C. Elegans Numunelerinin Ultrasonik Hazırlanması

Bir nematod solucanı olan C. elegans, biyolojide yaygın olarak kullanılan bir model organizmadır. Analizden önce numune hazırlama, sonikasyon yoluyla güvenilir bir şekilde gerçekleştirilebilen lizis, protein ve lipid ekstraksiyonunun yanı sıra RNA parçalanmasını gerektirir. Ultrasonik hücre bozucular, C. elegans numunelerinin hızlı bir şekilde hazırlanması için güvenilir, sofistike ve kullanımı kolay cihazlardır.

C. Elegans Numunelerinin Ultrasonik Hazırlanması

C. elegans, genomik, gelişim biyolojisi ve hastalıkları araştırmak için araştırma laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılan yuvarlak kurtlardır. C. elegans genomundaki birçok genin insanlarda işlevsel karşılıkları vardır. Bu nedenle, nematod solucanı insan hastalıkları için son derece yararlı bir modeldir. C. elegans'ın geniş kullanımı için diğer avantajlar, bakteri (örneğin, E. coli) içeren plakalar üzerinde kolay ve ucuz yetiştirilmesi, şeffaflığı, rahat kullanımı ve solucanları daha uzun süre dondurma ve saklama olasılığıdır.
Protein ve lipid analizi laboratuvarlarda düzenli prosedürlerdir ve ultrasonik numune hazırlama, her gelişim aşamasında (yani embriyolar, larvalar L1-L4, yetişkinler) C. elegans nematodlarını parçalamak için yerleşik bir yöntemdir. C. elegans, hedeflenen proteinleri aşırı eksprese etmek için protein ekspresyon sistemi olarak da kullanıldığından, yüksek protein verimi veren güvenilir, tekrarlanabilir bir lizis ve protein ekstraksiyon yöntemi gereklidir. Ultrasonik hücre bozma ve ekstraksiyon sistemleri, prob tipi homojenizatörler ve çok örnekli ultrasonikatörler olarak mevcuttur. Uygun numune hazırlama ve her türlü numune boyutu numarasına hitap eden Hielscher Ultrasonics, laboratuvar prosedürünüz için ideal ultrasonik hücre bozucuya sahiptir.

C. elegans Bozulması ve Lizisi için Ultrasonik Protokoller

C. elegans'ın ultrasonik homojenizasyonu ve parçalanması ve ardından protein ve lipit ekstraksiyonu, farklı homojenizasyon ve lizis tamponları vb. kullanılarak çeşitli prosedürler kullanılarak gerçekleştirilebilir. Tüm lizis protokollerinin ortak noktası, protein bozulmasını önlemek için numunelerin sürekli olarak buz üzerinde tutulması gerektiğidir. Aşağıda, yüksek kaliteli protein veya lipid içeren C. elegans örneklerinin hazırlanması için size bazı güvenilir ve hızlı ultrasonik lizis ve ekstraksiyon protokolleri sunuyoruz.

Ultrasonik C. elegans Lysis'in Avantajları

• Güvenilir
• Tekrarlanabilir
• Hassas sıcaklık kontrollü
• Güvenilir proses kontrolü
• nazik yöntem
• Uygulaması kolay
• Kasa

C. elegans Örneklerinden Ultrasonik Protein Ekstraksiyonu

C. elegans solucanlarının ultrasonik lizisi ve protein ekstraksiyonu çeşitli protokoller kullanılarak gerçekleştirilebilir. Aşağıda, tekrarlanabilir protein ekstraksiyon sonuçları için size birkaç güvenilir ve hızlı lizis protokolü sunuyoruz.

