Zastosowania ultradźwięków w pracy z wirusem ospy małpiej

Sonikacja jest ważną metodą przetwarzania stosowaną do izolacji wirusa ospy małpiej (MPXV) z próbek analitycznych, fragmentacji DNA wirusa, a także w produkcji szczepionek przeciw ospie małpiej. Podczas przygotowania próbek przed diagnostyką i analizą (PCR, ELISA itp.) sonikację stosuje się do lizy komórek w celu uwolnienia wirusa ospy małpiej z ich wnętrza i / lub fragmentacji DNA. W produkcji szczepionek zastosowania obejmują przygotowanie cząstek wirusa / DNA, enkapsulację w nośnikach leków oraz przygotowanie inokulów.
Poniżej znajdują się szczegółowe informacje o ultradźwiękowym przygotowaniu próbek wirusa ospy małpiej, a także o wspomaganej ultradźwiękami produkcji szczepionek przeciw MPXV.

Co znajdziesz na tej stronie:

• Liza ultradźwiękowa do ekstrakcji wirusa ospy małpiej
• Ultradźwiękowa fragmentacja DNA wirusa ospy małpiej
• Zastosowania ultradźwięków w produkcji szczepionek przeciw MPXV

Liza ultradźwiękowa i fragmentacja DNA przed reakcją łańcuchową polimerazy (PCR)

Zakażenie wirusem ospy małpiej wykrywa się za pomocą testów amplifikacji kwasów nukleinowych (NAAT), wykorzystujących reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym lub konwencjonalną reakcję PCR do wykrywania unikalnych sekwencji wirusowego DNA. Próbka (np. z wymazu z nosogardła lub biopsji skóry) zawiera wirusa w komórkach.
Do analizy wirus musi zostać uwolniony z komórek, a wirusowe DNA musi zostać poddane fragmentacji na potrzeby PCR.

Liza ultradźwiękowa:

Ultradźwiękowe rozbijanie komórek / liza jest niezawodną i wydajną metodą izolacji wirusów z próbek komórkowych, a tym samym techniką preferowaną w porównaniu ze środkami chemicznymi, takimi jak lizozym, proteinaza K i różne detergenty, które stosuje się alternatywnie do uzyskania lizy komórek i uwolnienia DNA.
Jednak stosowanie takich odczynników chemicznych wymaga czasochłonnego, wieloetapowego przygotowania próbek przed analizą PCR, aby zapobiec hamowaniu reakcji PCR. Ponieważ inhibitory PCR wpływają na wydajność amplifikacji, niewielkie różnice w ilości nieusuniętych inhibitorów mogą prowadzić do dużych różnic w amplifikacji produktu PCR (Diaco, 1995).
Zaletą sonikacji stosowanej do lizy jest to, że całkowite rozbicie struktur komórkowych i uwolnienie DNA bez konieczności stosowania odczynników lizujących i czasochłonnego przygotowania próbek są pożądane. (por. Fykse et al., 2003)

Ultradźwiękowa fragmentacja DNA:

Ultradźwiękowa fragmentacja DNA jest prosta i niezawodna, ponieważ pozwala uzyskać fragmenty DNA o regulowanej długości (pary zasad, bp). Za pomocą ultradźwięków można skutecznie fragmentować DNA do docelowej długości. Precyzyjna kontrola parametrów ultradźwięków i zaawansowane możliwości chłodzenia zapobiegają degradacji DNA.
Dowiedz się więcej o ultradźwiękowej fragmentacji DNA!

Zastosowania ultradźwięków w szczepionkach przeciw wirusowi ospy małpiej

Szczepionki stosowane przeciw wirusowi ospy małpiej są obecnie szczepionkami zawierającymi żywe wirusy. Nowo opracowywane szczepionki mogą wykorzystywać inne platformy, takie jak oparte na DNA… Obecnie zawiera zmodyfikowany wirus Vaccinia Ankara, atenuowany ortopokswirus niezdolny do replikacji. Zawiera również Tris (tris-aminometan) i chlorek sodu. Szczepionka może również zawierać niewielkie ilości DNA i białka z komórek fibroblastów zarodka kurzego, które służą do namnażania wirusa szczepionkowego, benzonazę oraz antybiotyki, takie jak gentamycyna i cyprofloksacyna.

Homogenizacja ultradźwiękowa jest stosowana w produkcji szczepionek zawierających żywe atenuowane wirusy, szczepionek DNA, wielowalentnych koktajli DNA, szczepionek mRNA, szczepionek zawierających białka rekombinowane, szczepionek zawierających cząstki wirusopodobne itp.

Tutaj znajdziesz bardziej szczegółowe informacje o zastosowaniach ultradźwięków w usprawnianiu produkcji szczepionek!

Protokół ultradźwiękowej izolacji wirusa ospy małpiej

Zespół badawczy Stittelaara (2005) zastosował lizę ultradźwiękową do uwolnienia wirusa ospy małpiej z hodowli komórek gospodarza służących do jego namnażania, a także z komórek uzyskanych z wymazów z gardła zakażonych naczelnych.

Przygotowanie szczepionki przeciw ospie małpiej:

Wirusy ospy małpiej namnażano w komórkach fibroblastów zarodka kurzego wolnych od określonych patogenów. Po inkubacji przez 1 do 2 dni zawiesinę wirusów i komórek zebrano po jednym cyklu zamrażania i rozmrażania, a następnie zagęszczono przez wirowanie. Osad ponownie zawieszono i poddano kilku cyklom homogenizacji ultradźwiękowej.

Izolacja wirusa ospy małpiej od zaszczepionych makaków:

Próbki trzykrotnie zamrożono i rozmrożono, a następnie poddano sonikacji w ultradźwiękowym CupHorn. Dwa rozcieńczenia (1:10 i 1:100) w podłożu transportowym z dodatkiem 1% płodowej surowicy bydlęcej wykorzystano do inokulacji monowarstw komórek Vero w płytkach sześciodołkowych. Po 1 h inkubacji w 37°C inokula usunięto i zastąpiono podłożem hodowlanym z dodatkiem 1% płodowej surowicy bydlęcej. Monowarstwy hodowano przez 5 dni w 37°C i barwiono roztworem fioletu krystalicznego.
(por. Stittelaar et al., 2005)

Sonikatory do analizy wirusów i produkcji szczepionek

Szeroka oferta produktów Hielscher Ultrasonics obejmuje idealny sonikator zarówno dla laboratoriów badawczych i analitycznych, jak i do przemysłowej produkcji szczepionek.
Hielscher Ultrasonics specjalizuje się w projektowaniu, produkcji i dystrybucji sonikatorów o wysokiej wydajności oraz sonobioreaktorów do zastosowań w laboratoriach badawczych i analitycznych, a także do wdrażania w przemysłowej produkcji szczepionek (np. szczepionek, aktywnych substancji farmaceutycznych (API)).
Sonikację można stosować w otwartych naczyniach, zamkniętych reaktorach z ciągłym mieszaniem oraz reaktorach o przepływie ciągłym. Wszystkie części systemów ultradźwiękowych mające kontakt z ciekłym medium są wykonane ze stali nierdzewnej, tytanu lub szkła. Części nadające się do sterylizacji w autoklawie i złącza sanitarne zapewniają produkcję w warunkach spełniających wymagania jakości farmaceutycznej.
Automatyczny zapis danych: Inteligentne oprogramowanie automatycznie zapisuje parametry procesu sonikacji na zintegrowanej karcie pamięci SD. Precyzyjna kontrola wszystkich parametrów procesu zapewnia powtarzalność, standaryzację produkcji, a także ułatwia spełnianie norm bezpieczeństwa produktów farmaceutycznych.
Procesory ultradźwiękowe Hielscher Ultrasonics są wysoce niezawodne i umożliwiają precyzyjne sterowanie. Wszystkie sonikatory przemysłowe można regulować w pełnym zakresie amplitud, od niższych do bardzo wysokich. Solidna konstrukcja systemów ultradźwiękowych Hielscher umożliwia pracę 24/7 pod dużym obciążeniem i w wymagających warunkach.

Poniższa tabela przedstawia orientacyjną wydajność przetwarzania naszych sonikatorów: