용해를위한 초음파 처리 : 세포 파괴 및 추출
세포 분해 또는 용해는 생명 공학 실험실에서 매일 샘플 준비의 일반적인 부분입니다. 용해의 목표는 세포벽의 일부 또는 전체 세포를 파괴하여 생물학적 분자를 방출하는 것입니다. 초음파 균질화는 성공적인 세포 용해에 널리 사용됩니다. 정교한 초음파 의 주요 장점은 강도 및 온도와 같은 공정 매개 변수를 정밀하게 제어하여 부드럽지만 매우 효율적인 세포 파괴 및 추출을 가능하게한다는 것입니다.
초음파를 이용한 세포 용해
초음파 세포 용해 및 추출은 열린 세포를 분해하고 고주파 음파, 즉 초음파를 사용하여 내용물을 추출하는 데 사용되는 방법입니다. 초음파 처리는 세포 내 물질의 세포 파괴 및 추출의 확립되고 신뢰할 수있는 방법으로 널리 사용되는 용해 기술입니다. 초음파 용해는 플라스미드, 수용체 분석, 단백질, DNA, RNA 등과 같은 용해물 c함유 제제를 준비하는 신뢰할 수있는 기술입니다. 초음파 강도는 공정 매개 변수를 조정하여 평준화 될 수 있으므로 특정 응용 프로그램 요구 사항을 충족하기 위해 각 물질 및 매체에 대해 매우 부드러운 것에서 강렬한 최적의 초음파 강도를 개별적으로 설정할 수 있습니다. 용해의 다음 단계는 분획화, 세포 기관 분리 또는 / 및 단백질 추출 및 정제입니다. 추출된 물질(= 용해물)은 분리되어야 하며 단백질체학 연구와 같은 추가 조사 또는 적용의 대상이 됩니다.
초음파 균질화 UP100H (100 와트) 및 UP400St (400 와트) 용해 및 추출과 같은 샘플 준비.
다른 세포 용해 및 추출 방법에 비해 초음파 세포 용해에는 몇 가지 장점이 있습니다.
- 속도: 초음파 세포 용해 및 추출은 몇 초 만에 열린 세포를 깰 수있는 빠른 방법입니다. 이것은 균질화, 프리즈 해동 또는 비드 밀링과 같은 다른 방법보다 훨씬 빠릅니다.
- 효율성: 초음파 세포 용해 및 추출은 작은, 큰 또는 여러 샘플을 한 번에 처리하는 데 사용할 수 있으므로 작은 샘플의 개별 처리가 필요한 다른 방법보다 효율적입니다.
- 화학 물질 없음: 초음파 세포 용해 및 추출은 가혹한 화학 물질이나 효소를 사용할 필요가없는 비 침습적 방법입니다. 따라서 셀 내용의 무결성을 유지해야 하는 응용 분야에 이상적입니다. 원치 않는 시료 오염을 피할 수 있습니다.
- 고수익: 초음파 세포 용해 및 추출은 DNA, RNA 및 단백질을 포함한 세포 내용물의 높은 수율을 추출 할 수 있습니다. 이것은 고주파 음파가 세포벽을 부수고 내용물을 주변 용액으로 방출하기 때문입니다.
- 온도 제어: 정교한 초음파 장치를 사용하면 샘플의 온도를 정밀하게 제어 할 수 있습니다. Hielscher 디지털 초음파에는 플러그 형 온도 센서와 온도 모니터링 소프트웨어가 장착되어 있습니다.
- 재현할: 초음파 세포 용해를 위한 프로토콜은 쉽게 재현할 수 있으며 간단한 선형 스케일업으로 다른 더 크거나 작은 샘플 볼륨과 일치시킬 수도 있습니다.
- 다재 다능 한: 초음파 세포 용해 및 추출은 박테리아, 효모, 곰팡이, 식물 및 포유류 세포를 포함한 광범위한 세포 유형을 추출하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 단백질, DNA, RNA 및 지질을 포함한 다양한 유형의 분자를 추출하는 데 사용할 수 있습니다.
- 수많은 샘플의 동시 준비: Hielscher 초음파는 정확히 동일한 공정 조건에서 수많은 샘플을 편안하게 처리 할 수있는 몇 가지 솔루션을 제공합니다. 이것은 용해 및 추출의 샘플 준비 단계를 매우 효율적이고 시간을 절약합니다.
- 사용하기 쉬운: 초음파 세포 용해 및 추출 장비는 사용하기 쉽고 최소한의 교육이 필요합니다. 이 장비는 또한 폐기 재구매에 대한 요구 사항이 없는 단일 투자이기 때문에 경제적입니다. 이것은 광범위한 연구자와 실험실에 매력적입니다.
전반적으로 초음파 세포 용해 및 추출은 세포 내용물을 추출하는 빠르고 효율적이며 정밀하게 제어 가능하며 다양한 방법입니다. 대체 방법에 비해 장점은 광범위한 연구 및 산업 응용 분야에 매력적인 선택입니다.
초음파 세포 용해의 작동 원리
초음파 세포 용해 및 추출은 고주파 음파를 사용하여 세포를 파괴하고 내용물을 추출합니다. 음파는 주변 액체에 압력 변화를 일으켜 캐비테이션으로 알려진 과정에서 작은 기포가 형성되고 붕괴됩니다. 이 기포는 국부적으로 매우 강렬한 기계적 힘을 생성하여 열린 세포를 부수고 내용물을 주변 용액으로 방출 할 수 있습니다.
초음파 를 사용한 세포 용해는 일반적으로 다음 단계를 포함합니다.
- 샘플은 액체 완충액이있는 튜브 또는 용기에 넣습니다.
- 초음파 프로브가 샘플에 삽입되고 약 20-30kHz의 고주파 음파가 적용됩니다.
- 초음파는 주변 액체에서 진동과 캐비테이션을 일으켜 열린 세포를 부수고 내용물을 방출하는 국부적 인 힘을 생성합니다.
- 샘플을 원심 분리 또는 여과하여 세포 파편을 제거하고 추출 된 내용물을 수집하여 다운 스트림 분석을 수행합니다.
강력한 초음파는 생물학적 구조의 세포 매트릭스를 파괴하고 생리 활성 화합물을 방출합니다. 식물 재료와 용매 (예를 들어, 완충액) 사이의 물질 전달이 강화된다. (그래픽: ©빌쿠 외, 2006)
일반적인 용해 방법의 단점
실험실에서 작업하는 동안 기존의 기계적 또는 화학적 용해 프로토콜을 사용하여 세포 용해의 번거로움을 이미 경험했을 수 있습니다.
- 기계적 용해: 모르타르 및 유봉으로 분쇄하거나 프렌치 프레스, 비드 밀 또는 로터 고정자 시스템을 사용한 균질화와 같은 기계적 용해 방법은 종종 정밀 제어 및 조정 옵션이 부족합니다. 즉, 밀링 및 분쇄를 사용하면 샘플을 손상시키고 단백질을 변성시킬 수 있는 열과 전단력을 빠르게 생성할 수 있습니다. 또한 시간이 많이 걸리고 많은 양의 출발 물질이 필요할 수 있습니다.
- 화학 용해: 세제 기반 용해와 같은 화학적 용해 방법은 지질 이중층을 파괴하고 단백질을 변성시켜 샘플을 손상시킬 수 있습니다. 또한 여러 단계가 필요할 수 있으며 다운스트림 응용 분야를 방해하는 잔류 오염 물질을 남길 수 있습니다. 세제의 최적 복용량을 찾는 것은 추가적인 과제입니다.
- 동결-해동 주기: 동결-해동 주기는 세포막을 파열시킬 수 있지만 반복되는 주기는 단백질 변성 및 분해를 유발할 수도 있습니다. 이 방법은 또한 여러 사이클이 필요할 수 있으며, 이는 시간이 많이 걸리고 종종 수율을 낮출 수 있습니다.
- 효소 용해 : 효소 용해 방법은 특정 세포 유형에 특이적일 수 있으며 여러 단계가 필요하므로 시간이 많이 걸립니다. 또한 폐기물을 생성하고 샘플의 분해를 방지하기 위해 신중한 최적화가 필요합니다. 효소 용해 키트는 종종 비쌉니다. 현재의 효소 용해 절차가 불충분 한 결과를 제공하는 경우, 시너지 방법으로 초음파 처리를 적용하여 세포 파괴를 강화할 수 있습니다.
기존의 기계 및 화학 세포 용해 방법과 달리 초음파 처리는 초음파 매개 변수를 완벽하게 제어 할 수있는 세포 분해를위한 매우 효율적이고 신뢰할 수있는 도구입니다. 이것은 재료 방출 및 제품 순도에 대한 높은 선택성을 보장합니다. [발라순다람 외, 2009 참조]
모든 세포 유형에 적합하며 소규모 및 대규모에 쉽게 적용 할 수 있습니다. – 항상 통제 된 조건에서. 초음파 는 쉽게 청소할 수 있습니다. 초음파 균질화는 항상 클린 인 플레이스 (CIP) 및 멸균 - 인 - 플레이스 (SIP) 기능을 갖추고 있습니다. sonotrode는 물이나 용제 (작동 매체에 따라 다름)로 닦거나 씻을 수있는 거대한 티타늄 혼으로 구성됩니다. 초음파 의 유지 보수는 거의 무시할 수있는 견고성 때문입니다.
