Aplikacje ultradźwiękowe w wirusie MonkeyPox
Ultradźwięki są ważną metodą przetwarzania w celu izolacji wirusa ospy małpiej (MPXV) z próbek analitycznych, fragmentacji DNA wirusa, a także w produkcji szczepionek przeciwko ospie małpiej. W celu przygotowania próbek przed diagnostyką i analizą (PCR, ELISA itp.) ultradźwięki są używane do liofilizacji komórek w celu uwolnienia wirusa ospy małpiej z wnętrza komórki i/lub do fragmentacji DNA. W produkcji szczepionek, zastosowania obejmują przygotowanie cząstek wirusa / DNA, kapsułkowanie w nośnikach leków i formułowanie inokulatorów.
Poniżej znajdują się szczegółowe informacje na temat ultradźwiękowego przygotowania próbek wirusa ospy małpiej, jak również wspomaganej ultradźwiękami produkcji szczepionki MPXV.
Co znajdziesz na tej stronie:
- Liza ultradźwiękowa do ekstrakcji wirusa ospy małpy
- Ultradźwiękowa fragmentacja DNA wirusa małpiej ospy
- Zastosowania ultradźwięków w produkcji szczepionek MPXV
Ten system 2x 1kW ultradźwięków do pracy w trybie ciągłym jest zainstalowany w zakładzie produkcji szczepionek.
Liza ultradźwiękowa i fragmentacja DNA przed reakcją łańcuchową polimerazy (PCR)
Zakażenie wirusem małpiej ospy jest wykrywane za pomocą badania amplifikacji kwasów nukleinowych (NAAT), z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym lub konwencjonalnej, w celu wykrycia unikalnych sekwencji wirusowego DNA. Próbka (np. z wymazu z nosogardła lub biopsji skóry) zawiera wirusa w komórkach.
Do analizy wirus musi być uwolniony z komórek ans wirusowe DNA musi być pofragmentowane do PCR.
Liza ultradźwiękowa:
Ultradźwiękowe rozbijanie/liza komórek jest niezawodną i skuteczną metodą izolacji wirusów z próbek komórek, a tym samym jest to technika preferowana w stosunku do środków chemicznych, takich jak lizozym, proteinaza K i różne detergenty, które są alternatywnie stosowane w celu osiągnięcia lizy komórek i uwolnienia DNA.
Jednakże stosowanie takich odczynników chemicznych wymaga czasochłonnego przygotowania próbki w kilku etapach przed analizą PCR, aby zapobiec inhibicji reakcji PCR. Ponieważ inhibitory PCR wpływają na wydajność amplifikacji, niewielkie zmiany ilości nie usuniętych inhibitorów mogą prowadzić do dużych różnic w amplifikacji produktu PCR (Diaco, 1995).
Zaletą stosowania ultradźwięków do lizy jest to, że pożądane jest całkowite przerwanie struktur komórkowych i uwolnienie DNA bez konieczności stosowania odczynników lizujących i czasochłonnego przygotowania próbki. (por. Fykse i in., 2003)
Ultrasoniczna fragmentacja DNA:
Ultradźwiękowa fragmentacja DNA jest prosta i niezawodna, ponieważ wytwarza fragmenty DNA o regulowanej długości (basepairs, bp). Przy użyciu ultradźwięków, DNA może być efektywnie fragmentowane do docelowej długości DNA. Precyzyjna kontrola parametrów ultradźwiękowych i zaawansowane opcje chłodzenia zapobiegają degradacji DNA.
Read more about Ultradźwiękowa fragmentacja DNA!
Zastosowania ultradźwięków w szczepionce na wirusa ospy małpiej
Szczepionki stosowane przeciwko wirusowi małpiej ospy są obecnie szczepionkami zawierającymi żywe wirusy. Nowo opracowane szczepionki mogą wykorzystywać inne platformy, takie jak oparte na DNA Obecnie zawiera zmodyfikowany Vaccinia Ankara viurs, atenuowany, niereplikujący się ortopokswirus. Zawiera również Tris (tris-aminometan) i chlorek sodu. Szczepionka może również zawierać niewielkie ilości DNA i białka z komórek Chicken Embryo Fibroblast, które są wykorzystywane do hodowli wirusa szczepionkowego, benzonazę i związki antybiotykowe, takie jak gentamycyna i cyprofloksacyna.
Homogenizacja ultradźwiękowa znajduje zastosowanie w produkcji szczepionek z żywymi atenuowanymi wirusami, szczepionek DNA, wielowalentnych koktajli DNA, szczepionek z mRNA, rekombinowanych szczepionek białkowych, szczepionek z cząstkami wirusopodobnymi itp.
- rozproszenie cząstek i czynników wirusowych
- emulgowanie
- inaktywacja wirusów
- formulacja nośnika leku (NLC, SLN)
- kapsułkowanie
- rozpuszczanie środków
- przygotowanie adiuwantów
- Odgazowanie / Odgazowanie
Protokół ultradźwiękowej izolacji wirusa ospy małpiej
Zespół badawczy Stittelaara (2005) zastosował lizę ultradźwiękową w celu uwolnienia wirusa ospy małpiej z hodowli komórkowej gospodarza wzrostu, jak również z komórek uzyskanych w wyniku podmiany gardła od zakażonych naczelnych.
Preparat do szczepienia przeciwko ospie małpiej:
Wirusy ospy małpiej były hodowane na wolnych od specyficznych patogenów komórkach fibroblastów zarodków kurzych. Po inkubacji przez 1 do 2 dni, zawiesina komórek wirusa była zbierana przez jedną rundę liofilizacji, a następnie zagęszczana przez odwirowanie. Pelet był ponownie zawieszany i poddawany kilkukrotnej homogenizacji ultradźwiękowej.
Izolacja wirusa ospy małpiej od szczepionych makaków:
Próbki były trzykrotnie zamrażane i sonikowane w ultradźwiękowym CupHorn. Dwa rozcieńczenia (1:10 i 1:100) w pożywce transportowej uzupełnionej 1% płodową surowicą bydlęcą zostały użyte do inokulacji monowarstw komórek Vero w płytkach sześciodołkowych. Po 1 h inkubacji w 37°C, inokulacje usuwano i zastępowano medium hodowlanym uzupełnionym 1% płodową surowicą bydlęcą. Monolaje hodowano przez 5 dni w temperaturze 37°C i barwiono roztworem fioletu krystalicznego.
(por. Stittelaar i in., 2005)
Ultradźwiękowce do analizy wirusów i produkcji szczepionek
Szerokie portfolio produktów Hielscher Ultrasonics oferuje idealne ultradźwięki dla laboratoriów badawczych i analitycznych, jak również dla przemysłowej produkcji szczepionek.
Hielscher Ultrasonics specjalizuje się w projektowaniu, produkcji i dystrybucji wysokowydajnych ultradźwiękowców i sono-bioreaktorów do zastosowania w laboratoriach badawczych i analitycznych, jak również do wdrożenia w przemysłowej produkcji szczepionek (np. szczepionki, API).
Sonikacja może być stosowana w otwartych zbiornikach, zamkniętych reaktorach z ciągłym mieszaniem oraz w reaktorach z ciągłym przepływem. Wszystkie części systemów ultradźwiękowych, które mają kontakt z ciekłym medium, wykonane są ze stali nierdzewnej, tytanu lub szkła. Części autoklawowalne i armatura sanitarna zapewniają produkcję w warunkach warunki klasy farmaceutycznej.
Automatyczny zapis danych: Inteligentne oprogramowanie automatycznie zapisuje parametry procesu dźwiękowego na zintegrowanej karcie pamięci SD. Precyzyjna kontrola wszystkich parametrów procesu zapewnia, że powtarzalność, standaryzacja produkcji, oraz ułatwia spełnienie norm bezpieczeństwa produktów farmaceutycznych.
Hielscher Ultrasonics’ Procesory ultradźwiękowe są wysoce niezawodne i mogą być precyzyjnie kontrolowane. Wszystkie przemysłowe ultradźwięki mogą być dostosowane do dostarczania pełnego zakresu od niższych do bardzo wysokich amplitud. Solidność systemów ultradźwiękowych firmy Hielscher pozwala na pracę 24/7 pod dużym obciążeniem i w wymagających środowiskach.
Poniższa tabela daje wskazanie przybliżonej mocy przerobowych naszych ultrasonicators:
| Wielkość partii | natężenie przepływu | Polecane urządzenia |
|---|---|---|
| płytki wielokrotnego użytku / mikrotitery | nie dotyczy | UIP400MTP |
| 1 do 500mL | 10-200mL/min | UP100H |
| 10 do 2000mL | 20-400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 do 20L | 0.2 do 4L/min | UIP2000hdT |
| 10-100L | 2 do 10L/min | UIP4000hdT |
| nie dotyczy | 10-100L/min | UIP16000 |
| nie dotyczy | większe | klaster UIP16000 |
Skontaktuj się z nami! / Zapytaj nas!
Ultradźwiękowy DNA Ścinanie
Zaadaptowano z Jkwchui pod CC-BY-SA.03
Literatura / materiały źródłowe
- Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
- Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidov in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
- J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
- Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
- Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.
Fakty Warto wiedzieć
Wirus małpiej ospy
Ospa małpia (MPV, MPXV lub hMPXV) to gatunek dwuniciowego wirusa DNA, który wywołuje wirusową chorobę odzwierzęcą. Choroba ta znana jest jako zakażenie małpią ospą i może wystąpić u ludzi i zwierząt. Należy on do rodzaju Orthopoxvirus w rodzinie Poxviridae. Wirus ospy małpiej jest jednym z ortopokswirusów ludzkich wraz z wirusami variola (VARV), ospy krowiej (CPX) i vaccinia (VACV). Ortopokswirusy charakteryzują się dużymi cząstkami wirusowymi o ceglastym kształcie, zawierającymi dwuniciowy genom DNA o długości około 200 000 bp.
Test ELISA
ELISA to skrót od Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay i jest to oznaczony test immunologiczny, który jest uważany za złoty standard testów immunologicznych. ELISA to test immunologiczny, ceniony za wysoką czułość diagnostyczną, służy do wykrywania i ilościowego oznaczania cząsteczek, w tym przeciwciał, antygenów, białek, glikoprotein i hormonów. Zasada działania testu ELISA opiera się na interakcji antygen-przeciwciało. Poprzez tę interakcję antygen-przeciwciało, specyficzne przeciwciała wiążą się z docelowym antygenem. Dopiero gdy dojdzie do interakcji, substrat może związać się z enzymem i można zaobserwować następującą po nim przemianę substratu, co oznacza uzyskanie wyniku pozytywnego.
Firma Hielscher Ultrasonics produkuje wysokowydajne homogenizatory ultradźwiękowe od laboratorium do wielkość przemysłowa.