超音波を用いた植物細胞の遺伝的形質転換

超音波処理支援アグロバクテリウム媒介形質転換（SAAT）は、アグロバクテリウムを運搬体として用い、植物細胞に外来遺伝子を感染させる効率的な方法です。超音波キャビテーションはソノポレーションを引き起こします。これは、植物組織に標的を定めて微小な傷を形成する作用として説明できます。超音波によって形成されたこれらの微小な傷を通じて、DNAおよびDNAベクターを細胞マトリックス内へ効率的に輸送できます。

ソノポレーション – 超音波による細胞形質転換の促進

細胞懸濁液に低周波超音波（約20kHz）を照射すると、音響キャビテーションの作用によって細胞組織の膜透過性が一時的に高まります。この超音波の作用はソノポレーションと呼ばれ、細胞や組織への遺伝子導入に用いられます。
超音波処理の利点は、非熱的な機械作用の原理に基づいています。この原理により、超音波処理は多くの場合、より幅広く利用でき、細胞の種類への依存性も低くなります。ソノポレーションの多様な用途は、複雑なヒト治療用タンパク質の生物生産に大きな可能性を持つ遺伝子導入植物の利用に道を開きます。このような植物ベースのバイオリアクターは、遺伝的操作が容易で、ヒト病原体による潜在的な汚染を防ぎ、形質転換を媒介する細菌（例えばアグロバクテリウム）を損傷せず、安価で有効な生合成方法となります。

超音波支援による細胞形質転換

超音波処理は、低周波の超音波を照射して溶液中の粒子を攪拌し、溶液を混合することで、物質移動と溶解の速度を高める技術です。同時に、超音波処理によって液体から溶存ガスを除去できます。植物の形質転換では、超音波処理によって植物組織に微小な傷が形成され、植物プロトプラストへの裸のDNAの導入が促進されます。

遺伝的形質転換では、超音波処理支援アグロバクテリウム媒介形質転換（SAAT）が推奨される方法であり、裸のDNAおよびDNAベクターをプロトプラストへ直接導入するための超音波処理よりも、効率が有意に高くなります。数多くの研究により、超音波処理支援アグロバクテリウム媒介形質転換（SAAT）では、超音波とそれに伴う音響キャビテーションによって、植物細胞の機械的破壊と傷の形成を誘発できることが示されています。短時間の超音波処理によって、外植片の表面に微小な傷が形成されます。傷ついた細胞はアグロバクテリウムが植物組織のより深い部分へ侵入することを可能にし、植物細胞が感染する可能性を高めます。さらに、分泌されるフェノール性化合物が形質転換を促進します。超音波で形成された微小な傷は、細菌が外植片へ侵入することも容易にします。SAATは、特にアグロバクテリウムに対して抵抗性があると考えられる植物種の遺伝的形質転換に、成功裏に用いられました。
非常に簡単で安価な方法であることと、アグロバクテリウム媒介遺伝子導入を大幅に促進することが、SAATの主な利点です。SAATはChenopodium rubrum L.およびBeta vulgaris L.の形質転換に成功裏に利用されているほか、Nicotiana tabacumにおける組換えEscherichia coli野生型易熱性ホロ毒素およびEscherichia coli変異型LTワクチンアジュバントの生産にも用いられており、その際、鳥類で最高の全身性LT-B特異的IgG抗体価が検出されました。
（参照：Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014）

植物細胞におけるソノポレーションによる遺伝子導入の一般的な手順

1. 遺伝物質の準備： まず、植物細胞に導入したい遺伝物質を準備します。プラスミドDNA、RNA、またはその他の核酸を使用できます。
2. 植物細胞の単離： 標的とする植物細胞を単離します。実験に応じて、これらの細胞を植物組織または培養物から単離する場合があります。
3. 細胞懸濁液： 適切な培地または緩衝液に植物細胞を懸濁します。これは、細胞を健全に保ち、遺伝子の取り込みに適した状態にするために不可欠です。
4. 超音波処理装置の設定： 振幅、時間、エネルギー、温度などの超音波処理パラメーターをあらかじめ設定し、プローブ型超音波処理装置を準備します。超音波プローブを細胞懸濁液に浸します。
5. 超音波処理： 超音波処理を開始します。プローブ先端の高速振動によって、液体中にキャビテーション気泡が発生します。これらの気泡は超音波によって膨張・崩壊し、懸濁液中に機械的な力とマイクロストリーミングを生じさせます。
6. ソノポレーション： キャビテーションによって生じる機械的な力とマイクロストリーミングは、植物細胞の膜に一時的な細孔や穴を形成します。懸濁液中に存在する遺伝物質は、これらの細孔を通って植物細胞内へ入ることができます。
7. インキュベーション： ソノポレーション処理後、植物細胞をインキュベートして、細胞の回復と膜の安定化を促します。これは、細胞の生存と遺伝子導入の成功を確実にするための重要なステップです。

アグロバクテリウムまたはリポソームを介した遺伝子導入

植物細胞に遺伝子を導入する一般的な方法には二つあります。いずれも遺伝物質の運搬体として、グラム陰性細菌の一属であるアグロバクテリウム、またはリポソームを用います。

