Technologia ultradźwiękowa firmy Hielscher

Sonication Lysis: Zakłócenia w komórkach & ekstracji

Dezintegracja lub liza komórek jest powszechną częścią codziennego przygotowywania próbek w laboratoriach biotechnologicznych. Celem lizy jest rozerwanie części ściany komórkowej lub pełnej komórki w celu uwolnienia cząsteczek biologicznych. Tak zwany lizat może składać się np. Z plazmidu, testów receptorowych, białek, DNA, RNA itd. Kolejnymi etapami lizy są frakcjonowanie, izolacja organelli i / lub ekstrakcja białka i oczyszczanie. Wyekstrahowany materiał (= lizat) musi zostać oddzielony i poddany dalszym badaniom lub zastosowaniom, np. W przypadku badań proteomicznych. Homogenizatory ultradźwiękowe są powszechnym narzędziem do skutecznej lizy komórek. Ponieważ intensywność ultradźwięków można wyrównać poprzez dostosowanie parametrów procesu, optymalną intensywność sonikacji od bardzo miękkiej do bardzo twardej można ustawić indywidualnie dla każdej substancji i medium, aby spełnić szczególne wymagania aplikacji.

Struktura komórkowa

Komórki są chronione przez membranę półprzepuszczalną osoczu, który polega na dwuwarstwie fosfo-lipidów (także białka dwuwarstwy lipidowej; utworzonej przez hydrofobowych tłuszczów i hydrofilowych cząsteczek fosforu z wbudowanymi cząsteczkami białka) i tworzy barierę między wnętrza komórek (cytoplazmy) i środowisko zewnątrzkomórkowej. komórki roślinne i komórki prokariotyczne są otoczone ścianą komórkową. Ze względu na wiele warstw, grubość ścianek komórek celulozy, komórki roślinne są trudniejsze niż do lizy komórek zwierzęcych. We wnętrzu komórek, takich jak organelle, jądro, mitochondrium, stabilizuje cytoszkieletu.
Przez lizę komórek, to jest skierowane na wyodrębnianie i oddzielenie organelli, białka, DNA, mRNA, lub innych cząsteczek biologicznych.

Sonizacja jest powszechnie stosowana do przygotowywania próbek materii komórkowej.

Fig. 1: ekstrakcja ultradźwiękowy z komórek: mikroskopowy przekrój poprzeczny (TS) od koniuszka trzpienia mięty (Mentha piperita) przedstawia mechanizm działania przy ekstrakcji ultradźwiękowej z komórek (powiększenie 2000x) [źródło: Vilkhu et al. 2011]

metody

Istnieje kilka sposobów lizat komórek, które można podzielić na metody mechaniczne i chemiczne, które obejmują wykorzystanie detergenty lub rozpuszczalniki, do stosowania wysokich ciśnień lub zastosowanie młynie kulowym lub prasy francuskiej. Najbardziej problematyczne Wadą tych metod jest trudna kontrola i regulacja parametrów procesu i tym samym wpływ.
Główne wady typowych metod lizy:

Różne techniki lizy

Tabela: Konwencjonalne metody lizy komórek mają poważne wady

Wręcz przeciwnie, działanie ultradźwiękami jest bardzo wydajne i niezawodne narzędzie do dezintegracji komórek, które pozwala na pełną kontrolę nad parametrami ultradźwięków. Zapewnia to wysoką selektywnością na uwalnianie materiałów i czystości produktu. [Balasundaram i in. 2009] Jest odpowiedni do wszystkich typów komórek i łatwe do zastosowania w małej i dużej skali. Ultrasonicators są łatwe do czyszczenia. Homogenizator ultradźwiękowy zawsze dysponuje czyszczenia na miejscu (CIP) i sterylizacji na miejscu funkcyjnego (SIP). Sonotroda składa się z masywnej klaksonu tytanu, które można usunąć lub przepłukać wodą lub rozpuszczalnikiem (w zależności od medium roboczego). Utrzymanie ultrasonicators jest ze względu na ich wytrzymałość niemal pomijalne.

Liza

Lizy jest czułym procesem. Podczas rozpadu ochronę błony komórkowej zniszczone, jednak inaktywacja, denaturacja i degradacja białek wyekstrahowanych przez niefizjologiczną środowiska (odchylenie od wartości pH), muszą być zabezpieczone. Zatem na ogół lizy przeprowadza się w roztworze buforowym. Największe trudności wynikają z niekontrolowanego rozerwania komórek otrzymanego w nieukierunkowanej uwolnienia wszystkich wewnątrzkomórkowych materiału i / lub denaturacji docelowego produktu.

Ultradźwiękowy lizy komórkowej może być stosowany do przygotowania próbek w laboratorium i dla wytwarzania dużych ilościach. Kliknij, aby powiększyć!

Fig. 1: 200 W silne ultradźwiękowy homogenizator UP200Ht z cyfrowego sterowania i automatycznego zapisu danych dla niezawodnego i powtarzalnego lizy komórek.

ultradźwiękowy lizę

Ogólnie rzecz biorąc, liza próbek w laboratorium trwa od 15 sekund do 2 minut. Ponieważ intensywność sonikacji jest bardzo łatwa do dostosowania poprzez ustawienie amplitudy czasu sonikacji, a także przez dobór odpowiedniego sprzętu, możliwe jest bardzo delikatne lub bardzo gwałtowne rozerwanie błon komórkowych, w zależności od struktury komórki i celu lizy ( np. ekstrakcja DNA wymaga delikatniej sonikacji, pełna ekstrakcja białek bakterii wymaga intensywniejszej obróbki ultradźwiękowej). Temperatura podczas procesu może być monitorowana przez zintegrowany czujnik temperatury i może być łatwo kontrolowana przez chłodzenie (kąpiel lodowa lub komory przepływu z płaszczem chłodzącym) lub przez sonikację w trybie pulsacyjnym. Podczas sonikacji w trybie impulsowym, krótkie serie cykli sonikacji trwające 1-15 sekund pozwalają na rozpraszanie ciepła i chłodzenie podczas dłuższych okresów przerywanych.
Wszystkie procesy ultradźwiękowe napędzane są całkowicie powtarzalne i liniowo skalowalne.

Ultradźwiękowy homogenizator VialTweeter do równoczesnego przygotowania próbki do 10 probówek. (Kliknij, aby powiększyć!)

Urządzenie ultradźwiękowe VialTweeter pozwala na jednoczesne przygotowanie próbki do 10 fiolek, w takich samych warunkach technologicznych.

homogenizatorów ultradźwiękowych

Różne rodzaje Urządzenia ultradźwiękowe pozwalają na dopasowanie Przygotowanie próbki cel i zapewnić łatwość obsługi i komfort pracy. Sonda typu ultrasonicators są najczęściej urządzenia w laboratorium. Są one najbardziej odpowiednie do wytwarzania małych i średnich próbek z objętości 0,1 ml do 1000 ml w górę. Różne wielkości mocy i sonotrody umożliwiają dostosowanie ultrasonicator objętości próbki i naczynia dla najbardziej skutecznych i efektywnych wyników ultradźwiękami. Ultradźwiękowy urządzenie sonda jest najlepszym wyborem, gdy pojedyncze próbki muszą być przygotowane.

Jeśli trzeba przygotować więcej próbek, np. 8 fiolek roztworu komórkowego, to urządzenia takie jak VialTweeter lub ultradźwiękowy cuphorn są najbardziej odpowiednimi homogenizatorami do lizy. Kilka fiolek jest poddanych działaniu ultradźwięków w tym samym czasie, przy tej samej intensywności. Oszczędza to nie tylko czas, ale zapewnia również takie same traktowanie wszystkich próbek, dzięki czemu wyniki wśród próbek są wiarygodne i porównywalne. Ponadto unika się zanieczyszczenia krzyżowego przez zanurzenie ultradźwiękowej sonotrody (znanej również jako sonda ultradźwiękowa, róg, końcówka lub palec). Ponieważ stosowane są fiolki, czasochłonne oczyszczanie i utrata próbki z powodu dekantacji naczyń są pomijane.
W przypadku większych objętości, np do komercyjnej produkcji ekstraktów komórkowych systemów ciągłych ultradźwiękowe z reaktora komórek przepływu są najbardziej odpowiednie. Ciągły i równomierny przepływ obrabianego materiału zapewnia równomierne ultradźwięków. Wszystkie parametry ultradźwiękowego procesu rozdrabniania może zostać zoptymalizowana i dostosowane do wymagań danego zastosowania i konkretnego materiału komórkowego.

Przykładowa procedura ultradźwiękowy lizowania komórek bakteryjnych:

  • Wytwarzanie zawiesiny komórek: Komórki granulki muszą być całkowicie zawieszony w roztworze buforowym przez homogenizację (wybierz buforu zgodny z niniejszej analizy, na przykład specyficzne metody chromatografii). Dodać lizozymy i / lub inne dodatki, w razie potrzeby (muszą być zgodne ze środkami rozdzielania / oczyszczania). Mieszać / homogenizować ostrożnie roztwór w łagodnych ultradźwiękami aż do całkowitego zawiesiny.
  • Ultradźwiękowy lizy: Próbkę umieszcza się w łaźni z lodem. Do rozbicia komórek, sonicate zawiesinę w temperaturze 60-90 drugich seriach (z wykorzystaniem trybu impulsowego ultrasonicator'S).
  • (, Na przykład 10 minut przy 10000 x g, w 4degC) oddzielenie Lizat wirowano. Oddzielenie supernatantu od osadu komórek ostrożnie. Supernatant całkowity lizat komórkowy. Po przesączeniu supernatantu, można otrzymać klarownego płynu z rozpuszczalnego białka komórkowego.

Najczęstsze aplikacje dla ultrasonicators w biologii i biotechnologii są:

  • Wytwarzanie ekstraktu komórkowego
  • Zakłócenie drożdży, bakterii, komórek roślinnych, miękkie & twarde tkanki komórkowej nukleinowy Materiał
  • ekstrakcja białka
  • Wytwarzanie i wydzielanie enzymów
  • Produkcja antygenów
  • Ekstrakcja DNA i / lub celowe rozdrobnienie
  • przygotowanie liposomów
Homogenizatory o dużej mocy ultradźwięków, takie jak UIP1000hd służą do rozbijania komórek i ekstrakcję w sposób okresowy lub ciągły przepływ, chociaż. (Kliknij, aby powiększyć!)

Ultradźwiękowe systemy stacjonarne takie jak UIP1000hd (1 kW) może przetwarzać większych ilości materiału biologicznego.

Różnorodne aplikacje oddziałów ultrasonograficznych w sektorach biotechnologii, bioinżynierii, mikrobiologii, biologii molekularnej, biochemii, immunologii, bakteriologii, wirusologii, proteomiki, genetyki, fizjologii, biologii komórkowej, hematologicznych i botaniki.

Do oceny i optymalizacji aplikacji klientów, Hielscher Ultrasonics oferuje w pełni wyposażoną Proces laboratoryjny ultradźwiękowy, Prosimy o kontakt w celu uzyskania dalszych informacji!

Literatura / Referencje

  • Balasundaram, B .; Harrison, S .; Bracewell, D. G. (2009): Postępy w strategii uwalniania produktów i wpływu na projekt bioprocesowej. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. s. 477-485.
  • Vilkhu K .; Manasesowych R .; Mawson R .; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Odzyskiwanie i modyfikacja składników żywności. W: Feng / Barbosa-Canovas / Weiss (2011): USG Technologie dla Żywności i bioprzetwarzaniu. New York: Springer, 2011. pp 345-368..

Kontakt / Poproś o więcej informacji

Porozmawiaj z nami o swoich wymagań technologicznych. My polecamy najbardziej odpowiednie parametry konfiguracyjne i przetwarzania dla danego projektu.





Proszę zwrócić uwagę na nasze Polityka prywatności.