Sonikacja do lizy: Rozbicie komórek i ekstrakcja

Dezintegracja lub liza komórek jest częstym elementem codziennego przygotowywania próbek w laboratoriach biotechnologicznych. Celem lizy jest przerwanie części ściany komórkowej lub całej komórki w celu uwolnienia cząsteczek biologicznych. Homogenizatory ultradźwiękowe są szeroko stosowane do skutecznej lizy komórek. Główną zaletą zaawansowanych ultradźwięków jest precyzyjna kontrola parametrów procesu, takich jak intensywność i temperatura, co pozwala na delikatne, ale wysoce wydajne rozbicie i ekstrakcję komórek.

Liza komórek przy użyciu ultradźwięków

Ultradźwiękowa liza i ekstrakcja komórek to metoda stosowana do rozbijania otwartych komórek i ekstrakcji ich zawartości przy użyciu fal dźwiękowych o wysokiej częstotliwości, czyli ultradźwięków. Sonikacja to technika lizy, która jest szeroko stosowana jako uznana i niezawodna metoda rozbijania komórek i ekstrakcji materiału wewnątrzkomórkowego. Liza ultradźwiękowa jest niezawodną techniką przygotowywania lizatów zawierających np. plazmidy, testy receptorowe, białka, DNA, RNA itp. Ponieważ intensywność ultradźwięków może być regulowana poprzez dostosowanie parametrów procesu, optymalna intensywność sonikacji od bardzo łagodnej do intensywnej może być ustawiona indywidualnie dla każdej substancji i medium, aby spełnić specyficzne wymagania aplikacji. Kolejnymi etapami lizy są frakcjonowanie, izolacja organelli i/lub ekstrakcja i oczyszczanie białek. Wyekstrahowany materiał (= lizat) musi zostać oddzielony i jest przedmiotem dalszych badań lub zastosowań, np. w badaniach proteomicznych.

W porównaniu z innymi metodami lizy i ekstrakcji komórek, ultradźwiękowa liza komórek ma kilka zalet:

1. Prędkość: Ultradźwiękowa liza i ekstrakcja komórek jest szybką metodą, która może rozbić otwarte komórki w ciągu kilku sekund. Jest to znacznie szybsze niż inne metody, takie jak homogenizacja, rozmrażanie czy mielenie perełek.
2. Wydajność: Ultradźwiękowa liza i ekstrakcja komórek może być stosowana do obróbki małych, dużych lub wielu próbek jednocześnie, co czyni ją bardziej wydajną niż inne metody, które wymagają indywidualnego przetwarzania małych próbek.
3. Bez chemii: Ultradźwiękowa liza i ekstrakcja komórek to nieinwazyjna metoda, która nie wymaga stosowania ostrych środków chemicznych ani enzymów. Dzięki temu idealnie nadaje się do zastosowań, w których konieczne jest zachowanie integralności zawartości komórek. Można uniknąć niepożądanego zanieczyszczenia próbek.
4. Wysoka wydajność: Ultradźwiękowa liza i ekstrakcja komórek pozwala uzyskać wysoką wydajność zawartości komórkowej, w tym DNA, RNA i białek. Dzieje się tak, ponieważ fale dźwiękowe o wysokiej częstotliwości rozbijają ściany komórek i uwalniają ich zawartość do otaczającego roztworu.
5. Kontrola temperatury: Wyrafinowane ultrasonografy pozwalają na precyzyjną kontrolę temperatury próbki. Cyfrowe ultradźwięki firmy Hielscher wyposażone są w podłączany czujnik temperatury oraz oprogramowanie do monitorowania temperatury.
6. Reprodukcja: Protokoły ultradźwiękowej lizy komórek można łatwo odtworzyć, a nawet dopasować do różnych większych lub mniejszych objętości próbek poprzez proste liniowe skalowanie.
7. Wszechstronny: Ultradźwiękowa liza i ekstrakcja komórek może być stosowana do ekstrakcji szerokiego zakresu typów komórek, w tym bakterii, drożdży, grzybów, komórek roślinnych i ssaków. Można ją również stosować do ekstrakcji różnych typów cząsteczek, w tym białek, DNA, RNA i lipidów.
8. Jednoczesne przygotowanie wielu próbek: Hielscher Ultrasonics oferuje kilka rozwiązań umożliwiających komfortowe przetwarzanie licznych próbek w dokładnie takich samych warunkach procesowych. Dzięki temu etap przygotowania próbek w postaci lizy i ekstrakcji jest bardzo wydajny i oszczędza czas.
9. Łatwy w użyciu: Ultradźwiękowy sprzęt do lizy i ekstrakcji komórek jest łatwy w obsłudze i wymaga minimalnego szkolenia. Sprzęt jest również ekonomiczny, ponieważ jest to pojedyncza inwestycja bez wymogu ponownego zakupu urządzeń jednorazowych. To czyni go atrakcyjnym dla szerokiego grona badaczy i laboratoriów.

Ogólnie rzecz biorąc, ultradźwiękowa liza i ekstrakcja komórek jest szybką, wydajną, precyzyjnie kontrolowaną i wszechstronną metodą ekstrakcji zawartości komórkowej. Jej zalety w stosunku do metod alternatywnych sprawiają, że jest ona atrakcyjnym wyborem dla szerokiego zakresu zastosowań badawczych i przemysłowych.

Zasada działania ultradźwiękowej lizy komórek

Ultradźwiękowa liza i ekstrakcja komórek wykorzystuje fale dźwiękowe o wysokiej częstotliwości do rozbijania komórek i ekstrakcji ich zawartości. Fale dźwiękowe powodują zmiany ciśnienia w otaczającej cieczy, powodując powstawanie i zapadanie się małych pęcherzyków w procesie znanym jako kawitacja. Pęcherzyki te generują zlokalizowane, bardzo intensywne siły mechaniczne, które mogą rozbijać otwarte komórki i uwalniać ich zawartość do otaczającego roztworu.

Liza komórek przy użyciu ultradźwiękowca powszechnie obejmuje następujące etapy:

• Próbka umieszczana jest w probówce lub pojemniku z płynnym buforem.
• Do próbki wprowadzana jest sonda ultradźwiękowa i aplikowane są fale dźwiękowe o wysokiej częstotliwości ok. 20-30 kHz.
• Fale ultradźwiękowe powodują oscylację i kawitację w otaczającym płynie, generując zlokalizowane siły, które rozbijają otwarte komórki i uwalniają ich zawartość.
• Próbka jest odwirowywana lub filtrowana w celu usunięcia wszelkich pozostałości komórkowych, a wyekstrahowana zawartość jest zbierana do dalszej analizy.

Silne fale ultradźwiękowe rozbijają macierz komórkową struktur biologicznych i uwalniają związki bioaktywne. Następuje intensyfikacja transferu masy pomiędzy materiałem roślinnym a rozpuszczalnikiem (np. buforem). (grafika: ©Vilkhu et al., 2006)

Wady popularnych metod lizy

Podczas pracy w laboratoriach mogliście już doświadczyć kłopotów związanych z lizą komórek przy użyciu tradycyjnych protokołów lizy mechanicznej lub chemicznej.

• Liza mechaniczna: Mechaniczne metody lizy, takie jak mielenie w moździerzu i tłuczku lub homogenizacja przy użyciu prasy francuskiej, młynka perełkowego lub systemu rotor-stator, często nie mają możliwości precyzyjnej kontroli i regulacji. Oznacza to, że stosowanie mielenia i rozdrabniania może szybko generować ciepło i siły ścinające, które mogą uszkadzać próbkę i denaturować białka. Mogą być również czasochłonne i wymagać dużych ilości materiału wyjściowego.
• Liza chemiczna: Chemiczne metody lizy, takie jak liza na bazie detergentów, mogą uszkodzić próbkę poprzez przerwanie warstwy lipidowej i denaturację białek. Wymagają one również przeprowadzenia wielu etapów i mogą pozostawiać resztki zanieczyszczeń, które zakłócają działanie dalszych aplikacji. Dodatkowym wyzwaniem jest znalezienie optymalnej dawki detergentu.
• Cykle zamrażania i rozmrażania: Cykle zamrażania i rozmrażania mogą spowodować pęknięcie błon komórkowych, ale powtarzające się cykle mogą również spowodować denaturację i degradację białek. Metoda ta może również wymagać wielu cykli, co może być czasochłonne i często skutkuje niższą wydajnością.
• Liza enzymatyczna: Enzymatyczne metody lizy mogą być specyficzne dla określonych typów komórek i wymagają wielu etapów, co czyni je czasochłonnymi. Generują one również odpady i wymagają starannej optymalizacji w celu uniknięcia degradacji próbki. Zestawy do lizy enzymatycznej są często drogie. Jeśli obecna procedura lizy enzymatycznej daje niewystarczające wyniki, można zastosować sonikację jako metodę synergiczną w celu zintensyfikowania procesu rozbijania komórek.

W przeciwieństwie do konwencjonalnych mechanicznych i chemicznych metod lizy komórek, sonikacja jest bardzo wydajnym i niezawodnym narzędziem do dezintegracji komórek, które pozwala na pełną kontrolę parametrów sonikacji. Zapewnia to wysoką selektywność w zakresie uwalniania materiałów i czystości produktu. [por. Balasundaram et al., 2009].
Jest on odpowiedni dla wszystkich typów komórek i łatwy do zastosowania w małej i dużej skali. – zawsze w kontrolowanych warunkach. Homogenizatory ultradźwiękowe są łatwe do czyszczenia. Homogenizator ultradźwiękowy zawsze posiada funkcję clean-in-place (CIP) i sterilize-in-place (SIP). Sonotroda składa się z masywnej tytanowej tuby, którą można przecierać lub płukać w wodzie lub rozpuszczalniku (w zależności od medium roboczego). Konserwacja ultradźwiękowców jest ze względu na ich solidność prawie pomijalna.

Analiza ultradźwiękowa i zaburzenia komórkowe

Ogólnie rzecz biorąc, liza próbek w laboratorium trwa od 15 sekund do 2 minut. Ponieważ intensywność sonikacji jest bardzo łatwa do dostosowania poprzez ustawienie amplitudy czasu sonikacji, a także przez dobór odpowiedniego sprzętu, możliwe jest bardzo delikatne lub bardzo gwałtowne rozerwanie błon komórkowych, w zależności od struktury komórki i celu lizy ( np. ekstrakcja DNA wymaga delikatniej sonikacji, pełna ekstrakcja białek bakterii wymaga intensywniejszej obróbki ultradźwiękowej). Temperatura podczas procesu może być monitorowana przez zintegrowany czujnik temperatury i może być łatwo kontrolowana przez chłodzenie (kąpiel lodowa lub komory przepływu z płaszczem chłodzącym) lub przez sonikację w trybie pulsacyjnym. Podczas sonikacji w trybie impulsowym, krótkie serie cykli sonikacji trwające 1-15 sekund pozwalają na rozpraszanie ciepła i chłodzenie podczas dłuższych okresów przerywanych.
Wszystkie procesy ultradźwiękowe napędzane są całkowicie powtarzalne i liniowo skalowalne.

Homogenizatory ultradźwiękowe do lizy i ekstrakcji komórek

Różne typy urządzeń ultradźwiękowych pozwalają na dopasowanie do celu przygotowania próbki oraz zapewnienie łatwości i komfortu obsługi. Ultradźwięki sondowe to najczęściej spotykane urządzenia w laboratorium. Są one najbardziej odpowiednie do przygotowania małych i średnich próbek o objętości od 0,1mL do 1000mL. Różne wielkości mocy i sonotrody pozwalają na dostosowanie ultradźwiękowca do objętości próbki i naczynia dla uzyskania najbardziej efektywnych i skutecznych wyników sonikowania. Urządzenie z sondą ultradźwiękową jest najlepszym wyborem w przypadku konieczności przygotowania pojedynczych próbek.

W przypadku konieczności przygotowania większej ilości próbek, np. 8-10 fiolek z roztworem komórkowym, najbardziej odpowiednią metodą homogenizacji dla efektywnej lizy jest intensywna sonikacja pośrednia za pomocą systemów ultradźwiękowych, takich jak VialTweeter lub ultradźwiękowy cuphorn. Kilka fiolek jest sonikowanych w tym samym czasie, z tą samą intensywnością. Oszczędza to nie tylko czas, ale zapewnia również takie samo traktowanie wszystkich próbek, co sprawia, że wyniki między próbkami są wiarygodne i porównywalne. Ponadto, podczas sonikacji pośredniej unika się zanieczyszczenia krzyżowego poprzez zanurzenie sondy ultradźwiękowej (znanej również jako sonda ultradźwiękowa, róg, końcówka lub palec). Ponieważ stosowane są fiolki dopasowane indywidualnie do wielkości próbki, nie ma potrzeby czasochłonnego czyszczenia i utraty próbki w wyniku dekantacji naczyń. Do jednolitej sonikacji płytek wielokomorowych lub mikrotitrowych Hielscher oferuje UIP400MTP.
W przypadku większych objętości, np do komercyjnej produkcji ekstraktów komórkowych systemów ciągłych ultradźwiękowe z reaktora komórek przepływu są najbardziej odpowiednie. Ciągły i równomierny przepływ obrabianego materiału zapewnia równomierne ultradźwięków. Wszystkie parametry ultradźwiękowego procesu rozdrabniania może zostać zoptymalizowana i dostosowane do wymagań danego zastosowania i konkretnego materiału komórkowego.
 
 
Przykładowa procedura ultradźwiękowy lizowania komórek bakteryjnych:

• Wytwarzanie zawiesiny komórek: Komórki granulki muszą być całkowicie zawieszony w roztworze buforowym przez homogenizację (wybierz buforu zgodny z niniejszej analizy, na przykład specyficzne metody chromatografii). Dodać lizozymy i / lub inne dodatki, w razie potrzeby (muszą być zgodne ze środkami rozdzielania / oczyszczania). Mieszać / homogenizować ostrożnie roztwór w łagodnych ultradźwiękami aż do całkowitego zawiesiny.
• Ultradźwiękowy lizy: Próbkę umieszcza się w łaźni z lodem. Do rozbicia komórek, sonicate zawiesinę w temperaturze 60-90 drugich seriach (z wykorzystaniem trybu impulsowego ultrasonicator'S).
• (, Na przykład 10 minut przy 10000 x g, w 4degC) oddzielenie Lizat wirowano. Oddzielenie supernatantu od osadu komórek ostrożnie. Supernatant całkowity lizat komórkowy. Po przesączeniu supernatantu, można otrzymać klarownego płynu z rozpuszczalnego białka komórkowego.

 
 
Najczęstsze aplikacje dla ultrasonicators w biologii i biotechnologii są:

• Wytwarzanie ekstraktu komórkowego
• Zakłócenie działania drożdży, bakterii, komórek roślinnych, miękkich lub twardych tkanek komórkowych, materiału nukleinowego
• ekstrakcja białka
• Wytwarzanie i wydzielanie enzymów
• Produkcja antygenów
• Ekstrakcja DNA i / lub celowe rozdrobnienie
• przygotowanie liposomów