• アグロバクテリウム媒介ソノポレーション： Agrobacterium tumefaciensは、植物の遺伝子工学で一般的に用いられる細菌です。この方法では、目的の遺伝子を含むプラスミドDNAをアグロバクテリウムに導入し、その後、植物細胞と混合します。細胞懸濁液を、プローブ型超音波処理装置を用いてソノポレーション処理します。超音波エネルギーは、アグロバクテリウムから植物細胞への遺伝物質の移行を促進します。この方法は、植物の遺伝子改変に広く用いられています。
• リポソーム媒介ソノポレーション： リポソームは、遺伝物質を運ぶことができる脂質ベースの小胞です。この方法では、プラスミドDNAまたはその他の核酸を封入したリポソームを植物細胞と混合します。植物細胞によるリポソームの取り込みを促進するために、プローブ型超音波処理装置を用いたソノポレーションを行います。超音波はリポソームの脂質二重層を破壊し、遺伝物質を植物細胞内へ放出します。この方法は、植物細胞における一過性遺伝子発現の研究に有用です。

科学的に実証された超音波処理支援アグロバクテリウム媒介形質転換（SAAT）の利点

超音波処理支援アグロバクテリウム媒介形質転換（SAAT）は、数多くの植物種に適用されています。植物細胞培養物を短時間かつ比較的穏やかに超音波処理すると、ソノポレーションが生じ、その結果、遺伝子運搬体としてのアグロバクテリウムが深部まで侵入できるようになります。以下では、SAATの有益な作用を示す研究例をご紹介します。

超音波支援によるアシュワガンダの形質転換

W. somnifera（アシュワガンダまたはウィンターチェリーとして知られる）の形質転換効率を向上させるため、Dehdashtiら（2016）はアセトシリンゴン（AS）と超音波処理の利用を検討しました。
アセトシリンゴン（AS）は、アグロバクテリウムの液体培養、アグロバクテリウムによる感染、外植片とアグロバクテリウムの共培養という三つの段階で添加されました。アグロバクテリウムの液体培養への75 μM ASの添加が、vir遺伝子の誘導に最適であることが明らかになりました。
超音波処理（SAAT）を追加で適用すると、最も高い遺伝子発現が得られました。毛状根におけるgusA遺伝子発現は、葉と茎頂をそれぞれ10および20s超音波処理した場合に最良であることが明らかになりました。改良プロトコルの形質転換効率は、葉と茎頂の外植片でそれぞれ66.5および59.5%と記録されました。他のプロトコルと比較して、この改良プロトコルの形質転換効率は、葉で2.5倍、茎頂で3.7倍高いことが明らかになりました。サザンブロット解析により、系統W1-W4ではgusA導入遺伝子が1–2コピー確認され、一方、改良プロトコルで作製された系統W5では導入遺伝子が1–4コピー検出されました。

超音波処理支援アグロバクテリウム媒介形質転換（SAAT）の処理時間が、W. somniferaの葉（a）および茎頂（b）の外植片の形質転換頻度に及ぼす影響
（研究および図：© Dehdashti et al., 2016）

超音波支援によるワタの形質転換

Hussainら（2007）は、超音波処理支援によるワタの形質転換の有益な作用を示しています。低周波超音波によって生じる音響キャビテーションは、植物組織の表面およびその下に微小な傷を形成し（ソノポレーション）、アグロバクテリウムが植物組織のより深い部分へ、そして組織全体にくまなく移動できるようにします。このような傷の形成により、組織の深部に存在する植物細胞に感染する確率が高まります。SAATの形質転換効率を評価するため、GUS遺伝子発現を測定しました。GUSレポーターシステムは、植物分子生物学および微生物学で特に有用なレポーター遺伝子システムです。さまざまなSAATパラメーターを調整することで、成熟胚を外植片として用いたワタのGUS一過性発現が有意に増強されました。GUSは外植片のインキュベーションから24h後に初めて検出され、48hまでにはGUS発現が非常に強くなりました。これは、超音波処理支援アグロバクテリウム媒介形質転換（SAAT）によるワタの外植片の形質転換が成功したことを示す有用な指標となりました。さまざまな形質転換技術（具体的にはバイオリスティック法、Agro、BAAT、SAAT）を比較した結果、超音波処理支援アグロバクテリウム媒介形質転換（SAAT）が、形質転換において群を抜いて最良の結果を示しました。

GUSの一過性発現に基づく形質転換手順の選択。超音波処理支援アグロバクテリウム媒介形質転換（SAAT）は、有意に高い一過性発現を示します。
（研究および図：© Hussain et al., 2007）

ソノポレーションおよびSAAT向けの高性能超音波ソリューション

Hielscher Ultrasonicsは、実験室、研究施設、そして非常に高い処理能力を持つ産業生産向けの高性能超音波処理装置の開発・製造において、長年の経験を有しています。微生物学および生命科学の分野では、特定の組織とその処理に必要な多様な要件に対応するため、Hielscherはさまざまなソリューションを提供しています。多数のサンプルを同時に超音波処理するために、Hielscherはマルチウェルプレート用のUIP400MTP、最大10本のバイアル（例えばEppendorfチューブ）を超音波処理するVialTweeter、または超音波CupHornを提供しています。プローブ型超音波処理装置の出力範囲は、実験室用ホモジナイザーでは50ワットから400ワットまで、産業用システムでは500ワットから16kWまでです。
お客様の用途とプロセス要件について、ぜひお問い合わせください。経験豊富なスタッフが、お客様の生物学的プロセスに最適な超音波処理装置をご提案いたします。
以下の表は、当社の超音波処理装置のおおよその処理能力の目安を示しています。