Doku ve Hücre Kültürlerinden Ultrasonik Protein Ekstraksiyonu
- Protein ekstraksiyonu, proteomikte temel bir numune hazırlama adımıdır.
- Proteinler bitki ve hayvan dokularından, mayalardan ve mikroorganizmalardan ekstrakte edilebilir.
- Sonikasyon, kısa bir ekstraksiyon süresinde yüksek protein verimleri sağlayan güvenilir ve verimli bir protein ekstraksiyonu yöntemidir.
Dokulardan ve Hücrelerden Protein Ekstraksiyonu
Dokulardan ve kültüre alınmış hücrelerden protein ekstraksiyonu, ELISA, PAGE, Western blotlama, kütle spektrometrisi veya protein saflaştırma gibi birçok biyokimyasal ve analitik teknik sırasında gerçekleştirilen temel bir numune hazırlama adımıdır. Ultrasonik hücre parçalama, lizis ve ekstraksiyon, yüksek protein verimleri sağlamak için hassas biçimde kontrol edilebilen, termal olmayan bir tekniktir.
Hücrelerden protein ekstraksiyonu için UP200St ultrasonik probunun kullanımı
- Hızlı
- Yüksek verimler
- Yüksek verimlilik
- Parametreler üzerinde hassas kontrol
- Tekrarlanabilir sonuçlar
- Doğrusal ölçeklenebilirlik
Ultrasonik Lizis ve Protein Ekstraksiyonu İçin Genel Talimatlar
- Sıcaklık kontrolü: Termal denatürasyon olmadan yüksek protein verimi sağlamak için ekstraksiyon sırasında sıcaklık kontrol edilmelidir. Ultrasonik parçalayıcı veya ultrasonik işlem cihazı olarak da adlandırılan, en son teknolojiye sahip Hielscher ultrasonik homojenizatörleri hassas biçimde kontrol edilebilir. Takılabilir bir sıcaklık sensörüyle birlikte sunulurlar. Ultrasonik homojenizatörün ayar seçeneklerinde bir maksimum sıcaklık belirlenebilir. Bu maksimum sıcaklığa ulaşıldığında sonikatör, numune soğuyana kadar otomatik olarak durur.
- Tampon: Uygun tamponun ve doğru tampon hacminin seçimi dokudan dokuya değişir ve deneme yanılma testleriyle belirlenmelidir.
- İzolasyon / saflaştırma: Protein lizatları, DNA veya karbonhidratlar gibi biyomolekülleri fazla miktarda içerebilir; bunlar protein çöktürme (deoksikolat-trikloroasetik asit) veya tampon değişimiyle uzaklaştırılabilir.
Chittapalo ve Noomhorm (2009), çalışmalarında sonikasyon kullanımıyla protein veriminin arttığını ve ultrasonik doku homojenizasyonu ve lizis işleminin mevcut ekstraksiyon işlemlerini önemli ölçüde iyileştirebildiğini – böylece yeni ticari ekstraksiyon fırsatları sağladığını bildirmiştir.
Ultrasonik CupHorn ile protein izolasyonu ve DNA parçalama için birden fazla numunenin aynı koşullarda eş zamanlı ve yüksek etkinlikte hazırlanması.
Hayvan Dokusundan Protein Ekstraksiyonu
Bütün haldeki dokunun (ör. böbrek, kalp, akciğer, kas vb.) hazırlanması için doku, temiz aletlerle, tercihen buz üzerinde ve proteazların neden olduğu bozunmayı önlemek için mümkün olduğunca hızlı biçimde çok küçük parçalara ayrılmalıdır (ör. RIPA gibi bir lizis tamponu veya proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyli içeren hipotonik lizis tamponu). Parçalara ayrıldıktan sonra numune, ani dondurma için sıvı azota daldırılır. Numune daha sonra kullanılmak üzere -80°C sıcaklıkta saklanabilir veya hemen homojenize edilmek üzere buz üzerinde tutulabilir. Ultrasonik ekstraksiyondan hemen önce numune tüpüne hızla buz soğukluğunda lizis tamponu (proteaz inhibitörleri DTT, löpeptin ve aprotinin içeren) eklenir (her ~10 mg doku için yaklaşık ~600 μL tampon önerilir). Her numune tüpü için yaklaşık 20–60mg doku önerilir.
Ultrasonik homojenizasyon, lizis ve ekstraksiyon, mikro uçlu bir sonotrotla donatılmış UP100H veya UP200Ht gibi bir ultrasonik homojenizatörle gerçekleştirilir. Sonikasyon süresi, 15 saniye sonikasyon ve 10 saniye dinlenme süresinden oluşan ultrasonik döngü modunda 60–90 saniyedir. Numune sürekli buz içinde tutulmalıdır.
Ultrasonik homojenizasyon / ekstraksiyondan sonra lizat, yaklaşık 20 dakika boyunca 27.000g değerinde santrifüjlenir. Ardından süpernatan toplanır; böylece protein konsantrasyonu, Pierce BCA protein testi gibi bir protein testiyle belirlenebilir.
Kan Serumundan Protein Ekstraksiyonu
Serum ve fosfat tamponunun homojen bir karışımını elde etmek için numune, ultrasonik hücre lizisinden önce vorteksle karıştırılır. Ultrasonik lizis için numuneye, UP100H gibi bir ultrasonik laboratuvar homojenizatörüyle %20 genlikte, her biri 5 saniye çalışma ve 15 saniye durma süresinden oluşan 8 döngü boyunca sonikasyon uygulanır. Protein ekstraksiyonu, numunenin aşırı ısınmasını ve termal bozunmasını önlemek için döngüler halinde sonikasyon uygulanarak (pulsasyon modu) ve numune buz üzerine yerleştirilerek gerçekleştirilir. Serum, IEF sırasında düşük molekül ağırlıklı proteinlerin ayrılmasını engelleyen yüksek molekül ağırlıklı proteinleri (albümin, α1-antitripsin, transferrin, haptoglobulin, immünoglobulin G ve immünoglobulin A gibi) büyük miktarda içerdiğinden, bunların bir uzaklaştırma kolonu kullanılarak serumdan uzaklaştırılması önerilir.
Bitki Dokusundan Protein Ekstraksiyonu
Taze ve yumuşak bitki dokuları, ör. yosun vb., doğranmış numune materyalinin sonikasyon için lizis tamponuna yerleştirilmesiyle kolayca parçalanabilir. Tohumlar, köknar iğne yaprakları vb. gibi sert ve odunsu bitki dokuları kuru halde öğütülmelidir. Bazı sert, odunsu bitki materyalleri sonikasyonla ekstrakte edilmeden önce sıvı azot içinde dondurulmalı ve öğütülmelidir. Bitki hücre kültürü süspansiyonları için lizis tamponunda 30 ile 150 saniye arasında ultrasonik işlem çoğunlukla yeterlidir. Kabak çekirdeği gibi daha sert materyaller, aşağıda açıklandığı gibi daha yoğun sonikasyon gerektirir.
Kabak Çekirdeklerinden Ultrasonik Albümin Ekstraksiyonu Protokolü
İnce öğütülmüş kabak çekirdeği tozundan ultrasonik protein ekstraksiyonuyla albümin elde etmek için 250mL hacimli bir cam behere 10 g yağı alınmış kabak çekirdeği tozu ve çözücü olarak 100 mL deiyonize su eklenir. Protein ekstraksiyonu iki adımdan oluşur: İlk olarak numuneye, S24d7 sonotroduyla donatılmış prob tipi UP400St sonikatörü (400W, 24kHz) kullanılarak sonikasyon uygulanır. Ultrasonik homojenizasyon sırasında cam beher soğuk su banyosuna yerleştirilir. UP400St sonikatörünün takılabilir sıcaklık sensörü ve sıcaklık kontrol ayarları, numune sıcaklığının her zaman 30°C altında tutulmasını sağlar. Sonikasyon sırasında hassas sıcaklık kontrolü sayesinde albüminin denatürasyonu önlenir. İkinci olarak ekstraksiyon, 200 rpm hızında ve 30°C sıcaklıkta bir karıştırıcıyla gerçekleştirilmiştir. Ardından beher termostatlı bir çalkalayıcıya aktarılır. Globülin, damıtılmış suyla diyaliz yoluyla uzaklaştırılır. Globülin uzaklaştırıldıktan sonra albümin profilini belirlemek için protein ekstraktından numune alınabilir ve daha sonra albümin koagülasyonu için 0,1 M HCl kullanılarak pI=3,0 değerine ayarlanır. Katı faz, 5000g değerinde ve 20°C sıcaklıkta santrifüjlemeyle ayrılır ve deiyonize suda yeniden çözülür. Albümin konsantresindeki protein oranını artırmak için albümin koagülasyonu iki kez gerçekleştirilir.
Pirinç kepeğinden protein konsantresi hazırlamak için uygulanan ultrasonik alkali protein ekstraksiyonu, ultrasonik işlemin geleneksel ekstraksiyon yöntemlerine kıyasla önemli ölçüde daha kısa bir ekstraksiyon süresinde daha yüksek protein verimi sağladığını gösterir.
İşlevsel iNOS Enzimi İçin Numune Hazırlama Protokolü
Tamamen işlevsel iNOS enzimi elde etmek için (ör. ilaç taraması amacıyla) aşağıdaki protokol önerilir: Hücre süspansiyonu buz üzerine yerleştirilmeli ve UP100H sonikatörüyle 10µm genlikte, 5 saniye sonikasyon ve buz üzerinde 25 saniye dinlenmeden oluşan döngü modunda sonikasyona tabi tutulmalıdır. İşlem yaklaşık 3 kez tekrarlanmalıdır. Sonikasyon döngüleri arasındaki dinlenme süresi sıcaklık artışını azaltır ve dolayısıyla denatürasyon riskini düşürür.
Ultrasonik Protein Çözündürme
Sonikasyon, genellikle birkaç saat gerektiren protein çözündürme sürecini hızlandırabilir. Numunenin aşırı ısınmasını önlemek ve üre içeren çözeltilerde protein bozunmasını ve modifikasyonlarını engellemek için ultrasonik darbeler birkaç saniyeden uzun sürmemelidir.
UP200Ht sonikatörü ile 2mm mikro uçlu S26d2 kullanılarak küçük numunelere sonikasyon uygulanması.
Protein Ekstraksiyonu İçin Ultrasonik Ekipman
Hielscher Ultrasonics, hücrelerin, dokuların, bakterilerin, mikroorganizmaların, mayaların ve sporların parçalanması için geniş bir ultrasonik homojenizatör yelpazesi sunar.
Hielscher laboratuvar sonikatörleri güçlüdür ve kullanımları kolaydır. 24/7 çalışmak üzere üretilen bu cihazlar, sağlam ve verimli laboratuvar ve tezgâh üstü cihazlar olarak tasarlanmıştır. Tüm cihazlarda enerji çıkışı ve genlik hassas biçimde kontrol edilebilir. Geniş aksesuar yelpazesi ek kurulum seçenekleri sunar. VialTweeter, UP200Ht, UP200St ve UP400St gibi dijital sonikatörler, entegre sıcaklık kontrolüne ve otomatik veri kaydı için yerleşik bir SD karta sahiptir.
Birden fazla numunenin dolaylı, çapraz kontaminasyon olmadan ve eş zamanlı sonikasyonu için VialTweeter veya ultrasonik CupHorn sunuyoruz.
Aşağıdaki tablo, numune hazırlama, hücre parçalama ve ekstraksiyon için sonikatörlerimize genel bir bakış sunar. Her bir ultrasonik homojenizatör hakkında daha fazla bilgi almak için cihaz tipine tıklayın. İyi eğitimli ve uzun yıllara dayanan deneyime sahip teknik personelimiz, numune hazırlama işleminiz için en uygun sonikatörü seçmenize memnuniyetle yardımcı olacaktır!
| Parti Hacmi | Debi | Önerilen Cihazlar |
|---|---|---|
| 10 adede kadar viyal veya tüp | uygulanamaz | VialTweeter |
| çok kuyucuklu / mikrotitre plakaları | uygulanamaz | UIP400MTP |
| birden fazla tüp / kap | uygulanamaz | CupHorn |
| 1–500mL | 10–200mL/min | UP100H |
| 10–1000mL | 20–200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10–2000mL | 20–400mL/min | UP400St |
Uygulamanıza, materyalinize ve numune hacminize bağlı olarak numune hazırlama işleminiz için en uygun kurulumu önereceğiz. Bugün bizimle iletişime geçin!
Bizimle İletişime Geçin! / Bize Sorun!
Hielscher dijital sonikatörleri, tarayıcı üzerinden uzaktan kontrol ve entegre bir SD karta otomatik veri kaydı özelliklerine sahiptir.
VialTweeter ile dolaylı sonikasyon.
Bilinmesi Gerekenler
Proteomik
Proteomik, proteinleri ve proteomu inceleyen araştırma alanıdır. Proteinler, organizmalarda çok çeşitli yaşamsal işlevleri yerine getirir. Proteom, bir genom, hücre, doku veya organizma tarafından belirli bir zamanda ifade edilen proteinlerin tamamıdır. Proteom, zamana ve bir hücre veya organizmanın karşılaştığı farklı gereksinimlere ya da streslere göre değişir. Daha özel olarak proteom, belirli bir hücre veya organizma tipinde, belirli bir zamanda, tanımlanmış koşullar altında ifade edilen proteinler bütünüdür. Terim, protein ve genom sözcüklerinin birleşimidir. Proteomik, proteomun incelenmesidir.
Protein
Proteinler, bir veya daha fazla uzun amino asit kalıntısı zincirinden oluşan ve makromolekül olarak adlandırılan büyük biyomoleküllerdir. Proteinler hem bitkisel hem hayvansal kökenli tüm organizmalarda bulunur ve biyolojik işlevlerin çoğu için kritik öneme sahiptir. Proteinler çok miktarda biyolojik bilgi içerdiğinden, ör. proteomik araştırmalar gibi analitik amaçlarla ekstrakte edilirler. Proteinlerin yerine getirdiği en önemli işlevler arasında metabolik reaksiyonların katalizi, DNA replikasyonu, uyaranlara yanıt ve moleküllerin bir yerden başka bir yere taşınması bulunur. Proteinler birbirlerinden öncelikle amino asit dizileri bakımından farklılık gösterir. Bu diziler, genlerinin nükleotid dizisi tarafından belirlenir ve genellikle proteinin, etkinliğini belirleyen belirli bir üç boyutlu yapıya katlanmasını sağlar. Proteinler – peptitlerin yanı sıra – gıdanın temel bileşenlerinden biridir. Bu nedenle proteomik, gıda biliminde süreçleri, gıda güvenliğini ve beslenme değerlendirmesini optimize etmek için güçlü bir araçtır.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction analitleri ayırmak ve ön konsantre etmek için kullanılan analiz öncesi bir işlemdir. Ultrasonikasyonla birlikte bulutlanma noktası ekstraksiyonu yoğunlaştırılarak süreç daha verimli, daha hızlı ve daha çevre dostu hale getirilebilir. Ultrasonikasyonla bulutlanma noktası ekstraksiyonu, analit hazırlama için önemli ölçüde daha verimli bir yöntemdir. Ultrasonik destekli bulutlanma noktası ekstraksiyonu hakkında daha fazla bilgi edinin!
Jel Elektroforezi
Jel elektroforezi, DNA, RNA ve proteinler gibi makromoleküllerin ve bunların parçalarının boyut ve yüklerine göre ayrılması ve analizi için başlıca yöntemdir. Klinik kimyada proteinleri yüklerine ve/veya boyutlarına göre ayırmak için (IEF agaroz, esasen boyuttan bağımsız) ve biyokimya, moleküler biyoloji ve proteomikte DNA ve RNA parçalarından oluşan karma bir popülasyonu uzunluklarına göre ayırmak, DNA ve RNA parçalarının boyutunu tahmin etmek veya proteinleri yüklerine göre ayırmak için kullanılır.
Hücre Kültürleri
Hücre kültürü, hücrelerin kontrollü koşullar altında yetiştirildiği kontrollü büyütme sürecidir. Hücre kültürü koşulları her hücre tipi için farklıdır. Genel olarak bir hücre kültürünün ortamı, temel besin maddelerini (amino asitler, karbonhidratlar, vitaminler, mineraller), büyüme faktörlerini, hormonları ve gazları (CO2, O2) sağlayan ve fizikokimyasal ortamı (pH tamponu, ozmotik basınç, sıcaklık) düzenleyen bir substrat veya besiyeri içeren uygun bir kaptan (ör. Petri kabı) oluşur. Çoğu hücre bir yüzeye veya yapay substrata ihtiyaç duyarken, diğer hücre kültürleri kültür besiyerinde serbestçe yüzer halde yetiştirilebilir (süspansiyon kültürü, hücre süspansiyonu).
Hayvan hücre hatlarının büyük ölçekli kültürleri, viral aşıların ve biyoteknolojik yöntemlerle elde edilen diğer ürünlerin endüstriyel üretiminde kullanılır. İnsan kök hücreleri, hücre sayısını artırmak ve transplantasyon amacıyla hücreleri çeşitli somatik hücre tiplerine farklılaştırmak için kültüre alınır.
Doku Numuneleri
Doku terimi, hücresel materyalin organizasyon düzeyinin hücreler ile bütün bir organ arasında bulunduğu hücresel bir ara yapıyı tanımlar. Dokuda, aynı kökenden gelen ve birlikte belirli bir işlevi yerine getiren benzer hücreler bir araya gelmiştir. Birden fazla dokunun işlevsel olarak gruplanmasıyla organların karmaşık yapıları oluşur.
Biyoloji, histoloji/histopatoloji, parazitoloji, biyokimya ve immünohistokimya araştırmalarının yanı sıra doku kültürü ve DNA ekstraksiyonu için doku numuneleri alınır. Hayvan dokusu (alt bölüm: memeli dokusu) ile bitki dokusu arasında ayrım yapılabilir. Hayvan dokuları bağ, kas, sinir ve epitel dokusu olmak üzere dört temel tipte gruplandırılır. Bitki dokusu şu üç doku sistemine ayrılır: epidermis, temel doku ve iletim dokusu.
Doku numuneleri hayvan veya bitki kısımlarından, ör. kemik, kas, yaprak vb. hazırlanabilir.
Vücut Sıvıları
Kan, serum, plazma, beyin-omurilik sıvısı, tükürük ve sinovyal sıvı, tanısal açıdan önemli bilgiler için zengin bir kaynak sunan vücut sıvılarıdır. Bu nedenle vücut sıvısı numunelerinin analiz için özenli biçimde hazırlanması önemlidir. İlk güçlük, vücut sıvılarında bulunan bileşenlerin geniş dinamik aralığıyla ilişkilidir.
Protein konsantrasyonunun belirlenmesi
Bradford testi, Lowry testi ve bisinkoninik asit (BCA) testi, proteinlerin konsantrasyonunu belirlemek için yaygın olarak kullanılan testlerdir. Sığır serum albümini (BSA), en sık kullanılan protein standartlarından biridir.
Lizis Tamponu
Lizis tamponu, hücresel materyale veya dokuya (doku kültürü, bitki, bakteri, mantar vb.), hücrelerin bir yapı içinde bulunup bulunmadığına ve bu yapının tipine göre seçilmelidir. Proteinlerin, membranların ve organellerin ekstraksiyonu için kullanılan çok çeşitli lizis tamponları bir veya daha fazla deterjanla formüle edilir. Deterjan genellikle deneme yanılma testleriyle veya – varsa – mevcut bir protein ekstraksiyonu protokolüne göre seçilir. Deterjan, doku kaynağı ve proteinlerle uyumlu olmalıdır. Genel olarak ekstraktın maksimum işlevselliğini korumak için belirli bir doku / protein üzerinde etkili olan en yumuşak deterjan seçilir. Ayrıca membranların ve organellerin ekstraksiyonunda yumuşak bir deterjan membranı sağlam tutar. Lizis tamponlarında yaygın olarak kullanılan deterjanlar çoğunlukla noniyonik veya zwitteriyoniktir; ör. CHAPS, deoksikolat, Triton™ X-100, NP40 ve Tween 20.
Örneğin beyin, karaciğer, bağırsak, böbrek, dalak vb. dokular RIPA ile kolayca tamponlanabilir – ancak proteaz inhibitörleri ve DTT (ör. jel elektroforezi için) dahil edilmelidir.
İskelet kası dokusu için lizis tamponu (buz soğukluğunda): proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyli eklenmiş 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, %1 Triton X-100, %10 (w/v) gliserol, 1 mM EDTA, 1 mM ditiyotreitol
Yaygın tamponlar ve pH aralıkları tablosu. Genel olarak bu tamponlar normalde 20–50 mM konsantrasyonlarında kullanılır.
| Tampon | pH aralığı |
|---|---|
| Sitrik asit – NaOH | 2,2 – 6,5 |
| Sodyum sitrat – sitrik asit | 3,0 – 6,2 |
| Sodyum asetat – asetik asit | 3,6 – 5,6 |
| Kakodilik asit sodyum tuzu – HCl | 5,0 – 7,4 |
| MES – NaOH | 5,6 – 6,8 |
| Sodyum dihidrojen fosfat – disodyum hidrojen fosfat | 5,8 – 8,0 |
| İmidazol – HCl | 6,2 – 7,8 |
| MOPS – KOH | 6,6 – 7,8 |
| Trietanolamin hidroklorür – NaOH | 6,8 – 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7,2 – 8,2 |
| Trisin – NaOH | 7,6 – 8,6 |
| Sodyum tetraborat – borik asit | 7,6 – 9,2 |
| Bisin – NaOH | 7,7 – 8,9 |
| Glisin – NaOH | 8,6 – 10,6 |
Çoğu tamponun pH değeri sıcaklığa bağlı olarak değişir. Bu durum özellikle Tris tamponları için geçerlidir. pKa, 25°C sıcaklıkta 8,06 değerinden 0°C sıcaklıkta 8,85 değerine değişir.
(Bir tamponun pH ve pKa değerleri: pH, sulu bir çözeltideki hidrojen iyonlarının konsantrasyonunu ölçer. pKa (= asit ayrışma sabiti), bir molekülün belirli bir pH değerinde nasıl davranacağını öngörmeye yardımcı olması bakımından bununla ilişkili, ancak daha özel bir ölçüttür.)
TRIzol
TRIzol, guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyonu sırasında RNA/DNA/protein ekstrakte etmek için kullanılan kimyasal bir çözeltidir. Ultrasonik destekli TRIzol ekstraksiyonunun kullanımı, aynı numuneden yüksek DNA, RNA ve protein verimleri sağlar ve böylece diğer ekstraksiyon yöntemlerinden üstün sonuç verir.
Literatür/Kaynaklar
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.