Sonikacja w lizie komórek: rozbijanie komórek i ekstrakcja
Ultradźwiękowa liza komórek jest techniką przygotowania próbek szeroko stosowaną w nowoczesnych laboratoriach biotechnologicznych. Jej głównym celem jest rozbijanie błon komórkowych lub całych komórek w celu uwolnienia składników wewnątrzkomórkowych, takich jak białka, kwasy nukleinowe lub organelle. W codziennej pracy laboratoryjnej oznacza to, że sonikacja jest standardową metodą kontrolowanego rozbijania komórek i wydajnej ekstrakcji biomolekuł. Kluczową zaletą sonikatorów jest możliwość precyzyjnego regulowania najważniejszych parametrów procesu, w tym intensywności ultradźwięków, pulsacji i kontroli temperatury. Taka kontrola pozwala badaczom uzyskać niezawodną lizę przy jednoczesnym minimalizowaniu termicznych lub mechanicznych uszkodzeń wrażliwych biomolekuł, co zapewnia łagodny, a zarazem wysoce wydajny proces ekstrakcji.
Liza komórek za pomocą sonikatorów
Ultradźwiękowa liza komórek wykorzystuje kawitację akustyczną do rozbijania błon komórkowych i uwalniania cząsteczek wewnątrzkomórkowych. Hielscher Ultrasonics oferuje klasyczny sonikator z sondą, a także sonikatory do wielu próbek przeznaczone do przetwarzania w warunkach sterylnych: VialTweeter do wielu probówek i fiolek oraz sonikator do płytek 96-dołkowych UIP400MTP do standardowych mikropłytek.
Hielscher Ultrasonics dostarcza wydajne sonikatory bezkontaktowe do przygotowania próbek i analizy klinicznej. Sonikator do płytek wielodołkowych UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn oraz sonikator przepływowy GDmini2 przetwarzają próbki w warunkach sterylnych.
Homogenizatory ultradźwiękowe UP100H (100 watów) i UP400St (400 watów): sonikacja do lizy komórek i ekstrakcji.
Homogenizatory ultradźwiękowe do lizy komórek i ekstrakcji
| Typ urządzenia ultradźwiękowego | Główne zastosowanie | Objętość próbki | Typowy przykład zastosowania | Zalety | Przykładowe modele |
|---|---|---|---|---|---|
| Sonikatory z sondą | Sonikacja pojedynczej próbki | Od 0,1 mL do ~1000 mL | Liza komórek, ekstrakcja białek, fragmentacja DNA/RNA | Precyzyjna kontrola energii; różne sonotrody; optymalne do małych i średnich próbek | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | Równoległe przetwarzanie wielu zamkniętych fiolek | 8–10 fiolek (~1–20 mL każda) | Standaryzowana liza wielu zawiesin komórkowych | Jednorodna sonikacja; zapobiega zanieczyszczeniu krzyżowemu; powtarzalne wyniki | VialTweeter, CupHorn |
| Sonikator do płytek 96-dołkowych | Sonikacja płytek wielodołkowych i mikrotitracyjnych | Format mikropłytki | Wysokoprzepustowe badania przesiewowe, proteomika, testy komórkowe | Jednoczesna, równomierna sonikacja we wszystkich dołkach; idealny do procedur obejmujących wiele próbek | UIP400MTP |
| Reaktory z komorami przepływowymi | Ciągła sonikacja większych objętości | >1 L, możliwość skalowania | Rozbijanie komórek na skalę przemysłową, produkcja ekstraktów | Przetwarzanie ciągłe; możliwość skalowania; pełna kontrola procesu (amplituda, ciśnienie, temperatura) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + komora przepływowa |
| Systemy do sonikacji sterylnej / pośredniej | Przetwarzanie próbek bez zanieczyszczeń | Zależna od fiolki/probówki/mikropłytki | Wrażliwe próbki, środowiska sterylne, warunki podlegające wymogom regulacyjnym | Brak kontaktu z sondą; zapobiega przenoszeniu pozostałości między próbkami; minimalny nakład pracy na czyszczenie | VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP |
Zalety stosowania sonikacji do lizy komórek
W porównaniu z innymi metodami lizy komórek i ekstrakcji ultradźwiękowa liza komórek ma kilka zalet:
- Szybkość: Ultradźwiękowa liza komórek i ekstrakcja to szybka metoda, która może rozbić komórki w ciągu kilku sekund. Jest znacznie szybsza niż inne metody, takie jak homogenizacja, zamrażanie i rozmrażanie czy mielenie w młynie kulkowym.
- Wydajność: Ultradźwiękowa liza komórek i ekstrakcja mogą być stosowane do jednoczesnego przetwarzania małych, dużych lub wielu próbek, dzięki czemu są wydajniejsze niż inne metody wymagające indywidualnego przetwarzania małych próbek.
- Bez środków chemicznych: Ultradźwiękowa liza komórek i ekstrakcja to metoda nieinwazyjna, która nie wymaga stosowania agresywnych środków chemicznych ani enzymów. Dzięki temu jest idealna do zastosowań, w których należy zachować integralność zawartości komórek. Można uniknąć niepożądanego zanieczyszczenia próbek.
- Wysoki uzysk: Ultradźwiękowa liza komórek i ekstrakcja pozwalają uzyskać wysoki uzysk składników komórkowych, w tym DNA, RNA i białek. Dzieje się tak dlatego, że fale dźwiękowe o wysokiej częstotliwości rozbijają ściany komórkowe i uwalniają zawartość komórek do otaczającego roztworu.
- Kontrola temperatury: Zaawansowane sonikatory umożliwiają precyzyjną kontrolę temperatury próbki. Cyfrowe sonikatory Hielscher są wyposażone w podłączany czujnik temperatury i oprogramowanie do monitorowania temperatury.
- Powtarzalność: Protokoły ultradźwiękowej lizy komórek można łatwo odtwarzać, a nawet dostosowywać do różnych większych lub mniejszych objętości próbek przez proste liniowe zwiększanie skali.
- Wszechstronność: Ultradźwiękowa liza komórek i ekstrakcja mogą być stosowane do ekstrakcji szerokiego zakresu typów komórek, w tym bakterii, drożdży, grzybów oraz komórek roślinnych i ssaczych. Mogą być również stosowane do ekstrakcji różnych rodzajów cząsteczek, w tym białek, DNA, RNA i lipidów.
- Jednoczesne przygotowanie licznych próbek: Hielscher Ultrasonics oferuje kilka rozwiązań umożliwiających wygodne przetwarzanie licznych próbek w dokładnie takich samych warunkach procesu. Dzięki temu etap przygotowania próbek obejmujący lizę i ekstrakcję jest wysoce wydajny i pozwala oszczędzić czas.
- Łatwość obsługi: Urządzenia do ultradźwiękowej lizy komórek i ekstrakcji są łatwe w obsłudze i wymagają minimalnego przeszkolenia. Są również ekonomiczne, ponieważ stanowią jednorazową inwestycję bez konieczności ponownego zakupu jednorazowych materiałów eksploatacyjnych. Dzięki temu są atrakcyjne dla szerokiego grona badaczy i laboratoriów.
Ogólnie rzecz biorąc, ultradźwiękowa liza komórek i ekstrakcja to szybka, wydajna, precyzyjnie kontrolowalna i wszechstronna metoda pozyskiwania zawartości komórek. Jej zalety w porównaniu z alternatywnymi metodami sprawiają, że jest atrakcyjnym wyborem w szerokim zakresie zastosowań badawczych i przemysłowych.
Zasada działania ultradźwiękowej lizy komórek
Ultradźwiękowa liza komórek i ekstrakcja wykorzystują fale dźwiękowe o wysokiej częstotliwości do rozbijania komórek i ekstrakcji ich zawartości. Fale dźwiękowe wywołują zmiany ciśnienia w otaczającej cieczy, powodując powstawanie i zapadanie się małych pęcherzyków w procesie zwanym kawitacją. Pęcherzyki te generują miejscowo bardzo intensywne siły mechaniczne, które mogą rozbijać komórki i uwalniać ich zawartość do otaczającego roztworu.
Liza komórek za pomocą sonikatora zazwyczaj obejmuje następujące etapy:
- Próbkę umieszcza się w probówce lub pojemniku z płynnym buforem.
- Do próbki wprowadza się sondę ultradźwiękową i stosuje fale dźwiękowe o wysokiej częstotliwości, wynoszącej około 20–30 kHz.
- Fale ultradźwiękowe wywołują oscylacje i kawitację w otaczającej cieczy, generując miejscowe siły, które rozbijają komórki i uwalniają ich zawartość.
