신뢰할 수 있는 시료 전처리로 HPLC 분석 개선
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 복잡한 매트릭스에서 화합물을 식별하고 정량화하는 데 가장 중요한 분석 기법 중 하나입니다. 제약 품질 관리부터 환경 모니터링 및 식품 분석에 이르기까지 HPLC 방법은 감도, 선택성 및 재현성으로 인해 그 가치를 인정받고 있습니다. 그러나 크로마토그래피 데이터의 신뢰성은 한 가지 중요한 단계, 즉 HPLC 시료 준비에 크게 좌우됩니다.
연구 및 시료 준비 루틴은 초음파 처리 지원 추출 및 시료 준비가 HPLC 분석의 효율성, 정확성 및 속도를 크게 향상시킨다는 것을 입증합니다. 초음파 에너지를 사용하여 매트릭스를 파괴하고 용매로의 분석 물질 전달을 개선함으로써 실험실은 더 높은 회수율, 더 짧은 추출 시간, 더 재현 가능한 분석 결과를 얻을 수 있습니다.
HPLC에서 시료 전처리가 중요한 이유
많은 분석 워크플로우에서 샘플 매트릭스 – 식물 재료, 생물학적 조직, 토양 또는 물 등 – 에는 크로마토그래피 분리를 방해할 수 있는 복잡한 화합물 혼합물이 포함되어 있습니다. 따라서 분석물을 분리하고, 방해 물질을 제거하고, HPLC 시스템에 주입하기 전에 목표 화합물을 농축하려면 효율적인 시료 전처리가 필요합니다.
기존의 추출 기술에는 종종 긴 절차, 많은 양의 유기 용매, 여러 단계의 정화 단계가 필요합니다. 이러한 방법은 변수가 발생하고 운영 비용이 증가하며 총 분석 시간이 길어질 수 있습니다.
초음파 시료 전처리는 효과적인 대안을 제공합니다. 초음파 처리는 액체 매질에 고주파 음향 에너지를 도입하여 미세한 캐비테이션 버블을 생성합니다. 이러한 기포가 붕괴되면 국부적인 전단력과 미세 혼합 효과가 발생하여 고체 매트릭스를 파괴하고 질량 전달을 가속화합니다. 이 과정을 통해 추출 효율이 크게 향상됩니다.
UIP400MTP 고처리량 초음파 발생기 오토샘플러 바이알용 튜브 랙 포함
과학적 증거: 초음파 처리를 통한 분석 성능 향상
여러 동료 검토 연구에서 HPLC 워크플로우에서 초음파 추출의 이점이 입증되었습니다.
예를 들어, 물 샘플의 잔류 농약을 모니터링하기 위해 개발된 방법에서는 초음파 처리와 LC-MS/MS 분석을 결합하여 카바릴 농약 농도를 측정했습니다. 이 접근법에서는 크로마토그래피 분석 전에 초음파 처리로 아세토니트릴로 물 샘플을 추출했습니다. 이 방법은 89.53%에서 101.72% 사이의 회수율을 포함하여 강력한 분석 성능을 달성하여 초음파 시료 전처리 절차의 정확성과 신뢰성을 확인했습니다.
초음파 추출 단계를 통해 수성 매트릭스에서 유기 용매로 분석 물질을 효율적으로 전달하여 용매 소비를 줄이고 광범위한 세척 절차가 필요하지 않습니다. 검증된 분석 방법은 탁월한 선형성, 정밀도 및 정량 한계를 보여줌으로써 최신 크로마토그래피 워크플로우에서 초음파 처리의 효율성을 강조했습니다. (Roudani 외, 2018 참조)
또 다른 연구에서는 HPLC 분석을 사용하여 올리브 잎에서 올레우로페인을 측정하기 위해 초음파 보조 매트릭스 고상 분산법(UA-MSPD)을 도입했습니다. 이 기술에서는 식물 분말과 흡착 물질을 혼합한 다음 용출 단계에서 초음파에 노출시켰습니다. 초음파는 흡착제 표면에서 분석물 탈착을 향상시키는 동시에 시료 매트릭스에서 추출을 개선했습니다. (참조: 라시디푸르와 헤이다리, 2018)
최적화된 초음파 절차는 다음과 같은 상당한 분석 개선 효과를 가져왔습니다:
- R² = 0.9979의 선형 보정 곡선
- 0.03µg mL-¹의 낮은 검출 한계
- 90.2%~96.7%의 복구율
이러한 결과는 초음파를 이용한 추출이 기존의 매트릭스 고상 분산 기술에 비해 시료 준비 속도를 높일 뿐만 아니라 추출 수율도 높인다는 것을 확인시켜 줍니다.