Sitozolik Ekstraktın C. elegans Solucanlarından Sonikasyon ile Hızlı Hazırlanması

Aşağıdaki protokol ile C. elegans lizatlarını 30 dakikadan daha kısa sürede hazırlayabilirsiniz.
C. elegans Koleksiyonu
İstenilen C. elegans solucanlarını 1.5 ml'lik bir tüp fosfat tamponlu salin (PBS) içine alın veya 1.5 ml PBS içeren bir plakadan yıkayın. Peletlemek için 2000 rpm'de 1 dakika santrifüjleyin. Numuneleri her zaman buz üzerinde tutun.
Ardından, solucanları PBS ile iki kez yıkayın.
Daha sonra solucanları ddH ile iki kez yıkayın₂O.
Solucanları en az 500ul homojenizasyon tamponunda (HB) yeniden süspanse edin. Solucan örnekleri artık ultrasonik lizis için hazırdır.
Daha yüksek protein özü kalitesi için, solucanları PBS'de ve steril, ultra saf suda (ddH) 5 dakika boyunca yıkayarak bakteriyel kontaminasyonu azaltmak isteyebilirsiniz.₂O) veya sükroz yüzdürme gerçekleştirin. Solucan örneklerini sürekli olarak buz üzerinde tutun.

Ultrasonik C. elegans Lizis Protokolü

• Ultrasonik homojenizatörün kullanıma hazır olması için ultrasonicator'ı önceden hazırladığınızdan emin olun (prob monte edilmiş, sonication programı önceden ayarlanmış).

Ultrasonicator'ınız standa monte edilmişse, örnek tüplerinizle birlikte buz banyosunu ultrasonik probun altına yerleştirin ve ultrasonik probu 1.5ml tüpe yerleştirin.

• UP200St veya UP200Ht ile C. elegans lizisi için, ultrasonikasyon, aralarında 30 saniyelik duraklamalarla 1 saniye boyunca% 40 genlikte bir mikro uç (örneğin, 2 mm prob S26d2; soldaki resme bakın) kullanılarak yapılmalıdır. 30 saniyelik duraklamalarla her 1 saniye için 5 sonikasyon döngüsü C. elegans lizisi için idealdir. Lizisi ilk kez gerçekleştiriyorsanız, bir mikroskop kullanarak her darbeden sonra numunenin küçük alikotlarında lizis ilerlemesini kontrol edebilirsiniz.
• Solucanlar bozulduğunda lizis başarıyla tamamlanır. Aşırı sonikasyon, çekirdeklerin kırılmasına neden olur ve numune viskoz veya köpük aldığında görünür hale gelir. Numunenin bozulmasını önlemek için gerekirse daha fazla darbe kullanın. Yüksek kaliteli protein özleri elde etmek için her ultrasonik nabız döngüsünün süresini artırmayın.
• Ultrasonik olarak parçalanmış solucanları 4ºC'de 10 dakika boyunca 14.000 rpm'de santrifüjleyerek hücre lizatını temizleyin.
• Ardından, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve immünopresipitasyon veya diğer tahliller için hazırlanın.

Homojenizasyon tamponu için not: Yukarıdaki ultrasonik lizis protokolü için homojenizasyon tamponunu aşağıdaki gibi hazırlayın:

Yüksek Verimli Lizis C. elegans UIP400MTP Plakalı Sonikatör kullanılarak 96 Kuyulu Plakalarda

C. elegans Lysis (yetişkin nematodlar)
UIP400MTP% 80 genlik, 20 döngü (her sonikasyon döngüsü: 30 saniye AÇIK, 30 saniye KAPALI)
Lizis tamponu:

• Seçenek 1) %4 SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Seçenek 2) Ko-immünopresipitasyon (co-IP) için: 10 mM Tris HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, %0.5 NP-40 (Tam proteinaz inhibitörü kokteyli)

Yüksek Verimli DNA Parçalanması
C. elegans (yetişkin nematodlar) DNA 200-300bp: UIP400MTP plakalı sonikatör – % 80 genlik, 30 darbe ayarlayın – her 30 saniyede bir açık, 30 saniye kapalı

Yüksek verimli numune hazırlama için UIP400MTP Plakalı Sonikatör, çok kuyulu, mikrotitre plakalar ve 96 oyuklu plakalardaki numuneleri eşit şekilde sonikleştirir

