Endüstriyel Üretimde Biyomühendislikle Geliştirilmiş Hücrelerin Ultrasonik Lizisi

E. coli gibi biyomühendislikle geliştirilmiş bakteri türlerinin yanı sıra genetik olarak değiştirilmiş memeli ve bitki hücresi tipleri, moleküllerin ekspresyonu için biyoteknolojide yaygın olarak kullanılır. Sentezlenen bu biyomolekülleri serbest bırakmak için güvenilir bir hücre parçalama tekniği gerekir. Yüksek performanslı ultrasonikasyon, verimli ve güvenilir hücre lizisi için kanıtlanmış bir yöntemdir – yüksek işleme kapasitelerine kolayca ölçeklenebilir. Hielscher Ultrasonics, büyük hacimlerde yüksek kaliteli biyomoleküller üretmek amacıyla etkin hücre lizisi için yüksek performanslı ultrasonik ekipman sunar.

Hücre Fabrikalarından Moleküllerin Ekstraksiyonu

Çok çeşitli biyomoleküllerin üretimi için, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana ve algler de dahil olmak üzere çok sayıda farklı, mühendislikle geliştirilmiş mikrop ve bitki hücresi mikrobiyal hücre fabrikası olarak kullanılabilir. Bu hücre fabrikaları, gıda olarak veya endüstriyel uygulamalarda ham madde olarak kullanılan proteinler, lipitler, biyokimyasallar, polimerler, biyoyakıtlar ve oleokimyasallar üretebilir. Hücre fabrikası olarak kullanılan hücreler, yüksek verimliliğe, özgüllüğe ve düşük enerji gereksinimlerine ulaşabilecekleri kapalı biyoreaktörlerde kültüre edilir.
Hedef molekülleri biyomühendislikle geliştirilmiş hücre kültürlerinden izole etmek için, hücre içi materyalin serbest kalmasını sağlayacak şekilde hücreler parçalanmalıdır. Ultrasonik hücre parçalayıcılar, hücrelerin parçalanması ve bileşiklerin serbest bırakılması için son derece güvenilir ve verimli bir teknik olarak yerleşmiş durumdadır.

Mikrobiyal hücre fabrikaları, çeşitli değerli bileşiklerin sentezi için kullanılan, metabolik mühendislikle geliştirilmiş hücrelerdir. Ultrasonik hücre parçalama, değerli bileşikleri hücre içinden serbest bırakmak için verimli ve güvenilir bir yöntemdir.
çalışma ve grafik: ©Villaverde, 2010.

Ultrasonik Hücre Parçalayıcıların Avantajları

Termal olmayan, nazik ancak son derece verimli bir teknoloji olan ultrasonik parçalayıcılar, laboratuvarda ve endüstride hücreleri lize etmek ve örneğin hücre fabrikalarından moleküllerin izolasyonunda kullanılan yüksek kaliteli ekstraktlar üretmek için kullanılır.

Mikrobiyal Hücre Fabrikalarının Verimli Bir Şekilde Parçalanması İçin Güç Ultrasonu

Ultrasonik Hücre Parçalayıcıların Mekanizması ve Etkileri:
Ultrasonik hücre parçalama, ultrason dalgalarının gücünden yararlanır. Ultrasonik homojenizatör / hücre parçalayıcı, yaklaşık 20 kHz gibi yüksek bir frekansta salınan, titanyum alaşımından yapılmış bir probla (diğer adıyla sonotrot) donatılmıştır. Bu, ultrasonik probun sonikasyona tabi tutulan sıvıya saniyede 20.000 titreşim aktardığı anlamına gelir. Sıvıya aktarılan ultrason dalgaları, birbirini izleyen yüksek basınç / düşük basınç döngüleriyle karakterizedir. Düşük basınç döngüsü sırasında sıvı genleşir ve çok küçük vakum kabarcıkları oluşur. Bu çok küçük kabarcıklar, daha fazla enerji soğuramayacak hale gelene kadar birbirini izleyen birkaç basınç döngüsü boyunca büyür. Bu noktada kavitasyon kabarcıkları şiddetle içe çöker ve yerel olarak olağanüstü enerji yoğunluğuna sahip bir ortam oluşturur. Bu olgu akustik kavitasyon olarak bilinir ve yerel olarak çok yüksek sıcaklıklar, çok yüksek basınçlar ve kesme kuvvetleriyle karakterizedir. Bu kesme gerilmeleri, hücre duvarlarını verimli bir şekilde parçalar ve hücre içi ile çevredeki çözücü arasındaki kütle transferini artırır. Tamamen mekanik bir teknik olarak, ultrasonik olarak oluşturulan kesme kuvvetleri yaygın biçimde kullanılır ve hem bakteriyel hücre parçalama hem de protein izolasyonu için önerilen işlemdir. Basit ve hızlı bir hücre parçalama yöntemi olan sonikasyon, küçük, orta ve büyük hacimlerde izolasyon için idealdir. Hielscher dijital sonikatörleri, hassas sonikasyon kontrolü için anlaşılır bir ayar menüsüyle donatılmıştır. Tüm sonikasyon verileri, yerleşik bir SD karta otomatik olarak kaydedilir ve bunlara kolayca erişilebilir. Ultrasonik parçalama işlemi sırasında harici soğutma, darbeli modda sonikasyon vb. gelişmiş ısı uzaklaştırma seçenekleri, ideal işlem sıcaklığının korunmasını ve böylece ekstrakte edilen ısıya duyarlı bileşiklerin bozulmadan kalmasını sağlar.

Araştırmalar Ultrasonik Hücre Parçalama ve Ekstraksiyonun Güçlü Yönlerini Vurguluyor

Prof. Chemat et al. (2017), çalışmalarında şu şekilde özetlemektedir: “Ultrason destekli ekstraksiyon, gıda ve doğal ürünler için geleneksel tekniklere çevreci ve ekonomik açıdan uygulanabilir bir alternatiftir. Başlıca faydaları; ekstraksiyon ve işlem süresinin, kullanılan enerji ve çözücü miktarının, birim işlemlerin ve CO₂ emisyonlarının azalmasıdır.”
Gabig-Ciminska et al. (2014), DNA’yı serbest bırakmak amacıyla sporların lizisine yönelik çalışmalarında yüksek basınçlı bir homojenizatör ve ultrasonik bir hücre parçalayıcı kullanmıştır. İki hücre parçalama yöntemini karşılaştıran araştırma ekibi, spor DNA’sı için hücre lizisine ilişkin şu sonuca varmaktadır: “Analiz, yüksek basınçlı homojenizasyondan elde edilen hücre lizatları kullanılarak yapılmıştır. Daha sonra ultrasonik hücre parçalamanın bu amaç için olağanüstü avantajları olduğunu fark ettik. Oldukça hızlıdır ve küçük numune hacimlerinde uygulanabilir.” (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Gıda Üretimi İçin Hücre Fabrikalarından Biyomoleküller

Mikrobiyal hücre fabrikaları, bakteri, maya, mantar vb. mikrobiyal mikroorganizmaların metabolik biyomühendisliği yoluyla doğal ve doğal olmayan metabolitleri yüksek verimlerle üretmek için mikrobiyal organizmalardan yararlanan, uygulanabilir ve verimli bir üretim yöntemidir. Örneğin, büyük miktarlarda üretilen enzimler Aspergillus oryzae, mantarlar ve bakteriler gibi mikroorganizmalar kullanılarak üretilir. Bu enzimler, gıda ve içecek üretiminin yanı sıra tarımda, biyoenerjide ve ev bakımında kullanılır.
Acetobacter xylinum ve Gluconacetobacter xylinus gibi bazı bakteriler, nano liflerin aşağıdan yukarıya bir süreçle sentezlendiği fermantasyon işlemi sırasında selüloz üretir. Bakteriyel selüloz (mikrobiyal selüloz olarak da bilinir), kimyasal açıdan bitki selülozuna eşdeğerdir; ancak yüksek kristallik derecesine ve yüksek saflığa (lignin, hemiselüloz, pektin ve diğer biyojenik bileşenleri içermez) ve ayrıca selüloz nano liflerinden örülmüş üç boyutlu (3D) ağsı bir yapıya sahiptir. (bkz. Zhong, 2020) Bitki kaynaklı selüloza kıyasla bakteriyel selüloz daha sürdürülebilirdir ve üretilen selüloz saftır, karmaşık saflaştırma adımları gerektirmez. Ultrasonikasyon ve NaOH veya SDS (sodyum dodesil sülfat) kullanılarak yapılan çözücü ekstraksiyonu, bakteriyel selülozun bakteri hücrelerinden izolasyonu için çok etkilidir.

İlaç ve Aşı Üretimi İçin Hücre Fabrikalarından Biyomoleküller

Hücre fabrikalarından elde edilen en önde gelen farmasötik ürünlerden biri insan insülinidir. Biyomühendislikle insülin üretimi için ağırlıklı olarak E. coli ve Saccharomyces cerevisiae kullanılır. Biyosentez yoluyla elde edilen nano boyutlu moleküller yüksek biyouyumluluk sunduğundan, ferritin gibi biyolojik nanopartiküller çok sayıda biyolojik üretim uygulaması için avantajlıdır. Ayrıca, metabolik mühendislikle geliştirilmiş mikroplarda üretim, elde edilen verimler açısından çoğu zaman belirgin ölçüde daha etkindir. Örneğin, artemisinik asit, resveratrol ve likopen üretimi on kat ile birkaç yüz kat arasında artmış olup, endüstriyel ölçekli üretime geçişi hâlihazırda gerçekleştirilmiş veya geliştirme aşamasındadır. (bkz. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Örneğin, ferritin ve virüs benzeri partiküller gibi kendiliğinden bir araya gelme özelliklerine sahip protein temelli nano boyutlu biyomoleküller, patojenlerin hem boyutunu hem de yapısını taklit ettikleri ve bağışıklık hücreleriyle etkileşimi desteklemek üzere antijenlerin yüzeye konjugasyonuna uygun oldukları için aşı geliştirme açısından özellikle ilgi çekicidir. Bu tür moleküller, belirli bir hedef molekülü üreten ve hücre fabrikaları olarak adlandırılan hücrelerde (ör. mühendislikle geliştirilmiş E. coli suşları) eksprese edilir.

Ferritinin Serbest Bırakılması İçin E. coli BL21 Hücrelerinin Ultrasonik Lizis Protokolü

Ferritin, temel işlevi demirin depolanması olan bir proteindir. Ferritin, aşılarda kendiliğinden bir araya gelen nanopartiküller olarak umut verici özellikler gösterir ve burada aşı taşıma aracı olarak kullanılır (ör. SARS-Cov-2 spike proteinleri). Sun et. al. (2016) tarafından yapılan bilimsel araştırma, rekombinant ferritinin düşük NaCl konsantrasyonlarında (≤50 mmol/L) Escherichia coli hücrelerinden çözünür formda serbest bırakılabileceğini göstermektedir. E. coli BL21 hücrelerinde ferritini eksprese etmek ve serbest bırakmak için aşağıdaki protokol başarıyla uygulanmıştır. Rekombinant pET-28a/ferritin plazmidi, E coli BL21 (DE3) suşuna transforme edilmiştir. Ferritin E coli BL21 (DE3) hücreleri, %0,5 kanamisin içeren LB büyüme ortamında 37°C sıcaklıkta kültüre edilmiş ve 0,6 OD600 değerinde, %0,4 izopropil-β-D-tiyogalaktopiranozid ile 37°C sıcaklıkta 3 saat boyunca indüklenmiştir. Ardından son kültür, 4°C sıcaklıkta 10 dakika boyunca 8000g değerinde santrifüjlenerek hasat edilmiş ve pelet toplanmıştır. Daha sonra pelet, sırasıyla LB ortamında (%1 NaCl, %1 Typone, %0,5 maya ekstraktı)/lizis tamponunda (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) ve farklı konsantrasyonlardaki NaCl çözeltilerinde (0, 50, 100, 170 ve 300 mmol/L) yeniden süspanse edilmiştir. Bakteriyel hücre lizisi için darbeli modda sonikasyon uygulanmıştır: örneğin, UP400St sonikatörü kullanılarak %100 genlikte, 5 saniye AÇIK, 10 saniye KAPALI çalışma döngüsüyle 40 döngü boyunca) sonikasyon uygulanmış ve ardından 4°C sıcaklıkta 15 dakika boyunca 10 000g değerinde santrifüjlenmiştir. Süpernatan ve çökelti, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile analiz edilmiştir. Sodyum dodesil sülfat ile boyanmış tüm jeller, yüksek çözünürlüklü bir tarayıcıyla taranmıştır. Jel görüntüleri, Magic Chemi 1D yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir. En uygun netlik için, parametreler ayarlanarak protein bantları tespit edilmiştir. Bantlara ilişkin veriler, üçlü teknik tekrarlardan elde edilmiştir. (bkz. Sun et al., 2016)

Hücre Fabrikalarının Endüstriyel Lizisi İçin Ultrasonik Hücre Parçalayıcılar

Ultrasonik lizis ve ekstraksiyon, hücre fabrikalarından metabolitleri serbest bırakmak için güvenilir ve kolay uygulanabilir bir yöntemdir ve böylece hedef moleküllerin etkin üretimini destekler. Ultrasonik hücre parçalayıcılar, laboratuvar boyutundan endüstriyel boyuta kadar mevcuttur ve işlemler tamamen doğrusal olarak ölçeklenebilir.
Hielscher Ultrasonics, yüksek performanslı ultrasonik parçalayıcılar konusunda yetkin ortağınızdır ve ultrasonik sistemlerin tezgâh üstü ve endüstriyel ortamlara kurulması alanında uzun yıllara dayanan deneyime sahiptir.
Gelişmiş donanım ve yazılım söz konusu olduğunda, Hielscher Ultrasonics hücre parçalama sistemleri, optimum işlem kontrolü, kolay kullanım ve kullanıcı dostu çalışma için tüm gereksinimleri karşılar. Hielscher sonikatörlerinin müşterileri ve kullanıcıları, Hielscher ultrasonik hücre parçalayıcılarının ve ekstraktörlerinin dijital dokunmatik ekran ve tarayıcı üzerinden uzaktan kontrol aracılığıyla hassas işlem izleme ve kontrol olanağı sunmasını değerli bulur. Tüm önemli sonikasyon verileri (ör. net enerji, toplam enerji, genlik, süre, sıcaklık, basınç), entegre bir SD karta CSV dosyası olarak otomatik kaydedilir. Bu, yeniden üretilebilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde edilmesine yardımcı olur ve işlem standardizasyonunu ve İyi Üretim Uygulamalarının (cGMP) karşılanmasını kolaylaştırır.
Elbette Hielscher ultrasonik işlemcileri, tam yük altında 24/7 çalışma için üretilmiştir ve bu nedenle endüstriyel üretim ortamlarında güvenilir bir şekilde çalıştırılabilir. Yüksek dayanıklılık ve düşük bakım gereksinimi sayesinde ultrasonik ekipmanın duruş süresi gerçekten düşüktür. CIP (yerinde temizleme) ve SIP (yerinde sterilizasyon) özellikleri, özellikle sıvıyla temas eden tüm parçaların pürüzsüz metal yüzeyler olması (gizli delikler veya nozullar bulunmaması) sayesinde zahmetli temizliği en aza indirir.

Aşağıdaki tablo, sonikatörlerimizin yaklaşık işleme kapasitesi hakkında fikir verir: