세포 용해를 위한 초음파 처리: 세포 파괴 및 추출
초음파 세포 용해는 생명 공학 실험실의 시료 전처리 절차입니다. 목표는 세포벽이나 전체 세포를 파괴하여 생물학적 분자를 방출하는 것입니다. 초음파 처리는 일반적으로 세포 용해, 세포 파괴 및 추출에 사용됩니다. 세포 용해를 위한 초음파 발생기의 주요 장점은 강도 및 온도와 같은 공정 매개변수를 정밀하게 제어하여 부드러우면서도 효율적인 세포 파괴 및 추출을 가능하게 한다는 것입니다.
초음파를 이용한 세포 용해
초음파 세포 용해는 고주파 음파를 사용하여 열린 세포를 파괴하고 내용물을 추출합니다. 초음파 처리는 세포 파괴 및 플라스미드, 수용체 분석, 단백질, DNA 및 RNA와 같은 세포 내 물질의 추출에 대해 확립되고 신뢰할 수 있습니다. 공정 매개 변수를 조정함으로써 초음파 강도는 부드러운 것부터 강렬한 초음파 처리에 이르기까지 특정 응용 프로그램 요구 사항을 충족하도록 미세 조정할 수 있습니다. 용해 후 단계에는 분획, 세포 기관 분리, 단백질 추출 및 정제가 포함됩니다. 생성된 용해물은 단백질체 연구와 같은 추가 조사 또는 응용을 위해 분리해야 합니다.
용해, 세포 파괴 및 추출을 위한 초음파 처리에 대해 자세히 알아보려면 당사에 문의하십시오. 당사의 기술 팀은 세포 용해 프로젝트에서 귀하와 함께 일하게 되어 기쁩니다.
초음파 균질화 기 UP100H (100 와트) 및 UP400St (400 와트) : 세포 용해 및 추출을위한 초음파 처리.
세포 용해를 위해 초음파 처리(Sonication) 사용의 장점
다른 세포 용해 및 추출 방법과 비교할 때 초음파 세포 용해에는 몇 가지 장점이 있습니다.
- 속도: 초음파 세포 용해 및 추출은 몇 초 만에 열린 세포를 파괴할 수 있는 빠른 방법입니다. 이는 균질화, 동결-해동 또는 비드 밀링과 같은 다른 방법보다 훨씬 빠릅니다.
- 능률: 초음파 세포 용해 및 추출은 한 번에 작거나 큰 또는 여러 샘플을 처리하는 데 사용할 수 있으므로 작은 샘플을 개별적으로 처리해야 하는 다른 방법보다 효율적입니다.
- 화학 성분 무함유: 초음파 세포 용해 및 추출은 독한 화학 물질이나 효소를 사용할 필요가 없는 비침습적 방법입니다. 따라서 셀 내용물의 무결성을 유지해야 하는 응용 분야에 이상적입니다. 원치 않는 시료 오염을 방지할 수 있습니다.
- 높은 수율 : 초음파 세포 용해 및 추출은 DNA, RNA 및 단백질을 포함한 세포 내용물을 높은 수율로 추출할 수 있습니다. 이는 고주파 음파가 세포벽을 부수고 내용물을 주변 용액으로 방출하기 때문입니다.
- 온도 제어: 정교한 초음파를 사용하면 샘플의 온도를 정밀하게 제어할 수 있습니다. Hielscher 디지털 초음파 발생기에는 플러그형 온도 센서와 온도 모니터링 소프트웨어가 장착되어 있습니다.
- 재현할: 초음파 세포 용해를 위한 프로토콜은 쉽게 재현할 수 있으며 간단한 선형 스케일업을 통해 더 크거나 더 작은 다른 샘플 부피에 일치시킬 수도 있습니다.
- 다재 다능 한: 초음파 세포 용해 및 추출은 박테리아, 효모, 곰팡이, 식물 및 포유류 세포를 포함한 광범위한 세포 유형을 추출하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 단백질, DNA, RNA 및 지질을 포함한 다양한 유형의 분자를 추출하는 데 사용할 수 있습니다.
- 수많은 시료의 동시 준비: Hielscher 초음파는 정확히 동일한 공정 조건에서 수많은 샘플을 편안하게 처리 할 수있는 여러 솔루션을 제공합니다. 따라서 용해 및 추출의 시료 전처리 단계가 매우 효율적이고 시간을 절약할 수 있습니다.
- 사용하기 쉬움 : 초음파 세포 용해 및 추출 장비는 사용이 간편하고 최소한의 교육만 필요합니다. 이 장비는 또한 폐기품을 재구매할 필요가 없는 단일 투자이기 때문에 경제적입니다. 이는 다양한 연구자와 실험실에 매력적입니다.
전반적으로 초음파 세포 용해 및 추출은 세포 내용물을 추출하기 위한 빠르고 효율적이며 정밀하게 제어 가능하고 다양한 방법입니다. 대체 방법에 비해 장점이 있어 광범위한 연구 및 산업 응용 분야에 매력적인 선택입니다.
초음파 세포 용해의 작동 원리
초음파 세포 용해 및 추출은 고주파 음파를 사용하여 세포를 파괴하고 내용물을 추출합니다. 음파는 주변 액체에 압력 변화를 일으켜 캐비테이션으로 알려진 과정에서 작은 기포가 형성되고 붕괴되도록 합니다. 이러한 기포는 열린 세포를 파괴하고 내용물을 주변 용액으로 방출할 수 있는 국부적이고 매우 강렬한 기계적 힘을 생성합니다.
초음파기를 사용한 세포 용해에는 일반적으로 다음 단계가 포함됩니다.
- 샘플은 액체 완충액이 있는 튜브 또는 용기에 넣습니다.
- 초음파 프로브를 샘플에 삽입하고 약 20-30kHz의 고주파 음파를 적용합니다.
- 초음파는 주변 액체에 진동과 캐비테이션을 일으켜 열린 세포를 파괴하고 내용물을 방출하는 국부적인 힘을 생성합니다.
- 샘플을 원심분리하거나 여과하여 세포 파편을 제거하고 추출된 내용물을 수집하여 다운스트림 분석을 수행합니다.
강력한 초음파는 생물학적 구조의 세포 기질을 파괴하고 생체 활성 화합물을 방출합니다. 식물 재료와 용매(예: 완충액) 사이의 질량 전달이 강화됩니다. (그래픽: ©Vilkhu et al., 2006)
Common Lysis 방법의 단점
실험실에서 일하는 동안 기존의 기계적 또는 화학적 용해 프로토콜을 사용하여 세포 용해의 번거로움을 이미 경험했을 수 있습니다.
- 기계적 용해: 모르타르 및 유봉을 사용한 연삭 또는 프렌치 프레스, 비드 밀 또는 로터-스테이터 시스템을 사용한 균질화와 같은 기계적 용해 방법은 종종 정밀 제어 및 조정 옵션이 부족합니다. 이는 밀링 및 그라인딩을 사용하면 시료를 손상시키고 단백질을 변성시킬 수 있는 열과 전단력을 빠르게 생성할 수 있음을 의미합니다. 또한 시간이 많이 걸리고 많은 양의 시작 물질이 필요할 수 있습니다.
- 화학적 용해: 세제 기반 용해와 같은 화학적 용해 방법은 지질 이중층을 파괴하고 단백질을 변성시켜 시료를 손상시킬 수 있습니다. 또한 여러 단계가 필요할 수 있으며 다운스트림 응용 분야를 방해하는 잔류 오염 물질이 남을 수 있습니다. 최적의 세제 복용량을 찾는 것은 또 다른 도전입니다.
- 동결-해동 주기: 동결-해동 주기는 세포막을 파열시킬 수 있지만 반복적인 주기는 단백질 변성 및 분해를 유발할 수도 있습니다. 이 방법은 또한 시간이 많이 걸리고 종종 더 낮은 수율을 초래할 수 있는 여러 사이클이 필요할 수 있습니다.
- 효소 용해: 효소 용해 방법은 특정 세포 유형에 따라 다를 수 있으며 여러 단계가 필요하기 때문에 시간이 많이 걸립니다. 또한 폐기물을 생성하고 샘플의 분해를 방지하기 위해 신중한 최적화가 필요합니다. 효소 용해 키트는 종종 비쌉니다. 현재의 효소 용해 절차가 불충분한 결과를 제공하지 않는 경우, 시너지 효과 방법으로 초음파 처리를 적용하여 세포 파괴를 강화할 수 있습니다.
