Doku ve Hücre Kültürlerinden Ultrasonik Protein Ekstraksiyonu
- Protein ekstraksiyonu, proteomikte önemli bir numune hazırlama adımıdır.
- Proteinler bitki ve hayvan dokusundan, mayalardan ve mikroorganizmalardan ekstrakte edilebilir.
- Sonikasyon, kısa bir ekstraksiyon süresi içinde yüksek protein verimi veren güvenilir, verimli bir protein ekstraksiyon yöntemidir.
Doku ve Hücrelerden Protein Ekstraksiyonu
Dokulardan ve kültürlenmiş hücrelerden protein ekstraksiyonu, ELISA, PAGE, Western blotting, kütle spektrometresi veya protein saflaştırma gibi birçok biyokimyasal ve analitik teknik sırasında gerçekleştirilen önemli bir numune hazırlama adımıdır. Ultrasonik hücre bozulması, parçalanması ve ekstraksiyonu, yüksek protein verimi sağlamak için hassas bir şekilde kontrol edilebilir, termal olmayan bir tekniktir.
Hücrelerden protein ekstraksiyonu ultrasonik prob UP200St
- hızlı
- Yüksek verim
- Yüksek verimli
- Parametreler üzerinde hassas kontrol
- Tekrarlanabilir sonuçlar
- Doğrusal ölçeklenebilirlik
Ultrasonik Lizis ve Protein Ekstraksiyonu İçin Genel Talimatlar
- Sıcaklık kontrolü: Termal denatürasyon olmadan yüksek bir protein verimi sağlamak için, ekstraksiyon sırasındaki sıcaklık kontrol edilmelidir. Hielscher'ın son teknoloji ultrasonik homojenizatörleri – ultrasonik parçalayıcı veya ultrasonlaştırıcı olarak da adlandırılır – hassas bir şekilde kontrol edilebilir. Takılabilir bir sıcaklık sensörü ile birlikte gelirler. Ultrasonik homojenizatörün ayar seçeneklerinde, maksimum bir sıcaklık ayarlanabilir. Bu sıcaklık maksimuma ulaşıldığında, ultrasonicator örnek soğuyana kadar otomatik olarak durur.
- Arabellek: Uygun bir tamponun ve doğru tampon hacminin seçimi dokudan dokuya değişir ve deneme yanılma testi ile anlaşılmalıdır.
- İzolasyon / saflaştırma: Protein lizatları, protein çökeltme (deoksikolat-trikloroasetik asit) veya tampon değişimi ile uzaklaştırılabilen DNA veya karbonhidratlar gibi fazla miktarda biyomolekül içerebilir.
Chittapalo ve Noomhorm (2009) çalışmalarında, sonikasyon kullanılarak protein veriminin arttığını ve ultrasonik doku homojenizasyonu ve lizis işleminin mevcut ekstraksiyon işlemlerini önemli ölçüde artırabileceğini bildirmiştir – yeni ticari çıkarma fırsatlarının etkinleştirilmesi.
Ultrasonik CupHorn protein izolasyonu ve DNA parçalanması için aynı koşullar altında birden fazla numunenin eşzamanlı, oldukça etkili numune hazırlığı için.
Hayvan Dokusundan Protein Ekstraksiyonu
Tam boyutlu dokunun (örn. böbrek, kalp, akciğer, kas vb.) hazırlanması için, doku temiz aletlerle, tercihen buz üzerinde ve proteazlar tarafından bozunmayı önlemek için mümkün olduğunca çabuk çok küçük parçalara ayrılmalıdır (örn. RIPA gibi lizis tamponu veya proteaz ve fosfataz inhibitör kokteyli içeren hipotonik lizis tamponu). Diseksiyondan sonra, numune ani dondurma için sıvı nitrojene daldırılır. Numune daha sonra kullanılmak üzere -80°C'de saklanabilir veya anında homojenizasyon için buz üzerinde tutulabilir. Ultrasonik ekstraksiyondan hemen önce, buz gibi soğuk lizis tamponu (proteaz inhibitörleri DTT, leupeptin ve aprotinin ile) numune tüpüne hızla eklenir (~ 10 mg doku başına yaklaşık ~ 600 μL tampon önerilir). Numune tüpü başına yaklaşık 20-60 mg doku önerilir.
Ultrasonik homojenizasyon, parçalama ve ekstraksiyon, mikro uçlu bir sonotrot ile donatılmış UP100H veya UP200Ht gibi bir ultrasonik homojenizatör ile gerçekleştirilir. Sonikasyon süresi 60-90 saniyedir. 15 saniye ultrasonik döngü modunda. sonikasyon ve 10 saniye dinlenme süresi. Numune her zaman buzda tutulmalıdır.
