İnsan Sütü Oligosakkaritlerinin Biyosentetik Üretimi

İnsan sütü oligosakkaritlerinin (HMO’lar) fermantasyon veya enzimatik reaksiyonlar yoluyla biyosentezi karmaşık, kaynak tüketen ve genellikle düşük verimli bir süreçtir. Ultrasonikasyon, substrat ile hücre fabrikaları arasındaki kütle transferini artırır ve hücre büyümesini ve metabolizmasını uyarır. Böylece sonikasyon, fermantasyon ve biyokimyasal süreçleri yoğunlaştırarak HMO’ların daha hızlı ve daha verimli üretilmesini sağlar.

İnsan Sütü Oligosakkaritleri

İnsan sütü glikanları olarak da bilinen insan sütü oligosakkaritleri (HMO’lar), oligosakkarit grubuna ait şeker molekülleridir. HMO’ların öne çıkan örnekleri arasında 2’-fukozillaktoz (2′-FL), lakto-N-neotetraoz (LNnT), 3’-galaktozillaktoz (3′-GL) ve difukozillaktoz (DFL) bulunur.
İnsan anne sütü 150’den fazla farklı HMO yapısı içerirken, şu anda yalnızca 2′-fukozillaktoz (2′-FL) ve lakto-N-neotetraoz (LNnT) ticari ölçekte üretilmekte ve bebek mamalarında besin katkısı olarak kullanılmaktadır.
İnsan sütü oligosakkaritleri (HMO’lar), bebek beslenmesindeki önemleriyle bilinir. İnsan sütü oligosakkaritleri, bebeğin bağırsağında prebiyotik, antiadezif antimikrobiyal ve immünomodülatör olarak işlev gören ve beyin gelişimine önemli ölçüde katkıda bulunan benzersiz bir besin türüdür. HMO’lar yalnızca insan anne sütünde bulunur; diğer memelilerin sütleri (ör. inek, keçi, koyun, deve vb.) bu özgül oligosakkarit biçimlerini içermez.
İnsan sütü oligosakkaritleri, insan sütünde en bol bulunan üçüncü katı bileşendir ve suda çözünmüş, emülsifiye edilmiş veya süspansiyon halinde bulunabilir. Laktoz ve yağ asitleri, insan sütünde en bol bulunan katı maddelerdir. HMO’lar 0,35–0,88 ons (9,9–24,9 g)/ L konsantrasyonunda bulunur. Yapısal olarak farklı yaklaşık 200 insan sütü oligosakkariti bilinmektedir. Tüm kadınların %80’inde baskın oligosakkarit, insan anne sütünde yaklaşık 2,5 g/ L konsantrasyonunda bulunan 2′-fukozillaktozdur.
HMO’lar sindirilmedikleri için beslenmeye kalori açısından katkıda bulunmaz. Sindirilemeyen karbonhidratlar olarak prebiyotik işlevi görür ve yararlı bağırsak mikroflorası, özellikle bifidobakteriler tarafından seçici olarak fermente edilirler.

İnsan Sütü Oligosakkaritlerinin Biyosentezi

Hücre fabrikaları ve enzimatik / kemoenzimatik sistemler, HMO’ların sentezinde kullanılan güncel teknolojilerdir. Endüstriyel ölçekte HMO üretimi için mikrobiyal hücre fabrikalarının fermantasyonu, biyokimyasal sentez ve farklı enzimatik reaksiyonlar, HMO’ların biyolojik üretiminde uygulanabilir yöntemlerdir. Ekonomik nedenlerle, mikrobiyal hücre fabrikaları yoluyla biyosentez şu anda HMO’ların endüstriyel üretiminde kullanılan tek tekniktir.

Mikrobiyal Hücre Fabrikaları Kullanılarak HMO’ların Fermantasyonu

E.coli, Saccharomyces cerevisiae ve Lactococcus lactis, HMO’lar gibi biyolojik moleküllerin biyolojik üretiminde yaygın olarak kullanılan hücre fabrikalarıdır. Fermantasyon, bir substratı hedeflenen biyolojik moleküllere dönüştürmek için mikroorganizmaları kullanan biyokimyasal bir süreçtir. Mikrobiyal hücre fabrikaları, substrat olarak basit şekerleri kullanır ve bunları HMO’lara dönüştürür. Basit şekerler (ör. laktoz) bol bulunan ve ucuz bir substrat olduğundan, bu durum biyosentez sürecinin maliyet açısından verimli olmasını sağlar.
Büyüme ve biyodönüşüm hızı, esas olarak besinlerin (substratın) mikroorganizmalara kütle transferinden etkilenir. Kütle transfer hızı, fermantasyon sırasında ürün sentezini etkileyen temel bir faktördür. Ultrasonikasyonun kütle transferini desteklediği iyi bilinmektedir.
Fermantasyon sırasında biyoreaktördeki koşullar sürekli izlenmeli ve düzenlenmelidir; böylece hücreler, ardından hedeflenen biyomolekülleri (ör. HMO’lar gibi oligosakkaritler; insülin; rekombinant proteinler) üretebilmek için mümkün olduğunca hızlı büyüyebilir. Teorik olarak ürün oluşumu, hücre kültürü büyümeye başlar başlamaz başlar. Ancak özellikle mühendislikle geliştirilmiş mikroorganizmalar gibi genetiği değiştirilmiş hücrelerde, ürün oluşumu genellikle daha sonra substrata hedeflenen biyomolekülün ekspresyonunu artıran bir kimyasal madde eklenerek indüklenir. Ultrasonik biyoreaktörler (sono-biyoreaktörler) hassas biçimde kontrol edilebilir ve mikropların özgül olarak uyarılmasına olanak tanır. Bu, daha hızlı biyosentez ve daha yüksek verimle sonuçlanır.
Ultrasonik lizis ve ekstraksiyon: Karmaşık HMO’ların fermantasyonu, düşük fermantasyon titreleri ve ürünlerin hücre içinde kalması nedeniyle sınırlanabilir. Ultrasonik lizis ve ekstraksiyon, saflaştırma ve sonraki işlem basamaklarından önce hücre içi materyali serbest bırakmak için kullanılır.

Ultrasonik Olarak Desteklenen Fermantasyon

Escherichia coli, mühendislikle geliştirilmiş E.coli, Saccharomyces cerevisiae ve Lactococcus lactis gibi mikropların büyüme hızı, kontrollü düşük frekanslı ultrasonikasyon uygulanarak kütle transfer hızı ve hücre duvarı geçirgenliği artırıldığında hızlandırılabilir. Hafif ve ısıl olmayan bir işleme tekniği olarak ultrasonikasyon, fermantasyon sıvısına tamamen mekanik kuvvetler uygular.
Akustik Kavitasyon: Sonikasyonun çalışma prensibi akustik kavitasyona dayanır. Ultrasonik prob (sonotrot), düşük frekanslı ultrason dalgalarını ortama aktarır. Ultrason dalgaları sıvı boyunca ilerleyerek dönüşümlü yüksek basınç (sıkışma) / düşük basınç (seyrelme) döngüleri oluşturur. Sıvının dönüşümlü döngülerde sıkıştırılıp gerilmesiyle çok küçük vakum kabarcıkları ortaya çıkar. Bu küçük vakum kabarcıkları, daha fazla enerji soğuramayacakları bir boyuta ulaşana kadar birkaç döngü boyunca büyür. Bu maksimum büyüme noktasında vakum kabarcığı şiddetle içe doğru çöker ve yerel olarak kavitasyon olgusu olarak bilinen aşırı koşullar oluşturur. Kavitasyonun “sıcak noktasında”, yüksek basınç ve sıcaklık farkları ile 280m/sec’ye kadar ulaşan sıvı jetleriyle birlikte yoğun kesme kuvvetleri gözlemlenebilir. Bu kavitasyon etkileri sayesinde kapsamlı kütle transferi ve sonoporasyon (hücre duvarlarında ve hücre zarlarında deliklerin oluşması) elde edilir. Substrattaki besinler, canlı ve bütünlüğünü koruyan hücrelere doğru ve hücrelerin içine taşınır; böylece hücre fabrikaları en uygun şekilde beslenir ve hem büyüme hem de dönüşüm hızları artırılır. Ultrasonik biyoreaktörler, biyokütleyi tek kapta yürütülen bir biyosentez sürecinde işlemek için basit ancak son derece etkili bir stratejidir.
Hassas biçimde kontrol edilen hafif sonikasyonun fermantasyon süreçlerini yoğunlaştırdığı iyi bilinmektedir.
Sonikasyon, “substrat alımının artırılması, hücre gözenekliliğinin artırılmasıyla üretimin veya büyümenin artırılması ve hücre bileşenlerinin salımının potansiyel olarak artırılması yoluyla canlı hücreleri içeren birçok biyoprosesin üretkenliğini” artırır. (Naveena et al. 2015)
Ultrasonik destekli fermantasyon hakkında daha fazla bilgi edinin!

Naveena et al. (2015), ultrasonik yoğunlaştırmanın biyoprosesler sırasında, iyileştirme sağlayan diğer işlem seçeneklerine kıyasla düşük işletme maliyetleri, kullanım kolaylığı ve mütevazı güç gereksinimleri dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sunduğunu bulmuştur.

Yüksek Performanslı Ultrasonik Fermantasyon Reaktörleri

Fermantasyon süreçleri, hücre fabrikaları olarak işlev gören bakteriler veya mayalar gibi canlı mikroorganizmaları içerir. Sonikasyon, kütle transferini desteklemek ve mikroorganizmaların büyüme ve dönüşüm hızını artırmak için uygulanırken, hücre fabrikalarının tahrip olmasını önlemek için ultrasonik yoğunluğun hassas biçimde kontrol edilmesi kritik önem taşır.
Hielscher Ultrasonics, üstün fermantasyon verimleri sağlamak için hassas biçimde kontrol edilip izlenebilen yüksek performanslı sonikatörlerin tasarımı, üretimi ve dağıtımı konusunda uzmandır.

Proses kontrolü, yüksek verim ve üstün kalite için gerekli olmasının yanı sıra sonuçların tekrarlanmasını ve yeniden üretilebilmesini sağlar. Özellikle hücre fabrikalarının uyarılmasında, yüksek verim elde etmek ve hücre bozunmasını önlemek için sonikasyon parametrelerinin hücreye özgü olarak uyarlanması gereklidir. Bu nedenle, Hielscher sonikatörlerinin tüm dijital modelleri, sonikasyon parametrelerini ayarlamanıza, izlemenize ve revize etmenize olanak tanıyan akıllı yazılımla donatılmıştır. Genlik, sıcaklık, basınç, sonikasyon süresi, çalışma döngüleri ve enerji girdisi gibi ultrasonik proses parametreleri, fermantasyon yoluyla HMO üretimini desteklemek için gereklidir.
Hielscher sonikatörlerinin akıllı yazılımı, tüm önemli proses parametrelerini entegre SD karta otomatik olarak kaydeder. Sonikasyon prosesine ait verilerin otomatik olarak kaydedilmesi, İyi Üretim Uygulamaları (GMP) için gerekli olan proses standardizasyonunun ve yeniden üretilebilirliğin / tekrarlanabilirliğin temelidir.

Fermantasyon için Ultrasonik Reaktörler

Hielscher, hem kesikli hem de sürekli akışlı işlemlerde kullanılabilen çeşitli boyut, uzunluk ve geometrilerde ultrasonik problar sunar. Sono-biyoreaktörler olarak da bilinen ultrasonik reaktörler, küçük laboratuvar numunelerinden pilot ve tam ticari üretim düzeyine kadar ultrasonik biyoprosesleri kapsayan her hacim için mevcuttur.
Ultrasonik sonotrodun reaksiyon kabındaki konumunun, ortam içindeki kavitasyon ve mikro akımların dağılımını etkilediği iyi bilinmektedir. Sonotrot ve ultrasonik reaktör, hücre kültürü sıvısının işleme hacmine göre seçilmelidir. Sonikasyon hem kesikli hem de sürekli modda gerçekleştirilebilse de yüksek üretim hacimleri için sürekli akışlı bir sistemin kullanılması önerilir. Ultrasonik bir akış hücresinden geçen hücre ortamının tamamı, sonikasyona tam olarak aynı düzeyde maruz kalır ve böylece en etkili işlem sağlanır. Hielscher Ultrasonics firmasının geniş ultrasonik prob ve akış hücresi reaktörü yelpazesi, ideal ultrasonik biyoproses düzeneğinin kurulmasına olanak tanır.

Hielscher Ultrasonics – Laboratuvardan Pilot Ölçeğe ve Üretime

Hielscher Ultrasonics, numune hazırlama için kompakt, elde taşınabilen ultrasonik homojenizatörlerden masaüstü ve pilot sistemlere, ayrıca saatte kamyonlar dolusu malzemeyi kolayca işleyebilen güçlü endüstriyel ultrasonik ünitelere kadar ultrasonik ekipmanların tüm yelpazesini kapsar. Kurulum ve montaj seçenekleri açısından çok yönlü ve esnek olan Hielscher sonikatörleri, her türlü kesikli reaktöre, beslemeli kesikli sisteme veya sürekli akışlı düzeneğe kolayca entegre edilebilir.
Çeşitli aksesuarlar ve özelleştirilmiş parçalar, ultrasonik düzeneğinizin proses gereksinimlerinize ideal biçimde uyarlanmasına olanak tanır.
Zorlu koşullarda tam yük altında ve ağır hizmet için 24/7 çalışacak şekilde üretilen Hielscher ultrasonik işlemcileri güvenilirdir ve yalnızca az bakım gerektirir.
Aşağıdaki tablo, sonikatörlerimizin yaklaşık işleme kapasitesi hakkında fikir verir: