Yüksek Numune İşleme Kapasiteli Protein Sindirimi ile Proteomik İş Akışları

Proteomik, biyolojik süreçleri ve sistemleri anlamak için temel bir alandır ve protein sindirimi, bu alandaki iş akışlarının kritik bir adımını oluşturur. Geleneksel olarak protein sindirimi, lizin ve arjinin kalıntılarındaki peptit bağlarını özgül olarak hidrolize eden tripsin gibi proteolitik enzimler kullanılarak çözelti içinde gerçekleştirilir. Bu süreç, kütle spektrometrisi (MS) uygulamalarında iyonlaşma ve parçalanma için son derece uygun peptitler oluşturur. Ancak geleneksel sindirim yöntemlerinin tamamlanması 12–24 saat gerektirir ve bu durum proteomik iş akışlarında önemli darboğazlar yaratır.
Ultrasonikasyon, sindirim sürelerini saatlerden yalnızca birkaç dakikaya çarpıcı biçimde düşüren güçlü bir alternatif sunar. Hielscher CupHorn, VialTweeter ve 96 kuyucuklu plaka sonikatörü UIP400MTP gibi gelişmiş çoklu numune sonikatörleriyle birleştirildiğinde ultrasonikasyon, hızlandırılmış ve yüksek numune işleme kapasiteli proteomik çalışmaları mümkün kılar. Bu teknolojiler iş akışlarını kolaylaştırır, tekrarlanabilirlikten veya veri kalitesinden ödün vermeden numune hazırlama süresini azaltır ve verimliliği artırır.

Protein Sindiriminde Ultrasonik Enerjinin Rolü

Ultrasonikasyon, kavitasyon oluşturmak için odaklanmış ultrason dalgaları kullanır – kavitasyon sırasında oluşan yerel mikro kabarcıklar çökerek yoğun kesme kuvvetleri üretir. Bu olgu kütle transferini artırır, enzimlerin substratlarla karışmasını destekler ve protein yapılarını açarak kesilme bölgelerini tripsin gibi proteolitik enzimlere erişilebilir hâle getirir.
Sonuç? Verimlilikten veya tekrarlanabilirlikten ödün vermeden sindirim süresinde önemli bir azalma.

Ultrasonik Yöntemle İyileştirilmiş Proteolitik Sindirim: Yöntem ve Sonuçlar

Hızlandırılmış Sindirim Protokolü

Ultrasonik destekli sindirim, iş akışlarını hızlandırmak için proteolitik enzimleri ve ultrasonik enerjiyi birleştirir. Örneğin Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) kullanıldığında sindirim iş akışı şu şekilde ilerler:

1. İndirgeme: Protein numuneleri (0,5 mg/mL, 20 µL), amonyum bikarbonat tamponunda (12,5 mM) DTT (2 µL, 110 mM) ile işleme tabi tutulur. 5 dakika boyunca %50 genlikte sonikasyon uygulanır.
2. Alkilasyon: IAA (2 µL, 400 mM) eklendikten sonra aynı koşullarda sonikasyon tekrarlanır.
3. Sindirim: Numuneler seyreltilir ve immobilize tripsin taşıyan nanoparçacıklarla inkübe edilir. Son bir sonikasyon turu (5 dakika) sindirimi tamamlar. Peptitler ayrılır, kurutulur ve MS analizi için saklanır.

Bu ultrasonik yöntem, toplam hazırlama süresini 12 saatten 30 dakikanın altına düşürür. Sürecin hızlandırılmasına rağmen peptit verimi ve kalitesi, geleneksel gece boyunca uygulanan yöntemlerle tutarlı kalır.

Ultrasonik Protein Sindiriminin Verimliliği

E. coli proteomlarının kullanıldığı karşılaştırmalı çalışmalarda:

• Protein Tanımlama: Ultrasonik olarak sindirilen numunelerde 5 dakikada 777 protein tanımlanırken, 12 saatte 817 protein tanımlandı. Ortak protein tanımlamalarının oranı %70’i aştı.
• Tekrarlanabilirlik: Tekrarlı analizler, her bir yöntem içinde %98’in üzerinde korelasyon değerleri göstererek güvenilirliği ortaya koydu.
• Seçicilik: Her yöntem belirli proteinleri tercihli olarak sindirdi; ultrasonik sindirimde 65 protein, gece boyunca sindirimde ise 54 protein tercihli olarak sindirildi. Bu tür ince farklılıklar, ultrasonikasyonun belirli uygulamalar için benzersiz potansiyelini vurgular.

Bir E. coli
numunesine eklenen yedi proteinin etiketsiz protein miktar tayini sonuçları. Aşağıdaki proteinler,
“Theo Ratio” adlı sütunda belirtildiği gibi iki farklı düzeyde eklenmiştir. Theo Ratio, bu
deneyde kullanılan iki düzey arasındaki teorik orandır. Sığır serum albümini (ALBU), β-laktoglobulin (LACB), α-S1 kazein (CASA1),
α-S2 kazein (CASA2), sitokrom c (CYC), ovalbümin (OVAL) ve karbonik anhidraz 2
(CAH2). Oranlar, MaxQuant
analizinden elde edilen LFQ protein yoğunlukları kullanılarak hesaplandı. Her yöntemle elde edilen değerleri karşılaştırmak için Student t testi uygulandı (p>0,01, n=3, t-theoretical=4,6).
Çalışma ve grafik: © Martins et al., 2019)

Nanoparçacıklara İmmobilize Edilmiş Tripsin

İmmobilize tripsin taşıyan nanoparçacıkların (ör. T-FMNPs) ultrasonikasyonla birleştirilmesi, proteomik iş akışlarını daha da iyileştirir. Bu nanoparçacıklar, enzim–substrat etkileşimleri için yüksek bir yüzey alanı sunarak verimliliği artırır. E. coli gibi karmaşık proteomlara uygulandığında birleşik yöntem şunları gerçekleştirir:

• Hız: 5 dakika içinde tam sindirim.
• Doğruluk: Geleneksel yöntemlerle karşılaştırılabilir protein miktar tayini (p > 0,01, n=3).
• Ölçeklenebilirlik: UIP400MTP gibi çok kuyucuklu platformlara uyarlama, yüksek numune işleme kapasiteli işlemeyi mümkün kılar.

Adım adım talimatlar içeren ayrıntılı protokol için buraya tıklayın!
(bkz. Martins et al., 2019)

Hielscher sonikatörleriyle yüksek hızda ve yüksek numune işleme kapasitesinde proteolitik sindirim

Proteomik için En İyi Sonikatör Modelleri

Hielscher Ultrasonics, yüksek numune işleme kapasiteli iş akışlarını kolaylaştıran, eş zamanlı çoklu numune hazırlama için çeşitli sonikatör modelleri sunar. Viyaller, deney tüpleri, çok kuyucuklu plakalar (ör. 6, 24, 96 kuyucuklu plakalar) veya Petri kaplarıyla çalışıyor olun – deneyleriniz için ideal sonikatörleri sunuyoruz.

UIP400MTP Çok Kuyucuklu Plaka Sonikatörü

En yüksek numune işleme kapasitesi için UIP400MTP, 96 kuyucuklu plakaları ultrasonik olarak işleme olanağı sunar. Her standart mikroplakayla uyumlu olan UIP400MTP, pahalı, üreticiye özgü tek kullanımlık sarf malzemeleri gerektirmez ve araştırmanız için en iyi çok kuyucuklu plakayı seçme özgürlüğü verir. Plaka genelinde eşit enerji ileterek yalnızca 1 saatte 200’e kadar karmaşık proteomun hızlı indirgenmesini, alkilasyonunu ve sindirimini mümkün kılar. Bu otomasyon ve verimlilik düzeyi, yüksek numune işleme kapasiteli proteomik çalışmalar ve klinik uygulamalar için kritik öneme sahiptir. Çok kuyucuklu plaka sonikatörü hakkında daha fazla bilgi edinin!

VialTweeter

VialTweeter, aynı anda 10 adede kadar viyalin veya deney tüpünün sonikasyonunu gerektiren laboratuvarlar için özel olarak tasarlanmıştır. Numuneye müdahale etmeyen yaklaşımı, tekrarlanabilir protein sindirimini güvence altına alırken çapraz kontaminasyon risklerini ortadan kaldırır. Bu cihaz, sınırlı numune hacimleriyle veya çeşitli numune türleriyle çalışan araştırmacılar için idealdir.
VialTweeter çoklu tüp sonikatörü hakkında daha fazla bilgi edinin!

Hielscher UP200St-CupHorn

CupHorn sonikatörü, kapalı kaplardaki birden fazla numunenin eş zamanlı işlenmesi için tasarlanmış güçlü bir cihazdır. Eşit ultrasonik enerji dağılımı ve hassas sıcaklık kontrolü sağlar. Aynı anda beş adede kadar numuneyi işleyebilmesi ve indirgeme, alkilasyon ve sindirim içeren iş akışlarıyla uyumluluğu, CupHorn sonikatörünü MS tabanlı proteomik çalışmalar için güvenilir bir araç hâline getirir.
CupHorn SonoReactor hakkında daha fazla bilgi edinin!

Nanoparçacıklara İmmobilize Edilmiş Tripsin Kullanılarak Ultrasonikasyon Destekli Proteolitik Sindirim için Adım Adım Protokol

Martins et al. (2019) tarafından geliştirilen bu protokol, ultrasonik enerji ve nanoparçacıklara immobilize edilmiş tripsin (T-FMNPs) kullanılarak hızlı protein sindirimi için optimize edilmiştir. Belirtilen adımlar, kütle spektrometrisi (MS) uygulamalarına uygun, verimli indirgeme, alkilasyon ve proteoliz sağlar.
Protokol Adımları

1. Disülfür Bağlarının İndirgenmesi
   • AmBic tamponundaki 20 µL protein numunesine (0,5 mg/mL) 2 µL DTT çözeltisi (110 mM) ekleyin.
   • Numune tüpünü UP200St-CupHorn sonoreaktörüne yerleştirin.
   • Numuneye %50 genlikte (200 W, 26 kHz) 2,5 dakika boyunca sonikasyon uygulayın.
   • Soğumayı sağlamak için kısa bir süre ara verin, ardından aynı koşullarda 2,5 dakika daha sonikasyon uygulayın.
2. İndirgenmiş Sistein Kalıntılarının Alkilasyonu
   • İndirgenmiş protein numunesine 2 µL IAA çözeltisi (400 mM) ekleyin.
   • Alkilasyonu kolaylaştırmak için %50 genlikte 2,5 dakika boyunca sonikasyon uygulayın.
   • Soğuma için ara verin, ardından 2,5 dakika daha sonikasyon uygulayın.

   Not: IAA bozunmasını önlemek için alkile edilmiş numunenin ışığa maruz kalmasını en aza indirin.

3. Numunenin Seyreltilmesi
   • Alkile edilmiş protein numunesini, %4 asetonitril (v/v) içeren 25 mM AmBic tamponu kullanarak 100 µL son hacme seyreltin.
   • Nazikçe pipetleyerek iyice karıştırın.
4. Nanoparçacıklara İmmobilize Edilmiş Tripsin ile Proteolitik Sindirim
   • Seyreltilmiş protein numunesine 20 µL T-FMNP çözeltisi (3 mg/mL) ekleyin.
   • Sonoreaktördeki karışıma %50 genlikte 2,5 dakika boyunca sonikasyon uygulayın.
   • Soğuma için ara verin, ardından aynı koşullarda 2,5 dakika daha sonikasyon uygulayın.
5. Tripsin Taşıyan Nanoparçacıkların Ayrılması
   • T-FMNPs nanoparçacıklarını, sindirilmiş peptitleri içeren süpernatanttan ayırmak için bir mıknatıs kullanın.
   • Süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
6. MS Analizi için Peptit Hazırlama
   • Peptitleri içeren süpernatantı bir vakum santrifüjünde kurutun.
   • Kurutulmuş peptitleri, kütle spektrometrisiyle yapılacak sonraki analize kadar -20°C sıcaklıkta saklayın.