- Próbkę odwirowuje się lub filtruje w celu usunięcia wszelkich resztek komórkowych, a wyekstrahowaną zawartość zbiera się do dalszej analizy.
Wady powszechnie stosowanych metod lizy
Podczas pracy w laboratoriach można było już doświadczyć trudności związanych z lizą komórek przy użyciu tradycyjnych protokołów lizy mechanicznej lub chemicznej.
- Liza mechaniczna: Metody lizy mechanicznej, takie jak rozcieranie w moździerzu za pomocą tłuczka lub homogenizacja z użyciem prasy Frencha, młyna kulkowego albo układu rotor–stator, często nie oferują możliwości precyzyjnej kontroli i regulacji. Oznacza to, że mielenie i rozcieranie mogą szybko generować ciepło i siły ścinające, które mogą uszkadzać próbkę i denaturować białka. Mogą też być czasochłonne i wymagać dużych ilości materiału wyjściowego.
- Liza chemiczna: Metody lizy chemicznej, takie jak liza z użyciem detergentów, mogą uszkadzać próbkę przez naruszanie dwuwarstwy lipidowej i denaturację białek. Mogą również wymagać wielu etapów i pozostawiać resztkowe zanieczyszczenia, które zakłócają dalsze zastosowania. Dodatkowym wyzwaniem jest dobranie optymalnej dawki detergentu.
- Cykle zamrażania i rozmrażania: Cykle zamrażania i rozmrażania mogą powodować pękanie błon komórkowych, ale powtarzane cykle mogą również prowadzić do denaturacji i degradacji białek. Metoda ta może też wymagać wielu cykli, co bywa czasochłonne i często skutkuje niższym uzyskiem.
- Liza enzymatyczna: Metody lizy enzymatycznej mogą być specyficzne dla określonych typów komórek i wymagać wielu etapów, przez co są czasochłonne. Generują również odpady i wymagają starannej optymalizacji, aby uniknąć degradacji próbki. Zestawy do lizy enzymatycznej są często drogie. Jeśli obecna procedura lizy enzymatycznej daje niewystarczające wyniki, można zastosować sonikację jako metodę synergistyczną, aby zintensyfikować rozbijanie komórek.
W przeciwieństwie do konwencjonalnych mechanicznych i chemicznych metod lizy komórek sonikacja jest bardzo wydajnym i niezawodnym narzędziem do dezintegracji komórek, które umożliwia pełną kontrolę parametrów sonikacji. Zapewnia to wysoką selektywność uwalniania materiału i wysoką czystość produktu. [por. Balasundaram et al., 2009]
Nadaje się do wszystkich typów komórek i można ją łatwo stosować w małej i dużej skali – zawsze w kontrolowanych warunkach. Sonikatory są łatwe w czyszczeniu. Homogenizator ultradźwiękowy zawsze ma funkcję czyszczenia na miejscu (CIP) i sterylizacji na miejscu (SIP). Sonotroda ma postać masywnego tytanowego rogu, który można przecierać lub przepłukiwać wodą albo rozpuszczalnikiem (w zależności od medium roboczego). Ze względu na wytrzymałość sonikatorów ich konserwacja jest niemal pomijalna.
Ultradźwiękowa liza i rozbijanie komórek
Zazwyczaj liza próbek w laboratorium trwa od 15 sekund do 2 minut. Ponieważ intensywność sonikacji można bardzo łatwo regulować poprzez ustawienie amplitudy i czasu sonikacji, a także dobór odpowiedniego sprzętu, możliwe jest rozbijanie błon komórkowych bardzo łagodnie lub bardzo gwałtownie, w zależności od struktury komórki i celu lizy (np. ekstrakcja DNA wymaga łagodniejszej sonikacji, a pełna ekstrakcja białek z bakterii wymaga bardziej intensywnej obróbki ultradźwiękowej). Temperaturę podczas procesu można monitorować za pomocą zintegrowanego czujnika temperatury i łatwo kontrolować poprzez chłodzenie (kąpiel lodowa lub komory przepływowe z płaszczami chłodzącymi) albo sonikację w trybie impulsowym. Podczas sonikacji w trybie impulsowym krótkie cykle sonikacji o czasie trwania 1–15 sekund umożliwiają odprowadzanie ciepła i chłodzenie podczas dłuższych przerw.
Wszystkie procesy wykorzystujące ultradźwięki są w pełni powtarzalne i liniowo skalowalne.
VialTweeter jest homogenizatorem ultradźwiękowym do jednoczesnego, równomiernego i szybkiego przygotowania licznych próbek w warunkach sterylnych.
- Przygotowanie zawiesiny komórkowej: Osady komórkowe należy całkowicie zawiesić w roztworze buforowym poprzez homogenizację (należy wybrać roztwór buforowy zgodny z dalszą analizą, np. określoną metodą chromatograficzną). W razie potrzeby należy dodać lizozymy i/lub inne dodatki (muszą one być również zgodne z metodami rozdzielania/oczyszczania). Delikatnie mieszać/homogenizować roztwór przy łagodnej sonikacji aż do uzyskania pełnej zawiesiny.
Przeczytaj więcej o synergii lizozymów w połączeniu z sonikacją! - Liza ultradźwiękowa: Umieścić próbkę w kąpieli lodowej. W celu rozbijania komórek poddawać zawiesinę sonikacji w cyklach trwających 60–90 sekund (korzystając z trybu impulsowego sonikatora).
- Rozdzielanie: Odwirować lizat (np. przez 10 min. przy 10 000 x g; w temperaturze 4degC). Ostrożnie oddzielić supernatant od osadu komórkowego. Supernatant stanowi całkowity lizat komórkowy. Po przefiltrowaniu supernatantu otrzymuje się klarowną ciecz zawierającą rozpuszczalne białko komórkowe.
Najczęstsze zastosowania sonikatorów w biologii i biotechnologii to:
- Przygotowanie ekstraktów komórkowych
- Rozbijanie drożdży, bakterii, komórek roślinnych, miękkich lub twardych tkanek komórkowych, materiału nukleinowego
- Ekstrakcja białek
- Przygotowanie i izolacja enzymów
- Produkcja antygenów
- Ekstrakcja DNA i/lub ukierunkowana fragmentacja
- Przygotowanie liposomów
Rozbijanie komórek za pomocą sonikatora z sondą jest wydajną metodą przygotowania próbek.
Liczne zastosowania ultradźwięków obejmują biotechnologię, bioinżynierię, mikrobiologię, biologię molekularną, biochemię, immunologię, bakteriologię, wirusologię, proteomikę, genetykę, fizjologię, biologię komórki, hematologię i botanikę.
Liza: rozbijanie struktur komórkowych
Komórki są chronione przez półprzepuszczalną błonę komórkową, która składa się z dwuwarstwy fosfolipidowej (również dwuwarstwy białkowo-lipidowej; utworzonej z hydrofobowych lipidów i hydrofilowych cząsteczek fosforu z osadzonymi cząsteczkami białek) i tworzy barierę między wnętrzem komórki (cytoplazmą) a środowiskiem zewnątrzkomórkowym. Komórki roślinne i prokariotyczne są otoczone ścianą komórkową. Ze względu na grubą, wielowarstwową ścianę komórkową z celulozy komórki roślinne trudniej poddają się lizie niż komórki zwierzęce. Wnętrze komórki, w tym organelle, jądro i mitochondrium, jest stabilizowane przez cytoszkielet.
Liza komórek ma na celu ekstrakcję i rozdzielenie organelli, białek, DNA, mRNA lub innych biomolekuł.
Konwencjonalne metody lizy komórek i ich wady
Istnieje kilka metod lizy komórek, które można podzielić na mechaniczne i chemiczne. Obejmują one stosowanie detergentów lub rozpuszczalników, działanie wysokiego ciśnienia albo użycie młyna kulkowego lub prasy Frencha. Najbardziej problematyczną wadą tych metod jest trudność w kontrolowaniu i regulowaniu parametrów procesu, a tym samym jego oddziaływania.
Poniższa tabela przedstawia główne wady powszechnie stosowanych metod lizy:
Tabela: konwencjonalne metody lizy komórek mają istotne wady
Procedura lizy
Liza jest procesem wymagającym ostrożności. Podczas lizy niszczona jest ochrona zapewniana przez błonę komórkową, jednak należy zapobiec inaktywacji, denaturacji i degradacji wyekstrahowanych białek przez środowisko niefizjologiczne (odchylenie od wartości pH). Dlatego lizę zazwyczaj przeprowadza się w roztworze buforowym. Większość trudności wynika z niekontrolowanego rozbijania komórek, prowadzącego do nieukierunkowanego uwolnienia całego materiału wewnątrzkomórkowego i/lub denaturacji produktu docelowego.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące sonikacji i lizy komórek
- Czy można przeprowadzić lizę komórek za pomocą sonikacji? Tak, sonikacja skutecznie powoduje lizę komórek, wykorzystując fale ultradźwiękowe o wysokiej częstotliwości, które wywołują kawitację – zjawisko polegające na powstawaniu i gwałtownym zapadaniu się drobnych pęcherzyków pary w zawiesinie komórkowej. Powstające siły mechaniczne rozbijają błony komórkowe i ułatwiają uwalnianie składników wewnątrzkomórkowych do cieczy.
- Jak używać sonikatora do lizy komórek? Użycie sonikatora do lizy komórek polega na zanurzeniu sondy sonikatora w zawiesinie komórkowej i dostosowaniu parametrów, takich jak amplituda i czas trwania impulsu. Proces należy ściśle monitorować, aby zoptymalizować rozbijanie komórek, jednocześnie minimalizując denaturację białek i inaktywację enzymów.
- Na jakiej zasadzie działa sonikacja w lizie komórek? Sonikacja działa na zasadzie kawitacji akustycznej. Energia ultradźwiękowa jest przekazywana do ciekłego medium, powodując szybkie wahania ciśnienia, które prowadzą do powstawania i implozji mikropęcherzyków. Implozje te generują intensywne siły ścinające i miejscowo wysokie temperatury, rozbijając struktury komórkowe i zwiększając jednorodność lizatu.
- Jak długo trwa sonikacja do lizy komórek? Czas trwania sonikacji do lizy komórek może znacznie się różnić w zależności od takich czynników jak typ komórek, gęstość komórek, moc sonikatora i konkretny stosowany protokół. Typowe procedury mogą trwać od kilku sekund do kilku minut i często są przeprowadzane w cyklach, aby kontrolować wytwarzanie ciepła i zapewnić równomierne rozbijanie komórek.
- Jaki jest cel sonikacji w ekstrakcji białek? W ekstrakcji białek sonikacja służy do wydajnego rozrywania błon komórkowych i solubilizacji białek. Metoda ta jest szczególnie przydatna do uwalniania białek z przedziałów wewnątrzkomórkowych, co czyni ją niezbędną do przygotowania lizatów, z których białka mają być oczyszczane lub analizowane.
- Dlaczego sonikację stosuje się do ekstrakcji? Sonikacja jest preferowana w ekstrakcji ze względu na szybkie działanie i możliwość ukierunkowanego dostarczania energii, która rozbija struktury komórkowe, uwalniając cząsteczki bioaktywne bez stosowania agresywnej obróbki chemicznej, a tym samym zachowując integralność funkcjonalną wyekstrahowanych związków.
- Czy sonikacja zakłóca oddziaływania białko–białko? Chociaż sonikacja może skutecznie rozbijać błony komórkowe, może również zakłócać oddziaływania białko–białko. Stopień zakłócenia zależy od intensywności sonikacji i czasu ekspozycji; może ona prowadzić do denaturacji lub dysocjacji kompleksów białkowych, co może wpływać na późniejsze badania analityczne lub funkcjonalne.
- Czy sonikację można stosować do lizy E. coli? Sonikatory Hielscher są szczególnie skuteczne w lizie komórek bakteryjnych, takich jak E. coli, które mają wytrzymałe ściany komórkowe. Technika ta stanowi fizyczną metodę rozbijania ściany i błony komórkowej przez ścinanie, dzięki czemu jest preferowaną metodą przygotowania lizatów bakteryjnych w laboratoriach biologii molekularnej i biochemii.
- Jakie procesy następują po etapie sonikacji?
Dalsze etapy po lizie ultradźwiękowej zazwyczaj obejmują frakcjonowanie lizatu, ukierunkowaną izolację organelli oraz dalszą ekstrakcję lub oczyszczanie białek.
Przetworzony lizat jest następnie rozdzielany i przygotowywany do zastosowań analitycznych lub funkcjonalnych, takich jak proteomika o wysokiej rozdzielczości, transkryptomika lub badania wiązania z receptorami.
Literatura/Źródła
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.