E. coli gibi biyomühendis bakteri türlerinin yanı sıra genetiği değiştirilmiş memeli ve bitki hücre tipleri molekülleri ifade etmek için biyoteknolojide yaygın olarak kullanılmaktadır. Sentezlenen bu biyo molekülleri serbest bırakmak için güvenilir bir hücre bozulması tekniği gereklidir. Yüksek performanslı ultrasonication verimli ve güvenilir hücre liziz için kanıtlanmış bir yöntemdir – büyük aktarım hızına kolayca ölçeklenebilir. Hielscher Ultrasonics yüksek kaliteli biyo moleküller büyük hacimlerde üretmek için etkili hücre liziz için yüksek performanslı ultrasonik ekipman sunar.

Hücre Fabrikalarından Moleküllerin Çıkarılması

Çok çeşitli biyomoleküllerin üretimi için, çeşitli mühendislik mikropları ve bitki hücreleri mikrobiyal hücre fabrikaları olarak kullanılabilir, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolitica, Nicotiana benthamiana ve algler dahil. Bu hücre fabrikaları, endüstriyel uygulamalar için gıda veya hammadde olarak kullanılan proteinler, lipitler, biyokimyasallar, polimerler, biyoyakıtlar ve oleokimyasallar üretebilir. Hücre fabrikası olarak kullanılan hücreler, yüksek verimlilik, özgüllük ve düşük enerji gereksinimleri elde edebilecekleri kapalı biyoreaktörlerde kültürlenir.
Hedef molekülleri biyomühendislik hücre kültürlerinden izole etmek için hücrelerin bozulması gerekir, böylece hücre içi malzeme serbest bırakılır. Ultrasonik hücre bozucular, hücre parçalanması ve bileşik salınım için son derece güvenilir ve verimli bir teknik olarak iyi kurulmuştur.

Mikrobiyal hücre fabrikaları, çeşitli değerli bileşiklerin sentezi için kullanılan metabolik olarak tasarlanmış hücrelerdir. Ultrasonik hücre bozulması hücre iç değerli bileşikleri serbest bırakmak için verimli ve güvenilir bir yöntemdir.
çalışma ve grafik: ©Villaverde, 2010.

Ultrasonik Hücre Bozucuların Avantajları

Termal olmayan, hafif, ancak yüksek verimli bir teknoloji olarak, ultrasonik bozucular laboratuvar ve endüstride hücreleri sızlatmak ve yüksek kaliteli özler üretmek için kullanılır, örneğin moleküllerin hücre fabrikalarından izolasyonu için kullanılır.

Mikrobiyal Hücre Fabrikalarının Verimli Bozulması için Güç Ultrason

Ultrasonik Hücre Bozucuların Mekanizması ve Etkileri:
Ultrasonik hücre bozulması ultrason dalgalarının gücünü kullandı. Ultrasonik homojenizatör / hücre bozucu, yaklaşık 20 kHz'lik yüksek bir frekansta salınan titanyum alaşımından yapılmış bir prob (aka sonotrode) ile donatılmıştır. Bu ultrasonik prob çift anlamına gelir 20,000 titreşim saniyede sonicated sıvı içine. Sıvıya bağlı ultrason dalgaları, değişen yüksek basınç / düşük basınç döngüleri ile karakterize edilir. Düşük basınç döngüsü sırasında sıvı genişler ve dakika vakum kabarcıkları ortaya çıkar. Bu çok küçük kabarcıklar, daha fazla enerji ememeyene kadar birkaç alternatif basınç döngüsü boyunca büyür. Bu noktada, kavitasyon kabarcıkları şiddetli bir şekilde patlar ve yerel olarak olağanüstü enerji yoğun bir ortam yaratır. Bu fenomen akustik kavitasyon olarak bilinir ve lokal olarak çok yüksek sıcaklıklar, çok yüksek basınçlar ve kesme kuvvetleri ile karakterizedir. Bu kesme gerilimleri hücre duvarlarını verimli bir şekilde kırar ve hücre içi ile çevresindeki çözücü arasındaki kütle transferini arttırır. Tamamen mekanik bir teknik olarak, ultrasonik olarak oluşturulan kesme kuvvetleri yaygın olarak kullanılır ve bakteri hücresi bozulmasının yanı sıra protein izolasyonu için önerilen prosedürdür. Basit ve hızlı bir hücre bozulması yöntemi olarak sonication, küçük, orta ve büyük boyutlu hacimlerin izolasyonu için idealdir. Hielscher'ın dijital ultrasonicators hassas sonication kontrolü için ayarların net bir menü ile donatılmıştır. Tüm sonication verileri otomatik olarak yerleşik bir SD kartta saklanır ve basitçe erişilebilir. Ultrasonik parçalama işlemi sırasında harici soğutma, titreşim modunda sonication vb gibi ısı dağılımı sofistike seçenekleri ideal proses sıcaklığının korunmasını ve böylece çıkarılan ısıya duyarlı bileşiklerin sağlamlığını sağlar.

Araştırma Ultrasonik Hücre Bozulması ve Ekstraksiyon güçlü yönlerinin altını çiziyor

Prof. Chemat ve arkadaşları (2017) çalışmalarında "ultrason destekli ekstraksiyon, gıda ve doğal ürünler için geleneksel tekniklere yeşil ve ekonomik olarak uygulanabilir bir alternatiftir. Başlıca yararları ekstraksiyon ve işleme süresinin azaltılması, kullanılan enerji ve çözücülerin miktarı, birim işlemleri ve CO₂ emisyonlar."
Gabig-Ciminska ve ark. (2014), DNA'yı serbest bırakmak için sporların lizisi için yaptıkları çalışmada yüksek basınçlı bir homojenizatör ve ultrasonik hücreli bir dsintegrator kullandı. Her iki hücre bozulma yöntemini de karşılaştıran araştırma ekibi, spore DNA'sı için hücre lizisi ile ilgili olarak, "yüksek basınç homojenizasyonundan hücre lizazları kullanarak analiz yapıldığı sonucuna varmaktadır. Daha sonra, ultrasonik bir hücre bozulmasının bu amaç için olağanüstü avantajlara sahip olduğunu fark ettik. Oldukça hızlıdır ve küçük numune hacimleri için işlenebilir." (Gabig-Ciminska vd., 2014)

Gıda Üretimi için Hücre Fabrikalarından Biyomoleküller

Mikrobiyal hücre fabrikaları, bakteri, maya, mantar gibi mikrobiyal mikroorganizmaların metabolik biyo-mühendisliği ile yüksek verim üreten yerel ve yerli olmayan metabolitlerin yüksek verimini üretmek için mikrobiyal organizmaları kullanan uygulanabilir ve verimli bir üretim metodolojisidir. Toplu enzimler örneğin Aspergillus oryzae, mantarlar ve bakteriler gibi mikroorganizmalar kullanılarak üretilir. Bu dökme enzimler yiyecek ve içecek üretiminin yanı sıra tarım, biyoenerji ve ev bakımında kullanılır.
Asetobakterik kslinum ve Gluconacetobacter ksilinus gibi bazı bakteriler fermantasyon işlemi sırasında selüloz üretir ve burada nanofiberler aşağıdan yukarıya bir işlemle sentezlenir. Bakteriyel selüloz (mikrobiyal selüloz olarak da bilinir) bitki selülozlarına kimyasal olarak eşdeğerdir, ancak yüksek derecede kristaliteye ve yüksek saflığa (lignin, hemiselüloz, pektin ve diğer biyojenik bileşenlerden arındırılmış) ve selüloz nanofiber örme üç boyutlu (3D) retiküle ağın benzersiz bir yapısına sahiptir. (cf. Zhong, 2020) Bitki kaynaklı selüloz ile karşılaştırıldığında bakteriyel selüloz daha sürdürülebilirdir ve üretilen selüloz karmaşık saflaştırma adımları gerektirmeyen saftır. NaOH veya SDS (sodyum dodecyl sülfat) kullanılarak ultrasonication ve solvent ekstraksiyon bakteri hücrelerinden bakteriyel selüloz izolasyonu için çok etkilidir.

İlaç ve Aşı Üretimi için Hücre Fabrikalarından Biyomoleküller

Hücre fabrikalarından elde edilen en belirgin farmasötik ürünlerden biri insan insülinidir. Biyomühendislik insülin üretimi için ağırlıklı olarak E. coli ve Saccharomyces cerevisiae kullanılmaktadır. Biyo-sentezlenmiş nano boyutlu moleküller yüksek biyouyumluluk sunduğundan, ferritin gibi biyolojik nanopartiküller çok sayıda biyo-üretim uygulaması için avantajlıdır. Ek olarak, metabolik olarak tasarlanmış mikroplardaki üretim genellikle elde edilen verimlerde önemli ölçüde daha etkilidir. Örneğin, artemisinic asit, resveratrol ve likopen üretimi on kat artarak birkaç yüz kata çıkmıştır ve zaten kurulmuştur veya endüstriyel ölçekli üretime geliştirmektedir. (cf. Liu vd.; Mikrob. Hücre Gerçeği. 2017)
Örneğin, ferritin ve virüs benzeri parçacıklar gibi kendi kendine bir araya getiren özelliklere sahip protein bazlı nano boyutlu biyomoleküller, patojenlerin hem boyutunu hem de yapısını taklit ettikleri ve bağışıklık hücreleriyle etkileşimi teşvik etmek için antijenlerin yüzey konjugasyonuna uygun oldukları için aşı geliştirme için özellikle ilginçtir. Bu tür moleküller, belirli bir hedef molekül üreten hücre fabrikalarında (örneğin, tasarlanmış E. coli suşları) ifade edilir.

Ferritin Salınımı için Ultrasonik Lizis ve E. coli BL21 protokolü

Ferritin, birincil işlevi demirin depolanmasının bir proteinidir. Ferritin, aşı dağıtım aracı olarak kullanıldığı aşılarda kendi kendine monte edilmiş nanopartiküller (örneğin SARS-Cov-2 spike proteinleri) olarak umut verici yetenekler gösterir. Sun et'in bilimsel araştırması. al. (2016), rekombinant ferritin düşük NaCl konsantrasyonlarında (≤50 mmol / L) Escherichia coli'den çözünür bir form olarak salınabileceğini göstermektedir. Ferritin E. coli BL21'de eksprese etmek ve ferrtin serbest bırakmak için aşağıdaki protokol başarıyla uygulanmıştır. Rekombinant pET-28a/ferritin plazmid E coli BL21 (DE3) suşuna dönüştürüldü. Ferritin E coli BL21 (DE3) hücreleri LB büyüme ortamlarında 37°C'de %0,5 kanamycin ile kültürlendi ve 37°C'de 3 saat boyunca %0,4 izopropil-β-D-tiyogalactopyranoside ile 0,6 OD600'de indüklendi. Son kültür daha sonra 8000g'de 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleme ile hasat edildi ve pelet toplandı. Daha sonra, pelet LB ortamında yeniden süzdü (%1 NaCl, Sırasıyla % 1 Typone, % 0.5 maya özü)/lizis tamponu (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7.6) ve farklı NaCl çözeltisi konsantrasyonları (0, 50, 100, 170 ve 300 mmol/L). Bakteriyel hücre lizizi için, sonication nabız modunda uygulandı: örneğin, ultrasonicator UP400St 40 döngü için 5 saniye AÇıK, 10 saniye KAPASIT) görev döngüsü ile % 100 genlikte ve ardından 4 °C'de 15 dakika boyunca 10 000g'de santrifüjlendi. Süpernatant ve çökelti sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) ile analiz edildi. Tüm sodyum dodecyl sülfat lekeli jeller yüksek çözünürlüklü tarayıcı ile tarandı. Jel görüntüler Magic Chemi 1D yazılımı kullanılarak analiz edildi. Optimum netlik için parametreler ayarlanarak protein bantları tespit edildi. Bantların verileri teknik triplicates'ten oluşturulmuştu. (cf. Sun vd., 2016)

Hücre Fabrikalarının Endüstriyel Lizizi için Ultrasonik Hücre Bozucular

Ultrasonik lizis ve ekstraksiyon, hücre fabrikalarından metabolitleri serbest bırakmak için güvenilir ve rahat bir yöntemdir, böylece hedef moleküllerin etkili bir üretimine yardımcı olur. Ultrasonik hücre bozucular laboratuvardan endüstriyel boyuta kadar mevcuttur ve süreçler tamamen doğrusal olarak ölçeklendirilebilir.
Hielscher Ultrasonics yüksek performanslı ultrasonik bozucular için yetkin ortağınızdır ve tezgah üstü ve endüstriyel ortamlarda ultrasonik sistemlerin implantesi alanında uzun süreli deneyime sahiptir.
Sofistike donanım ve yazılım söz konusu olduğunda, Hielscher Ultrasonics hücre bozulması sistemleri optimum süreç kontrolü, kolay kullanım ve kullanıcı dostu için tüm gereksinimleri karşılar. Hielscher ultrasonicators müşterileri ve kullanıcısı Hielscher ultrasonik hücre bozucular ve çıkarıcılar hassas süreç izleme ve kontrol için izin fayda değer – dijital dokunmatik ekran ve tarayıcı uzaktan kumandası ile. Tüm önemli sonikasyon verileri (örneğin net enerji, toplam enerji, genlik, süre, sıcaklık, basınç) otomatik olarak entegre bir SD kartta CSV dosyası olarak saklanır. Bu, tekrarlanabilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmeye yardımcı olur ve proses standardizasyonunun yanı sıra İyi Üretim Uygulamalarının (cGMP) yerine getirilmesini kolaylaştırır.
Tabii ki, Hielscher ultrasonik işlemciler tam yük altında 7/24 çalışma için üretilmiştir ve bu nedenle endüstriyel üretim ayarlarında güvenilir bir şekilde çalıştırılabilir. Yüksek sağlamlık ve düşük bakım nedeniyle, ultrasonik ekipmanın kapalı kalma süresi gerçekten düşüktür. CIP (yerinde temizlik) ve SIP (yerinde sterilize) özellikleri, özellikle tüm ıslak parçalar pürüzsüz metal yüzeyler (gizli delikler veya nozüller olmadığından) zahmetli temizliği en aza indirir.

Aşağıdaki tablo size bizim ultrasonicators yaklaşık işleme kapasitesinin bir göstergesidir: