ünitesi veya kuyucuklu plakalar için MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP önerilir. Sonikasyondan sonra ekstraktlar 4°C sıcaklıkta 30.000g ile 20 min santrifüjlenerek ön berraklaştırma işleminden geçirildi. Ön berraklaştırma işleminden geçirilen ekstrakt (300µg toplam protein), protein A-agaroza çapraz bağlanmış 40µ􏰂g afiniteyle saflaştırılmış anti-CDC-25.1 antikoruyla (bu çalışma) inkübe edildi veya kontrol olarak protein A-agaroza çapraz bağlanmış benzer miktarda tavşan immünoglobulini (Ig)G kullanıldı; işlemler, proteinlerin matrikse özgül olmayan bağlanmasını azaltan %1 NP-40 içeren toplam 200µl lizis tamponunda gerçekleştirildi. Numuneler 4°C sıcaklıkta 1 h döndürüldü, boncuklar lizis tamponuyla üç kez yıkandı ve 30µl glisin/HCl ve 200 mM NaCl, pH 2,2 ile elüe edildi. İmmünopresipitasyondan sonra elüatlar 30µ􏰂l SDS numune tamponunda seyreltildi, 95°C sıcaklıkta 4 min ısıtıldı ve tipik olarak girdi için toplamın %3’ü, elüatlar için %30’u SDS-PAGE’e uygulandı; ardından anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubikuitin (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) veya anti-􏰁β-aktin (1:2000) antikorlarıyla Western blotlama gerçekleştirildi. Ekstraktların immünopresipitasyona tabi tutulmadığı durumlarda, bu ekstraktlardan elde edilen aynı miktarda toplam protein SDS numune tamponunda yeniden süspanse edildi, 95°C sıcaklıkta ısıtıldı ve ardından doğrudan SDS-PAGE’e uygulanarak Western blotlamayla analiz edildi. (bkz. Segref et al. 2020)

Hassas Sıcaklık Kontrolü Altında Ultrasonik Lizis

Biyolojik numunelerle çalışırken hassas ve güvenilir sıcaklık kontrolü kritik öneme sahiptir. Yüksek sıcaklıklar numunelerde ısıl kaynaklı protein bozunmasını başlatır.
Tüm mekanik numune hazırlama teknikleri gibi sonikasyon da ısı üretir. Ancak VialTweeter kullanıldığında numunelerin sıcaklığı iyi kontrol edilebilir. Numunelerinizi analiz için VialTweeter ve VialPress ile hazırlarken sıcaklıklarını izlemek ve kontrol etmek için çeşitli seçenekler sunuyoruz.

1. Numune sıcaklığının izlenmesi: VialTweeter ünitesini çalıştıran UP200St ultrasonik işlemcisi, akıllı yazılım ve takılabilir bir sıcaklık sensörüyle donatılmıştır. Sıcaklık sensörünü UP200St işlemcisine bağlayın ve sıcaklık sensörünün ucunu numune tüplerinden birine yerleştirin. Dijital renkli dokunmatik ekran aracılığıyla UP200St işlemcisinin menüsünde numune sonikasyonunuz için belirli bir sıcaklık aralığı ayarlayabilirsiniz. Sonikatör, maksimum sıcaklığa ulaşıldığında otomatik olarak durur ve numune sıcaklığı ayarlanan sıcaklık ∆ aralığının alt değerine düşene kadar bekler. Ardından sonikasyon otomatik olarak yeniden başlar. Bu akıllı özellik, ısı kaynaklı bozunmayı önler.
2. VialTweeter bloğu önceden soğutulabilir. Titanyum bloğu önceden soğutmak için VialTweeter bloğunu (yalnızca sonotrot, dönüştürücü olmadan!) buzdolabına veya dondurucuya koymak, numunedeki sıcaklık artışını geciktirmeye yardımcı olur. Mümkünse numunenin kendisi de önceden soğutulabilir.
3. Sonikasyon sırasında soğutma için kuru buz kullanın. Kuru buzla doldurulmuş sığ bir tepsi kullanın ve ısının hızla dağılabilmesi için VialTweeter ünitesini kuru buzun üzerine yerleştirin.

Lizis Uygulamanız için En Uygun Ultrasonik Hücre Parçalayıcısını Bulun

Hielscher Ultrasonics; laboratuvar, tezgâh üstü ve endüstriyel ölçekli sistemler için yüksek performanslı ultrasonik hücre parçalayıcıları ve homojenizatörler üreten, uzun yıllara dayanan deneyime sahip bir üreticidir. Bakteriyel hücre kültürünüzün büyüklüğü, araştırma veya üretim hedefiniz ve saat ya da gün başına işlenecek hücre hacmi, uygulamanız için doğru ultrasonik hücre parçalayıcısını bulmada temel etkenlerdir.
Hielscher Ultrasonics, çoklu numunelerin (10 viyale kadar) ve büyük sayıda numunenin (yani mikrotitre plakaları / 96 kuyucuklu plakalar) eş zamanlı sonikasyonu için çeşitli çözümler sunar; bunlar, 50–400 watt arasında farklı güç seviyelerine sahip klasik prob tipi laboratuvar sonikatöründen, büyük ölçekli üretimde ticari hücre parçalama ve protein ekstraksiyonu için ünite başına 16.000watt değerine kadar güce sahip tamamen endüstriyel ultrasonik işlemcilere uzanır. Tüm Hielscher sonikatörleri tam yük altında 24/7/365 çalışma için üretilmiştir. Sağlamlık ve güvenilirlik, ultrasonik cihazlarımızın temel özellikleridir.
Tüm dijital ultrasonik homojenizatörler; ultrasonik cihazı laboratuvar ve üretim tesislerinde kullanışlı bir çalışma aracına dönüştüren akıllı yazılım, renkli dokunmatik ekran ve otomatik veri kaydıyla donatılmıştır.
Biyolojik numunelerinizde hangi hücre türlerini, ne hacimde, ne sıklıkla ve hangi hedefle işlemeniz gerektiğini bize bildirin. Proses gereksinimleriniz için en uygun ultrasonik hücre parçalayıcısını önereceğiz.

Aşağıdaki tablo, kompakt el tipi homojenizatörlerden ve çoklu numune sonikatörlerinden ticari uygulamalar için endüstriyel ultrasonik işlemcilere kadar ultrasonik sistemlerimizin yaklaşık işleme kapasitesi hakkında fikir verir: