Yüksek Verimli Protein Sindirimi ile Proteomik İş Akışları

Proteomik, biyolojik süreçleri ve sistemleri anlamak için önemli bir alandır ve protein sindirimi iş akışlarında kritik bir adım oluşturur. Geleneksel olarak, protein sindirimi, lizin ve arginin kalıntılarındaki peptit bağlarını spesifik olarak hidrolize eden tripsin gibi proteolitik enzimler kullanılarak çözelti içinde gerçekleştirilir. Bu işlem, kütle spektrometresi (MS) uygulamalarında iyonizasyon ve parçalanma için çok uygun peptitler üretir. Bununla birlikte, geleneksel sindirim yöntemlerinin tamamlanması için 12-24 saat gerekir ve bu da proteomik iş akışlarında önemli darboğazlar yaratır.
Ultrasonication, sindirim sürelerini saatlerden sadece birkaç dakikaya kadar önemli ölçüde kısaltan güçlü bir alternatif sunar. Hielscher CupHorn, VialTweeter ve 96 oyuklu plaka sonikatör UIP400MTP gibi gelişmiş çok örnekli sonikatörlerle birleştirildiğinde, ultrasonikasyon hızlandırılmış, yüksek verimli proteomik sağlar. Bu teknolojiler, tekrarlanabilirlik veya veri kalitesinden ödün vermeden iş akışlarını kolaylaştırarak numune hazırlama süresini azaltır ve verimliliği artırır.

Protein Sindiriminde Ultrasonik Enerjinin Rolü

Ultrasonication, kavitasyon oluşturmak için odaklanmış ultrason dalgalarını kullanır - yoğun kesme kuvvetleri oluşturmak için çöken lokalize mikro kabarcıklar. Bu fenomen kütle transferini arttırır, enzimlerin substratlarla karıştırılmasını teşvik eder ve protein yapılarını açarak bölünme bölgelerini tripsin gibi proteolitik enzimlere maruz bırakır.
Sonuç? Verimlilikten veya tekrarlanabilirlikten ödün vermeden sindirim süresinde önemli bir azalma.

Ultrasonik Geliştirilmiş Proteolitik Sindirim: Metodoloji ve Sonuçlar

Hızlandırılmış Sindirim Protokolü

Ultrasonik destekli sindirim, iş akışlarını hızlandırmak için proteolitik enzimleri ve ultrasonik enerjiyi birleştirir. Örneğin, Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) kullanarak, sindirim iş akışı aşağıdaki gibi ilerler:

1. İndirgeme: Protein örnekleri (0.5 mg / mL, 20 μL), amonyum bikarbonat tamponunda (12.5 mM) DTT (2 μL, 110 mM) ile muamele edilir. Sonikasyon 5 dakika boyunca% 50 genlikte uygulanır.
2. Alkilasyon: IAA (2 μL, 400 mM) eklendikten sonra, aynı koşullar altında sonikasyon tekrarlanır.
3. Sindirim: Numuneler seyreltilir ve hareketsizleştirilmiş tripsin nanopartikülleri ile inkübe edilir. Son bir sonikasyon turu (5 dakika) sindirimi tamamlar. Peptitler ayrılır, kurutulur ve MS analizi için saklanır.

Bu ultrasonik yöntem, toplam hazırlık süresini 12 saatten 30 dakikanın altına düşürür. Hızlandırılmış prosese rağmen, peptit verimi ve kalitesi geleneksel gece yöntemleriyle tutarlı kalmaktadır.

Ultrasonik Protein Sindiriminin Etkinliği

E. coli proteomları kullanılarak yapılan karşılaştırmalı çalışmalarda:

• Protein Tanımlama: Ultrasonik olarak sindirilmiş numuneler, 12 saatte 817'ye kıyasla 5 dakikada 777 protein tanımladı. Paylaşılan protein tanımlamaları p'i aştı.
• Tekrarlanabilirlik: Tekrarlanan analizler, her yöntemde �'in üzerinde korelasyon değerleri gösterdi ve bu da güvenilirliği gösterdi.
• Seçicilik: Bazı proteinler tercihen her yöntemle sindirildi, ultrasonik sindirim 65 proteini ve gece boyunca sindirimi 54 proteini tercih etti. Bu tür nüanslı farklılıklar, belirli uygulamalar için ultrasonikasyonun benzersiz potansiyelinin altını çizmektedir.

Bir E. coli'ye yedi çivili proteinin etiketsiz protein miktar tayin sonuçları
örnek. Aşağıdaki proteinler, sütunda belirtildiği gibi iki farklı seviyede eklenmiştir
"Theo Ratio" olarak adlandırılmıştır. Theo Oranı, bu bölümde kullanılan iki seviye arasındaki teorik orandır.
deney. Sığır serum albümini (ALBU), β-laktoglobulin (LACB), α-S1 kazein (CASA1),
α-S2 kazein (CASA2), sitokrom c (CYC), ovalbümin (OVAL) ve karbonik anhidraz 2
(CAH2). Oranlar, MaxQuant'tan elde edilen LFQ protein yoğunlukları kullanılarak hesaplandı
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Çalışma ve grafik: © Martins ve ark., 2019)

Nanopartikül ile İmmobilize Tripsin

İmmobilize tripsin nanopartiküllerinin (örneğin, T-FMNP'ler) ultrasonikasyon ile entegrasyonu, proteomik iş akışlarını daha da geliştirir. Bu nanopartiküller, enzim-substrat etkileşimleri için yüksek bir yüzey alanı sağlayarak verimliliği artırır. E. coli gibi karmaşık proteomlara uygulandığında, kombine yöntem şunları başarır:

• Hız: 5 dakika içinde tam sindirim.
• Doğruluk: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Ölçeklenebilirlik: UIP400MTP gibi çok kuyulu platformlara adaptasyon, yüksek verimli işlemeye olanak tanır.

Adım adım talimatların yer aldığı ayrıntılı protokol için buraya tıklayın!
(bkz. Martins ve diğerleri, 2019)

Hielscher sonicators ile yüksek hızda ve yüksek verimde proteolitik sindirim

Proteomik için En İyi Sonikatör Modelleri

Hielscher Ultrasonics, yüksek verimli iş akışlarını kolaylaştıran eşzamanlı çoklu numune hazırlama için çeşitli sonicator modelleri sunar. Şişeler, test tüpleri, çok kuyulu plakalar (örn. 6, 24, 96 oyuklu plakalar) veya Petri kapları ile çalışıyor olun – Deneyleriniz için size ideal sonikatörleri sunuyoruz.

UIP400MTP çok kuyulu plaka sonikatörü

Nihai verim için UIP400MTP, 96 oyuklu plakaları ultrasonik olarak işleme yeteneği sağlar. Herhangi bir standart mikroplaka ile uyumlu olan UIP400MTP, pahalı tescilli tek kullanımlık malzemeler gerektirmez ve size araştırmanız için en iyi çok kuyulu plakayı seçme özgürlüğü verir. Plaka boyunca eşit enerji sağlayarak, sadece 1 saat içinde 200'e kadar kompleks proteomun hızlı bir şekilde azaltılmasını, alkilasyonunu ve sindirimini sağlar. Bu otomasyon ve verimlilik seviyesi, yüksek verimli proteomik ve klinik uygulamalar için çok önemlidir. Çok kuyulu plaka sonikatörü hakkında daha fazla bilgi edinin!

VialTweeter

VialTweeter, 10 flakon veya test tüpünün aynı anda sonikasyonunu gerektiren laboratuvarlar için tasarlanmıştır. Non-invaziv yaklaşımı, tekrarlanabilir protein sindirimi sağlarken çapraz kontaminasyon risklerini ortadan kaldırır. Bu cihaz, sınırlı numune hacimleri veya çeşitli numune türleri ile çalışan araştırmacılar için idealdir.
VialTweeter çok tüplü sonikatör hakkında daha fazla bilgi edinin!

Hielscher UP200St-CupHorn

CupHorn sonikatörü, kapalı kaplarda birden fazla numunenin aynı anda işlenmesi için tasarlanmış güçlü bir cihazdır. Düzgün ultrasonik enerji dağılımı ve hassas sıcaklık kontrolü sağlar. Azaltılmış, alkillenmiş ve sindirilmiş iş akışlarıyla uyumluluğu ile birlikte aynı anda beş adede kadar numuneyi işleme yeteneği, CupHorn'u MS tabanlı proteomikler için güvenilir bir araç haline getirir.
CupHorn SonoReactor hakkında daha fazla bilgi edinin!

Nanopartikül İmmobilize Tripsin Kullanarak Ultrasonikasyon Destekli Proteolitik Sindirim için Adım Adım Protokol

Martins ve ark. (2019), ultrasonik enerji ve nanopartikül ile hareketsizleştirilmiş tripsin (T-FMNP'ler) kullanılarak hızlı protein sindirimi için optimize edilmiştir. Özetlenen adımlar, kütle spektrometresi (MS) uygulamaları için uygun verimli indirgeme, alkilasyon ve proteoliz sağlar.
Protokol Adımları

1. Disülfid Bağlarının İndirgenmesi
   • AmBic tamponundaki 20 μL protein örneğine (0.5 mg / mL) 2 μL DTT çözeltisi (110 mM) ekleyin.
   • Numune tüpünü sonoreaktör UP200St-CupHorn'a yerleştirin.
   • Numuneyi% 50 genlikte (200 W, 26 kHz) 2,5 dakika boyunca sonikleştirin.
   • Soğumaya izin vermek için kısa bir süre duraklayın, ardından aynı koşullar altında 2,5 dakika daha sonikasyon yapın.
2. İndirgenmiş Sistein Kalıntılarının Alkilasyonu
   • İndirgenmiş protein örneğine 2 μL IAA çözeltisi (400 mM) ekleyin.
   • Alkilasyonu kolaylaştırmak için% 50 genlikte 2.5 dakika sonikat.
   • Soğuma için duraklatın, ardından 2,5 dakika daha sonikasyon yapın.

   Not: IAA bozulmasını önlemek için alkillenmiş numunenin ışığa maruz kalmasını en aza indirin.

3. Numune Seyreltme
   • Alkillenmiş protein numunesini,% 4 asetonitril (h / h) içeren 25 mM AmBic tamponu kullanarak 100 μL'lik bir nihai hacme seyreltin.
   • Nazik pipetleme ile iyice karıştırın.
4. Nanopartikül İmmobilize Tripsin ile Proteolitik Sindirim
   • Seyreltilmiş protein örneğine 20 μL T-FMNP çözeltisi (3 mg / mL) ekleyin.
   • Karışımı sonorereaktörde% 50 genlikte 2,5 dakika boyunca sonikleştirin.
   • Soğumak için duraklatın, ardından aynı koşullar altında 2,5 dakika daha sonikasyon yapın.
5. Tripsin Nanopartiküllerinin Ayrılması
   • T-FMNP'leri sindirilmiş peptitler içeren süpernatandan ayırmak için bir mıknatıs kullanın.
   • Süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
6. MS Analizi için Peptit Hazırlama
   • Süpernatan içeren peptitleri bir vakum santrifüjünde kurutun.
   • Kurutulmuş peptitleri kütle spektrometresi ile daha fazla analize kadar -20 ° C'de saklayın.