Ultrasonik homojenizasyon / ekstraksiyondan sonra, lizat yaklaşık 20 dakika boyunca 27.000 g'da santrifüjlenir. Daha sonra süpernatan toplanır, böylece protein konsantrasyonu Pierce protein testi BCA gibi bir protein testi ile belirlenebilir.
Kan Serumundan Protein Ekstraksiyonu
Serum ve fosfat tamponunun homojen bir karışımı için, numune ultrasonik hücre lizizinden önce girdaplanır. Ultrasonik lizis için, numune, her 5 saniye açık ve 15 saniye kapalı döngüler için% 20 genlikte 8 döngü için UP100H gibi bir ultrasonik laboratuvar homojenizatörü ile sonikleştirilir. Protein ekstraksiyonu, döngülerde sonikasyon (titreşim modu) ve numunenin buz üzerine yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir, böylece numunenin aşırı ısınması ve termal bozulması önlenir. Serum, IEF sırasında düşük moleküler ağırlıklı proteinlerin ayrılmasına müdahale eden çok miktarda yüksek moleküler ağırlıklı protein (albümin, α1-antitripsin, transferrin, haptoglobulin, immünoglobulin G ve immünoglobulin A gibi) içerdiğinden, bunların bir tükenme sütunu kullanılarak serumdan tüketilmesi önerilir.
Bitki Dokusundan Protein Ekstraksiyonu
Taze, yumuşak bitki dokusu, örneğin yosun vb., doğranmış numune materyalini sonikasyon için lizis tamponuna yerleştirerek kolayca bozulabilir. Tohumlar, köknar iğneleri vb. gibi sert, ligen bitki dokuları kuru öğütülmelidir. Bazı sert, odunsu bitki materyalleri, sonikasyon ile ekstrakte edilmeden önce dondurulmalı ve sıvı nitrojen içinde öğütülmelidir. Bitki hücre kültürü süspansiyonları için, bir lizis tamponunda 30 ila 150 saniye arasında bir ultrasonik tedavi çoğunlukla yeterlidir. Kabak çekirdeği gibi daha sert malzemeler, aşağıda açıklandığı gibi daha yoğun bir sonikasyon gerektirir.
Kabak Çekirdeğinden Albüminin Ultrasonik Ekstraksiyonu için Protokol
İnce öğütülmüş kabak çekirdeği tozundan albüminin ultrasonik protein ekstraksiyonu için, 250 mL'lik bir cam behere 10 g yağı alınmış kabak çekirdeği tozu ve çözücü olarak 100 mL deiyonize su eklenir. Protein ekstraksiyonu iki adımdan oluşur: İlk olarak, numune ile sonikleştirilir. Sonotrot S24d7 ile donatılmış bir prob tipi ultrasonicator UP400St (400W, 24kHz). Cam beher, ultrasonik homojenizasyon sırasında soğuk su banyosuna yerleştirilir. Ultrasonicator UP400St'nin takılabilir sıcaklık sensörü ve sıcaklık kontrol ayarları, örnek sıcaklığın her zaman 30 ° C'nin altında tutulmasını sağlar. Sonikasyon sırasında hassas sıcaklık kontrolü ile, albüminin denatürasyonu önlenir. İkinci olarak, ekstraksiyon 200 rpm hızında ve 30 ° C'de bir karıştırıcı ile gerçekleştirildi. Daha sonra beher, termostatik bir çalkalayıcıya aktarılır. Globulin, damıtılmış su ile diyaliz yoluyla uzaklaştırılır. Globulinin uzaklaştırılmasından sonra, protein ekstraktı albümin profilinin belirlenmesi için örneklenebilir ve daha sonra albümin pıhtılaşması için 0.1 M HCl kullanılarak pI = 3.0'a ayarlanır. Katı faz, 5000 g, 20 ° C'de santrifüjleme ile ayrılır ve deiyonize suda yeniden çözülür. Albümin konsantresindeki protein oranını artırmak için albümin pıhtılaşması iki kez yapılır.
Pirinç kepeğinden protein konsantresinin hazırlanması için ultrasonik alkali protein ekstraksiyonu, ultrasonik tedavinin önemli ölçüde daha kısa bir ekstraksiyon süresinde daha yüksek protein verimi ile sonuçlandığını göstermektedir – geleneksel ekstraksiyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında.
Fonksiyonel iNOS Enzimi için Numune Hazırlama Protokolü
Tamamen işlevsel iNOS enzimi elde etmek için (ör. ilaç taraması için), aşağıdaki protokol önerilir: Hücre süspansiyonu buz üzerine yerleştirilmeli ve 5 saniye döngü modunda 10μm genlikte bir UP100H ile sonikasyon ve 25 saniye ile sonikasyona tabi tutulmalıdır. İşlem yaklaşık 3 kez tekrarlanmalıdır. Sonikasyon döngüleri arasındaki dinlenme süresi sıcaklık artışını azaltır ve bu nedenle denatürasyon riskini azaltır.
ultrasonik protein çözündürme
Sonikasyon, genellikle birkaç saat gerektiren protein çözündürme sürecini hızlandırabilir. Numuneyi aşırı ısıtmamak ve üre içeren çözeltilerde protein bozulmasını ve modifikasyonlarını önlemek için, ultrasonik patlamalar birkaç saniyeden uzun sürmemelidir.
Ultrasonik atör UP200Ht küçük örneklerin sonikasyonu için 2mm mikro uç S26d2 ile.
Protein Ekstraksiyonu için Ultrasonik Ekipman
Hielscher Ultrasonics, hücrelerin, dokuların, bakterilerin, mikroorganizmaların, mayaların ve sporların parçalanması için geniş bir ultrasonik homojenizatör yelpazesi sunar.
Hielscher laboratuvar ultrasonicators güçlü ve kullanımı kolaydır. 7/24 çalışacak şekilde üretilen bu cihazlar, sağlam ve verimli laboratuvar ve tezgah üstü cihazlar olarak tasarlanmıştır. Tüm cihazlar için enerji çıkışı ve genlik hassas bir şekilde kontrol edilebilir. Geniş aksesuar yelpazesi, daha fazla kurulum seçeneği sunar. VialTweeter, UP200Ht, UP200St ve UP400St gibi dijital ultrasonicators, otomatik veri kaydı için entegre bir sıcaklık kontrolüne ve yerleşik bir SD karta sahiptir.
Birden fazla numunenin dolaylı, çapraz kontaminasyon içermeyen ve aynı anda sonikasyonu için VialTweeter veya ultrasonik CupHorn'u sunuyoruz.
Aşağıdaki tablo, numune hazırlama, hücre bozulması ve ekstraksiyon için ultrasonicator'larımız hakkında genel bir bakış sunar. Her ultrasonik homojenizatör hakkında daha fazla bilgi almak için cihaz tipine tıklayın. İyi eğitimli ve uzun süreli deneyime sahip teknik personelimiz, numune hazırlığınız için en uygun ultrasonicator'ı seçmenize yardımcı olmaktan memnuniyet duyacaktır!
| Numune Hacmi | Akış Oranı | Önerilen Cihaz |
|---|---|---|
| 10 şişeye veya tüpe kadar | n.a. | VialTweeter |
| Multiwell / Mikrotitre Plakaları | n.a. | UIP400MTP |
| Çoklu Tüpler / Gemiler | n.a. | Kupa boynuzu |
| 1 - 500mL | 10 - 200mL/min | UP100H |
| 10 ila 1000 mL | 20 ila 200 mL/dk | UP200Ht, UP200St |
| 10 - 2000mL | 20 - 400mL/min | UP400St |
Uygulamanıza, malzemenize ve numune hacminize bağlı olarak, numune hazırlığınız için size en uygun kurulumu önereceğiz. Bugün bize ulaşın!
Bizimle İletişime Geçin! / Bize Sor!
Hielscher dijital ultrasonicators, entegre bir SD kart üzerinde bir tarayıcı uzaktan kumanda ve otomatik veri protokolü özelliğine sahiptir.
VialTweeter dolaylı sonikasyon için.
Bilmeye Değer Gerçekler
Proteomik
Proteomik, proteinleri ve proteomu inceleyen araştırma alanıdır. Proteinler, organizmalar içinde çok çeşitli hayati işlevleri yerine getirir. Proteom, belirli bir zamanda bir genom, hücre, doku veya organizma tarafından ifade edilen proteinlerin tamamıdır. Proteom, zamana ve bir hücrenin veya organizmanın maruz kaldığı farklı gereksinimlere veya streslere göre değişir. Daha spesifik olarak, belirli bir hücre veya organizma tipinde, belirli bir zamanda, tanımlanmış koşullar altında ifade edilen proteinler kümesidir. Terim, proteinlerin ve genomun bir karışımıdır. Proteomik, proteomun incelenmesidir.
Protein
Proteinler, makromoleküller olarak adlandırılan büyük biyomoleküllerdir – bir veya daha fazla uzun amino asit kalıntısı zincirinden oluşur. Proteinler hem bitkisel hem de hayvansal kökenli tüm organizmalarda bulunur ve biyolojik fonksiyonların çoğu için çok önemlidir. Proteinler çok fazla biyolojik bilgi içerdiğinden, örneğin proteomik araştırmalar için analitik amaç için ekstrakte edilirler. Proteinler tarafından gerçekleştirilen en önemli işlev, metabolik reaksiyonların katalizini, DNA replikasyonunu, uyaranlara yanıtı ve moleküllerin bir yerden başka bir yere taşınmasını içerir. Proteinler, esas olarak, genlerinin nükleotid dizisi tarafından belirlenen ve genellikle proteinin aktivitesini belirleyen belirli bir üç boyutlu yapıya katlanmasıyla sonuçlanan amino asit diziliminde birbirlerinden farklıdır. Proteinler şunlardır – peptitlerin yanı sıra – Gıdanın temel bileşenlerinden biri. Bu nedenle proteomik, gıda biliminde süreçleri, gıda güvenliğini ve beslenme değerlendirmesini optimize etmek için güçlü bir araçtır.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction analitleri ayırmak ve ön konstrükte etmek için kullanılan bir pre-analitik prosedürdür. Ultrasonication ile birlikte, bulut noktası ekstraksiyonu süreci daha verimli, daha hızlı ve çevre dostu hale getirerek yoğunlaştırılabilir. Ultrasonication ile, bulut noktası ekstraksiyonu, analit hazırlama için önemli ölçüde daha verimli bir yöntemdir. Ultrasonik destekli bulutlanma noktası ekstraksiyonu hakkında daha fazla bilgi edinin!Jel Elektroforezi
Jel elektroforezi, DNA, RNA ve proteinler gibi makromoleküllerin yanı sıra fragmanlarının boyutlarına ve yüklerine göre ayrılması ve analizi için ana yöntemdir. Klinik kimyada proteinleri yük ve/veya boyuta göre ayırmak için (IEF agaroz, esasen boyuttan bağımsız) ve biyokimya, moleküler biyoloji ve proteomikte karışık bir DNA ve RNA fragmanı popülasyonunu uzunluğa göre ayırmak, DNA ve RNA fragmanlarının boyutunu tahmin etmek veya proteinleri yüke göre ayırmak için kullanılır.
Hücre Kültürleri
Hücre kültürü, hücrelerin kontrollü koşullar altında yetiştirildiği kontrollü büyüme sürecidir. Hücre kültürü koşulları her hücre tipi için farklılık gösterir. Genel olarak, bir hücre kültürünün ortamı, temel besinleri (amino asitler, karbonhidratlar, vitaminler, mineraller), büyüme faktörlerini, hormonları ve gazları (CO2, O2) ve fizyo-kimyasal ortamı (pH tamponu, ozmotik basınç, sıcaklık) düzenler. Çoğu hücre bir yüzeye veya yapay substrata ihtiyaç duyarken, diğer hücre kültürleri kültür ortamında (süspansiyon kültürü, hücre süspansiyonu) serbest yüzer olarak yetiştirilebilir.
Hayvan hücre hatlarının kitle kültürleri, viral aşıların ve diğer biyoteknolojik olarak türetilmiş ürünlerin endüstriyel üretiminde kullanılmaktadır. İnsan kök hücreleri, hücre sayısını artırmak ve hücreleri transplantasyon amacıyla çeşitli somatik hücre tiplerine farklılaştırmak için kültürlenir.
Doku Örnekleri
Doku terimi, hücre materyalinin hücreler ve tam bir organ arasında organizasyonel bir düzeyde olduğu bir hücresel ara ürünü tanımlar. Dokuda, birlikte belirli bir işlevi yerine getiren aynı kökenden benzer hücreler bir araya getirilir. Birden fazla dokunun fonksiyonel gruplandırılmasıyla, organların karmaşık yapıları oluşur.
Biyoloji, histoloji/histopatoloji, parazitoloji, biyokimya, immünohistokimya araştırmalarının yanı sıra DNA'yı yetiştirmek ve çıkarmak için doku örneklenir. Hayvan (alt bölüm: memeli dokusu) ve bitki dokusu arasında ayrım yapılabilir. Hayvan dokuları dört temel bağ, kas, sinir ve epitel dokusu tipinde gruplandırılır. Bitki dokusu şu üç doku sistemine ayrılır: epidermis, zemin dokusu ve vasküler doku.
Doku örnekleri, örneğin kemik, kas, yapraklar vb. gibi hayvan veya bitki parçalarından hazırlanabilir.
Vücut Sıvıları
Kan, serum, plazma, beyin omurilik sıvısı, tükürük ve sinovyal sıvı, tanısal olarak ilgili harika bir bilgi kaynağı sunan vücut sıvılarıdır. Bu nedenle, analiz için vücut sıvısı örneklerinin sofistike bir şekilde hazırlanması önemlidir. İlk zorluk, vücut sıvılarında bulunan geniş dinamik bileşen yelpazesi ile ilişkilidir.
Protein konsantrasyonunun belirlenmesi
Bradford testi, Lowry testi ve biskintoninik asit (BCA) testi, proteinlerin konsantrasyonunu belirlemek için yaygın tahlillerdir. Sığır serum albümini (BSA) en sık kullanılan protein standartlarından biridir.
lizis tamponu
Lizis tamponu, hücre materyali veya dokusuna (doku kültürü, bitki, bakteri, mantar vb.) ve hücrelerin bir yapıda olup olmadığına ve yapının türüne uygun olarak seçilmelidir. Proteinlerin, zarların ve organellerin ekstraksiyonu için çok çeşitli lizis tamponları, bir veya daha fazla deterjan ile formüle edilir. Deterjan genellikle deneme yanılma testleri yoluyla seçilir veya – Varsa – mevcut bir protein ekstraksiyon protokolüne göre. Deterjan, doku kaynağı ve proteinlerle uyumlu olmalıdır. Genel olarak, belirli bir doku / protein için çalışan en hafif deterjan, ekstraktın maksimum işlevselliğini korumak için seçilir. Ayrıca, zarların ve organellerin ekstraksiyonu durumunda, yumuşak bir deterjan zarı sağlam tutar. Lizis tamponlarında yaygın olarak kullanılan deterjanlar çoğunlukla iyonik olmayan veya zwitteriyoniktir, örneğin CHAPS, deoksikolat, Triton™ X-100, NP40 ve Tween 20.
Örneğin, beyin, karaciğer, bağırsak, böbrek, dalak gibi dokular RIPA ile kolayca tamponlanabilir – bununla birlikte, proteaz inhibitörleri ve DTT (örn. jel elektroforezi için) dahil edilmelidir.
İskelet kası dokusu için lizis tamponu (buz gibi): 20 mM Tris (pH 7.8), 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, %1 Triton X-100, (a/h) gliserol, 1 mM EDTA, proteaz ve fosfataz inhibitör kokteyli ile desteklenmiş 1 mM dithiothreitol
Ortak tamponlar ve pH aralıkları tablosu. Genel olarak, bu tamponlar normalde 20-50 mM konsantrasyonlarda kullanılır.
| Arabellek | pH aralığı |
|---|---|
| Sitrik asit – NaOH (Doğal) | 2.2 – 6.5 |
| Sodyum sitrat – Sitrik asit | 3.0 – 6.2 |
| Sodyum asetat – asetik asit | 3.6 – 5.6 |
| Kakodilik asit sodyum tuzu – Hcl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOH (Doğal) | 5.6 – 6.8 |
| Sodyum dihidrojen fosfat – disodyum hidrojen fosfat | 5.8 – 8.0 |
| İmidazol – Hcl | 6.2 – 7.8 |
| MOPLAR – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Trietanolamin hidroklorür – NaOH (Doğal) | 6.8 – 8.8 |
| Tris – Hcl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES PROJESİ – NaOH (Doğal) | 7.2 – 8.2 |
| Trisin – NaOH (Doğal) | 7.6 – 8.6 |
| Sodyum tetraborat – borik asit | 7.6 – 9.2 |
| Bisiklet – NaOH (Doğal) | 7.7 – 8.9 |
| Glisin – NaOH (Doğal) | 8.6 – 10.6 |
Çoğu tampon, sıcaklıkla pH bağımlılığı gösterir. Bu özellikle Tris tamponları için geçerlidir. pKa, 25 ° C'de 8.06'dan 0 ° C'de 8.85'e değişir.
(Bir tamponun pH ve pKa'sı: pH, sulu bir çözeltideki hidrojen iyonlarının konsantrasyonunu ölçer. pKa (= asit ayrışma sabiti), bir molekülün belirli bir pH değerinde nasıl davranacağını tahmin etmeye yardımcı olması bakımından ilişkili, ancak daha spesifik bir ölçüdür.)
TRIzol
TRIzol, guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyonu sırasında RNA/DNA/proteini çıkarmak için kullanılan kimyasal bir çözeltidir. Ultrasonik destekli TRIzol ekstraksiyonunun kullanılması, aynı numuneden yüksek DNA, RNA ve protein verimleri ile sonuçlanır ve bu nedenle diğer ekstraksiyon yöntemlerini mükemmelleştirir.
Literatür/Referanslar
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.