초음파 리시스 및 세포 파괴
일반적으로 실험실에서 샘플의 용해는 15 초에서 2 분 정도 소요됩니다. 초음파 처리의 강도는 초음파 처리 시간을 설정하고 적절한 장비를 선택하여 조정하기가 매우 쉽기 때문에 세포 구조와 용해 목적에 따라 매우 부드럽게 또는 매우 갑자기 세포막을 파괴 할 수 있습니다 ( 예를 들어 DNA 추출은보다 부드러운 초음파 처리가 필요하며 박테리아의 완전한 단백질 추출은보다 강력한 초음파 처리가 필요합니다. 공정 중 온도는 통합 온도 센서로 모니터링 할 수 있으며 냉각 (냉각 재킷이 장착 된 얼음 욕조 또는 플로우 셀) 또는 펄스 모드의 초음파 처리로 쉽게 제어 할 수 있습니다. 펄스 모드 초음파 처리 동안 1 ~ 15 초 지속되는 짧은 초음파 버스트주기는 더 긴 간헐적 인 기간 동안 열 방출 및 냉각을 허용합니다.
모든 초음파 기반 프로세스는 완벽하게 재현 가능하고 선형 적으로 확장 가능합니다.
바이알트위터 수많은 샘플의 동시적이고 균일하며 신속한 멸균 준비를위한 초음파 균질화기입니다.
세포 용해 및 추출을 위한 초음파 균질화기
다양한 유형의 초음파 장치를 통해 샘플 준비 목표를 일치시키고 사용자 친화성과 작동 편의성을 보장할 수 있습니다. 프로브 형 초음파 는 실험실에서 가장 일반적인 장치입니다. 0.1mL에서 최대 1000mL의 부피를 가진 중소형 시료의 준비에 가장 적합합니다. 다양한 전력 크기와 sonotrodes는 가장 효과적이고 효율적인 초음파 처리 결과를 위해 초음파 를 샘플 볼륨과 용기에 적응시킬 수 있습니다. 초음파 프로브 장치는 단일 샘플을 준비해야 할 때 최상의 선택입니다.
더 많은 샘플을 준비해야하는 경우, 예를 들어 8-10 바이알의 세포 용액, VialTweeter 또는 초음파 컵혼과 같은 초음파 시스템을 사용한 강렬한 간접 초음파 처리가 효율적인 용해를위한 가장 적합한 균질화 방법입니다. 여러 바이알이 동일한 강도로 동시에 초음파 처리됩니다. 이를 통해 시간을 절약 할뿐만 아니라 모든 샘플의 동일한 처리를 보장하므로 샘플 간의 결과를 신뢰할 수 있고 비교할 수 있습니다. 또한, 간접 초음파 처리 동안 초음파 sonotrode (초음파 프로브, 경적, 팁 또는 손가락이라고도 함)를 담그는 교차 오염을 피할 수 있습니다. 개별적으로 샘플 크기에 맞는 바이알이 사용되기 때문에 시간이 많이 소요되는 세척 및 용기 디캔팅으로 인한 샘플 손실이 생략됩니다. 멀티 웰 또는 마이크로 타이터 플레이트의 균일 한 초음파 처리를 위해 Hielscher는 UIP400MTP를 제공합니다.
예를 들어 셀 추출물의 상업 생산과 같이 더 많은 용적의 경우, 플로우 셀 리액터가있는 연속 초음파 시스템이 가장 적합합니다. 처리 된 물질의 연속적이고 균일 한 흐름은 균일 한 초음파 처리를 보장합니다. 초음파 붕괴 과정의 모든 매개 변수는 응용 프로그램 및 특정 셀 재료의 요구 사항에 맞게 최적화 및 조정할 수 있습니다.
박테리아 세포의 초음파 용해를위한 예시적인 절차 :
- 세포 현탁액의 준비 : 세포 펠렛은 균질화하여 완충 용액에 완전히 부유해야합니다 (다음 분석과 호환되는 완충 용액을 선택하십시오, 예를 들어 특정 크로마토 그래피 방법). 필요한 경우 리소자임 및 / 또는 기타 첨가제를 첨가하십시오 (분리 / 정제 수단과도 호환되어야합니다). 완전한 정지가 이루어질 때까지 가볍게 초음파 처리하여 용액을 부드럽게 혼합 / 균질화하십시오.
- 초음파 용해 : 얼음 욕조에 샘플을 놓습니다. 세포 파괴의 경우, 초음파 현미경의 펄스 모드를 사용하여 60-90 초 버스트로 현탁액을 초음파 처리하십시오.
- 분리 : lysate를 원심 분리하십시오 (예 : 10,000 xg에서 10 분, 4 ° C에서). 세포 펠렛에서 뜨는 것을 조심스럽게 분리하십시오. 상층 액은 총 세포 용 해물이다. 상등액을 여과 한 후 가용성 세포 단백질의 정화 된 액을 얻습니다.
생물학 및 생명 공학 분야의 초음파 검사기의 가장 일반적인 응용 분야는 다음과 같습니다.
- 세포 추출물 제조
- 효모, 박테리아, 식물 세포, 연질 또는 단단한 세포 조직, 핵산 물질의 파괴
- 단백질 추출
- 효소의 제조 및 분리
- 항원 생산
- DNA 추출 및 / 또는 표적 분열
- 리포좀 준비
프로브 형 초음파 를 사용한 세포 파괴는 효율적인 샘플 준비 방법입니다.
아래 표는 세포 파괴 및 추출을 위한 초음파 에 대한 개요를 제공합니다. 각 초음파 균질화기에 대한 자세한 정보를 얻으려면 장치 유형을 클릭하십시오. 우리의 잘 훈련되고 오랜 경험 기술 직원은 샘플에 가장 적합한 초음파 를 선택하는 데 기꺼이 도움을 드릴 것입니다!
| 일괄 볼륨 | 유량 | 권장 장치 |
|---|---|---|
| 최대 10개의 바이알 또는 튜브 | N.A. | 유리 병 |
| 멀티웰/마이크로타이터 플레이트 | N.A. | UIP400MTP |
| 다중 튜브 / 용기 | N.A. | 쿠펀 |
| 1 ~ 500mL | 10 ~ 200mL / min | UP100H |
| 10 내지 1000 밀리람베르트 | 20 내지 200mL/분 | UP200Ht, UP200St |
| 10 ~ 2000mL | 20 ~ 400 mL / min | UP400St |
생체 공학, 미생물학, 분자 생물학, 생화학, 면역학, 세균학, 바이러스학, 프로테오믹스, 유전학, 생리학, 세포 생물학, 혈액학 및 식물학 분야의 다양한 분야에서 초음파의 다양한 적용이 이루어지고 있습니다.
용해: 세포 구조 파괴
세포는 포스 포 - 지질 이중층 (단백질 - 지질 이중층 : 소수성 지질과 단백질 분자가 포획 된 친수성 인 분자로 구성됨)으로 구성된 반투과성 플라즈마 막에 의해 보호되며 세포 내부 (세포질)와 세포 내부 세포 외 환경. 식물 세포와 원핵 세포는 세포벽으로 둘러싸여 있습니다. 셀룰로오스의 다중 층 두꺼운 세포벽으로 인해, 식물 세포는 동물 세포보다 용해되기가 더 어렵습니다. organelles, nucleus, mitochondrion과 같은 세포 내부는 세포 골격에 의해 안정화됩니다.
세포를 용해시킴으로써 세포 소기관, 단백질, DNA, mRNA 또는 기타 생체 분자를 추출하고 분리하는 것을 목표로합니다.
기존의 세포 용해 방법과 단점
세제 나 용매의 사용, 고압의 적용, 또는 비드 밀 또는 프렌치 프레스의 사용을 포함하여 기계적 방법과 화학적 방법으로 나누어 질 수있는 세포를 용균시키는 몇 가지 방법이 있습니다. 이러한 방법의 가장 문제가되는 단점은 공정 매개 변수의 제어 및 조정이 어렵고 그에 따라 영향을 받는다는 것입니다.
아래 표는 일반적인 용해 방법의 주요 단점을 보여줍니다.
테이블 : 세포 용해의 전통적인 방법에는 중요한 불리가 있습니다
용해 절차
용해는 민감한 과정입니다. 용해하는 동안 세포막의 보호는 파괴되지만, 비 생리 학적 환경 (pH 값으로부터의 편차)에 의한 추출 된 단백질의 불 활성화, 변성 및 분해는 방지되어야한다. 따라서, 일반적으로 용해는 완충 용액 내에서 수행된다. 대부분의 어려움은 조절되지 않은 세포 파괴로 인해 모든 세포 내 물질의 표적이없는 방출 또는 표적 생성물의 변성을 초래한다.
문학 / 참고 문헌
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