Aplikacje ultradźwiękowe w wirusie MonkeyPox

Ultradźwięki są ważną metodą przetwarzania w celu izolacji wirusa ospy małpiej (MPXV) z próbek analitycznych, fragmentacji DNA wirusa, jak również w produkcji szczepionek przeciwko ospie małpiej. Do przygotowania próbek przed diagnostyką i analizą (PCR, ELISA itp.) stosuje się ultradźwięki do lizy komórek w celu uwolnienia wirusa ospy małpiej z wnętrza komórki i / lub do fragmentacji DNA. W produkcji szczepionek zastosowania obejmują przygotowanie cząstek wirusa / DNA, kapsułkowanie w nośnikach leków i formułowanie inokulantów.
Poniżej znajdują się szczegółowe informacje na temat ultradźwiękowego przygotowania próbek wirusa ospy małpiej, a także ultradźwiękowo wspomaganej produkcji szczepionki MPXV.

Co można znaleźć na tej stronie:

• Liza ultradźwiękowa do ekstrakcji wirusa ospy małpiej
• Ultradźwiękowa fragmentacja DNA wirusa ospy małpiej
• Zastosowania ultradźwiękowe w produkcji szczepionek MPXV

Liza ultradźwiękowa i fragmentacja DNA przed reakcją łańcuchową polimerazy (PCR)

Zakażenie wirusem ospy małpiej jest wykrywane za pomocą testu amplifikacji kwasu nukleinowego (NAAT), wykorzystującego reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym lub konwencjonalną, w celu wykrycia unikalnych sekwencji wirusowego DNA. Próbka (np. z wymazu z jamy nosowo-gardłowej lub biopsji skóry) zawiera wirusa w komórkach.
Do analizy wirus musi zostać uwolniony z komórek, a wirusowe DNA musi zostać pofragmentowane do PCR.

Liza ultradźwiękowa:

Ultradźwiękowe rozbicie / liza komórek jest niezawodną i skuteczną metodą izolacji wirusów z próbek komórek, a tym samym preferowaną techniką w stosunku do środków chemicznych, takich jak lizozym, proteinaza K i różne detergenty, które są alternatywnie stosowane do osiągnięcia lizy komórek i uwolnienia DNA.
Jednak stosowanie takich odczynników chemicznych wymaga czasochłonnego przygotowania próbki w kilku etapach przed analizą PCR, aby zapobiec zahamowaniu reakcji PCR. Ponieważ inhibitory PCR wpływają na wydajność amplifikacji, niewielkie różnice w ilości inhibitorów, które nie zostały usunięte, mogą prowadzić do dużych różnic w amplifikacji produktu PCR (Diaco, 1995).
Zaletą ultradźwięków do lizy jest to, że pożądane jest całkowite rozbicie struktur komórkowych i uwolnienie DNA bez konieczności stosowania odczynników lizujących i czasochłonnego przygotowywania próbek. (por. Fykse i in., 2003)

Ultradźwiękowa fragmentacja DNA:

Ultradźwiękowa fragmentacja DNA jest prosta i niezawodna, ponieważ wytwarza fragmenty DNA o regulowanej długości (basepairs, bp). Za pomocą ultradźwięków DNA może być skutecznie fragmentowane do docelowej długości DNA. Precyzyjna kontrola parametrów ultradźwiękowych i zaawansowane opcje chłodzenia zapobiegają degradacji DNA.
Przeczytaj więcej o ultradźwiękowej fragmentacji DNA!

Zastosowania ultradźwiękowe w szczepionce przeciwko wirusowi ospy małpiej

Szczepionki stosowane przeciwko wirusowi ospy małp są obecnie szczepionkami zawierającymi żywe wirusy. Nowo opracowane szczepionki mogą wykorzystywać inne platformy, takie jak oparte na DNA. Obecnie zawiera zmodyfikowany wirus Vaccinia Ankara, atenuowany, niereplikujący się ortopokswirus. Zawiera również Tris (tris-aminometan) i chlorek sodu. Szczepionka może również zawierać niewielkie ilości DNA i białka z komórek fibroblastów zarodka kurzego, które są wykorzystywane do hodowli wirusa szczepionkowego, benzonazy i związków antybiotykowych, takich jak gentamycyna i cyprofloksacyna.

Homogenizacja ultradźwiękowa jest stosowana w produkcji żywych atenuowanych szczepionek wirusowych, szczepionek DNA, wielowartościowych koktajli DNA, szczepionek mRNA, rekombinowanych szczepionek białkowych, wirusopodobnych szczepionek cząsteczkowych itp.

Więcej szczegółowych informacji na temat zastosowań ultradźwięków w ulepszonej produkcji szczepionek można znaleźć tutaj!

Protokół ultradźwiękowej izolacji wirusa ospy małpiej

Zespół badawczy Stittelaar (2005) wykorzystał lizę ultradźwiękową do uwolnienia wirusa ospy małp z hodowli komórek gospodarza wzrostu, a także z komórek uzyskanych poprzez wymianę gardła od zakażonych naczelnych.

Przygotowanie szczepionki przeciwko ospie małp:

Wirusy ospy małp hodowano na wolnych od specyficznych patogenów komórkach fibroblastów zarodków kurzych. Po inkubacji przez 1 do 2 dni, zawiesinę komórek wirusa zebrano przez jedną rundę zamrażania-rozmrażania, a następnie zagęszczono przez odwirowanie. Pelet został ponownie zawieszony i poddany kilku rundom homogenizacji ultradźwiękowej.

Izolacja wirusa ospy małp od szczepionych makaków:

Próbki zostały trzykrotnie zamrożone i poddane sonikacji w ultradźwiękowym CupHorn. Dwa rozcieńczenia (1:10 i 1:100) w podłożu transportowym uzupełnionym 1% płodową surowicą bydlęcą wykorzystano do zaszczepienia monowarstw komórek Vero w płytkach sześciodołkowych. Po 1 godzinie inkubacji w temperaturze 37°C, inokulacje usunięto i zastąpiono podłożem hodowlanym uzupełnionym 1% płodową surowicą bydlęcą. Monowarstwy hodowano przez 5 dni w temperaturze 37°C i barwiono roztworem fioletu krystalicznego.
(por. Stittelaar et al., 2005)

Ultradźwięki do analizy wirusów i produkcji szczepionek

Szerokie portfolio produktów Hielscher Ultrasonics oferuje idealny ultrasonograf do laboratoriów badawczych i analitycznych, a także do przemysłowej produkcji szczepionek.
Hielscher Ultrasonics specjalizuje się w projektowaniu, produkcji i dystrybucji wysokowydajnych ultrasonografów i sono-bioreaktorów do stosowania w laboratoriach badawczych i analitycznych, a także do wdrażania w przemysłowej produkcji szczepionek (np. szczepionki, Interfejsy API).
Sonikacja może być stosowana do otwartych zbiorników, zamkniętych reaktorów z ciągłym mieszaniem i ciągłych reaktorów przepływowych. Wszystkie części systemów ultradźwiękowych, które wchodzą w kontakt z ciekłym medium, są wykonane ze stali nierdzewnej, tytanu lub szkła. Części autoklawowalne i armatura sanitarna zapewniają produkcję w warunkach warunki klasy farmaceutycznej.
Automatyczny zapis danych: Inteligentne oprogramowanie automatycznie rejestruje parametry procesu sonikacji na zintegrowanej karcie pamięci SD. Precyzyjna kontrola wszystkich parametrów procesu zapewnia odtwarzalność, standaryzacja produkcjii ułatwia spełnienie norm bezpieczeństwa produktów farmaceutycznych.
Hielscher Ultrasonics’ Procesory ultradźwiękowe są wysoce niezawodne i mogą być precyzyjnie kontrolowane. Wszystkie ultradźwięki przemysłowe można regulować w celu zapewnienia pełnego zakresu od niższych do bardzo wysokich amplitud. Wytrzymałość systemów ultradźwiękowych firmy Hielscher pozwala na pracę w trybie 24/7 pod dużym obciążeniem i w wymagających środowiskach.

Poniższa tabela przedstawia przybliżoną wydajność przetwarzania naszych ultradźwiękowców: