Endüstriyel Üretimde Biyomühendislik Hücrelerinin Ultrasonik Parçalanması

E. coli gibi biyomühendislik ürünü bakteri türlerinin yanı sıra genetiği değiştirilmiş memeli ve bitki hücre tipleri, biyoteknolojide molekülleri ifade etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Sentezlenen bu biyo-molekülleri serbest bırakmak için güvenilir bir hücre parçalama tekniği gereklidir. Yüksek performanslı ultrasonikasyon, verimli ve güvenilir hücre lizisi için kanıtlanmış bir yöntemdir – Büyük aktarım hızlarına kolayca ölçeklendirilebilir. Hielscher Ultrasonics, büyük miktarlarda yüksek kaliteli biyo-moleküller üretmek için etkili hücre lizisi için yüksek performanslı ultrasonik ekipman sunar.

Hücre Fabrikalarından Moleküllerin Ekstraksiyonu

Çok çeşitli biyomoleküllerin üretimi için, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana ve algler dahil olmak üzere çeşitli mühendislik mikropları ve bitki hücreleri mikrobiyal hücre fabrikaları olarak kullanılabilir. Bu hücre fabrikaları, endüstriyel uygulamalar için gıda veya hammadde olarak kullanılan proteinler, lipitler, biyokimyasallar, polimerler, biyoyakıtlar ve oleokimyasallar üretebilir. Hücre fabrikaları olarak kullanılan hücreler, yüksek verimlilik, özgüllük ve düşük enerji gereksinimleri elde edebilecekleri kapalı biyoreaktörlerde kültürlenir.
Hedef molekülleri biyomühendislik hücre kültürlerinden izole etmek için, hücre içi materyalin serbest bırakılması için hücrelerin parçalanması gerekir. Ultrasonik hücre bozucular, hücre parçalanması ve bileşik salınımı için son derece güvenilir ve verimli bir teknik olarak iyi bilinmektedir.

Mikrobiyal hücre fabrikaları, çeşitli değerli bileşiklerin sentezi için kullanılan metabolik olarak tasarlanmış hücrelerdir. Ultrasonik hücre bozulması, değerli bileşikleri hücre içinden serbest bırakmak için verimli ve güvenilir bir yöntemdir.
çalışma ve grafik: ©Villaverde, 2010.

Ultrasonik Hücre Bozucuların Avantajları

Termal olmayan, hafif, ancak yüksek verimli bir teknoloji olan ultrasonik bozucular, laboratuarda ve endüstride hücreleri parçalamak ve hücre fabrikalarından moleküllerin izolasyonu için kullanılan yüksek kaliteli ekstraktlar üretmek için kullanılır.

Mikrobiyal Hücre Fabrikalarının Verimli Bir Şekilde Bozulması için Power-Ultrason

Ultrasonik Hücre Bozucuların Mekanizması ve Etkileri:
Ultrasonik hücre bozulması, ultrason dalgalarının gücünü kullandı. Ultrasonik homojenizatör / hücre bozucu, yaklaşık 20 kHz'lik yüksek bir frekansta salınan titanyum alaşımından yapılmış bir prob (aka sonotrot) ile donatılmıştır. Bu, ultrasonik probun saniyede 20.000 titreşimi sonikasyonlu sıvıya bağladığı anlamına gelir. Sıvıya bağlanan ultrason dalgaları, alternatif yüksek basınç / düşük basınç döngüleri ile karakterize edilir. Düşük basınç döngüsü sırasında sıvı genişler ve çok küçük vakum kabarcıkları ortaya çıkar. Bu çok küçük kabarcıklar, daha fazla enerji ememeyecek duruma gelene kadar birkaç alternatif basınç döngüsü boyunca büyür. Bu noktada, kavitasyon kabarcıkları şiddetli bir şekilde patlar ve yerel olarak olağanüstü bir enerji yoğun ortam yaratır. Bu fenomen akustik kavitasyon olarak bilinir ve yerel olarak çok yüksek sıcaklıklar, çok yüksek basınçlar ve kesme kuvvetleri ile karakterize edilir. Bu kesme gerilmeleri, hücre duvarlarını verimli bir şekilde kırar ve hücre içi ile çevreleyen çözücü arasındaki kütle transferini arttırır. Tamamen mekanik bir teknik olarak, ultrasonik olarak üretilen kesme kuvvetleri yaygın olarak kullanılır ve bakteri hücresi bozulmasının yanı sıra protein izolasyonu için önerilen prosedürdür. Basit ve hızlı bir hücre bozulma yöntemi olarak, sonikasyon küçük, orta ve büyük ölçekli hacimlerin izolasyonu için idealdir. Hielscher'ın dijital ultrasonicators, hassas sonication kontrolü için net bir ayar menüsü ile donatılmıştır. Tüm sonikasyon verileri otomatik olarak yerleşik bir SD kartta saklanır ve kolayca erişilebilir. Ultrasonik parçalanma işlemi sırasında harici soğutma, puls modunda sonikasyon vb. gibi sofistike ısı dağılımı seçenekleri, ideal proses sıcaklığının korunmasını ve dolayısıyla ekstrakte edilen ısıya duyarlı bileşiklerin bozulmamasını sağlar.

Araştırma, Ultrasonik Hücre Bozulması ve Ekstraksiyonunun Güçlü Yönlerinin Altını Çiziyor

Prof. Chemat ve ark. (2017) çalışmalarında, "ultrason destekli ekstraksiyonun, gıda ve doğal ürünler için geleneksel tekniklere yeşil ve ekonomik olarak uygulanabilir bir alternatif olduğunu" devam ettiriyor. Başlıca faydaları, ekstraksiyon ve işleme süresinin azalması, kullanılan enerji ve çözücü miktarı, birim işlemler ve CO'dur₂ emisyonlar."
Gabig-Ciminska ve ark. (2014), DNA'yı serbest bırakmak için sporların parçalanması için yaptıkları çalışmada yüksek basınçlı bir homojenizatör ve bir ultrasonik hücre dsintegratörü kullandılar. Her iki hücre parçalanma yöntemini karşılaştıran araştırma ekibi, spor DNA'sı için hücre lizisi ile ilgili olarak, "analiz, yüksek basınçlı homojenizasyondan elde edilen hücre lizatları kullanılarak yapılmıştır. Daha sonra, ultrasonik hücre bozulmasının bu amaç için olağanüstü avantajları olduğunu fark ettik. Oldukça hızlıdır ve küçük numune hacimleri için işlenebilir." (Gabig-Ciminska ve diğerleri, 2014)

Gıda Üretimi için Hücre Fabrikalarından Biyomoleküller

Mikrobiyal hücre fabrikaları, bakteri, maya, mantar vb. mikrobiyal mikroorganizmaların metabolik biyo-mühendisliği ile doğal ve doğal olmayan metabolitlerin yüksek verimini üretmek için mikrobiyal organizmaları kullanan uygulanabilir ve verimli bir üretim metodolojisidir. Toplu enzimler, örneğin Aspergillus oryzae, mantarlar ve bakteriler gibi mikroorganizmalar kullanılarak üretilir. Bu toplu enzimler, yiyecek ve içecek üretiminin yanı sıra tarım, biyoenerji ve ev bakımında da kullanılmaktadır.
Acetobacter xylinum ve Gluconacetobacter xylinus gibi bazı bakteriler, nanoliflerin aşağıdan yukarıya bir işlemle sentezlendiği fermantasyon işlemi sırasında selüloz üretir. Bakteriyel selüloz (mikrobiyal selüloz olarak da bilinir) kimyasal olarak bitki selülozuna eşdeğerdir, ancak yüksek derecede kristalliğe ve yüksek saflığa (lignin, hemiselüloz, pektin ve diğer biyojenik bileşenler içermez) ve ayrıca selüloz nanofiber dokuma üç boyutlu (3D) ağsı ağın benzersiz bir yapısına sahiptir. (bkz. Zhong, 2020) Bitki kaynaklı selüloz ile karşılaştırıldığında, bakteriyel selüloz daha sürdürülebilirdir ve üretilen selüloz saftır ve karmaşık saflaştırma adımları gerektirmez. NaOH veya SDS (sodyum dodesil sülfat) kullanarak ultrasonikasyon ve çözücü ekstraksiyonu, bakteriyel selülozun bakteri hücrelerinden izolasyonu için çok etkilidir.

İlaç ve Aşı Üretimi için Hücre Fabrikalarından Biyomoleküller

Hücre fabrikalarından elde edilen en önemli farmasötik ürünlerden biri insan insülinisidir. Biyomühendislik insülin üretimi için ağırlıklı olarak E. coli ve Saccharomyces cerevisiae kullanılır. Biyo-sentezlenen nano boyutlu moleküller yüksek bir biyouyumluluk sunduğundan, ferritin gibi biyolojik nanopartiküller çok sayıda biyo-üretim uygulaması için avantajlıdır. Ek olarak, metabolik olarak tasarlanmış mikroplardaki üretim, elde edilen verimlerde genellikle önemli ölçüde daha etkilidir. Örneğin, artemisik asit, resveratrol ve likopen üretimi on kat artarak birkaç yüz kata ulaşmıştır ve halihazırda endüstriyel ölçekte üretim için kurulmuştur veya geliştirilmektedir. (Bkz. Liu ve ark.; Mikrob. Hücre Gerçeği. 2017)
Örneğin, ferritin ve virüs benzeri parçacıklar gibi kendi kendine birleşen özelliklere sahip protein bazlı nano boyutlu biyomoleküller, patojenlerin hem boyutunu hem de yapısını taklit ettikleri ve bağışıklık hücreleri ile etkileşimi teşvik etmek için antijenlerin yüzey konjugasyonuna uygun oldukları için aşı geliştirme için özellikle ilgi çekicidir. Bu tür moleküller, belirli bir hedef molekül üreten hücre fabrikaları (örneğin, tasarlanmış E. coli suşları) olarak ifade edilir.

Ultrasonik Lizis ve Ferritin Salınımı için E. coli BL21 Protokolü

Ferritin, birincil işlevi demirin depolanması olan bir proteindir. Ferritin, aşı dağıtım aracı olarak kullanıldığı aşılarda (örneğin SARS-Cov-2 spike proteinleri) kendi kendine birleşen nanopartiküller olarak umut verici yetenekler gösterir. Sun et'in bilimsel araştırması. (2016), rekombinant ferritinin, düşük NaCl konsantrasyonlarında (≤50 mmol/L) Escherichia coli'den çözünür bir form olarak salınabileceğini göstermektedir. E. coli BL21'de ferritini eksprese etmek ve ferrtini serbest bırakmak için aşağıdaki protokol başarıyla uygulanmıştır. Rekombinant pET-28a/ferritin plazmidi, E coli BL21 (DE3) suşuna dönüştürüldü. Ferritin E coli BL21 (DE3) hücreleri, 37 ° C'de% 0.5 kanamisin ile LB büyüme ortamında kültürlendi ve 37 ° C'de 3 saat boyunca% 0.4 izopropil-β-D-tiyogalaktopiranosid ile 0.6'lık bir OD600'de indüklendi. Nihai kültür daha sonra 4 ° C'de 10 dakika boyunca 8000 g'da santrifüjleme ile hasat edildi ve pelet toplandı. Daha sonra pelet, LB ortamında (%1 NaCl, %1 Typone, %0.5 maya ekstraktı)/lizis tamponunda (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7.6) ve farklı konsantrasyonlarda NaCl çözeltisinde (sırasıyla 0, 50, 100, 170 ve 300 mmol/L) yeniden süspanse edildi. Bakteriyel hücre lizisi için, sonikasyon darbe modunda uygulandı: örneğin, ultrasonikatör UP400St 100 döngü için 5 saniye AÇIK, 10 saniye KAPALI görev döngüsü ile% 40 genlikte) ve daha sonra 4 ° C'de 15 dakika boyunca 10 000 g'de santrifüjlenir. Süpernatan ve çökelti, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile analiz edildi. Tüm sodyum dodesil sülfat lekeli jeller yüksek çözünürlüklü tarayıcı ile tarandı. Jel görüntüleri Magic Chemi 1D yazılımı kullanılarak analiz edildi. Optimum netlik için, parametreler ayarlanarak protein bantları tespit edildi. Bantlar için veriler teknik üçlülerden oluşturulmuştur. (bkz. Sun ve diğerleri, 2016)

Hücre fabrikalarının endüstriyel parçalanması için ultrasonik hücre bozucular

Ultrasonik lizis ve ekstraksiyon, hücre fabrikalarından metabolitleri serbest bırakmak için güvenilir ve rahat bir yöntemdir, böylece hedef moleküllerin etkili bir şekilde üretilmesine yardımcı olur. Ultrasonik hücre bozucular laboratuvardan endüstriyel boyuta kadar mevcuttur ve işlemler tamamen doğrusal olarak ölçeklendirilebilir.
Hielscher Ultrasonics, yüksek performanslı ultrasonik bozucular için yetkin ortağınızdır ve tezgah üstü ve endüstriyel ortamlarda ultrasonik sistemlerin implantasyonu alanında uzun süreli deneyime sahiptir.
Gelişmiş donanım ve yazılım söz konusu olduğunda, Hielscher Ultrasonik hücre bozulma sistemleri, optimum proses kontrolü, kolay kullanım ve kullanım kolaylığı için tüm gereksinimleri karşılar. Hielscher ultrasonicators müşterileri ve kullanıcısı, Hielscher ultrasonik hücre bozucuların ve çıkarıcıların hassas süreç izleme ve kontrol için izin verdiği yararına değer verir – dijital dokunmatik ekran ve tarayıcı uzaktan kumandası ile. Tüm önemli sonikasyon verileri (örneğin net enerji, toplam enerji, genlik, süre, sıcaklık, basınç) otomatik olarak entegre bir SD kartta CSV dosyası olarak saklanır. Bu, tekrarlanabilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmeye yardımcı olur ve süreç standardizasyonunun yanı sıra İyi Üretim Uygulamalarının (cGMP) yerine getirilmesini kolaylaştırır.
Tabii ki, Hielscher ultrasonik işlemciler tam yük altında 7/24 çalışma için üretilmiştir ve bu nedenle endüstriyel üretim ortamlarında güvenilir bir şekilde çalıştırılabilir. Yüksek sağlamlık ve düşük bakım nedeniyle, ultrasonik ekipmanın arıza süresi gerçekten düşüktür. CIP (yerinde temizlik) ve SIP (yerinde sterilizasyon) özellikleri, özellikle tüm ıslak parçalar pürüzsüz metal yüzeyler olduğundan (gizli delikler veya nozullar yoktur) zahmetli temizliği en aza indirir.

Aşağıdaki tablo size ultrasonicators'ımızın yaklaşık işleme kapasitesinin bir göstergesini verir: