超音波を用いた植物細胞の遺伝子組換え

ソノポレーション支援アグロバクテリウム媒介形質転換（SAAT）は、アグロバクテリウムをトランスポーターとして用い、植物細胞に外来遺伝子を感染させる効率的な方法である。超音波キャビテーションはソノポレーションを引き起こし、これは植物組織の標的微小創傷と表現できる。この超音波による微小創傷を介して、DNAおよびDNAベクターを細胞マトリックスに効率的に輸送することができる。

ソノポレーション – 超音波による細胞形質転換の促進

低周波超音波（約20kHz）を細胞懸濁液に印加すると、音響キャビテーションの効果により、細胞組織に一過性の膜透過が起こる。この超音波効果はソノポレーションと呼ばれ、細胞や組織への遺伝子導入に利用されている。
超音波処理の利点は、その非熱的な機械的作動原理に基づいており、そのため超音波処理は多くの場合、より汎用性が高く、細胞の種類に左右されにくい。超音波処理の多目的な応用は、複雑なヒト治療タンパク質の生物生産において重要な可能性を持つトランスジェニック植物を利用する可能性を開く。このような植物ベースのバイオリアクターは、遺伝子操作が容易で、ヒトの病原体による汚染の可能性を防ぎ、形質転換を媒介する細菌（例えばアグロバクテリウム）にダメージを与えず、安価で効率的なバイオ合成法である。

超音波による細胞形質転換

ソニケーションとは、低周波の超音波を照射して溶液中の粒子を攪拌し、溶液を混合することで、物質移動と溶解の速度を高める技術である。同時に、超音波処理によって液体中の溶存ガスを除去することができる。植物形質転換では、超音波処理によって植物組織上にマイクロワウンドが形成され、植物の原形質への裸のDNAの導入が促進される。

遺伝的形質転換では、超音波処理支援アグロバクテリウム媒介形質転換（SAAT）が好ましい方法であり、裸のDNAやDNAベクターをプロトプラストに直接導入するために使用される超音波処理よりも著しく高い効率を持っている。超音波処理によるアグロバクテリウムを介した形質転換（SAAT）は、超音波とその結果生じる音響キャビテーションによって、植物細胞に機械的破壊と傷の形成を引き起こすことができることが、数多くの研究で実証されている。短時間の超音波処理により、摘出物の表面に微小な傷が形成される。傷のついた細胞は、アグロバクテリウムの植物組織深部への侵入を可能にし、植物細胞が感染する可能性を高める。さらに、分泌されたフェノール化合物は形質転換を促進する。超音波で発生させた微細な傷は、バクテリアによる植物体への侵入をより可能にする。SAATは、特にアグロバクテリウムに耐性があるとされる植物種の遺伝子形質転換に成功した。
SAATは非常にシンプルで安価な方法であり、アグロバクテリウムを介した遺伝子導入が大幅に向上することが大きな利点である。チェノポディウム・ルブラム（Chenopodium rubrum L.）およびベータ・ブルガリス（Beta vulgaris L.）の形質転換におけるSAATの成功の他に、このアプローチはニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）における組換え大腸菌野生型熱-難燃性ホロトキシンおよび大腸菌変異型LTワクチンアジュバントの生産にも応用され、鳥類において最高の全身性LT-B特異的IgG力価が検出された。
(Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014参照）。

植物細胞におけるソノポレーションによる遺伝子導入の一般的手順

1. 遺伝物質の調製： 植物細胞に導入したい遺伝物質を準備することから始める。これはプラスミドDNA、RNA、あるいはその他の核酸である。
2. 植物細胞の分離： 目的とする植物細胞を単離する。実験によっては、これらの細胞は植物組織や培養物から単離される。
3. 細胞のサスペンション 植物細胞を適当な培地または緩衝液に懸濁する。これは、細胞が健康で遺伝子の取り込みに適した状態にあることを確認するために不可欠である。
4. ソニッケーターをセットアップする： 振幅、時間、エネルギー、温度などのパラメーターをあらかじめ設定し、プローブ型ソニケーターを準備する。超音波プローブを細胞懸濁液に浸す。
5. ソニケーション： 超音波処理を開始します。プローブ先端の急速な振動により、液中にキャビテーション気泡が発生する。この気泡は超音波によって膨張と崩壊を繰り返し、懸濁液中に機械的な力とマイクロストリーミングを発生させる。
6. ソノポレーション キャビテーションによって生じる機械的な力と微小流は、植物細胞の膜に一時的に孔や穴を形成する。懸濁液中に存在する遺伝物質は、これらの孔を通って植物細胞に入ることができる。
7. インキュベーション： ソノポレーション処理後、植物細胞をインキュベートして回復させ、細胞膜を安定させる。これは、細胞の生存と遺伝子導入の成功を確実にするための重要なステップである。

アグロバクテリウムまたはリポソームによる遺伝子導入

植物細胞への遺伝子導入には2つの一般的な方法がある。グラム陰性菌の一種であるアグロバクテリウムか、リポソームを遺伝物質のキャリアーとして使うのである。

• アグロバクテリウムを介したソノポレーション： アグロバクテリウム・ツメファシエンスは、植物の遺伝子工学によく使われる細菌である。この方法では、目的の遺伝子を含むプラスミドDNAをアグロバクテリウムに導入し、植物細胞と混合する。細胞懸濁液はプローブ型ソニケーターを用いてソノポレーションされる。超音波エネルギーは、アグロバクテリウムから植物細胞への遺伝物質の移動を促進する。この方法は植物の遺伝子組み換えに広く用いられている。
• リポソームを介したソノポレーション： リポソームは、遺伝物質を運ぶことができる脂質ベースの小胞である。この方法では、プラスミドDNAやその他の核酸を担持したリポソームを植物細胞と混合する。植物細胞によるリポソームの取り込みを促進するために、プローブ型ソニケーターを用いたソノポレーションが採用される。超音波がリポソームの脂質二重膜を破壊し、遺伝物質を植物細胞内に放出する。このアプローチは、植物細胞における一過性の遺伝子発現研究に有用である。

科学的に証明された超音波支援アグロバクテリウム媒介形質転換（SAAT）の利点

超音波処理によるアグロバクテリウムを介した形質転換（SAAT）は、数多くの植物種に応用されてきた。植物細胞培養の短時間で比較的穏やかな超音波処理によりソノポレーションが起こり、その後、遺伝子輸送体としてのアグロバクテリウムの深い浸透が可能になる。以下に、SAATの有益な効果を実証する模範的研究を紹介する。

超音波によるアシュワガンダの変形

W. somnifera（アシュワガンダまたはウィンターチェリーとして知られる）の形質転換効率を向上させるため、Dehdashtiら（2016）はアセトシリンゴン（AS）と超音波処理の使用を検討した。
アセトシリンゴン（AS）は3段階で添加した：アグロバクテリウムの液体培養、アグロバクテリウムの感染、摘出植物とアグロバクテリウムの共培養である。アグロバクテリウムの液体培養に75μMのASを添加することが、ウイルス遺伝子の誘導に最適であることがわかった。
さらに超音波処理（SAAT）を加えたところ、遺伝子発現が最も高くなった。毛状根におけるgusA遺伝子の発現は、葉およびシュート先端をそれぞれ10秒および20秒超音波処理した場合に最も良好であった。改良されたプロトコールによる形質転換効率は、葉とシュート先端の形質転換体において、それぞれ66.5%と59.5%を記録した。他のプロトコールと比較すると、この改良型プロトコールの形質転換効率は、葉で2.5倍、シュートチップで3.7倍高いことがわかった。サザンブロット解析の結果、W1-W4系統では1-2コピーのgusA導入遺伝子が確認されたが、改良プロトコールで作出されたW5系統では1-4コピーの導入遺伝子が検出された。

W.somniferaの葉（a）およびシュートチップ（b）摘出株の形質転換頻度に及ぼす超音波処理支援アグロバクテリウム媒介形質転換（SAAT）の持続時間の影響
(研究およびグラフィック：© Dehdashti et al.）

超音波による綿花の変形

Hussainら（2007）は、超音波処理による綿花形質転換の有益な効果を実証している。低周波超音波による音響キャビテーションは、植物組織の表面とその下に微小な傷を作り（ソノポレーション）、アグロバクテリウムが植物組織内を深く完全に移動することを可能にする。この傷の付け方により、組織の深部にある植物細胞に感染する確率が高まる。SAATの形質転換効率を評価するため、GUS遺伝子の発現を測定した。GUSレポーター・システムは、植物分子生物学および微生物学で特に有用なレポーター遺伝子システムである。様々なSAATパラメーターを調整することで、成熟胚を摘出植物として用いたワタにおけるGUS一過性発現が有意に増強された。GUSは、胚の培養から24時間後に初めて検出され、48時間後までにはGUSの発現が非常に強まり、超音波処理によるアグロバクテリウムを介した形質転換（SAAT）後のワタ胚の形質転換成功の有用な指標となった。様々な形質転換技術（すなわち、生物学的形質転換、アグロ、BAAT、SAAT）を比較した結果、超音波処理によるアグロバクテリウムを介した形質転換（SAAT）が圧倒的に良好な形質転換結果を示した。

GUSの一過性発現に基づく形質転換手順の選択。ソニケーション支援アグロバクテリウム媒介形質転換（SAAT）は、有意に高い一過性発現を示した。
(図と写真：© Hussain et al.）

ソノポレーションとSAATのための高性能超音波ソリューション

Hielscher Ultrasonics社は、実験室、研究施設だけでなく、非常に高いスループットを持つ工業生産用の高性能超音波発生装置の開発と製造において長年の経験を有しています。微生物学やライフサイエンスにおいて、Hielscher社は特定の組織やその処理に必要な様々な要求に対応する様々なソリューションを提供しています。多数のサンプルを同時に超音波処理するために、Hielscher社はマルチウェルプレート用のUIP400MTP、最大10本のバイアル（例えばエッペンドルフチューブ）を超音波処理するVialTweeter、または超音波CupHornを提供しています。ラボ用ホモジナイザーとしては、50～400ワットのプローブ型超音波発生装置があり、工業用システムとしては、500ワットから16kWまでの出力範囲をカバーしています。
お客様のアプリケーションやプロセスに関するご要望をお聞かせください。経験豊富なスタッフが、お客様のバイオプロセスに最適な超音波処理装置をご提案させていただきます。
下の表は、超音波処理装置の処理能力の目安です：