Kantitatif Afinite Saflaştırma Testleri için C. elegans'ın Ultrasonik Lizisi

C. elegans embriyoları (replikat başına ∼2 milyon), genç gravid hermafroditlerin ağartılmasıyla biyolojik üçlü olarak taze hasat edildi ve buz üzerinde sonikasyon yapıldı (döngü: 0.5 s, genlik:% 40-45, 5 vuruş / seans, 5 seans, seanslar arasındaki aralık: 30 s; UP200S ultrasonik işlemci mikro uçlu S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) ile lizis tamponunda (toplam hacim: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7.4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT,  gliserol, proteaz inhibitörü karışımı, %0.1 Nonidet P-40 Substitute). Sonikasyondan sonra, Nonidet P-40 Substitute% 1'e kadar ilave edildi ve lizatlar, 30 dakika boyunca 4 ° C'de kuyruk dönüşü üzerinde baş üzerinde inkübe edildi, ardından 4 ° C'de 20 dakika boyunca 20.000 × g'da santrifüjleme yapıldı. Temizlenmiş lizat daha sonra üst lipid tabakasını bozmadan aspire edildi ve yarı yarıya ya anti-GFP agaroz boncuklarına ya da bloke kontrol boncuklarına (40-50 μl) bölündü. 60-90 dakika boyunca 4 ° C'de kuyruk üzerinde baş dönüşünden sonra, boncuklar bir kez% 0.1 Nonidet P-40 İkamesi içeren lizis tamponu ile yıkandı, ardından tampon I'de (25 mm Tris-HCl, pH 7.4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) veya tampon II'de (1 mm Tris-HCl, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) veya her ikisi. GFP:MBK-2 pull-down makineleri için, farklı yıkama koşulları kullanılarak iki ayrı deney gerçekleştirilmiştir. Proteinler, oda sıcaklığında 50 μl 6 m üre / 2 M tiyoüre içinde orbital çalkalama ile ayrıştırıldı. MBK-1::GFP pull-down deneyleri için, proteinler 90 ° C'de 50μl 8 m guanidinyum klorür içinde çalkalanarak iki kez ayrıştırıldı ve ardından etanol çökeltildi. Ayrıştırılmış protein örnekleri daha sonra çözelti içinde sindirildi.
(bkz. Chen ve diğerleri, 2016)

Ultrasonik Solucan Homojenizasyonu ve Lizisi

C.elegans lizisi ve protein ekstraksiyon prosedürü için, numune başına ilgili aşamadan 30.000 nemotod toplandı ve buz gibi soğuk S-bazal içinde yıkandı, 2 dakika boyunca 1500 rpm'de santrifüjleme ile konsantre edildi, kalan bakterileri uzaklaştırmak için buz gibi soğuk S-bazal ile altı kez yıkandı ve daha sonra kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde saklandı. Protein ekstraksiyonu için, son S-bazal yıkamadan sonra gravid-yetişkin solucanların kompakt bir pelet oluşturmasına izin verildi. Solucan peletleri daha sonra 1 ml buz gibi soğuk Ekstraksiyon Tamponu [20 mM potasyum fosfat, pH 7.4, 2mM EDTA, %1 Triton-X-100, proteaz inhibitörleri (Sigma P2714)] içinde yeniden süspanse edildi ve hemen işlendi.
∼30.000 gravid-yetişkin solucan (∼100 mg ıslak ağırlığa karşılık gelir), 10 döngü boyunca% 40 genlikte% 40 genlikte bir prob tipi ultrasonicator (örneğin ∼100 mg ıslak ağırlık MS2 ile UP50H) kullanılarak buz üzerinde sonikasyon yapıldı 3 saniye açık, 30 saniye kapalı, 1 ml buz gibi soğuk ekstraksiyon tamponunda. (bkz. Baskharan ve ark. 2012)

C. elegans'tan Ultrasonik Lipid Ekstraksiyonu

Metabolomiklerin bir dalı olan lipidomikte, biyolojik sistemlerin lipid tamamlayıcısı karakterize edilir ve analiz edilir. C. elegans, metabolik lipidlerin etkileşimini ve bunların sağlık ve yaşam süresi üzerindeki etkilerini araştırmak için lipidomikte yaygın olarak kullanılmaktadır.
Ultrasonik lizis ve ekstraksiyon, C. elegans embriyolarından, larvalarından ve yetişkin solucanlardan sfingolipidler gibi lipitleri serbest bırakmak için kullanılır. Ultrasonikasyon, solucan homojenatlarını hazırlamak ve daha sonra lipitleri numuneden çıkarmak için kullanılır.
C. elegans'tan Ultrasonik Lipid Ekstraksiyonu için Protokol
C. elegans peletini buz üzerinde çözdürün ve 0,5 ml ultra su ile tekrar süspanse edin. 
C. elegans örneklerini 1,5 mL test tüplerinde sonikasyon yaparken, örnekleri sürekli olarak buz üzerinde tutun.
Sonikasyon, gibi bir prob-ultrasonicstor kullanılarak gerçekleştirilebilir. UP200Ht, ultrasonik numune hazırlama ünitesi VialTweeter (10 numunenin aynı anda sonikasyonu) veya UIP400MTP (96 oyuklu plakalar gibi çok kuyulu plakaların sonikasyonu için). UP200Ht ile ultrasonik liz için mikro uç S26d2'yi kullanın. Dijital menüde ultrasonik döngü modunu önceden ayarlayın. Genliği% 10'a ve 2 saniyelik sonikasyon döngüsü modunu, 30 saniyelik bir duraklama ile 20 döngülük darbelere ayarlayın.
Süpernatanları vidalı kapaklı cam tüplere aktarın. 
Her bir cam tüpe 1 ml ultrawater ekleyerek ve ardından her bir cam tüpe 6 ml kloroform/metanol (oran = 2: 1) karışımı ekleyerek Folch ekstraksiyonunu gerçekleştirin.
Her cam tüpü 4 kez 30 saniye boyunca vorteksleyin. 
Faz ayrımını daha da geliştirmek için tüpleri 1,258 x g'da 15 dakika (Eppendorf, 5810 R) santrifüjleyin. 
Alt hidrofobik fraksiyonu bir cam Pasteur pipeti ile temiz bir cam tüpe aktarın. 
Alt hidrofobik fraksiyonu bir nitrojen buharlaştırıcıda nitrojen akışı altında kurutun. 
Kurutulmuş peleti kullanana kadar -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın.

Solucan Lizatlarının Ultrasonik Hazırlanması

Solucan lizatı: L4 evresi solucanlar hasat edildi ve M9 tamponu (42.26 mM Na ) ile üç kez yıkandı₂HPO (Sorumlu Çalışan)₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85.56 mM NaCl ve 0.87 mM MgSO₄) tüm bakterileri uzaklaştırmak için. Mümkün olduğu kadar M9 tamponu çıkarıldıktan sonra, solucanlar lizis tamponunda yeniden süspanse edildi: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM fosfat β-gliserol, %0.1 (h/h) Triton X-100, 50 mM sodyum florür, 1 mM sodyum ortovanadat, 5 mM sodyum pirofosfat, 0.2 mM fenilmetansülfonilflorür ve proteaz inhibitörü. Solucanlar sıvı nitrojen içinde donduruldu ve üç kez 37 ° C'de çözüldü, daha sonra solucanlar, 10 numune tüpünün aynı anda hazırlanması için ultrasonik bir VialTweeter ünitesi ile kuru buz üzerinde sonikasyona tabi tutuldu. Sonikasyon, 2 saniyelik 10 döngüde% 50 genlikte gerçekleştirildi. sonikasyon patlamaları arasında 30 saniyelik duraklama ile. Daha sonra numuneler 12000 rpm'de 4°C'de 15 dakika santrifüjlendi. Süpernatan toplandı ve -70 ° C'de saklandı. Bradford testi ile protein miktar tayini için bir alikot kullanıldı.
Total glutatyon, GSH ve GSSG tayini: Glutatyon miktar tayini için lizatlar ve tayin aynı gün yapıldı. Glukoz ile beslenen ve kontrol L4 larvaları hasat edildi ve üç kez M9 tamponu ile yıkandı. M9 tamponunun mümkün olduğu kadar çıkarılmasından sonra, solucanlar buz gibi soğuk metafosforik asit (% 5 w / v) içinde yeniden süspanse edildi, daha sonra solucanlar, 2 saniyelik on sonikasyon döngüsünde% 50 genlikte% 50 genlikte ultrasonik bir VialTweeter ile buzda sonikasyona tabi tutuldu. her döngü arasında 30 saniye duraklama ile. Daha sonra 12000 rpm'de 4 ̊C'de 15 dakika santrifüjlendi.
(cf. Alcántar-Fernández ve diğerleri, 2018)

