超音波処理支援アグロバクテリウム媒介形質転換(SAAT)は、トランスポーターとしてアグロバクテリウムを使用して外来遺伝子で植物細胞に感染する効率的な方法です。超音波キャビテーションは、植物組織の標的微小創傷として記述することができる超音波処理を引き起こす。これらの超音波を介して微小創傷を作成し、DNAおよびDNAベクターを細胞マトリックスに効率的に輸送することができる。

ソノポレーション – 超音波強化細胞形質転換

低周波超音波(約20kHz)を細胞懸濁液に適用すると、音響キャビテーションの影響により、細胞組織に過渡的な膜透過が引き起こされます。この超音波効果は、超音波処理として知られており、細胞や組織への遺伝子導入のために使用されます。
超音波処理の利点は、超音波処理をしばしばより汎用性が高く、細胞型にあまり依存しない非熱機械的作業原理に基づいています。ソノポレーションの汎用性の高い適用は、複雑なヒト治療タンパク質の生物生産において大きな可能性を秘めたトランスジェニック植物の利用の可能性を開く。このような植物ベースのバイオリアクターは、容易に遺伝子操作することができ、ヒト病原体による潜在的な汚染を防止し、形質転換媒介細菌(例えばアグロバクテリウム)を損傷せず、かつ安価で有効な生物合成方法である。

超音波支援細胞形質転換

超音波処理は、溶液中の粒子を攪拌するために低周波超音波を適用する技術であり、溶液を混合し、それによって物質移動および溶解の速度を増加させる。同時に、超音波処理は、液体から溶存気体を除去することができます。植物形質転換において、超音波処理は、植物組織上の微小創傷の形成を引き起こし、植物プロトプラストへの裸のDNAの送達を強化する。

遺伝子形質転換のために、超音波処理支援アグロバクテリウム媒介形質転換(SAAT)は好ましい方法であり、裸のDNAおよびDNAベクターをプロトプラストに直接移すために使用される超音波処理よりも有意に高い効率を有する。多数の研究は、超音波処理がアグロバクテリウム媒介形質転換を支援したことを実証している (SAAT) 超音波による植物細胞上の機械的破壊および創傷の形成を誘導するために使用することができる 音響キャビテーション.短い超音波処理は、外植体の表面に微小創傷を作り出す。傷ついた細胞は、植物組織のより深い部分へのアグロバクテリウムの浸透を可能にするので、植物細胞が感染する可能性を高める。さらに、分泌されたフェノール化合物は形質転換を増強する。超音波で生成された微小創傷は、細菌による外植体浸透もより実現可能にする。SAATは、特にアグロバクテリウムに耐性であると考えられる植物種の遺伝子形質転換に首尾よく使用された。
非常に簡単で安価な方法であること、ならびにアグロバクテリウム媒介遺伝子導入の有意な増強は、SAATの主な利点である。Chenopodium rubrum L.およびBeta vulgaris L.の形質転換におけるSAATの適用の成功とは別に、このアプローチは、ニコチアナ・タバカムにおける組換え大腸菌野生型熱不安定ホロトキシンおよび大腸菌変異LTワクチンアジュバントの製造にも適用されており、その中で、鳥類において最も高い全身LT-B特異的IgG力価が検出された。
(Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014参照)

植物細胞におけるソノポレーションを介した遺伝子導入のための一般的な手順

1. 遺伝物質の調製: 植物細胞に導入したい遺伝物質を準備することから始めます。これは、プラスミドDNA、RNA、または他の核酸である可能性があります。
2. 植物細胞の分離: ターゲットとする植物細胞を単離します。実験に応じて、これらの細胞は植物組織または培養物から単離される場合があります。
3. 細胞懸濁液: 植物細胞を適切な培地または緩衝液に懸濁する。これは、細胞が健康で遺伝子の取り込みを助長する状態にあることを保証するために不可欠です。
4. あなたの超音波処理器をセットアップします: 振幅、時間、エネルギー、温度などのパラメータを事前設定する超音波処理によって、プローブ型超音波処理器を準備します。超音波プローブを細胞懸濁液に浸します。
5. 超音波処理： 超音波処理手順を開始します。プローブ先端の急速な振動により、液体中にキャビテーション気泡が発生します。これらの気泡は超音波によって膨張および崩壊し、サスペンション内に機械的な力とマイクロストリーミングを生み出します。
6. ソノポレーション: キャビテーションによって生成される機械的な力とマイクロストリーミングは、植物細胞の膜に一時的に細孔と穴を作ります。懸濁液中に存在する遺伝物質は、これらの細孔を通して植物細胞に入ることができる。
7. 潜伏： ソノポレーション処理の後、植物細胞をインキュベートして、膜を回復させ、安定させます。これは、細胞の生存と遺伝子導入の成功を確実にするための重要なステップです。

アグロバクテリウムまたはリポソームを介した遺伝子導入

植物細胞をトランスフェクトするための2つの一般的な形態があります。彼らは、アグロバクテリウム、グラム陰性菌の属、または遺伝物質のキャリアとしてリポソームのいずれかを使用します。

• アグロバクテリウム媒介ソノポレーション: アグロバクテリウムツメファシエンスは、植物遺伝子工学で一般的に使用される細菌です。この方法では、所望の遺伝子を含むプラスミドDNAをアグロバクテリウム菌に導入し、アグロバクテリウム菌を植物細胞と混合する。細胞懸濁液をプローブ型超音波処理器を用いてソノポレーションに供する。超音波エネルギーは、アグロバクテリウムから植物細胞への遺伝物質の移動を強化します。この方法は植物の遺伝子組み換えに広く使用されています。
• リポソーム媒介ソノポレーション: リポソームは、遺伝物質を運ぶことができる脂質ベースの小胞です。この方法では、プラスミドDNAまたは他の核酸を装填したリポソームを植物細胞と混合する。プローブ型超音波処理器を用いたソノポレーションは、植物細胞によるリポソームの取り込みを促進するために採用される。超音波はリポソームの脂質二重層を破壊し、遺伝物質を植物細胞に放出する。このアプローチは、植物細胞における一過性の遺伝子発現研究に有用である。

超音波処理支援アグロバクテリウム媒介形質転換(SAAT)の科学的に証明された利点

超音波処理支援アグロバクテリウム媒介形質転換(SAAT)は、多数の植物種に適用されています。植物細胞培養物の短くて比較的穏やかな超音波処理は、ソノポレーションを引き起こし、続いて遺伝子トランスポーターとしてのアグロバクテリウムの深い浸透を可能にする。以下では、SAATの有益な効果を実証する模範的な研究を読むことができます。

アシュワガンダの超音波支援変換

W. somnifera(アシュワガンダまたはウィンターチェリーとして知られている)の形質転換効率を改善するために、Dehdashtiら(2016)はアセトシリンゴン(AS)と超音波処理の使用を調査した。
アセトシリンゴン(AS)を、アグロバクテリウム液体培養、アグロバクテリウム感染、およびアグロバクテリウムと外植体の共培養の3段階で添加した。アグロバクテリウム菌の液体培養物に75μM ASを添加することは、vir遺伝子の誘導に最適であることが判明した。
超音波処理(SAAT)の追加適用は、最高の遺伝子発現をもたらしました。毛むくじゃらの根におけるgusA遺伝子発現は、葉とシュートの先端をそれぞれ10秒と20秒間超音波処理したときに最適であることが判明しました。改良されたプロトコールの形質転換効率は、葉および茎先端外植体の場合にそれぞれ66.5%および59.5%を記録した。他のプロトコルと比較すると、この改良されたプロトコルの変換効率は、葉で2.5倍、シュート先端で3.7倍高いことがわかりました。サザンブロット解析では、ラインW1-W4でgusA導入遺伝子の1~2コピーが確認され、改良されたプロトコールによって生成されたラインW5では1~4コピーの導入遺伝子が検出されました。

超音波処理支援アグロバクテリウム媒介形質転換(SAAT)の持続時間がW.ソムニフェラ葉(a)およびシュート先端(b)外植体の形質転換頻度に及ぼす影響
(研究と図表: © Dehdashti et al., 2016)

綿の超音波支援変換

Hussain et al. (2007)は、超音波処理支援綿形質転換の有益な効果を実証している。低周波超音波によって引き起こされる音響キャビテーションは、植物組織の表面上および下に微小創傷(超音波処理)を作り出し、アグロバクテリウムが植物組織全体をより深くそして完全に移動することを可能にする。この創傷様式は、組織のより深くに横たわっている植物細胞に感染する可能性を高める。SAATの形質転換効率を評価するために、GUS遺伝子発現を測定した。GUSレポーターシステムは、レポーター遺伝子システムであり、植物分子生物学および微生物学において特に有用である。様々なSAATパラメータを調整すると、成熟胚を外植体として用いた綿花におけるGUS一過性発現が有意に増強された。GUSは、外植体のインキュベーションの24時間後に最初に検出され、48hまでに、GUS発現は非常に強烈であり、超音波処理後の綿外植体の形質転換が成功した有用な指標として役立ったアグロバクテリウム媒介形質転換(SAAT)。様々な形質転換技術(すなわちバイオリスティック、アグロ、BAAT、SAAT)、超音波処理支援アグロバクテリウム媒介形質転換(SAAT)の比較は、形質転換のはるかに最良の結果を示した。

GUSの一過性発現に基づく変換手順の選択。超音波処理支援アグロバクテリウム媒介形質転換(SAAT)は、有意に高い一過性発現を示す。
(研究と図表:©フセインら、2007年)

ソノポレーションとSAATのための高性能超音波ソリューション

ヒールシャー超音波は、実験室、研究施設だけでなく、非常に高いスループットと工業生産のための高性能超音波装置の開発と製造で長年の経験があります。微生物学と生命科学のために、ヒールシャーは、特定の組織とその治療に必要なさまざまな要件に対応するためのさまざまなソリューションを提供しています。多数のサンプルの同時超音波処理のためにヒールシャーは、マルチウェルプレート用のUIP400MTP、最大10バイアル(例えば、エッペンドルフチューブ)または超音波CupHornの超音波処理のためのVialTweeterを提供しています。プローブタイプの超音波装置は、ラボホモジナイザーとして50〜400ワットから入手可能であり、産業システムは500ワットから16kWまでの電力範囲をカバーする。
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下の表は私達のultrasonicatorsのおおよその処理能力の目安を与えます：