기존의 기계적 및 화학적 세포 용해 방법과 달리, 초음파 처리는 세포 붕괴를위한 매우 효율적이고 신뢰할 수있는 도구로, 초음파 처리 매개 변수를 완벽하게 제어 할 수 있습니다. 이는 재료 방출 및 제품 순도에 대한 높은 선택성을 보장합니다. [Balasundaram et al., 2009 참조]
모든 세포 유형에 적합하며 소규모 및 대규모로 쉽게 적용 할 수 있습니다. – 항상 통제된 조건 하에서. 초음파기는 청소하기 쉽습니다. 초음파 균질화기는 항상 CIP (Clean-in-Place) 및 SIP (sterilize-in-place) 기능을 갖추고 있습니다. sonotrode는 물이나 용제로 닦거나 씻을 수있는 거대한 티타늄 혼으로 구성됩니다 (작업 매체에 따라 다름). 초음파기의 유지 관리는 거의 무시할 수 없는 견고함 때문입니다.
Ultrasonic Lysis and Cell Disruption
일반적으로 실험실에서 샘플을 용해하는 데는 15초에서 2분 정도 걸립니다. 초음파 처리의 강도는 진폭을 설정하고 초음파 처리 시간을 설정하고 올바른 장비를 선택하여 조정하기가 매우 쉽기 때문에 세포 구조 및 용해 목적에 따라 세포막을 매우 부드럽게 또는 매우 갑작스럽게 파괴 할 수 있습니다 (예 : DNA 추출은 더 부드러운 초음파 처리가 필요하고 박테리아의 완전한 단백질 추출은 더 강렬한 초음파 처리가 필요함). 공정 중 온도는 통합 온도 센서로 모니터링 할 수 있으며 냉각 (냉각 재킷이있는 얼음 수조 또는 플로우 셀) 또는 펄스 모드의 초음파 처리로 쉽게 제어 할 수 있습니다. 펄스 모드 초음파 처리 중에는 1-15 초 동안의 짧은 초음파 처리주기가 짧아지면 간헐적 인 기간 동안 열 방출 및 냉각이 가능합니다.
모든 초음파 기반 공정은 완전히 재현 가능하고 선형적으로 확장 가능합니다.
VialTweeter (바이알트위터) 수많은 샘플의 동시, 균일하고 신속한 멸균 준비를 위한 초음파 균질화기는 입니다.
세포 용해 및 추출을 위한 초음파 균질화기
다양한 유형의 초음파 장치를 통해 시료 전처리 목표를 달성하고 사용자 친화성과 작동 편의성을 보장할 수 있습니다. 프로브 형 초음파는 실험실에서 가장 일반적인 장치입니다. 0.1mL에서 최대 1000mL의 부피를 가진 중소형 시료 준비에 가장 적합합니다. 다양한 출력 크기와 소노트로드를 사용하면 초음파를 샘플 부피와 용기에 맞게 조정하여 가장 효과적이고 효율적인 초음파 처리 결과를 얻을 수 있습니다. 초음파 프로브 장치는 단일 샘플을 준비해야 할 때 가장 적합한 선택입니다.
더 많은 샘플을 준비해야하는 경우 (예 : 8-10 바이알의 세포 용액) VialTweeter 또는 초음파 cuphorn과 같은 초음파 시스템을 사용한 강렬한 간접 초음파 처리가 효율적인 용해에 가장 적합한 균질화 방법입니다. 여러 바이알이 동시에 동일한 강도로 초음파 처리됩니다. 이를 통해 시간을 절약할 수 있을 뿐만 아니라 모든 시료를 동일하게 처리할 수 있어 시료 간의 결과를 신뢰할 수 있고 비교할 수 있습니다. 또한, 간접 초음파 처리 중에는 초음파 sonotrode (초음파 프로브, 혼, 팁 또는 손가락이라고도 함)를 침수시킴으로써 교차 오염을 피할 수 있습니다. 시료 크기에 맞는 바이알을 개별적으로 사용하기 때문에 시간이 많이 소요되는 세척 작업과 용기 디캔팅으로 인한 시료 손실이 발생하지 않습니다. multiwell 또는 microtiter 플레이트의 균일 한 초음파 처리를 위해 Hielscher는 UIP400MTP 제공합니다.
예를 들어 세포 추출물의 상업적 생산과 같은 더 많은 양의 경우, 플로우 셀 반응기가 있는 연속 초음파 시스템이 가장 적합합니다. 가공 된 물질의 연속적이고 균일 한 흐름은 균일 한 초음파 처리를 보장합니다. 초음파 붕괴 과정의 모든 매개 변수는 응용 분야 및 특정 셀 재료의 요구 사항에 맞게 최적화하고 조정할 수 있습니다.
박테리아 세포의 초음파 용해를 위한 예시적인 절차:
- 세포 현탁액의 준비: 세포 펠릿은 균질화하여 완충 용액에 완전히 현탁시켜야 합니다(다음 분석과 호환되는 완충 용액 선택, 예: 특정 크로마토그래피 방법). 필요한 경우 라이소자임 및/또는 기타 첨가제를 추가합니다(분리/정제 수단과도 호환되어야 함). 완전한 현탁액이 달성 될 때까지 온화한 초음파 처리하에 용액을 부드럽게 혼합 / 균질화하십시오.
- 초음파 용해: 샘플을 얼음 수조에 넣습니다. 세포 파괴의 경우 60-90 초 버스트에서 현탁액을 초음파 처리합니다 (초음파 발생기의 펄스 모드 사용).
- 분리: 용해물을 원심분리합니다(예: 10,000 x g에서 10분, 4degC에서). 세포 펠릿에서 상층액을 조심스럽게 분리하십시오. 상층액은 총 세포 용해물입니다. 상층액을 여과 한 후 용해성 세포 단백질의 정화 된 액체를 얻습니다.
생물학 및 생명 공학에서 초음파의 가장 일반적인 응용 분야는 다음과 같습니다.
- 세포 추출물 준비
- 효모, 박테리아, 식물 세포, 연질 또는 경질 세포 조직, 핵 물질의 파괴
- 단백질 추출
- 효소의 준비 및 분리
- 항원의 생산
- DNA 추출 및/또는 표적 단편화
- 리포솜 준비
프로브 형 초음파를 사용한 세포 파괴는 효율적인 샘플 준비 방법입니다.
아래 표는 세포 파괴 및 추출을위한 초음파기에 대한 개요를 제공합니다. 각 초음파 균질화기에 대한 자세한 정보를 보려면 장치 유형을 클릭하십시오. 우리의 잘 훈련되고 오랜 경험을 가진 기술 직원은 샘플에 가장 적합한 초음파기를 선택하는 데 기꺼이 도움을 드릴 것입니다!
| 배치 볼륨(Batch Volume) | 유량 | 권장 장치 |
|---|---|---|
| 최대 10개의 바이알 또는 튜브 | N.A. 개시 | 바이알트위터 |
| Multiwell / Microtiter 플레이트 | N.A. 개시 | UIP400MTP |
| 여러 튜브 / 용기 | N.A. 개시 | 컵혼 |
| 1 내지 500mL | 10 내지 200mL/분 | 업100H |
| 10 to 1000mL | 20 to 200mL/min | UP200HT, UP200세인트 |
| 10 내지 2000mL | 20 내지 400mL/분 | UP400ST |
초음파의 다양한 응용 분야는 생명 공학, 생명 공학, 미생물학, 분자 생물학, 생화학, 면역학, 세균학, 바이러스학, 단백질체학, 유전학, 생리학, 세포 생물학, 혈액학 및 식물학 분야에서 뻗어 있습니다.
Lysis: 세포 구조 파괴
세포는 인-지질 이중층(단백질-지질 이중층, 단백질 분자가 내장된 소수성 지질 및 친수성 인 분자에 의해 형성됨)으로 구성되고 세포 내부(세포질)와 세포 외 환경 사이에 장벽을 생성하는 반투과성 원형질막으로 보호됩니다. 식물 세포와 원핵 세포는 세포벽으로 둘러싸여 있습니다. 셀룰로오스의 여러 층 두께의 세포벽으로 인해 식물 세포는 동물 세포보다 용해하기가 더 어렵습니다. 세포 소기관, 핵, 미토콘드리아와 같은 세포 내부는 세포골격에 의해 안정화됩니다.
세포를 용해함으로써 세포 소기관, 단백질, DNA, mRNA 또는 기타 생체 분자를 추출하고 분리하는 것을 목표로 합니다.
기존의 세포 용해 방법과 그 단점
세포를 용해하는 방법에는 여러 가지가 있으며, 이는 세제 또는 용제의 사용, 고압의 적용, 비드 밀 또는 프렌치 프레스의 사용을 포함하는 기계적 및 화학적 방법으로 나눌 수 있습니다. 이러한 방법의 가장 문제가 되는 단점은 공정 매개변수의 제어 및 조정이 어렵고 그로 인해 영향이 발생한다는 것입니다.
아래 표는 일반적인 lysis 방법의 주요 단점을 보여줍니다.
표: 기존의 세포 용해 방법에는 큰 단점이 있습니다.
용해 절차
용해는 민감한 과정입니다. 용해 중에는 세포막의 보호가 파괴되지만 비생리적 환경(pH 값과의 편차)에 의한 추출된 단백질의 불활성화, 변성 및 분해는 방지해야 합니다. 따라서 일반적으로 용해는 완충 용액에서 수행됩니다. 대부분의 어려움은 제어되지 않은 세포 파괴로 인해 발생하며, 이로 인해 모든 세포 내 물질의 비표적 방출 또는/또는 표적 산물의 변성화가 발생합니다.
Sonication and Cell Lysis에 대해 자주 묻는 질문
- 초음파 처리로 세포를 용해시킬 수 있습니까? 예, 초음파 처리는 캐비테이션을 유도하는 고주파 초음파를 사용하여 세포를 효과적으로 용해시킵니다.이 현상은 세포 현탁액 내에서 작은 증기 기포가 형성되고 격렬하게 붕괴되는 현상입니다. 그 결과 발생하는 기계적 힘은 세포막을 파괴하고 세포 내 구성 요소가 액체로 방출되는 것을 촉진합니다.
- 세포 용해를 위해 초음파 발생기를 사용하는 방법은 무엇입니까? 세포 용해를 위해 초음파 발생기를 사용하려면 초음파 발생기 프로브를 세포 현탁액에 담그고 진폭 및 펄스 지속 시간과 같은 매개 변수를 조정해야합니다. 단백질 변성 및 효소 불활성화를 최소화하면서 세포 파괴를 최적화하기 위해 이 과정을 면밀히 모니터링해야 합니다.
- 세포 용해를위한 초음파 처리 원리는 무엇입니까? 초음파 처리는 음향 캐비테이션의 원리에 따라 작동합니다. 초음파 에너지는 액체 매체로 전달되어 미세 기포의 형성 및 내파로 이어지는 급격한 압력 변동을 일으킵니다. 이러한 내파는 강렬한 전단력과 국부적인 고온을 생성하여 세포 구조를 파괴하고 용해물 균질성을 향상시킵니다.
- 세포 용해 초음파 검사는 얼마나 걸립니까? 세포 용해를 위한 초음파 처리 기간은 세포 유형, 세포 밀도, 초음파 발생기 전력 및 사용된 특정 프로토콜과 같은 요인에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 일반적인 절차는 몇 초에서 몇 분까지 걸릴 수 있으며, 종종 열 생성을 관리하고 균일한 셀 파괴를 보장하기 위해 주기로 수행됩니다.
- 단백질 추출에서 초음파 처리의 목적은 무엇입니까? 단백질 추출에서 초음파 처리는 세포막을 효율적으로 파열하고 단백질을 용해시키는 역할을합니다. 이 방법은 세포 구획 내에서 단백질을 방출하는 데 특히 유용하므로 단백질을 정제하거나 분석할 용해물을 준비하는 데 필수적입니다.
- 추출에 초음파 처리가 사용되는 이유는 무엇입니까? 초음파 처리는 가혹한 화학 처리를 사용하지 않고 세포 구조를 분해하여 생체 활성 분자를 방출함으로써 추출 된 화합물의 기능적 무결성을 보존하는 빠른 작용과 표적 에너지를 적용 할 수있는 능력으로 인해 추출에 선호됩니다.
- 초음파 처리는 단백질-단백질 상호 작용을 방해합니까? 초음파 처리는 세포막을 효과적으로 파괴 할 수 있지만 단백질-단백질 상호 작용을 방해 할 수도 있습니다. 파괴 수준은 초음파 처리 강도와 노출 기간에 따라 달라지며, 잠재적으로 단백질 복합체의 변성 또는 해리로 이어질 수 있으며, 이는 후속 분석 또는 기능 연구에 영향을 미칠 수 있습니다.
- 초음파 처리를 사용하여 대장균을 용해시킬 수 있습니까? Hielscher 초음파 발생기는 견고한 세포벽을 가진 대장균과 같은 박테리아 세포를 용해하는 데 특히 효과적입니다. 이 기술은 세포벽과 막을 전단하는 물리적 방법을 제공하므로 분자 생물학 및 생화학 실험실에서 박테리아 용해물을 준비하는 데 선호되는 방법입니다.
문헌/참고문헌
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
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- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
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