프로브 식 초음파 발생기 UP200St HPLC 샘플 준비용
HPLC용 초음파 시료 전처리의 주요 이점
분석 실험실에서 초음파 추출의 채택이 증가하는 이유는 몇 가지 측정 가능한 이점이 있기 때문입니다.
- 더 높은 추출 효율성
음향 캐비테이션은 고체 매트릭스를 분해하고 용매 침투를 개선합니다. 이는 특히 복잡한 시료의 미량 화합물의 경우 분석 물질 방출을 향상시키고 회수율을 높입니다. - 샘플 준비 시간 단축
초음파 추출은 종종 몇 초 또는 몇 분 안에 시료 준비를 완료할 수 있습니다. 예를 들어, UA-MSPD의 최적화된 초음파 추출 파라미터는 약 30초의 초음파 처리로 효율적인 분석물 회수를 달성하여 분석 워크플로우를 얼마나 획기적으로 가속화할 수 있는지 보여줍니다. - 솔벤트 소비량 감소
초음파는 질량 전달을 향상시키기 때문에 일반적으로 더 적은 양의 용매가 필요합니다. 용매 사용량을 줄이면 실험실의 지속 가능성이 향상되고 운영 비용이 절감됩니다. - 향상된 재현성
균일한 초음파 에너지 분포는 복제본 간에 일관된 샘플 파괴 및 추출을 보장하여 분석 측정의 정밀도를 향상시킵니다. - 최신 크로마토그래피 방법과의 호환성
초음파 추출은 HPLC, UHPLC 및 LC-MS 시스템과 쉽게 통합되므로 처리량이 많은 분석 환경에 적합합니다.
초음파기 UP400S를 사용하여 Annona muricata 잎의 초음파로 분리 된 추출물에서 페놀 화합물의 HPLC 크로마토 그램.
(연구 및 그래픽: ©Nolasco-González et al., 2022)
HPLC 샘플 준비를 위한 실용적인 초음파 처리 솔루션
초음파 추출을 구현하는 실험실의 경우 Hielscher 초음파 처리기는 진폭, 시간 및 펄스 모드와 같은 매개 변수를 정밀하게 제어할 수 있습니다. 따라서 Hielscher 실험실용 소닉레이터는 특히 분석 실험실에 적합합니다.
HPLC 시료에 가장 적합한 실험실 소닉레이터 선택
| 소닉레이터 모델 | HPLC의 이점 | HPLC 샘플 준비에 가장 잘 활용 |
| VialTweeter 멀티 튜브 초음파 발생기 |
- 동일한 초음파 에너지로 최대 10개의 밀폐된 바이알을 동시에 초음파 처리합니다. - 멸균: 샘플이 밀폐된 상태로 유지되므로 교차 오염이 없습니다. - 배치 간 재현성이 높은 추출 조건 - 소량의 분석 시료를 위한 효율적인 캐비테이션 |
- 환경, 식품 또는 제약 시료의 높은 처리량 준비 - HPLC, UHPLC 또는 LC-MS 분석 전 미량 분석물질 추출 - 여러 샘플을 동일하게 처리해야 하는 표준화된 워크플로 |
| 마이크로플레이트 초음파 발생기 UIP400MTP |
- 전체 마이크로 플레이트의 비접촉 초음파 처리(96웰, 384웰 형식) - 모든 유정에서 균일한 초음파 에너지 분포 - 분석 워크플로우를 위한 자동화 및 로봇 통합 지원 - 진폭과 초음파 처리 시간을 정밀하게 제어하여 처리량 증가 |
- 높은 처리량의 UHPLC 스크리닝 워크플로 - 제약 화합물 라이브러리 및 대사체학 샘플 준비 - LC-MS 또는 UHPLC 분석 파이프라인을 위한 플레이트 기반 추출 |
| 마이크로 팁이 있는 실험실용 초음파 처리기 (직접 초음파 처리) |
- 효율적인 매트릭스 파괴를 위한 최대 초음파 강도 - 고체, 점성 또는 이종 시료에서 매우 빠른 분석물 추출 - 최적화된 추출 조건을 위해 진폭 및 펄스 매개변수 조정 가능 - 높은 캐비테이션 에너지로 분석물 회수 및 추출 수율 향상 |
- 식물 조직, 식품 샘플 또는 폴리머와 같은 어려운 매트릭스에서 추출하기 - SPE, 여과 또는 액체-액체 추출 전 균질화 - 초음파 HPLC 시료 전처리를 위한 방법 개발 |
| 컵혼 (“고강도 목욕” 비커 및 튜브용) |
- 간접 초음파 처리로 프로브 오염 방지 - 여러 튜브에 동시에 균일한 초음파장 제공 - 밀봉 상태를 유지해야 하는 멸균, 위험 또는 휘발성 시료에 이상적입니다. - 강력한 캐비테이션 에너지를 유지하면서 취급을 간소화합니다. |
- 밀폐된 원심분리기 튜브에서 여러 HPLC 샘플의 병렬 추출 - 생물학적, 제약 또는 환경 시료의 준비 - 오염 없는 간접 초음파 처리가 필요한 워크플로 |
분석 화학의 과학적 관련성
분석 화학이 보다 빠르고 지속 가능한 실험실 관행을 향해 나아감에 따라 초음파 시료 전처리는 강력한 지원 기술이 되었습니다. 초음파 처리는 용매 소비를 줄이고 추출 효율을 개선하며 강력한 검증 파라미터를 통해 신속한 분석 방법의 개발을 지원합니다.
초음파 추출에 대한 문헌이 증가함에 따라 초음파 처리 지원 HPLC 시료 전처리가 단순히 편리하기만 한 것이 아니라는 것이 입증되었습니다. – 분석 성능을 향상시키는 과학적으로 검증된 접근 방식입니다. 초음파 추출과 최신 크로마토그래피 기술을 결합하여 실험실은 점점 더 복잡해지는 시료 매트릭스에서 미량 분석물을 안정적으로 검출할 수 있습니다.
초음파 처리로 향상된 HPLC 워크플로
분석 기기 및 시료 전처리 기술이 지속적으로 발전함에 따라 크로마토그래피 실험실에서 초음파 추출의 역할이 더욱 커질 것으로 보입니다. 워크플로우를 간소화하고 데이터 품질을 개선하며 환경에 미치는 영향을 줄이는 능력은 현대 분석 과학의 진화하는 요구 사항과 잘 맞아떨어집니다.
HPLC 시료 전처리를 최적화하고자 하는 분석 화학자 및 산업 실험실의 경우 초음파 추출은 입증되고 확장 가능하며 과학적으로 견고한 솔루션을 제공합니다. 초음파 처리를 일상적인 시료 전처리 프로토콜에 통합함으로써 실험실은 크로마토그래피 분석의 효율성과 신뢰성을 크게 향상시킬 수 있습니다.
설계, 제조 및 컨설팅 – 독일에서 만든 품질
Hielscher 초음파는 최고의 품질과 디자인 표준으로 잘 알려져 있습니다. 견고 함과 쉬운 작동으로 초음파를 산업 시설에 원활하게 통합 할 수 있습니다. 거친 조건과 까다로운 환경은 Hielscher 초음파기로 쉽게 처리 할 수 있습니다.
Hielscher 초음파는 ISO 인증 회사이며 최첨단 기술과 사용자 친화성을 갖춘 고성능 초음파에 특히 중점을 둡니다. 물론, Hielscher 초음파는 CE를 준수하며 UL, CSA 및 RoHs의 요구 사항을 충족합니다.
문헌 / 참고문헌
- M. Rashidipour and R. Heydari (2018): Ultrasonic-Assisted Matrix Solid-Phase Dispersion and High-Performance Liquid Chromatography as an Improved Methodology for Determination of Oleuropein from Olive Leaves. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 52, 2018. 307-316.
- Roudani, A.; Rachid, Mamouni; Nabil, Saffaj; Laknifli, A.; Gharby, Said; Noureddine, El Baraka; Bakka, Abdelhamid; Abdellah, Faouzi (2018): Method validation in the determination of Carbaryl pesticide in water samples using sonication and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. JMES 8 (7), 2017. 2409-2420.
- Bimakr M., Ganjloo A., Zarringhalami S., Ansarian E. (2017): Ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from Malva sylvestris leaves and its comparison with agitated bed extraction technique. Food Science and Biotechnology 2017 Nov 30;26(6):1481-1490.
자주 묻는 질문
HPLC란 무엇입니까?
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 혼합물 내의 성분을 식별, 정량화 및 정제하는 데 사용되는 분석 분리 기법입니다. HPLC에서 액체 이동상은 고압의 고정상으로 채워진 컬럼을 통해 용해된 분석물을 운반합니다. 분석 물질, 고정상, 이동상 간의 상호 작용의 차이로 인해 화합물이 컬럼을 통과할 때 분리됩니다. UV-Vis, 형광 또는 질량 분석과 같은 검출기는 분리된 화합물을 측정하여 정밀한 정성 및 정량 분석을 가능하게 합니다.
액체 크로마토그래피의 종류에는 어떤 것이 있나요?
액체 크로마토그래피는 분석 물질, 고정상, 이동상 사이에 사용되는 분리 메커니즘에 따라 분류할 수 있습니다. 가장 일반적인 유형으로는 무극성 고정상이 소수성 상호작용에 따라 화합물을 분리하는 역상 크로마토그래피, 극성 고정상을 사용하고 극성에 따라 화합물을 분리하는 정상 상 크로마토그래피, 하전 고정상이 이온 상호작용에 따라 분석물을 분리하는 이온 교환 크로마토그래피, 유체 역학적 크기와 분자량에 따라 분자를 분리하는 크기 배제 크로마토그래피가 있습니다. 특정 분자 상호작용 또는 극성 화합물을 표적으로 하는 친수성 크로마토그래피 및 친수성 상호 작용 크로마토그래피(HILIC)와 같은 특수한 방법도 있습니다.
HPLC에는 어떤 바이알이 사용되나요?
HPLC 분석은 일반적으로 크로마토그래피 시스템에 주입하기 전에 준비된 시료를 담을 수 있도록 설계된 작은 유리 또는 폴리머 바이알을 사용합니다. 가장 일반적인 형식은 대부분의 HPLC 자동 샘플러와 호환되는 2-mL 자동 샘플러 바이알입니다. 이러한 바이알은 일반적으로 붕규산 유리로 만들어져 내화학성을 보장하고 용매 및 분석물과의 상호 작용을 최소화합니다. 시료 유형에 따라 바이알에는 소량 시료용 인서트, 나사 캡 또는 크림프 탑 마개, 시료 무결성을 유지하기 위해 PTFE/실리콘과 같은 재질로 만들어진 격막이 포함될 수 있습니다.
자동 샘플러 바이알이란 무엇인가요?
오토샘플러 바이알은 HPLC 및 UHPLC 기기의 자동 주입 시스템용으로 설계된 특수 시료 용기입니다. 준비된 시료 용액을 담고 기기의 오토샘플러 트레이에 넣으면 시스템이 크로마토그래피 컬럼에 주입하기 위해 정해진 양을 자동으로 추출합니다. 오토샘플러 바이알은 로봇 샘플링 바늘과의 호환성을 보장하고 시료 증발, 오염 또는 흡착을 최소화하기 위해 정밀한 치수로 제조됩니다. 이러한 설계 덕분에 최신 크로마토그래피 실험실에서 재현 가능하고 처리량이 많은 분석을 수행할 수 있습니다.
HPLC의 단계는 무엇인가요?
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)의 일반적인 워크플로우는 분석 물질의 안정적인 분리와 검출을 보장하는 여러 순차적인 단계로 구성됩니다.
- 먼저, 분석물을 용해하고 미립자를 제거하며 종종 시료 매트릭스에서 목표 화합물을 추출하거나 농축하기 위해 시료 전처리를 수행합니다. 이 단계에는 여과, 희석 또는 초음파 추출, 고상 추출 또는 액체-액체 추출과 같은 추출 기술이 포함될 수 있습니다.
- 다음으로 준비된 샘플을 HPLC 바이알에 넣고 오토샘플러에 로드합니다. 자동 샘플러는 흐르는 이동상에 정확한 양의 샘플을 주입합니다.
- 그런 다음 이동상 전달 단계에서는 고압 펌프를 사용하여 주입된 샘플을 시스템 전체로 이송합니다. 이동상은 크로마토그래피 컬럼을 통해 제어된 유속으로 분석물을 운반합니다.
- 크로마토그래피 컬럼 내부에서 분리가 이루어집니다. 컬럼에는 일반적으로 화학적 특성이 정의된 입자로 포장된 고정상이 포함되어 있습니다. 분석 물질이 컬럼을 통과할 때 고정상 및 이동상과 서로 다르게 상호 작용하여 서로 다른 시간에 용출됩니다.
- 분리 후 화합물은 UV-Vis, 형광 또는 질량 분석 검출기와 같은 검출기를 통과합니다. 검출기는 용출된 화합물의 존재 여부와 농도를 측정하고 신호를 전자 데이터로 변환합니다.
- 마지막으로 크로마토그래피 소프트웨어를 사용하여 데이터 수집 및 분석을 수행합니다. 이 시스템은 피크가 개별 화합물에 해당하는 크로마토그램을 생성합니다. 피크 유지 시간은 분석물 식별에 도움이 되며, 피크 면적 또는 높이는 농도를 정량적으로 측정할 수 있게 해줍니다.
