Ultradźwiękowa izolacja komórek macierzystych
Sonikacja jest wysoce wydajną mechaniczną metodą izolacji komórek macierzystych z ludzkiej tkanki tłuszczowej. Frakcja zrębowo-naczyniowa (SVF) izolowana ultradźwiękowo wykazuje znaczny potencjał regeneracyjny w zastosowaniach medycznych. Hielscher Ultrasonics oferuje szereg możliwości sonikacji bezpośredniej i pośredniej do pozyskiwania komórek macierzystych. Znajdź idealny sonikator do swojego procesu izolacji komórek macierzystych!
Ultradźwiękowa izolacja komórek macierzystych
Tkankę tłuszczową pobraną z ludzkiego ciała (metodą liposukcji) poddaje się działaniu ultradźwięków w celu oddzielenia tkanki od komórek macierzystych i innych komórek uczestniczących we wzroście. Ta wyodrębniona część komórek jest określana jako komórki frakcji zrębowo-naczyniowej (SVF).
Technika ultradźwiękowej izolacji komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej opiera się wyłącznie na zasadzie działania kawitacji wywołanej ultradźwiękami, polegającej na czysto mechanicznym ścinaniu. Te kawitacyjne siły ścinające rozbijają tkankę tłuszczową, dzięki czemu komórki macierzyste są uwalniane z jej struktury. Ultradźwiękowa izolacja komórek macierzystych jest procedurą bez użycia enzymów, pozwalającą uniknąć stosowania kolagenazy, trypsyny lub dyspazy.
W celu oddzielenia wyekstrahowanych komórek macierzystych, mezenchymalnych komórek macierzystych, prekursorów komórek śródbłonka i innych typów komórek uczestniczących we wzroście tkankę tłuszczową poddaną sonikacji odwirowuje się.
Oddzielone komórki macierzyste zbiera się i analizuje pod kątem jakości, w tym liczby komórek, żywotności, endotoksyn i barwienia metodą Grama, przed ich natychmiastowym wykorzystaniem do przeszczepu autologicznego lub przechowaniem w warunkach kriogenicznych.
Dlaczego unikać enzymów?
Ponieważ trawienie enzymatyczne służące izolacji komórek macierzystych wiąże się z wysokimi kosztami i możliwymi zagrożeniami dla bezpieczeństwa, a także z brakiem skuteczności [Oberbauer et al. 2015], preferuje się nieenzymatyczne metody izolacji, takie jak kawitacja ultradźwiękowa. Etap izolacji ultradźwiękowej zastępuje trawienie enzymatyczne, mechanicznie oddzielając komórki i agregaty komórkowe od tkanki tłuszczowej.
GDmini2 przy przetworniku UP200St-TD (200 watów)
- Szybkość
- Wydajność
- Powtarzalność
- Bezpieczeństwo
- Brak użycia enzymów
- Opłacalność
- Możliwości pracy w warunkach sterylnych
Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej
Uzysk komórek macierzystych otrzymany dzięki sonikacji
Opublikowana metoda izolacji frakcji zrębowo-naczyniowej z wykorzystaniem kawitacji ultradźwiękowej pozwala uzyskać 1,67–2,24 × 107 komórek o żywotności 97,1–98,9% [Victor, S., 2014]. Uzysk około 2–4 milionów komórek/gram tkanki tłuszczowej otrzymano poprzez ultradźwiękową lizę dojrzałych adipocytów w zdysocjowanej tkance tłuszczowej [Bright et al., 2014].
Komórki przygotowane ultradźwiękowo mają równie wysoki potencjał różnicowania adipogennego i osteogennego jak komórki uzyskane standardową enzymatyczną metodą izolacji [Oberbauer et al. 2015].
Systemy ultradźwiękowe do izolacji komórek macierzystych
Aby zapewnić najwyższe bezpieczeństwo i najlepszą jakość, kluczowym czynnikiem skutecznego leczenia pacjentów jest niezawodny sprzęt ultradźwiękowy, który umożliwia precyzyjną kontrolę nad obróbką komórek macierzystych. Hielscher Ultrasonics oferuje różne rozwiązania do autologicznego procesu separacji z wykorzystaniem kawitacji ultradźwiękowej, służącego izolacji i pozyskiwaniu komórek macierzystych oraz prekursorów komórek śródbłonka.
Sonikacja bezpośrednia do izolacji komórek macierzystych
W procesie izolacji komórek macierzystych metodą sonikacji bezpośredniej róg ultradźwiękowy (sonotroda, końcówka / sonda ultradźwiękowa) jest zanurzany w tkance tłuszczowej. Za pośrednictwem sonotrody fale ultradźwiękowe są sprzęgane bezpośrednio z autologicznym tłuszczem, dzięki czemu kawitacja ultradźwiękowa uwalnia komórki macierzyste i komórki zrębowe z pozostałej tkanki. Sonikatory Hielscher UP200Ht i UP200St z sonotrodą S26d14 są systemami powszechnie stosowanymi do obróbki autologicznych komórek macierzystych. Izolacja frakcji zrębowo-naczyniowej metodą sonikacji bezpośredniej nadaje się przede wszystkim do stosowania w pomieszczeniach czystych.
Sonikacja pośrednia do izolacji komórek macierzystych
Ponieważ komórki macierzyste są wykorzystywane w zastosowaniach autologicznych, sterylność procesu jest bardzo ważna. Dlatego Hielscher opracował kilka rozwiązań do sonikacji pośredniej, takich jak GDmini2, VialTweeter i inne systemy dostosowane do indywidualnych potrzeb. W sonikacji pośredniej fale ultradźwiękowe są sprzęgane z tkanką tłuszczową przez ściankę pojemnika. Frakcja zrębowo-naczyniowa (SVF) jest oddzielana od tkanki tłuszczowej przez kawitację ultradźwiękową, tak samo jak podczas sonikacji bezpośredniej.
Zaletą procesu sonikacji pośredniej jest możliwość obróbki komórek w zamkniętym naczyniu w warunkach wolnych od zanieczyszczeń , ponieważ wyeliminowane zostaje ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego wskutek wprowadzenia rogu ultradźwiękowego (sonotrody). Izolację komórek przeprowadza się w zamkniętym systemie, zapewniającym sterylne warunki procesu.
Dowiedz się więcej o sterylnych sonikatorach Hielscher!
Cyfrowymi sonikatorami Hielscher można precyzyjnie sterować za pomocą wyświetlacza dotykowego lub przeglądarki. Procedury sonikacji można wstępnie ustawić za pomocą intuicyjnego menu. Urządzenia ultradźwiękowe są wyposażone w funkcję automatycznego rejestrowania danych (wszystkie dane procesu sonikacji są zapisywane na zintegrowanej karcie SD). Doprowadzaną moc ultradźwiękową można dokładnie dostosować do protokołu izolacji komórek.
Sonikator VialTweeter jest sterylnym homogenizatorem do jednorodnego i szybkiego przygotowywania próbek w warunkach sterylnych.
Literatura/Źródła
- Oberbauer, Eleni; Steffenhagen, Carolin; Wurzer, Christoph; Gabriel, Christian; Redl, Heinz; Wolbank, Susanne (2015): Enzymatic and non-enzymatic isolation systems for adipose tissue-derived cells: current state of the art. Cell Regeneration (2015) 4:7.
- Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
- Haghjoo M., Azarbayjani M.A., Peeri M., Hosseini S.A. (2019): Effect of Training, Hyaluronic Acid, and Mesenchymal Stem Cell Therapies on Osteocalcin Gene Expression in Cartilage Tissue of Rats with Knee Osteoarthritis. Gene Cell Tissue 6, 2019.
- Zhu M., Kong D., Tian R., Pang M. , Mo M., Cheng, Y., Yang G., Cheng H.L., Lei X., Fang K., Cheng B., Wu Y. (2020): Platelet sonicates activate hair follicle stem cells and mediate enhanced hair follicle regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine 24, 2020. 1786–1794.
Warto wiedzieć
Czym są komórki macierzyste?
Komórki macierzyste to niezróżnicowane komórki organizmu wielokomórkowego, które mają zdolność do wytwarzania nieograniczonej liczby kolejnych komórek tego samego typu. Charakteryzują się niezwykłym potencjałem do przekształcania się w wiele różnych typów komórek w organizmie we wczesnym okresie życia i wzrostu. Najbardziej wyróżniającymi cechami komórek macierzystych są zdolność do samoodnowy poprzez podział komórkowy oraz zdolność do przekształcania się w komórki swoiste dla tkanek lub narządów, pełniące wyspecjalizowane funkcje. Pluripotencjalne komórki macierzyste mają potencjał do różnicowania się w dowolny z trzech rodzajów komórek rozrodczych: endodermę (wewnętrzna wyściółka żołądka, przewód pokarmowy, płuca), mezodermę (mięśnie, kości, krew, układ moczowo-płciowy) lub ektodermę (tkanki naskórkowe i układ nerwowy).
W niektórych narządach, takich jak jelita i szpik kostny, komórki macierzyste regularnie dzielą się, aby naprawiać i zastępować zużyte lub uszkodzone tkanki. W innych narządach, takich jak trzustka i serce, komórki macierzyste dzielą się tylko w szczególnych warunkach.
Mezenchymalne komórki zrębowe/macierzyste (MSC), które mają wysoki potencjał do różnorodnych zastosowań terapeutycznych w medycynie regeneracyjnej i estetycznej, występują głównie w szpiku kostnym, ale można je również izolować z innych tkanek (np. chrząstki, tłuszczu, komórek mięśniowych). Mezenchymalne komórki macierzyste są uważane za prototypowe dorosłe komórki macierzyste, charakteryzujące się zdolnością do samoodnowy.
Badania nad komórkami macierzystymi i terapie z ich wykorzystaniem służą hodowli tkanek i narządów do celów transplantacyjnych (inżynieria tkankowa). Inne obszary medycznego zastosowania komórek macierzystych obejmują leczenie chorób mózgu (np. choroby Parkinsona i choroby Alzheimera), terapię niedoborów komórkowych, choroby krwi (np. białaczkę), zwyrodnienie stawów i chrząstki (np. chorobę zwyrodnieniową stawów), a także zabiegi kosmetyczne (np. zabiegi przeciwstarzeniowe). Ogólnie komórki macierzyste mają średnicę około 15–25 mikronów.
Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są multipotencjalnymi komórkami zrębowymi, które mają zdolność do różnicowania się w różne typy komórek, w tym osteoblasty (komórki kostne), chondrocyty (komórki chrzęstne), miocyty (komórki mięśniowe) i adipocyty (komórki tłuszczowe).
Czym jest frakcja zrębowo-naczyniowa (SVF)?
Frakcja zrębowo-naczyniowa (SVF) jest składnikiem lipoaspiratu, który można pozyskać metodą liposukcji z tkanki tłuszczowej w ludzkim ciele. Lipoaspirat stanowi niejednorodną mieszaninę komórek i zawiera dużą ilość komórek macierzystych, określanych jako komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC lub ADSC), które wykazują podobieństwa do komórek macierzystych szpiku kostnego, takie jak zdolność do różnicowania się w komórki różnych linii.
Niejednorodna populacja komórek frakcji zrębowo-naczyniowej obejmuje między innymi komórki śródbłonka, erytrocyty, fibroblasty, limfocyty, monocyty/ makrofagi i perycyty, a także istotną frakcję komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej.
Czym są komórki zrębowe/macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC)?
Komórki zrębowe/macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC / ADSC) uwalniają duże ilości bioaktywnych czynników wzrostu, takich jak naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), czynnik wzrostu keratynocytów (KGF), płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF), czynnik wzrostu hepatocytów (HGF), transformujący czynnik wzrostu beta (TGF-β), insulinowy czynnik wzrostu (IGF) i neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF). ACS nie tylko uwalniają czynniki wzrostu, lecz także wydzielają cytokiny, w tym ligand kinazy tyrozynowej 3 związanej z fms (Flt-3), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF), interleukiny (IL), takie jak IL-6, IL-7, IL-8, IL-11 i IL-12, czynnik hamujący białaczkę (LIF) oraz czynnik martwicy nowotworów alfa (TNF-α).
Jak pozyskuje się komórki macierzyste?
Autologiczne dorosłe komórki macierzyste człowieka można pozyskiwać z następujących źródeł:
- Szpik kostny, który wymaga pobrania poprzez nawiercenie kości.
- Tkanka tłuszczowa (komórki tłuszczowe), która wymaga pobrania metodą liposukcji.
- Krew, która wymaga pobrania metodą aferezy, podczas której krew dawcy przepływa przez aparat do „dializy”, gdzie pozyskuje się komórki macierzyste, a pozostałe składniki krwi są zwracane dawcy.