C. elegans İmmünopresipitasyon ve Western Blotting Öncesi Numune Hazırlama

Kısaca, embriyonik ekstraktlar için, C. elegans L1 larvaları büyük ölçekli sıvı S-medium kültürlerinde yetişkinliğe kadar büyütülmüştür. Embriyolar standart ağartma yöntemi kullanılarak toplandı ve lizis tamponunda süspanse edildi (50 mM Tris, pH 7.5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, %8.7 gliserol, %0.05 NP-40, 1 Proteaz İnhibitör Kokteyli ve 1 Fosfataz İnhibitör Kokteyli I ve II), hızlı bir şekilde sıvı nitrojen içinde donduruldu ve gibi mikro uçlu bir ultrasonikatör kullanılarak ultrasonik hücre bozulması ile parçalandı. UP200Ht & genlikte 2 saniye boyunca 10 darbe için S30d30 ile. Daha fazla sayıda numune hazırlanması gerekiyorsa, ultrasonik VialTweeter veya kuyu plakaları için MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP önerilir. Sonikasyondan sonra, ekstraktlar 4 ° C'de 20 dakika boyunca 30.000 g'da santrifüjleme ile önceden temizlendi. Önceden temizlenmiş ekstrakt (300μg toplam protein), protein A-agaroza çapraz bağlı 40μμg anti-CDC-25.1 afinite saflaştırılmış antikor (bu çalışma) ile inkübe edildi veya kontrol olarak, benzer miktarda tavşan immünoglobulini (Ig) protein A-agaroza çapraz bağlanmış,% 1 NP-40 içeren toplam 200μl lizis tamponu hacminde kullanıldı, bunların dahil edilmesi, proteinlerin matrise spesifik olmayan bağlanmasını azalttı. Numuneler 4 ° C'de 1 saat döndürüldü, boncuklar lizis tamponu ile üç kez yıkandı ve 30μl glisin / HCl ve 200 mM NaCl, pH 2.2 ile ayrıştırıldı. İmmünopresipitasyondan sonra, elüatlar 30μμΰ�l SDS numune tamponu içinde seyreltildi, 4 dakika boyunca 95 ° C'ye ısıtıldı ve tipik olarak girdi için toplamın% 3'ü ve elüatlar için% 30'u SDS-PAGE'ye uygulandı ve ardından anti-CDC-25.1 (1: 400), anti-LIN-23 (1: 750), anti-ubikitin (1: 1000), anti-GSK3 (1: 500) (1: 500) veya anti-oksidan β aktin (1: 2000) antikorları. Ekstraktların immünopresipitasyona tabi tutulmadığı durumlarda, bu ekstraktlardan türetilen aynı miktarda toplam protein, SDS numune tamponunda yeniden süspanse edildi, 95 ° C'ye ısıtıldı ve daha sonra doğrudan SDS-PAGE'ye uygulandı ve Western blotlama ile analiz edildi. (bkz. Segref ve ark. 2020)

Prescise Sıcaklık Kontrolü Altında Ultrasonik Lizis

Biyolojik numunelerle çalışırken hassas ve güvenilir sıcaklık kontrolü çok önemlidir. Yüksek sıcaklıklar, numunelerde termal olarak indüklenen protein bozunmasını başlatır.
Tüm mekanik numune hazırlama teknikleri gibi, sonikasyon da ısı oluşturur. Bununla birlikte, VialTweeter kullanılırken numunelerin sıcaklığı iyi kontrol edilebilir. Numunelerinizi analiz için VialTweeter ve VialPress ile hazırlarken sıcaklıklarını izlemek ve kontrol etmek için size çeşitli seçenekler sunuyoruz.

1. Numune sıcaklığının izlenmesi: VialTweeter'ı çalıştıran ultrasonik işlemci UP200St, akıllı bir yazılım ve takılabilir bir sıcaklık sensörü ile donatılmıştır. Sıcaklık sensörünü UP200St'ye takın ve sıcaklık sensörünün ucunu numune tüplerinden birine yerleştirin. Dijital renkli dokunmatik ekran aracılığıyla, UP200St'nin menüsünde örnek sonikasyonunuz için belirli bir sıcaklık aralığı ayarlayabilirsiniz. Ultrasonicator, maksimum sıcaklığa ulaşıldığında otomatik olarak duracak ve örnek sıcaklığı, ayarlanan sıcaklığın ∆ daha düşük değerine düşene kadar duraklayacaktır. Sonra sonikasyon otomatik olarak tekrar başlar. Bu akıllı özellik, ısı kaynaklı bozulmayı önler.
2. VialTweeter bloğu önceden soğutulabilir. Titanyum bloğu önceden soğutmak için VialTweeter bloğunu (yalnızca dönüştürücüsüz sonotrot!) buzdolabına veya dondurucuya koyun, numunedeki sıcaklık artışını ertelemeye yardımcı olur. Mümkünse, numunenin kendisi de önceden soğutulabilir.
3. Sonikasyon sırasında soğutmak için kuru buz kullanın. Kuru buzla dolu sığ bir tepsi kullanın ve ısının hızla dağılabilmesi için VialTweeter'ı kuru buzun üzerine yerleştirin.

Lizis Uygulamanız için En Uygun Ultrasonik Hücre Bozucuyu Bulun

Hielscher Ultrasonics, laboratuvarlar, tezgah üstü ve endüstriyel ölçekli sistemler için yüksek performanslı ultrasonik hücre bozucular ve homojenizatörler uzun süredir deneyimli bir üreticidir. Bakteri hücre kültürü boyutunuz, araştırma veya üretim hedefiniz ve saat veya gün başına işlenecek hücre hacmi, uygulamanız için doğru ultrasonik hücre bozucuyu bulmak için temel faktörlerdir.
Hielscher Ultrasonics, çoklu numunelerin (10 şişeye kadar) yanı sıra kütle numunelerinin (yani, mikrotitre plakaları / 96 kuyulu plakalar), 50 ila 400 watt arasında farklı güç seviyelerine sahip klasik prob tipi laboratuar ultrasonicator'ın eşzamanlı sonikasyonu için çeşitli çözümler sunar. Tüm Hielscher ultrasonicators tam yük altında 24/7/365 operasyon için üretilmiştir. Sağlamlık ve güvenilirlik, ultrasonik cihazlarımızın temel özellikleridir.
Tüm dijital ultrasonik homojenizatörler, ultrasonik cihazı laboratuvar ve üretim tesislerinde uygun bir çalışma aracı haline getiren akıllı yazılım, renkli dokunmatik ekran ve otomatik veri protokolü ile donatılmıştır.
Biyolojik numunelerinizi işlemek için ne tür hücreler, hangi hacim, hangi sıklıkta ve hangi hedefle yapmanız gerektiğini bize bildirin. Proses gereksinimleriniz için size en uygun ultrasonik hücre bozucuyu önereceğiz.

Aşağıdaki tablo, kompakt el tipi homojenizatörler ve MultiSample Ultrasonikatörlerden ticari uygulamalar için endüstriyel ultrasonik işlemcilere kadar ultrasonik sistemlerimizin yaklaşık işleme kapasitesinin bir göstergesini vermektedir: